JP2019509051A - 定量的増幅方法 - Google Patents

Abstract

定量的および半定量的な増幅のための方法、試料容器、および機器が提供されている。
【選択図】図１

Description

優先権の記述
本出願は、米国特許法１１９条（ｅ）の下、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている２０１６年３月２４日に出願の米国仮出願第６２／３１３，０３２号の優先権を主張するものである。

米国、カナダ、および西欧では、感染性疾患はヒトの死亡率の約７％を占めている一方で、途上国地域では、感染性疾患はヒトの死亡率の４０％より多くを占めている。感染性疾患は様々な臨床徴候をもたらす。一般的な明白な徴候の中には、発熱、肺炎、髄膜炎、下痢、および血液含有下痢が含まれる。身体的な徴候は何らかの病原体を示唆しており、病原因子として他の物を排除しているが、様々な潜在的な原因物質が残っており、明白な診断は多くの場合、様々なアッセイを行うことを必要とする。病原体を診断するための従来の微生物学的技法は数日間から数週間かかる場合があり、多くの場合、適切な処置過程を遅らせている。

近年では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が感染性因子の迅速な診断のための選択法となっている。ＰＣＲは、感染性疾患を診断するための迅速、高感度、かつ特異的なツールとなることができる。診断の主要な手段としてＰＣＲを使用することの１つの問題は、可能性のある原因生物が多様であること、および一部の病理学的検体中に存在する生物のレベルが低いことである。そのほとんどが陰性であると予想される、可能性のある原因生物それぞれについて１つずつのＰＣＲアッセイの大きなパネルを実行することは、多くの場合は非実用的である。病原体の核酸が低濃度であり、十分な反応鋳型を集めるために大量の試料を必要とする場合は、問題が悪化する。一部の事例では、すべての可能性のある病原因子についてアッセイするためには不十分な試料しか存在しない。一つの解決策は、試料を複数の標的について単一の反応で同時にアッセイする「多重ＰＣＲ」を実行することである。多重ＰＣＲは一部のシステムにおいて有益であることが証明されている一方で、高レベルの多重反応の頑健性および複数の生成物の明白な分析の困難に関して欠点が存在する。これらの問題を解決するために、アッセイを続いて複数の二次ＰＣＲへと分割し得る。二次反応を一次生成物内にネスティングすることで、多くの場合は頑健性が増加する。しかし、このさらなる取扱いは高価な場合があり、汚染または他の問題をもたらし得る。

試料調製、増幅、検出、および分析を統合した完全統合多重ＰＣＲシステムはユーザーフレンドリーであり、診断市場および症候性手法に特に良好に適応している。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、ユタ州Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）はそのようなシステムの１つであり、診断市場に向けて開発されたユーザーフレンドリーな、高度に多重化されたＰＣＲシステムである。単一の試料機器が、試料調製および入れ子多重ＰＣＲを統合する使い捨ての「パウチ」を受け入れる。統合された試料調製は使い勝手のよさをもたらす一方で、高度に多重化されたＰＣＲは、ＰＣＲの感度および３０個までの異なる生物を同時に試験する能力をどちらも提供する。このシステムは、いくつかの異なる病原体がすべて同様の臨床症状を現す、病原体の同定によく適している。現在の利用可能な診断的パネルには、上気道感染症のための呼吸器パネル、血流感染症のための血液培養物パネル、ＧＩ感染症のための胃腸管系パネル、および脳脊髄液感染症のための髄膜炎パネルが含まれる。他のパネルは開発中である。

ＦｉｌｍＡｒｒａｙパネルおよび他の検出システムによって標的とされる病原体の多くは、環境中に、および試料採取部位での共生生物として見つけることができる。たとえば、肺炎などの疾患では、最も頻繁に遭遇する細菌性病原体は、多くの場合はそれ自体が試料採取部位である（痰および気管吸引液もしくは上咽頭スワブ（ＮＰＳ））または気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）などのより侵襲性の検体の採取経路である、口咽頭路の「常在菌叢」としても存在し得る。そのような場合には、常在菌叢による頻繁な汚染またはその同時採取は回避できない。したがって、微生物学研究室における慣習は、細菌の病原的負荷を臨床的に意味のない共生生物の保因から区別するために、半定量的または定量的な培養を行うことである。様々な種類の検体について様々な診断的力価指針が存在する。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、時間がかかり多くの場合は主観的な微生物学的方法の、迅速かつ客観的な分子学的代替方法として機能することができる。

ｑＰＣＲによる増幅を含めた絶対的定量では、検量線手法を頻繁に使用する。この手法では、リアルタイムＰＣＲから得られた交点（Ｃｐ）値を既知量の単一の参照鋳型に対してプロットすることで作成した検量線により、目的の試料中の同じ標的遺伝子の量を外挿するために使用できる回帰直線が提供される。参照鋳型の段階希釈（例示的には１０倍希釈）を、定量する必要がある特定の遺伝子標的を含有する試料と並べて設置する。様々な別々の反応を、通常は参照標的のそれぞれのレベルについて１つずつと、目的の試料についてそれぞれ１つずつとを実行する。また、多くの場合は、ＰＣＲ効率のアッセイに特異的な相違が定量に影響を与えるため、別々の参照鋳型を用いた別々の検量線を設置して、様々な遺伝子標的を定量する。

しかし、この手法を使用して多重化されたＰＣＲシナリオにおいて標的を定量することは困難な場合がある。多重化されたＰＣＲからの標的の定量は行われているが、この手法は、多重化に含まれるそれぞれのアッセイについて複数の個々のＰＣＲ検量線を設定することを必要とする（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２０１４）。また、この手法は、アッセイが単一反応および多重反応において同じＰＣＲ効率を有することを想定している、または必要とする。現在までに公開されている検量線に基づくすべての定量手法は、様々なレベルの参照鋳型を別々の反応チャンバーに加える、外部検量線の設定を必要とする。

米国特許第７，３８７，８８７号 米国特許第８，３９４，６０８号 米国特許第８，８９５，２９５号 米国特許出願第２０１４−０２８３９４５号 ＵＳ２０１５／０１１８７１５号 米国特許第６，６４５，７５８号 米国特許第６，７８０，６１７号 米国特許出願第２０１４／００３８２７２号 米国特許第６，３０３，３０５号

Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、２０１４

この手法は、単一の試験が試料から回答までの解決策を提供するように設計されている、多重化されたＦｉｌｍＡｒｒａｙプラットフォームなどのシステムでは容易に利用可能ではない。ＦｉｌｍＡｒｒａｙシステムでは、第１段階多重反応には単一チャンバーのみが利用可能である２段階の入れ子多重ＰＣＲを用いる。したがって、それぞれのＰＣＲアッセイの外部検量線を含めることはできない。また。単一チャンバー反応では、それぞれのレベルのＣｐ値を得るために参照鋳型の段階希釈を容易に別々に保つことができない。さらに、患者試料からの核酸精製はＦｉｌｍＡｒｒａｙシステムに組み込まれているため、試料主導の核酸抽出のばらつきの効果、およびＰＣＲ、ひいては定量に対する、試料に由来するすべての阻害効果を、外部検量線によって容易に推定することができない。本開示は、複数の標的種の同時定量を提供することができ、また、ＰＣＲ結果におけるアッセイに特異的およびマトリックスに由来する変動の効果も考慮に入れる、多重反応における内部検量線を作成するための方法、システム、およびキットを提供する。また、本開示は、定量のためのプロセス対照または試料プロセス対照の使用も教示する。

