CN101619346A - 人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因拷贝数实时荧光定量PCR检测，公开了一种冠心病相关的人脂蛋白a基因拷贝数检测方法及其试剂盒，该方法包括如下步骤：(1)抽提与纯化人外周血基因组DNA；(2)制备阳性质粒标准品；(3)建立Taqman荧光定量PCR检测方法。以脂蛋白a基因为目的基因，白蛋白基因为内参基因，并利用双引物双探针法建立适合目的基因的定量PCR检测方法。还建立标准曲线，并通过计算标准曲线参数以及重复样本的变异系数，评估检测方法的可行性。该方法及试剂盒在冠心病预警诊断和高危人群早期筛查方面能发挥重要作用，有利于鉴别冠心病高风险个体，尽早实施预防、监控、干预和/或治疗，尽可能避免发病或延迟发病。

Description

人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因拷贝数的检测方法，尤其涉及一种与冠心病相关的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，还涉及一种检测脂蛋白a的基因拷贝数的试剂盒。

背景技术

随着后基因组时代的来临，在功能基因组学研究中，定量基因分析占有非常重要的地位。实时荧光定量PCR技术的问世，为后基因组时代疾病相关基因的研究提供了一个极好的技术平台。实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)通过设计针对目的基因的特异性引物和探针，优化反应体系和反应循环参数，可同时检测大量样本，节省实验时间和反应成本，为基因定量检测和准确定量疾病相关基因的表达提供有效的技术手段，实现对人类和动物疾病的早期诊断与基因分期、分型，以及对人类肿瘤转移的早期发现及预后判断，在临床上有广阔的应用前景。

实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR进程及连续分析扩增相关的荧光信号，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数呈指数方式增加，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，进入平台期。在PCR反应早期，产生的荧光水平不能与背景明显地区别，而后，荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检样本进行比较，在实时荧光定量PCR反应的指数期，首先需设定一个荧光信号的循环阈值(cycling threshold，CT)，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，如果检测到的荧光信号达到设定的阈值时被认为是真正的信号，它所经历的循环数即为CT值。研究表明：每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

在实时荧光定量PCR技术中，目前应用最普遍的荧光化学方法是水解探针法(hydrolysis probes)。水解探针法是一种利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针杂交扩增产物的检测方法。通常使用Taq聚合酶的5’核酸外切酶活性来水解与目的序列杂交的探针：在PCR扩增体系中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，被扩增物沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5’外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)，裂解双链DNA 5’端核苷酸，释放出单个寡核苷酸。基于Taq酶的这种活性，设计合成了一个能与PCR产物杂交的探针。目前，应用最广泛的是Taqman探针。Taqman探针是一段特异性的寡核苷酸，其5’端标记荧光发射基团，也称报告基团(reporter R)，3’端标记淬灭基团(quencher Q)，其序列与模板DNA中扩增序列的一段完全互补。常用的报告基团包括：FAM、VIC、TET、JOE、HEX(R)、CY3、CY5，淬灭荧光基团为MGB、TAMRA和DABCYL(Q)。当探针保持完整时，5’端荧光发射基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端淬灭基团，发生荧光共振能量转移，3’端淬灭基团抑制5’发射基团的荧光发射，故检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。在PCR的退火期，探针与引物所扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5’～3’核酸外切酶活性而发生置换切断探针，使报告荧光基团和淬灭基团分离，淬灭基团的抑制作用消失，荧光发射基团脱离3’端淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，同时伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度和被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此荧光信号的累积与PCR产物完全同步。在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，可推断出模板最初的含量，对模板进行准确定量。由于模板较短时扩增效率较高，故扩增长度一般以50bp～150bp为佳。

在实时荧光定量PCR中，模板定量有2种方法：相对定量法和绝对定量法。相对定量法是指在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化；绝对定量法是指用已知的标准曲线来推算未知样本的量。绝对定量法一般采用外标准品定量的制备来实现，质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品。将标准品(质粒DNA)稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值(荧光信号阈值)为纵坐标，绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中计算出样品的拷贝数。