本開示の一態様では、第１段階多重増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は複数の標的プライマーを含み、それぞれの標的プライマーは試料中に存在し得る異なる標的を増幅するように構成されており、増幅混合物はそれぞれ異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸および少なくとも１つの定量標準プライマーをさらに含み、定量標準プライマーは定量標準核酸を増幅するように構成されているステップと、第１段階増幅混合物を複数の第２段階の個々の反応へと分割するステップであって、複数の第２段階反応のうちの第１群がそれぞれ、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている少なくとも１つのプライマーを含み、複数の第２段階反応のうちの第２群がそれぞれ、定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている少なくとも１つのプライマーを含んでいるステップと、複数の第２段階の個々の反応を増幅条件に供して、１つまたは複数の標的単位複製配列および複数の定量標準単位複製配列を生じるステップとを含む、試料において定量的２ステップ増幅を行う方法が提供される。

本開示の別の態様では、増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は、試料中に存在し得る標的を増幅するように構成されている一対の標的プライマーを含み、それぞれ異なる既知濃度で提供される複数の定量標準核酸および少なくとも一対の定量標準プライマーをさらに含み、定量標準プライマーは定量標準核酸を増幅するように構成されているステップと、定量標準単位複製配列から検量線を作成するステップと、検量線を使用して標的核酸を定量するステップとを含む、試料において定量的ＰＣＲを行う方法が提供される。

本開示のさらに別の態様では、ａ）前記試料を溶解するステップと、ｂ）前記試料から核酸分子を抽出するステップと、ｃ）核酸増幅を行うステップであって、微生物を前記試料に、ステップａ）の前またはその間に、既知量で試料プロセス対照として加え、試料プロセス対照からの核酸配列が定量標準として役割を果たすことを特徴とするステップとを含む、試料において定量的核酸増幅を行う方法が提供される。また、試料中の核酸を定量する方法における定量標準としての、試料プロセスコントロールの使用も提供される。

本開示のさらに別の態様では、複数対の標的プライマーを含む増幅容器であって、それぞれの標的プライマー対は試料中に存在し得る異なる標的を増幅するように構成されており、増幅混合物は、それぞれ異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸および少なくとも一対の較正用プライマーをさらに含み、較正用プライマーは較正用核酸を増幅するように構成されている、増幅容器と、複数の第２段階の個々の反応ウェル、すなわち、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含む、複数の第２段階反応ウェルのうちの第１群、および較正用核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含む、複数の第２段階反応のうちの第２群とを含む、試料において定量的２ステップＰＣＲを行うための試料容器が提供される。

本開示のさらに別の態様では、定量標準を試料に既知量で加えるステップと、試料プロセス方法を使用して核酸を試料から抽出するステップと、第２の定量標準を試料に第２の既知量で加えるステップと、核酸および定量標準の核酸増幅を行うステップと、定量標準と第２の定量標準との間の増幅の差異を決定するステップであって、差異は試料プロセス方法の効率の指標であるステップとを含む、試料プロセス方法を試験する方法が提供される。

本開示のもう１つの態様では、本明細書中に開示した試料容器を受けるための開口部と、増幅容器を増幅条件に供するための第１の加熱器と、複数の第２段階の個々の反応ウェルを増幅条件に供するための第２の加熱器と、定量標準核酸の増幅を使用して検量線を作成し、それぞれの増幅された標的について定量的または半定量的な結果を出力するようにプログラミングされたコンピュータとを含む、試料において定量的２ステップＰＣＲを行うための機器が提供される。

本発明の実施形態のさらなる特長および利点は、続く説明に記載されている、またはそのような実施形態の実施によって知り得るであろう。そのような実施形態の特長および利点は、添付の特許請求の範囲内で特に指摘する機器および組合せによって実現および獲得し得る。これらおよび他の特長は、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明白となる、または本明細書中に以降記載するそのような実施形態の実施によって知り得るであろう。

上記列挙したものならびに本発明の他の利点および特長を得ることができる様式を記載するために、上に手短に記載した本発明のより詳細な説明は、添付の図面中に例示されている、その具体的な実施形態を参照することによって与えられるであろう。これらの図面は本発明の典型的な実施形態のみを表しており、したがってその範囲を限定するものとみなすべきではないことを理解した上で、添付の図面を使用することで本発明をさらに具体的かつ詳細に説明する。

図１は、本発明の一実施形態による柔軟なパウチを示す図である。 図２Ａ〜Ｂは、一緒になって、本発明の実施形態の一例による図１のパウチを含めた、図１のパウチと共に使用するための機器の分解斜視図を形成する。 図３は、本発明の実施形態の一例による図２Ａのブラダー構成要素を含めた図２Ａ〜Ｂの機器の部分断面図を示し、図１のパウチを破線で示す。 図４は、図２Ｂの機器の例示的な一実施形態で使用するモーターを示す図である。 図５は、４つの異なる予期される合成定量標準の５つの希釈液にわたるＣｐを示す図である。 図６Ａは、図５と同様であるが、定量標準のうちの３つのみのデータを示す図である。図６Ｂは、定量標準の３つすべてからのデータを使用した単一の曲線を示す図である。 図７は、３つの定量標準から作成した曲線に沿ってプロットしたＡ．バウマンニ（ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の検量線を示す図である。ｘ軸は反応に含めたＡ．バウマンニまたは定量標準の量であり、ｙ軸はＣｐである。 図８Ａは、定量標準およびＡ．バウマンニに特異的な外部検量線からの、補正なしの複合検量線を示す図である。図８Ｂは、アッセイに特異的な補正係数を用いた、図８Ａと同じデータを示す図である。 図９は、様々な試料標的における、阻害性マトリックスのＣｐに対する効果を示す図である。 図１０は、Ａ．バウマンニの図９からのデータをプロットした図であり、ｘ軸は阻害性マトリックスの増加する濃度を表し、ｙ軸はＣｐである。 図１１Ａ〜１１Ｄは、固定量のＡ．バウマンニを用いた、３つの定量標準から作成した検量線を示す図である。図１１ＡのデータはＰＢＳ中の試料を用いて作成し、図１１Ｂのデータは阻害性マトリックスの１０×希釈液を使用して作成し、図１１Ｃのデータは阻害性マトリックスの２×希釈液を使用して作成し、図１１Ｄのデータは希釈なしの阻害性マトリックスを使用して作成した。 図１２は、実施例５の実験設計の流れ図である。 図１３は、標準定量曲線を作成するために使用した、合成定量標準の４つの希釈液にわたるＣｐのプロットを示す図である。 図１４は、補正係数（この例示的な実施例では０．４６Ｌｏｇ）を適用したまたは適用していない、合成定量標準（ＱＳ）を用いた定量と試料プロセスコントロール（ＳＰＣ）を用いた定量と相違のボックスプロットの表示を示す図である。