脂蛋白a[Lp(a)]是挪威遗传学Kara Berg在1963年首先发现的，1987年，McLean等发现Lp(a)与纤维蛋白原之间具有结构高度同源性及交叉免疫反应性，自此Lp(a)与动脉粥样硬化的关系即成为研究的热点，被认为是一种新的致动脉粥样硬化性脂蛋白，是冠心病等动脉粥样硬化性疾病的独立危险因素之一，并促进粥样硬化血栓形成及进展。

Lp(a)是一种特殊脂蛋白颗粒，主要由LDL成分和载脂蛋白a组成。其颗粒大小与遗传因素有关，Lp(a)与溶解纤维蛋白的纤溶酶原具有同源性，干扰纤溶酶原在纤溶过程中的作用，参与动脉粥样硬化形成和发展的整个过程，是动脉粥样硬化和血栓形成的独立危险因素。动脉粥样硬化风险社区研究提示：高Lp(a)血症(Lp(a)≥0.3g/L)者患缺血性脑卒中的风险比低Lp(a)者(Lp(a)＜0.1g/L)高79％。Barbara等对429名I型糖尿病病人进行长达6年的前瞻性研究，结果表明高Lp(a)血症(Lp(a)≥0.3g/L)是冠心病的独立危险因素。高Lp(a)血症的糖尿病患者与血Lp(a)正常(Lp(a)＜0.3g/L)的糖尿病患者相比，其患冠心病的风险是后者的2倍(HR＝2.23，95％CI：1.28-3.87，P＝0.004)。现有研究认为血Lp(a)水平是由一个基因(lipoprotein(a)，LPA)的主要效应和多基因的微效作用所决定。Wong等运用全基因组的比较基因组杂交技术(whole-genome tilingBAC array，CGH)证实了人类基因组部分染色体的DNA片段存在重复和缺失，涉及了1000多个基因，其中大部分基因与疾病相关，包括LPA基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测冠心病的基因拷贝数的方法。

为了解决以上技术问题，本发明提供的应用实时荧光定量PCR技术检测冠心病的基因拷贝数的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、抽提与纯化人外周血基因组DNA；

(2)、制备阳性质粒标准品；

(3)、建立Taqman荧光定量PCR检测方法。

本发明还提供了一种利用上述方法检测人脂蛋白a基因拷贝数的试剂盒以及该方法和试剂盒在冠心病预警诊断和高危人群早期筛查中的应用。

本发明的冠心病的基因拷贝数的检测方法能达到如下效果：

1、本发明根据目的基因LPA和内参基因白蛋白基因(ALB)的非特异性管家序列，设计相应的引物和Taqman探针，利用Taqman特异性探针对定量分子进行识别，达到靶序列由引物和探针双重控制的目的。

2、在人体基因组DNA和质粒中分别进行重复性检验提示组内及组间变异系数均在合理范围(＜5％)，体现了Taqman实时荧光定量PCR对于临床检验反应特异性好、准确性高、线性关系好的优势。

3、对于样本浓度和变异系数的相关性分析得出人基因组DNA浓度为2ng/μL时，两基因变异系数最小，差值也最小，提示2ng/μL是临床样本检验较为合适的浓度。

4、PCR的扩增和检测在同一管中同时进行，实时监测，减少了污染的可能性，反应的试剂均具备尿嘧啶糖苷酶(UNG/DUTP)防污染技术，有效防止了来自扩增产物的污染，降低假阳性率，保证结果的准确性。

5、本发明的针对目的基因LPA和内参基因ALB的Taqman实时荧光定量PCR系统有较高的临床检验价值，为探索LPA基因拷贝数变异与冠心病的关系奠定了实验基础。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

图1是LPA基因和ALB基因PCR扩增条带电泳结果图；

图2是LPA基因和ALB基因阳性单克隆菌落PCR扩增条带电泳结果图；

图3是实时荧光定量PCR检测体系对LPA基因按10倍等拷贝数梯度稀释质粒的扩增曲线图；

图4是根据LPA基因扩增曲线建立的标准曲线图；

图5是实时荧光定量PCR检测体系对ALB基因按10倍等拷贝数梯度稀释质粒的扩增曲线图；

图6是根据ALB基因扩增曲线建立的标准曲线图。

具体实施方式

实施例1人脂蛋白(a)基因拷贝数荧光定量检测体系建立

1.人基因组DNA抽提与纯化

抽取人外周静脉血10mL，置于含有ACD(枸橼酸8g/L，枸橼酸钠22g/L，葡萄糖24.5g/L)的抗凝管中，振荡混匀后提取DNA。采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提人外周血基因组DNA。

2.阳性质粒标准品的制备

2.1.PCR扩增目的基因

参照GeneBank收录的目的基因LPA和内参基因ALB的基因组全序列，选择保守区域，采用美国ABI Primer Express3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，分别扩增89bp(LPA)和139bp(ALB)的片段。其中LPA探针选自SEQID NO：1的序列，其正向引物包括SEQID NO：3序列，反向引物包括SEQ ID NO：4序列；ALB探针选自SEQID NO：2的序列，其正向引物包括SEQID NO：5序列，反向引物包括SEQID NO：6序列。所扩增片段为非特异性管家序列，不存在任何已报道的基因内结构变异。在PCR反应体系中使用不同的Mg²⁺、探针、引物的浓度以确定最佳的反应体系：PCR反应总体积25μL，体系组分为：1.5μL 10×buffer、3μL betaine、1.5μL 25mmol/L MgCl₂、0.4μL 10mmol/L dNTPs、20mmol/L 上下游引物各0.2μL、0.12μL Taq DNA聚合酶、7.08μL高压灭菌双蒸水、1μL 20ng/μL DNA模板。PCR反应条件：95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，共40个循环。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果，具体结果如图1所示。PCR产物用QIAquick PCRPurification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。

2.2.采用氯化钙制备新鲜大肠杆菌DH5a感受态细胞

1)于新鲜平板上37℃培养大肠杆菌DH5a 16-20小时。

2)从隔夜培养的平板上挑取一个单菌落(直径2-3mm)，转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。

3)于旋转摇床上37℃，300rpm剧烈振摇培养3小时，每隔30分钟测量OD600值来监测培养物的生长情况，保持OD600＝0.35～0.4(活细胞数不超过108细胞/mL)。

4)用冰预冷一次性无菌50mL聚丙烯管(Falcon 2070)。

5)无菌条件下将细菌转移到预冷的聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。

6)于4℃4000rpm离心10分钟，回收细胞。

7)倒出培养液，将管倒置1分钟使残留的培养液流尽。

8)取10mL用冰预冷的0.1mol/L氯化钙重悬沉淀的细胞，冰浴30分钟。

9)于4℃以4000rpm离心10分钟，再次回收细胞。

10)再次倒出培养液，将管倒置1分钟使残留的培养液流尽。

11)加入100μL用冰预冷的0.1mol/L氯化钙重悬细胞，冰浴2小时后，4℃保存备用。

2.3.重组DNA的转化

在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μL：Pmd 18-T SimpleVector*11μL，insert DNA*30.1-0.3pmol，高压灭菌双蒸水加至5μL，加入5μL(等量)的Ligation Mix，16℃反应30分钟。10μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，冰中放置30分钟。然后将离心管转入42℃水浴，热冲击45秒后，迅速将其放在冰上1分钟静置。在离心管中加入SOC培养基890μL，枪头混匀，37℃、150rpm温和摇振60分钟。将200μL转化菌液均匀地涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上。37℃倒置培养过夜，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。挑选白色菌落进行鉴定。PCR反应总体积15μL，体系组分为：1.5μL 10×buffer、0.12μL 5mmol/LdNTPs、3μL betaine、1.5μL 25mmol/L MgCl₂，5mmol/L上下游引物各0.15μL、11.85μL高压灭菌双蒸水。用经灭菌的10μL枪头挑取白色菌落，迅速地使挑取物溶入上述混合液中。在沸水上温育10分钟。将样品冷却至室温，离心数秒，然后加入TaKaRa rTaq酶0.25μL。按以下条件进行PCR反应：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环。取PCR产物1μL，点样于含EB(0.5mg/L)的2g/kg琼脂糖凝胶电泳，电压150V，电泳15min，紫外线透视仪下对凝胶进行观察和摄影。具体结果如图2所示，其中，1、3、4、5、6、7、8、10为ALB基因菌落PCR扩增条带(289bp)，11、12、15、16为LPA基因菌落PCR扩增条带(239bp)，2、9、13、14为不纯条带。