実施形態の例を、添付の図面を参照して以下に記載する。多くの異なる形態および実施形態が本開示の精神および教示から逸脱せずに可能であり、したがって、本開示は、本明細書中に記載する実施形態の例を限定するものとして解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態の例は、本開示が徹底的かつ完全となり、本開示の範囲が当業者に伝わるように提供する。図面中、層および領域の大きさおよび相対的な大きさは、明瞭にするために誇張されている場合がある。説明の全体にわたって、同様の参照番号は同様の要素を指す。

別段に定義しない限りは、本明細書中で使用するすべての用語（技術用語および科学用語が含まれる）は、本開示が関連する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用されている辞書に定義されているものなどの用語は、本出願の状況および関連分野におけるその意味と一貫した意味を有するとして解釈されるべきであり、また、本明細書中に明白にそう定義されていない限り、理想化されたまたは過剰に形式的な意味として解釈されるべきでないことをさらに理解されたい。本明細書中の本発明の説明に使用されている用語法は、特定の実施形態を説明するためのみを目的とし、本発明を限定するものであることを意図しない。本明細書中に記載したものと同様または均等であるいくつかの方法および材料を本開示の実施に使用することができるが、特定の例示的な材料および方法のみを本明細書中に記載する。

本明細書中で言及するすべての出版物、特許出願、特許、または他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。用語法が矛盾する場合は、本明細書が支配する。

装置、システム、方法などを含めた本開示の様々な態様は、１つまたは複数の例示的な実装を参照して例示し得る。本明細書中で使用する用語「例示的な」および「例示的」とは、「一例、事例、または例示として役割を果たすこと」を意味し、必ずしも本明細書中に開示する他の実装よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきでない。さらに、本開示または本発明の「実装」または「実施形態」への参照には、その１つまたは複数の実施形態への具体的な参照が含まれ、その逆もそうであり、また、以下の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される、本発明の範囲を限定せずに例示的な実施例を提供することを意図する。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容により明白にそうでないと指示されない限り、複数の指示対象も含まれることに注意されたい。したがって、たとえば、「ａ タイル」への参照には、１つ、２つ、またはそれより多くのタイルが含まれる。同様に、複数の指示対象への参照は、内容および／または状況による明らかにそうでないと指示されない限り、単一の指示対象および／または複数の指示対象を含むとして解釈されるべきである。したがって、「タイルｓ」への参照は、必ずしも複数のそのようなタイルを必要としない。むしろ、活用とは独立して、１つまたは複数のタイルが本明細書中で企図されることを理解されたい。

本出願全体にわたって使用する言葉「できる（ｃａｎ）」および「し得る（ｍａｙ）」は、義務的な意味（すなわち、必要であることを意味する）ではなく、許可的な意味（すなわち、潜在性を有することを意味する）で使用される。さらに、例示的に、用語「含めること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含むこと（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「によって特徴づけられる」、その変形（たとえば、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」など）、および特許請求の範囲を含めた本明細書中で使用する同様の用語は、包括的および／または開放型であるべきであり、言葉「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその変形（たとえば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）と同じ意味を有するべきであり、追加の列挙していない要素または方法ステップを排除しない。

本明細書中で使用する、「上部」、「下部」、「左」、「右」、「上」、「下」、「上側」、「下側」、「内の」、「外の」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」、「近位」、「遠位」、「順方向」、「逆方向」などの方向用語および／または任意用語等は、相対的な方向および／または配向を示すためだけに使用することができ、他の様式で明細書、発明、および／または特許請求の範囲を含めた本開示の範囲を限定することを意図し得ない。

ある要素が別の要素と、またはそれ「上に（ｏｎ）」「カップリングされている」、「接続されている」、または「応答性である」として参照されている場合、これは、他方の要素と、もしくはそれ上に、直接カップリングされている、接続されている、もしくは応答性であることができる、または介在要素が存在していてもよいことを理解されたい。対照的に、ある要素が別の要素と、またはそれ「上に直接」、「直接カップリングされている」、「直接接続されている」、または「直接応答性である」として参照されている場合、介在要素は存在しない。

本発明の概念の実施形態の例は、実施形態の例の理想化された実施形態（および中間構造）の模式図である断面図を参照して、本明細書中に記載されている。したがって、たとえば製造技法および／または許容誤差の結果としての、図の形状からの変動を予想されたい。したがって、本発明の概念の実施形態の例は、本明細書中に例示した領域の特定の形状に限定されるものとして解釈されるべきでなく、たとえば製造の結果もたらされる形状のずれも含められたい。したがって、図中に例示した領域は模式的な性質のものであり、その形状は、装置の領域の実際の形状を例示することを意図せず、また、実施形態の例の範囲を限定することを意図しない。

様々な要素を説明するために本明細書において用語「第１」、「第２」などを使用し得るが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきではないことを理解されたい。これらの用語は、１つの要素を別の要素から区別するためにのみ使用する。したがって、「第１」の要素は、本実施形態の教示から逸脱せずに「第２」の要素と称することができる。

また、本明細書中に記載の様々な実装は、本開示の範囲から逸脱せずに、記載または開示した任意の他の実装と組み合わせて利用できることも理解されたい。したがって、本開示の特定の実装による生成物、メンバー、要素、装置、器具、システム、方法、プロセス、組成物、および／またはキットは、本開示の範囲から逸脱せずに、本明細書中に開示されている他の実装（システム、方法、器具、および／または同様のものが含まれる）中に記載の特性、特長、構成要素、メンバー、要素、ステップ、および／または同様のものを、含める、取り込む、または他の様式で含むことができる。したがって、１つの実装に関する具体的な特長への参照は、前記実装内のみでの施用に限定されるものとして解釈されるべきでない。

本明細書中で使用する見出しは組織化する目的のみであり、説明または特許請求の範囲の範囲を限定するために使用することを意図しない。理解を容易にするため、可能な場合は、図に共通する同様の要素を指定するために同様の参照番号が使用されている。さらに、可能な場合は、様々な図中で要素に同様の付番を使用している。さらに、特定の要素の代替の構成には、要素番号に付された別々の文字がそれぞれ含まれ得る。

本明細書中で使用する用語「約」とは、およそ、その辺り、大体、またはその前後を意味する。用語「約」を数値範囲と併せて使用する場合、これは、記載した数値の上および下に境界を伸ばすことによってその範囲を修正する。一般に、用語「約」は、５％の変動によって数値を記述した値の上および下に修正するために本明細書中で使用する。そのような範囲が表されている場合、別の実施形態には、一方の特定の値からおよび／または他方の特定の値までが含まれる。同様に、値が近似として表されている場合、先行詞「約」を使用することによって、特定の値が別の実施形態を形成することを理解されたい。それぞれの範囲の端値は、他方の端値に関連して、および他方の端値とは独立して有意であることをさらに理解されたい。

本明細書中で使用する言葉「または（ｏｒ）」とは、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味し、また、そのリストのメンバーの任意の組合せも意味する。

「試料」とは、本明細書中に記載のようにアッセイする、動物、動物からの組織または臓器、細胞（対象内のもの、対象から直接採取したもの、または培養物中に維持されている細胞もしくは培養細胞系からの細胞のいずれか）、細胞溶解液（もしくは溶解物画分）または細胞抽出物、細胞、細胞物質、またはウイルス物質に由来する１つもしくは複数の分子（たとえば、ポリペプチドもしくは核酸）を含有する溶液、あるいは、天然に存在しない核酸、例示的にはｃＤＮＡまたは次世代シーケンシングライブラリを含有する溶液を意味する。また、試料は、宿主もしくは病原体の細胞、細胞成分、または核酸を含有していても含有していなくてもよい、任意の体液または排泄物（たとえば、それだけには限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁、もしくは脳脊髄液）であり得る。

本明細書中で使用する語句「核酸」とは、ＤＮＡであれＲＮＡであれＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであれ、一本鎖であれ二本鎖であれ、センスであれアンチセンスであれ、ワトソン−クリック塩基対合によって相補的核酸にハイブリダイゼーションすることができる、天然に存在するまたは合成のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいう。また、本発明の核酸には、ヌクレオチド類似体（たとえばＢｒｄＵ）、修飾または処理した塩基、および非リン酸ジエステルヌクレオシド間結合（たとえば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはチオジエステル結合）も含めることができる。特に、核酸には、それだけには限定されないが、コード領域または非コード領域を含めた、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどのすべてのＲＮＡ種を含めたＲＮＡ、またはその任意の組合せを含めることができる。

「プローブ」、「プライマー」、または「オリゴヌクレオチド」とは、相補的配列（「標的」）を含有する第２の核酸分子と塩基対合することができる、定義された配列の一本鎖核酸分子を意味する。生じるハイブリッドの安定性は、長さ、ＧＣ含有率、および起こる塩基対合の程度に依存する。塩基対合の程度は、プローブと標的分子との間の相補性の度合およびハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの度合などのパラメータによって影響を受ける。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーの度合は、温度、塩濃度、およびホルムアミドなどの有機分子の濃度などのパラメータによって影響を受け、当業者に知られている方法によって決定される。プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドは、放射的、蛍光的、または非放射的のいずれかで、当業者に周知の方法によって検出可能に標識し得る。ｄｓＤＮＡ結合色素を使用してｄｓＤＮＡを検出し得る。「プライマー」はポリメラーゼによって伸長されるように具体的に構成されている一方で、「プローブ」または「オリゴヌクレオチド」はそのように構成されていても構成されていなくてもよいことが理解されよう。プローブとして、オリゴヌクレオチドは、当技術分野で知られている多くの蛍光ＰＣＲプライマーおよびプローブに基づく化学の一部として使用することができ、これには、蛍光消光および／または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）立体構造の使用を共有するもの、たとえば、天然または修飾塩基を有するものを含めた、５’ヌクレアーゼプローブ（ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ）、二重ハイブリダイゼーションプローブ（ＨｙｂＰｒｏｂｅｓ（商標））、またはＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブもしくは分子ビーコン、またはＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（商標）アッセイ、たとえばＳｃｏｒｐｉｏｎｓ（商標）、ＬＵＸ（商標）またはＱＺｙｍｅ（商標）ＰＣＲプライマーが含まれる。

「ｄｓＤＮＡ結合色素」とは、二本鎖ＤＮＡと結合した場合に、一本鎖ＤＮＡと結合した場合または溶液中に遊離している場合とは異なった蛍光を発する色素を意味し、通常はより強力な蛍光を発することによって異なる。ｄｓＤＮＡ結合色素に言及するが、本発明において任意の適切な色素を使用し得ることが理解されよう。一部の非限定的な例示的な色素は、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第７，３８７，８８７号に記載されている。当技術分野で知られているように、例示的には酵素、抗体などの他のシグナル生成物質を、核酸増幅および融解を検出するために使用し得る。

「特異的にハイブリダイズする」とは、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが高ストリンジェンシー条件下で実質的に相補的な核酸（たとえば試料核酸）を認識してそれと物理的に相互作用し（すなわち塩基対合する）、他の核酸とは実質的に塩基対合しないことを意味する。

「高ストリンジェンシー条件」とは、およその融解温度（Ｔｍ）−５℃（すなわち、核酸のＴｍの５度下）を意味する。機能的には、高ストリンジェンシー条件を、少なくとも８０％の配列同一性を有する核酸配列を同定するために使用する。

ＰＣＲが本明細書中の実施例で使用する増幅方法であるが、プライマーを使用する任意の増幅方法が適切であり得ることが理解されよう。そのような適切な手順には、任意の種類（１ステップ、２ステップ、または他のもの）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、カスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）、ループ媒介性等温ＤＮＡ増幅（ＬＡＭＰ）、等温およびキメラプライマー惹起の核酸増幅（ＩＣＡＮ）、標的に基づくヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、次世代シーケンシング技法などが含まれる。したがって、用語ＰＣＲを使用する場合、アミノ酸定量方法を含めた他の代替増幅方法が含まれることを理解されたい。別々のサイクルを用いない増幅方法では、測定をサイクルまたはＣｐで行う反応時間を使用してもよく、本明細書中に記載の実施形態において追加のＰＣＲサイクルを追加する場合は追加の反応時間を追加してもよい。必要に応じてプロトコルを調節する必要があり得ることが理解されよう。

「試料プロセスコントロール」とは、生きているかどうかにかかわらず病原体、微生物、細胞、核酸、あるいは、病原体もしくはその一部分または核酸および試料のワークフロー中のその挙動を模倣する能力を保有する天然または合成の任意の粒子を意味する。試料プロセスコントロールは、例示的には試料が正しく溶解されたこと、潜在的に感染性のある標的病原体の核酸が正しく抽出および精製されていること、ならびに標的病原体の特定の配列の正しい増幅および検出が起こっていることを確実にするために、多くの場合、試料が従うワークフローのステップの一部またはすべてをコントロールするために既知量で装置に含められる。