2.4.阳性克隆质粒抽提

1)取1.5-5mL菌液，于室温下10,000rpm离心1分钟以沉淀菌种。

2)弃去培养基，往沉淀中加入250μL的ZL-I/RNase A混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。

3)往重悬混和液中加入250μL ZL-II和10u蛋白酶混和物，轻轻翻转试管4-6次混和溶液，获得澄清的裂解液。

4)往上述混和液中加入350μL ZL-III，温和地上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮状沉淀。于室温下10,000rpm离心10分钟。

5)取一干净的Mu-Pu质粒微量分离柱装在2mL收集试管上，小心吸出上清，并将其转置于柱子内，确保转至柱内的上清中没有细胞杂质沉淀。

6)室温下10,000rpm离心1分钟，使裂解液完全流过柱子。

7)弃去离心甩出液，加入500μL的ZL缓冲液到柱子上。

8)室温下10,000rpm离心1分钟，除去残余的蛋白质。

9)弃去收集液，加入750μL用乙醇稀释的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子，室温10,000rpm离心1分钟，弃去洗涤液。

10)重复上述步骤，再用750μL的DNA洗涤缓冲液洗涤柱子一次。

11)室温下10,000rpm离心空柱1分钟，以甩干柱子基质。

12)将柱子置于一干净的1.5mL小离心管中，直接加入50-100μL灭菌去离子水至柱子基质上，10,000rpm离心1分钟以洗脱出DNA。

13)应用核酸蛋白分析仪测定D260nm，并计算提取质粒的含量，质粒-20℃保存备用。

14)将抽提出的DNA进行测序鉴定。

3.Taqman荧光定量PCR检测方法的建立

使用ABI7300实时荧光定量PCR仪，在PCR反应体系中使用不同的Mg2+、探针、引物的浓度以确定最佳反应体系：PCR反应总体积25μL，体系组分为：5μL 5×buffer、5μL betaine、0.5μL 250mmol/L MgCl₂、0.5μL 10mmol/L dNTPs、2.5μmol/L LPA基因和ALB基因上下游引物各0.5μL、20μmol/L LPA基因和ALB基因Taqman荧光探针各0.2μL、0.25μL Taq DNA聚合酶、1.35μL高压灭菌双蒸水、DNA模板10μL。其中LPA探针选自SEQID NO：1的序列，其正向引物包括SEQ ID NO：3序列，反向引物包括SEQ ID NO：4序列；ALB探针选自SEQID NO：2的序列，其正向引物包括SEQID NO：5序列，反向引物包括SEQID NO：6序列。反应条件：90℃预变性1秒，95℃变性2分30秒；95℃退火15秒；60℃延伸1分钟，共40个循环。

4.标准曲线的建立：

(1)根据公式：拷贝数＝(浓度×10²³×6.02)/(分子质量×10⁹)，应用高压灭菌双蒸水将不同浓度的LPA质粒和ALB质粒稀释至等拷贝数；

(2)将等拷贝数的LPA质粒和ALB质粒振荡混匀作为模板，以10⁵、10⁴、10³、10²、10倍梯度稀释，按步骤3所述体系在ABI7300荧光定量PCR仪上扩增检测，每份模板重复三次，根据所得的扩增曲线建立相应的标准曲线。

5.样本检测

PCR反应总体积25μL，体系组分为：5μL 5×buffer、5μLbetaine、0.5μL 250mmol/L MgCl₂、0.5μL 10mmol/L dNTPs、2.5μmol/LLPA基因和ALB基因上下游引物各0.5μL、20μmol/L LPA基因和ALB基因Taqman荧光探针各0.2μL、0.25μL Taq DNA聚合酶、1.35μL高压灭菌双蒸水、DNA模板10μL。反应条件：90℃预变性1秒，95℃变性2分30秒；95℃退火15秒；60℃延伸1分钟，共40个循环。样本基因组DNA浓度为2ng/μL，阴性对照的模板为高压灭菌双蒸水，标准品为实施例1中所述的浓度梯度的质粒。每份模板重复三次，根据标准品的扩增曲线建立相应的标准曲线，计算样本LPA基因拷贝数。