例示的には、試料プロセスコントロールとして使用する微生物（例示的にはシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ポンベ）は、検出および定量する標的微生物をできる限り厳密に模倣する。試料プロセスコントロール粒子は、検出する病原体の構造（膜および／またはカプシドおよび／または外被など）を再生して、ワークフローに沿った病原体およびその標的核酸の挙動を模倣することを可能にし得る。試料プロセスコントロールの目的は、標的の溶解および核酸抽出の収率が試料プロセスコントロールの収率と同様であり、また、最適な増幅／検出が保証されるように精製した核酸が適切に加工されることを確実にすることである。定性的な結果には、病原体を陽性もしくは陰性として報告することができる、またはランコントロールが失敗した場合は不確定として報告し得る。試料プロセスコントロールはいくつかのランコントロールのうちの１つであってよく、また、一部の阻害性の条件は抽出、精製、またはＰＣＲ増幅／検出の収率を減少させる場合があるため、これはランの正当性を実証するために陽性、場合によっては指定の範囲内であるべきである。試料プロセスコントロールを使用してこの種類の阻害をモニタリングすることができ、収率の低下は試料プロセスコントロールと標的病原体との間で同様である。定性的な結果では、そのような阻害は、検出されなかった場合に偽陰性結果をもたらす場合がある。定量的な結果では、ワークフローのステップのうちの１つの阻害は、少なく推定された定量的結果をもたらす場合がある。したがって、本発明のいくつかの例示的な実施形態は、以下の少なくとも２つの目的のために、少なくとも１つの試料プロセスコントロール（ＳＰＣ）を使用する：
１）ワークフローをコントロールし、その正当性を実証するため（上述のＳＰＣの古典的な役割）、および
２）試験した試料中の標的核酸の定量を援助するため（定量標準としても使用されるＳＰＣの新しい役割）。

例示的には、ＳＰＣは試料を供するプロセスの一部またはすべてに従う。したがって、ＳＰＣは試料の溶解ステップの前またはその間に加え得る。試料プロセスコントロールは標的病原体の種類に基づいて選択し得る。たとえば、ＰｈｉＸ１７４としてのバクテリオファージを、ウイルスを焦点としたアッセイに選択することができ、バクテリオファージは、広範な細菌および酵母の定量アッセイにおいて使用するための、標的ウイルスまたはＳ．ポンベなどの酵母を模倣するための良好な候補である。

単一の病原体を検出する場合、２つの増幅アッセイ、例示的にはＰＣＲアッセイ（標的病原体および試料プロセスコントロールを定量標準として使用する）は、同じまたは同様の熱力学的特徴に達し、合成定量標準を使用して正確な定量が可能となるように（実施例５のように）設計することができる。

複数の病原体の定量（すなわち多重増幅）では、増幅アッセイ、例示的にはそれぞれの病原体のＰＣＲアッセイのプロトコルを用いて、試料プロセスコントロールの増幅プロトコル、例示的にはＰＣＲ設計に当てはめて、同じ熱力学的特徴を得ることは、例示的には配列の可変性および単位複製配列の長さが原因で困難な場合がある。その結果、異なる標的病原体のＰＣＲ効率は異なり得る。この目的のために、定量標準および移入（ｉｍｐｏｒｔｅｄ）検量線で得られた定量を相関させる補正係数を、それぞれの病原体について計算することができる。

合成定量標準の代わりに、既知の濃度を有する既知の天然微生物に対して、または他の天然に存在する核酸鋳型に対して較正を行うことができる。

また、本発明の別の実施形態では、試料プロセスコントロールが、当技術分野で知られているように蛍光、放射、化学発光、酵素などで標識した配列特異的プローブなどの既知の同定技法によって同定できる限りは、少なくとも２つの異なる、例示的には３つまたは４つの異なる試料プロセスコントロールを用いた任意の増幅システムにおいて、病原体の信頼性のある定量を行うことも可能である。

本明細書中の様々な実施例はヒト標的およびヒト病原体を参照とするが、これらの実施例は例示的のみである。本明細書中に記載の方法、キット、および装置を使用して、ヒト、獣医学的、工業的、および環境的なものを含めた幅広い種類の試料からの幅広い種類の核酸配列を検出および配列決定し得る。

本明細書中に開示する様々な実施形態は、試料を、様々な生物学的物質、例示的には抗原および核酸配列の存在について、例示的には単一の閉鎖システムにおいてアッセイするために、自己充足型の核酸分析パウチを使用する。パウチおよびパウチと共に使用するための機器を含めたそのようなシステムは、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第８，３９４，６０８号、第８，８９５，２９５号、および米国特許出願第２０１４−０２８３９４５号により詳細に開示されている。しかし、そのような機器およびパウチは例示的のみであり、本明細書中に記述する核酸調製物および増幅反応は、９６ウェルプレート、他の構成のプレート、アレイ、カルーセルなどを含めた当技術分野で知られている様々な開放または閉鎖システムの試料容器のうちの任意のものにおいて、当技術分野で知られている様々な核酸精製および増幅システムを使用して行い得ることが理解されよう。用語「試料ウェル」、「増幅ウェル」、「増幅容器」などを本明細書中で使用するが、これらの用語は、これらの増幅システムにおいて使用されるウェル、チューブ、および様々な他の反応容器を包含することを意味する。そのような増幅システムには、増幅容器における単一の多重ステップが含まれていてよく、任意選択で、複数の個々の反応ウェルにおける複数の第２段階の個々または低次の多重反応が含まれていてよい。一実施形態では、パウチを複数の病原体のアッセイに使用する。パウチには、例示的には閉鎖システムにおいて、試料ウェルとして使用する１つまたは複数のブリスターが含まれていてよい。例示的には、核酸の調製、一次大量多重ＰＣＲ、一次増幅産物の希釈、および二次ＰＣＲが含まれ、融解曲線分析などの任意選択のリアルタイム検出または増幅後分析に終わる様々なステップを、任意選択で使い捨てのパウチにおいて行い得る。さらに、様々なステップを本発明のパウチにおいて行い得るが、特定の使用のためにステップのうちの１つまたは複数を省略してもよく、それに応じてパウチの構成を変更してもよいことが理解されよう。

図１は、様々な実施形態において使用し得る、または様々な実施形態のために再構成し得る例示的なパウチ５１０を示す。パウチ５１０は米国特許第８，８９５，２９５号の図１５と同様であり、同様の項目は同じように番号付けられている。取付物（ｆｉｔｍｅｎｔ）５９０には受入チャネル５１５ａ〜５１５ｌが備えられており、これは試薬リザーバーまたは廃棄物リザーバーとしても役割を果たす。例示的には、試薬を取付物５９０内で凍結乾燥させ、使用前に再水和させ得る。そのそれぞれのチャネル５１４、５３８、５４３、５５２、５５３、５６２、および５６５を備えたブリスター５２２、５４４、５４６、５４８、５６４、および５６６は、米国特許第８，８９５，２９５号の図１５の同じ番号のブリスターと同様のものである。図１の第２段階反応区域５８０は米国特許出願第８，８９５，２９５号のそれと同様のものであるが、高密度アレイ５８１の第２段階ウェル５８２は若干異なるパターンで配置されている。図１の高密度アレイ５８１のより円形なパターンは角のウェルを排除し、第２段階ウェル５８２のより均一な充填をもたらし得る。示すように、高密度アレイ５８１は１０２個の第２段階ウェル５８２を備えている。パウチ５１０はＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）機器（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ、ユタ州Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ）における使用に適している。しかし、パウチの実施形態は例示的のみであることが理解されよう。

他の容器を使用してもよいが、例示的には、パウチ５１０は、押出し成形、プラズマ堆積、およびラミネート加工を含めた当技術分野で知られている任意のプロセスによって作製することができる、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、およびその混合物などの、２層の柔軟なプラスチックフィルムまたは他の柔軟な材料から形成される。また、金属箔またはアルミニウムラミネート加工を施したプラスチックも使用し得る。一緒に密封してブリスターおよびチャネルを形成することができる、他の障壁材料が当技術分野で知られている。プラスチックフィルムを使用する場合、層は、例示的には熱密封によって一緒に結合させ得る。例示的には、材料は低い核酸結合能力を有する。

蛍光モニタリングを用いた実施形態では、動作波長で吸光度が十分に低く、自己蛍光であるプラスチックフィルムが好ましい。そのような材料は、様々なプラスチック、様々な可塑化剤、および複合比、ならびに様々なフィルム厚を試験することによって同定することができる。アルミニウムまたは他の箔のラミネート加工を施したプラスチックでは、蛍光検出装置によって読み取らせるパウチの部分は、箔を施さないままにすることができる。たとえば、蛍光をパウチ５１０の第２段階反応区域５８０の第２段階ウェル５８２中でモニタリングする場合、ウェル５８２の一方または両方の層を、箔を施さないままにする。ＰＣＲの例では、約０．００４８インチ（０．１２１９ｍｍ）の厚さのポリエステル（Ｍｙｌａｒ、ＤｕＰｏｎｔ、デラウェア州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）および０．００１〜０．００３インチ（０．０２５〜０．０７６ｍｍ）の厚さのポリプロピレンフィルムから構成されるフィルムラミネートが良好な性能である。例示的には、パウチ５１０は、入射光の約８０％〜９０％を透過することができる透明な材料から作製される。

例示的な実施形態では、材料は、圧力、例示的には空気圧をブリスターおよびチャネルにかけることによって、ブリスター間を移動させる。したがって、圧力を用いる実施形態では、パウチ材料は、例示的には圧力が所望の効果を有するよう十分に柔軟である。用語「柔軟な」は、パウチの材料の物理的特徴を説明するために本明細書中で使用する。用語「柔軟な」とは、本明細書中において、亀裂、破損、ひび割れなどなしに、本明細書中で使用する圧力のレベルによって容易に変形可能であることとして定義される。たとえば、Ｓａｒａｎ（登録商標）ラップおよびＺｉｐｌｏｃ（商標）バッグなどの薄いプラスチックシート、ならびにアルミニウム箔などの薄い金属箔が柔軟である。しかし、空気圧を用いる実施形態においてでも、ブリスターおよびチャネルの特定の領域のみが柔軟である必要がある。さらに、ブリスターおよびチャネルが容易に変形可能である限りは、ブリスターおよびチャネルの片側のみが柔軟である必要がある。パウチ５１０の他の領域は強固な材料で作製されていてもよく、または強固な材料で補強されていてもよい。

例示的には、プラスチックフィルムをパウチ５１０に使用する。金属、例示的にはアルミニウム、または他の適切な材料のシートを、圧延または他の様式で切断して、隆起した表面のパターンを有する型を作製し得る。例示的には１９５℃の動作温度で調節される空気プレス（例示的にはＡ−５３０２−ＰＤＳ、Ｊａｎｅｓｖｉｌｌｅ Ｔｏｏｌ Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍｉｌｔｏｎ）にはめ込んだ際、空気プレスは印刷機のように作動し、型がフィルムと接触した箇所のみでプラスチックフィルムの密封表面を融解させる。パウチ５１０が形成されるにつれ、ＰＣＲプライマー（例示的にはフィルム上にスポットして乾燥させる）、抗原結合基質、磁気ビーズ、およびケイ酸ジルコニウムビーズなどの様々な構成要素を様々なブリスター内に密封し得る。試料プロセス用の試薬は、密封の前にまとめてまたは別々にフィルム上にスポットすることができる。一実施形態では、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）をポリメラーゼおよびプライマーとは別々にフィルム上にスポットし、これにより、水性試料によって水和されるまでポリメラーゼの活性が本質的に排除される。水性試料を水和の前に加熱した場合、これは真のホットスタートＰＣＲの条件を作り出し、高価なホットスタート化学構成要素の必要性を低下または排除する。

パウチ５１０は、米国特許第８，８９５，２９５号に記載のものと同様の様式で使用し得る。例示的な一実施形態では、試験する試料（１００μｌ）および溶解緩衝液（２００μｌ）を含む３００μｌの混合物を、受入チャネル５１５ａ付近の取付物５９０の注入口（示さず）内に注入し、試料混合物を受入チャネル５１５ａ内に引き込む。また、水も、受入チャネル５１５ｌに隣接する取付物５９０の第２の注入口（示さず）内に注入し、取付物５９０に備えられたチャネル（示さず）を介して分配され、これにより、それぞれが受入チャネル５１５ｂ〜５１５ｌから乾燥形態で既に提供されている１１個の異なる試薬が水和される。これらの試薬には、例示的には、凍結乾燥したＰＣＲ試薬、ＤＮＡ抽出試薬、洗浄溶液、免疫アッセイ試薬、または他の化学物質が含まれ得る。例示的には、試薬は、核酸抽出、第１段階多重ＰＣＲ、多重反応の希釈、および第２段階ＰＣＲ試薬の調製、ならびに対照反応のためのものである。図１に示す実施形態では、注入する必要があるのは、一方の注入口からの試料溶液および他方の注入口からの水だけである。注入後、２つの注入口を密封し得る。パウチ５１０および取付物５９０の様々な構成のさらなる情報には、既に参考として組み込まれている米国特許第８，８９５，２９５号を参照されたい。

注入後、試料は、チャネル５１４を介して注入チャネル５１５ａから溶解ブリスター５２２へと移動する。溶解ブリスター５２２はセラミックビーズなどのビーズまたは粒子５３４を備えており、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）機器内に備えられた回転刃またはパドルを使用した、衝撃による渦撹拌用に構成されている。ケイ酸ジルコニウム（ＺＳ）ビーズ５３４などの溶解粒子の存在下で振盪または渦撹拌することによるビーズミリングは、溶解物を形成するために有効な方法である。本明細書中で使用する「溶解する」、「溶解すること」、および「溶解物」などの用語は細胞を破裂させることに限定されず、そのような用語には、ウイルスなどの非細胞性粒子の破壊が含まれることが理解されよう。