实施例2Taqman实时荧光定量PCR体系稳定性检测

1.对浓度20ng/μL的人基因组DNA按10倍浓度梯度稀释后，按照实施例1步骤5对各浓度梯度进行检测，结果显示(见表1)：各浓度组CT值变异系数均在合理范围(＜5％)，组间离散度小，表明人基因组DNA在2-20ng/μL的浓度范围内均可按以上方法进行扩增。其中，在浓度为2ng/μL组，LPA和ALB的变异系数最小(0.35vs0.4)，差值最小，提示2ng/μL是人基因组DNA检测较为合适的浓度。

表1

2.对拷贝数10⁵/μL的质粒标准品按10倍等拷贝数梯度稀释后，按照实施例1步骤5对各浓度梯度进行检测，结果显示(见表2)：各浓度组CT值变异系数均在合理范围(＜5％)，组间离散度小，表明在10²-10⁵/μL的范围内建立的标准曲线稳定性好，可用于LPA基因拷贝数变异的检测。

表2

3.随机挑选3例人基因组DNA样本，测定其OD260值后用高压灭菌水稀释至浓度为2ng/μL，按照实施例1步骤5进行检测，结果显示(表3)：各样本CT值变异系数均在合理范围(＜5％)，组间离散度小，稳定性高。

表3

本发明对于样本拷贝数的定量方式采用绝对定量法。将样本PCR产物克隆至载体上，抽提质粒后经过测量浓度和拷贝数建立标准曲线。因质粒的拷贝数可通过浓度换算，故可利用已知拷贝数的标准曲线来推算未知样本的量。因质粒是环状DNA，不易降解，故具有准确、稳定的优点。本发明建立的标准曲线参数显示：双引物双探针扩增条件下，单基因标准曲线相关系数r＝0.999，表明所建立的标准曲线可准确计算样本DNA的绝对含量及相对拷贝数。

本发明选择人ALB基因为内参基因，利用双引物双探针法建立适合目的基因(LPA)的Taqman实时荧光定量PCR检测方法，通过比对不同的反应组分，优化反应条件，减少双引物竞争底物降低基因扩增效率的影响。通过计算标准曲线参数以及重复样本的变异系数，评估检测方法的可行性。该方法体系的建立对于今后应用Taqman实时荧光定量PCR检测疾病相关易感基因具有重要参考价值。本发明的人脂蛋白(a)基因拷贝数的检测与冠心病具有密切相关性，且本发明的检测方法及试剂盒对冠心病的预警诊断和高危人群早期筛查方面能发挥重要作用，有利于鉴别冠心病高风险个体，尽早实施预防、监控、干预和/或治疗，尽可能避免发病或延迟发病。

实施例3人脂蛋白(a)基因拷贝数变异与冠心病的相关性研究

1.从上海交通大学医学院附属瑞金医院心脏科2006年11月至2007年5月住院病人中选取稳定性心绞痛患者203例和对照组207名，采用实施例1中的检测方法检测人脂蛋白(a)基因拷贝数变异情况。