図４は、図２Ａ〜Ｂに示す機器８００の、支持メンバー８０２の第１の側面８１１上に搭載され得る刃８２１を備えた、ビーズ殴打モーター８１９を示す。刃は、スロット８０４を通って伸びて、パウチ５１０と接触し得る。しかし、モーター８１９は機器８００の他の構造上に搭載されていてもよいことが理解されよう。例示的な一実施形態では、モーター８１９は、支持メンバー８０２上に搭載されたＭａｂｕｃｈｉ ＲＣ−２８０ＳＡ−２８６５ ＤＣモーター（日本、千葉）である。例示的な一実施形態では、モーターは、５，０００〜２５，０００ｒｐｍ、より例示的には１０，０００〜２０，０００ｒｐｍ、さらにより例示的には約１５，０００〜１８，０００ｒｐｍで回転させる。Ｍａｂｕｃｈｉモーターでは、７．２Ｖが溶解に十分なｒｐｍをもたらすことが見いだされている。しかし、刃８２１がパウチ５１０に衝撃を与えている際、実際の速度は若干遅い場合があることが理解されよう。使用するモーターおよびパドルに応じて、他の電圧および速度を溶解に使用し得る。任意選択で、制御された少量の空気を、溶解ブリスター５２２に隣接するブラダー８２２内に提供し得る。一部の実施形態では、隣接ブラダーに１つまたは複数の小量の空気を部分的に充填することで、溶解プロセス中の溶解ブリスターの位置決めおよび支持が助けられることが判明している。あるいは、他の構造、例示的には溶解ブリスター５２２の周りの強固なもしくは準拠ガスケットまたは他の保持構造を使用して、溶解中にパウチ５１０を拘束することができる。また、モーター８１９は例示的のみであり、他の装置を試料のミリング、振盪、または渦撹拌に使用し得ることも理解されたい。

細胞が十分に溶解した後、試料はチャネル５３８、ブリスター５４４、およびチャネル５４３を通ってブリスター５４６へと移動し、ここで試料は、シリカでコーティングされた磁気ビーズ５３３などの核酸結合物質と混合される。混合物を適切な時間、例示的には約１０秒間〜１０分間の間インキュベートさせる。ブリスター５４６に隣接する機器内に位置する格納式の磁石が磁気ビーズ５３３を溶液から捕捉し、ブリスター５４６の内側表面に対してペレットを形成する。その後、液体はブリスター５４６から移動して出ていき、ブリスター５４４を通って戻り、今度は廃棄物貯蔵器として使用されるブリスター５２２内に入る。注入チャネル５１５ｃ〜５１５ｅのうちの１つまたは複数からの１つまたは複数の洗浄バッファーが、ブリスター５４４およびチャネル５４３を介してブリスター５４６へと提供される。任意選択で、磁石は格納され、磁気ビーズ５３３は、チャネル５４３を介してブリスター５４４および５４６からビーズを往復して動かすことによって洗浄される。磁気ビーズ５３３を洗浄した後、磁石の稼働によって磁気ビーズ５３３をブリスター５４６中に再補足し、その後、洗浄溶液をブリスター５２２に移動する。このプロセスを必要に応じて繰り返して、溶解緩衝液および試料細片を核酸結合磁気ビーズ５３３から洗浄し得る。

洗浄後、注入チャネル５１５ｆで保管されている溶出緩衝液をブリスター５４８に移動し、磁石を格納する。溶液を、チャネル５５２を介してブリスター５４６と５４８との間で循環させ、ブリスター５４６中の磁気ビーズ５３３のペレットを解体し、捕捉された核酸をビーズから解離させて溶液内に入れる。磁石を再度稼働させ、磁気ビーズ５３３をブリスター５４６中に捕捉し、溶出された核酸溶液をブリスター５４８内に移動する。

注入チャネル５１５ｇからの第１段階ＰＣＲマスターミックスをブリスター５４８中の核酸試料と混合する。任意選択で、混合物を、チャネル５５３を介して５４８と５６４との間を強制することによって混合する。数サイクルの混合の後、溶液はブリスター５６４内に包含され、ここで第１段階ＰＣＲプライマーのペレット（それぞれの標的について少なくとも１組のプライマー）が提供され、第１段階多重ＰＣＲを行う。ＲＮＡ標的が存在する場合、第１段階多重ＰＣＲの前またはそれと同時に逆転写（ＲＴ）ステップを行い得る。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）機器における第１段階多重ＰＣＲの温度サイクルを例示的には１５〜３０サイクル行うが、具体的な応用の要件に応じて他のレベルの増幅も望ましい場合がある。第１段階ＰＣＲマスターミックスは、当技術分野で知られている様々なマスターミックスのうちの任意のものであり得る。例示的な一実施例では、第１段階ＰＣＲマスターミックスは、１サイクルあたり２０秒以下かかるＰＣＲプロトコルで使用するための、本明細書中に参考として組み込まれているＵＳ２０１５／０１１８７１５号に開示されている化学物質のうちの任意のものであり得る。

第１段階ＰＣＲが所望のサイクル数進行した後、例示的には試料のほとんどをブリスター５４８内に強制して戻し、少量のみをブリスター５６４内に残し、第２段階ＰＣＲマスターミックスを注入チャネル５１５ｉから加えることによって、試料を希釈し得る。あるいは、５１５ｉからの希釈緩衝液をブリスター５６６に移動し、その後、液体をブリスター５６４と５６６との間で往復移動させることによって、ブリスター５６４中の増幅試料と混合し得る。所望する場合は、注入チャネル５１５ｊおよび５１５ｋからの希釈緩衝液を使用して希釈を数回繰り返してもよく、または、注入チャネル５１５ｋをシーケンシングもしくは他のＰＣＲ後分析用に取っておき、その後、第２段階ＰＣＲマスターミックスを注入チャネル５１５ｈから希釈した増幅試料の一部もしくはすべてに加えてもよい。希釈ステップの数を変更することによって、または、希釈緩衝液もしくは第２段階ＰＣＲマスターミックスと混合する前に廃棄される試料の百分率を変更することによって、希釈のレベルを調節し得ることが理解されよう。ここで、第２段階ＰＣＲマスターミックスとは、増幅の構成要素、例示的にはポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および適切な緩衝液を含むが、特に非ＰＣＲ増幅方法では他の構成要素も適切であり得る。所望する場合は、この試料と第２段階ＰＣＲマスターミックスとの混合物は、第２段階増幅のために第２段階ウェル５８２に移動する前に、ブリスター５６４中で予熱し得る。そのような予熱は、第２段階ＰＣＲ混合物においてホットスタート構成要素（抗体、化学物質、または他のもの）の必要性を除去し得る。

例示的な第２段階ＰＣＲマスターミックスはプライマー対を欠いており、不完全であり、１０２個の第２段階ウェル５８２のそれぞれに特定のＰＣＲプライマー対（または場合によっては複数対のプライマー）を事前に載せる。所望する場合は、第２段階ＰＣＲマスターミックスは他の反応構成要素を欠いている場合があり、これらの構成要素も第２段階ウェル５８２に事前に載せてもよい。それぞれのプライマー対は、第１段階ＰＣＲプライマー対と同様もしくは同一であり得るか、または第１段階プライマー対内に入れ子状態であり得る。ブリスター５６４から第２段階ウェル５８２への試料の移動により、ＰＣＲ反応混合物が完成する。高密度アレイ５８１を充填した後、当技術分野で知られている多数の手段によって、個々の第２段階反応をそのそれぞれの第２段階ブリスター中に密封する。相互汚染なしに高密度アレイ５８１を充填および密封する例示的な方法は、既に参考として組み込まれている米国特許第８，８９５，２９５号に記述されている。例示的には、高密度アレイ５８１のウェル５８２中の様々な反応を、例示的には１つまたは複数のペルチェ装置を用いて同時に熱サイクルするが、熱サイクルの他の手段が当技術分野で知られている。