2.利用SPSS13.0(SPSS Inc.，Chicago，USA)进行统计分析。研究共检测到N_LPA＝1、2、3三种人脂蛋白(a)基因拷贝数变异，其中N_LPA＝1为单倍体，N_LPA＝2、3为多倍体，人脂蛋白(a)基因拷贝数变异在稳定性心绞痛组和对照组的分布频率具有显著差异(χ²＝13.614，P＜1×10^-3)，稳定性心绞痛组单倍体分布频率显著低于对照组(26.1％vs43.5％)，单倍体相对比值比OR＝0.459(95％CI：0.303-0.697)。校正发病年龄、性别、体重指数、收缩压、舒张压、血糖、血脂、吸烟、血Lp(a)水平等相关因素，经多因素Logistic回归分析发现：人脂蛋白(a)基因单倍体相对比值比OR＝0.27(95％CI：0.15-0.489，P＜1×10^-3)。结果表明，人脂蛋白(a)基因拷贝数变异与稳定性心绞痛发病相关，稳定性心绞痛患者单倍体分布频率显著降低，人脂蛋白(a)基因单倍体可能是稳定性心绞痛的保护因素。进一步比较人脂蛋白(a)基因单倍体和多倍体携带者高Lp(a)血症(血Lp(a)≥0.3g/L)与稳定性心绞痛的相关性后发现：单倍体携带者稳定性心绞痛组高Lp(a)血症比例与对照组相似(36.7％vs40.7％，P＞0.05)；多倍体携带者稳定性心绞痛组高Lp(a)血症比例显著高于对照组(39.4％vs21.7％，P＝0.028)。校正发病年龄、性别、收缩压、舒张压、体重指数、血脂、血糖、吸烟等相关因素，经多因素Logistic回归分析发现：多倍体携带者，高Lp(a)血症的相对比值比OR＝2.246(95％CI：1.09-4.631)。结果表明，人脂蛋白(a)基因单倍体、多倍体拷贝数分布频率不同影响了稳定性心绞痛患者高Lp(a)血症的发生率。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120>人冠心病易感基因-脂蛋白a基因拷贝数变异检测方法和试剂盒

<160>6

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>artificial

<400>1

TAGGTTGATG CTTCACTCTG TCTCCC 26

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>artificial

<400>2

CCTGTCATGC CCACACAAAT CTCTCCC 27

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<400>3

CTTGGATTGA GGGAATGATG AGA 23

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>artificial

<400>4

CCTTACCCAC GTTTCAGCTT CTA 23

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>artificial

<400>5

GCTGTCATCT CTTGTGGGCT GT 22

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>artificial

<400>6

ACTCATGGGA GCTGCTGGTT C 21

Claims (10)

1、一种人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其特征在于，采用实时荧光定量PCR方法，包括如下步骤：

(1)抽提与纯化人外周血基因组DNA；

(2)制备阳性质粒标准品；

(3)建立Taqman荧光定量PCR检测方法。

2、根据权利要求1所述的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述建立Taqman荧光定量PCR检测方法，以脂蛋白a基因为目的基因，白蛋白基因为内参基因。

3、根据权利要求2所述的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述建立Taqman荧光定量PCR检测方法包括：设计探针和引物，建立扩增体系和建立标准曲线。

4、根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述设计探针和引物为针对所述的脂蛋白a基因和白蛋白基因分别设计合成2组Taqman探针及引物。

5、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述脂蛋白a基因的探针选自SEQ ID NO：1序列，或其互补序列，或与SEQ ID NO：1及其互补序列至少70％同源性的序列；LPA探针正向引物包括SEQ ID NO：3序列，或其互补序列，或与SEQ ID NO：3及其互补序列至少70％同源性的序列；反向引物包括SEQ ID NO：4序列，或其互补序列，或与SEQ IDNO：4及其互补序列至少70％同源性的序列。

6、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，LPA探针选自SEQID NO：1序列，LPA探针正向引物包括SEQ ID NO：3序列，反向引物包括SEQ ID NO：4序列。

7、根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述脂蛋白a基因的探针的荧光标记选择FAM为荧光报告基团，白蛋白基因的探针的荧光标记选择VIC为荧光报告基团，两者的淬灭基团均为TAMRA。

8、根据权利要求3所述的人脂蛋白a的基因拷贝数的检测方法，其特征在于，所述的建立标准曲线包括如下步骤：

将标准品稀释成不同浓度的样品，并作为模板进行PCR反应；

以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线；

对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中计算出样品的拷贝数。

9、一种利用权利要求1所述的方法检测人脂蛋白a的基因拷贝数的试剂盒。

10、权利要求1所述的检测方法和权利要求9所述的试剂盒在冠心病预警诊断和高危人群早期筛查中的应用。

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