特定の実施形態では、第２段階ＰＣＲマスターミックスは、増幅のシグナル指標を生成するためにｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（商標）Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ）を含有する。しかし、この色素は例示的のみであり、他のｄｓＤＮＡ結合色素、および当技術分野で知られているように蛍光、放射、化学発光、酵素などで標識したプローブを含めた他のシグナルを使用し得ることが理解されよう。あるいは、アレイ５８１のウェル５８２をシグナルなしで提供してもよく、結果は続くプロセスで報告される。

空気圧を使用してパウチ５１０内の材料を移動させる場合、一実施形態では「ブラダー」を用い得る。その一部分が図２Ａ〜Ｂおよび３に示されているブラダーアセンブリ８１０には、そのそれぞれが例示的には圧縮ガス源によって個々に膨らませることができる、複数の膨張可能なブラダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、および８６６を収容するブラダープレート８２４が含まれる。ブラダーアセンブリ８１０は圧縮ガスに供して複数回使用し得るため、ブラダーアセンブリ８１０はパウチよりも丈夫または厚い材料で作製し得る。あるいは、ブラダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、および８６６は、ガスケット、シール、弁、およびピストンで一緒に固定された一連のプレートから形成され得る。他の配置が本発明の範囲内である。

二次ＰＣＲ反応の成功は、多重第１段階反応によって作製される鋳型に依存する。典型的には、高純度のＤＮＡを使用してＰＣＲを行う。フェノール抽出または市販のＤＮＡ抽出キットなどの方法が高純度のＤＮＡを提供する。パウチ５１０によって処理された試料は、より純度の低い調製物を補うために適応が必要であり得る。ＰＣＲは潜在的な障害物である生体試料の構成要素によって阻害され得る。例示的には、より低い核酸純度を補うために、ホットスタートＰＣＲ、より高濃度のｔａｑポリメラーゼ酵素、ＭｇＣｌ_２濃度の調節、プライマー濃度の調節、アジュバント（ＤＭＳＯ、ＴＭＳＯ、またはグリセロールなど）の添加を任意選択で使用し得る。純度の問題は第１段階増幅および単一段階ＰＣＲでより懸案事項となり得るが、第２段階増幅においても同様の調節を提供し得ることが理解されよう。

機器８００内にパウチ５１０を配置する際、ブラダーアセンブリ８１０がパウチ５１０の１つの面に押し付けられるため、１つの特定のブラダーを膨らませた場合、圧力がパウチ５１０中の対応するブリスターから液体を強制的に出させる。パウチ５１０のブリスターの多くに対応するブラダーに加えて、ブラダーアセンブリ８１０は、パウチ５１０の様々なチャネルに対応する、ブラダーまたは空気駆動のピストンなどの追加の空気アクチュエータを有し得る。図２Ａ〜Ｂおよび３は、パウチ５１０のチャネル５３８、５４３、５５３、および５６５に対応する例示的な複数のピストンまたはハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、および８６５、ならびに取付物５９０内への逆流を最小限にするシール８７１、８７２、８７３、８７４を示す。稼働させた場合、ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、および８６５は、対応するチャネルをくびれ切って閉鎖させるピンチ弁を形成する。パウチ５１０の特定のブリスター内に液体を閉じ込めるためには、アクチュエータがチャネルを挟んで閉じるためのピンチ弁として役割を果たすように、ブリスターに通じるチャネルにわたってハードシールを稼働させる。例示的には、異なるブリスター中の２つの体積の液体を混合するためには、接続するチャネルを密封するピンチ弁アクチュエータを稼働させ、ブリスターにわたる空気ブラダーが交互に加圧され、液体がブリスターを接続するチャネルを通って往復してそれ中の液体を混合するように強制する。ピンチ弁アクチュエータは様々な形状および大きさであってよく、また、一度に複数のチャネルをくびれ切るように構成されていてよい。空気アクチュエータを本明細書中で記述するが、リニアステッパーモーター、電動カム、空気、水圧、または電磁気力によって駆動される強固なパドル、ローラー、ロッカーアーム、および一部の事例ではコックばね（ｃｏｃｋｅｄ ｓｐｒｉｎｇ）などの様々な電気機械アクチュエータを含めた、パウチに圧力をもたらす他の方法が企図されることが理解されよう。さらに、チャネルの軸に垂直に圧力を与えることに加えて、チャネルを可逆的または不可逆的に閉じる様々な方法が存在する。これらには、バッグをチャネルに横断してねじらせること、熱密封、アクチュエータのローリング、ならびにバタフライ弁およびボール弁などのチャネル内に密封された様々な物理的弁が含まれる。さらに、小さなペルチェ装置または他の温度調節器をチャネルに隣接して配置し、流体を凍結させるための十分な温度に設定して、シールを有効に形成し得る。また、図１の設計はブリスターおよびチャネルのそれぞれの上方に配置されたアクチュエータ要素を特長とする自動機器に適応しているが、少数のアクチュエータを試料破壊、核酸捕捉、第１および第２段階ＰＣＲ、ならびに免疫アッセイおよび免疫ＰＣＲなどのパウチ５１０の他の応用を含めたプロセスステーションのうちのいくつかで使用できるように、アクチュエータを不動に保ち、パウチ５１０を一次元または二次元で移行させることも企図される。チャネルおよびブリスターに作用するローラーは、パウチ５１０がステーション間で平行移動する構成において特に有用性が証明される可能性がある。したがって、空気アクチュエータを本明細書中に開示した実施形態において使用するが、本明細書中で用語「空気アクチュエータ」を使用した場合、パウチおよび機器の構成に応じて他のアクチュエータおよび圧力を提供する他の方法を使用し得ることが理解されよう。

他の従来技術の機器は、密封された柔軟な容器内のＰＣＲを教示している。たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，６４５，７５８号および第６，７８０，６１７号、ならびに米国特許出願第２０１４／００３８２７２号を参照されたい。しかし、細胞溶解を密封されたＰＣＲ容器内に含めることは、特に試験する試料が生物災害を含有し得る場合は、使いやすさおよび安全性を改善させる場合がある。本明細書中に例示する実施形態では、細胞溶解およびすべての他のステップからの廃棄物は、パウチ内に密封して保たれる。しかし、パウチの内容物をさらなる試験のために取り出すことができることが理解されよう。

図２Ａ〜Ｂはパウチ５１０で使用できる例示的な機器８００を示す。機器８００には、ケーシングの壁を形成することができる、またはケーシング内に搭載することができる支持メンバー８０２が含まれる。また、機器８００には、パウチ５１０の挿入および取出しを可能にするために、支持メンバー８０２に対して任意選択で移動可能な第２の支持メンバー（示さず）も含まれ得る。例示的には、パウチ５１０が機器８００内に挿入された後、蓋がパウチ５１０を覆い得る。別の実施形態では、両方の支持メンバーが固定されていてよく、パウチ５１０は他の機械的手段または空気圧によってそこに保たれている。

例示的な実施例では、加熱器８８６および８８８は支持メンバー８０２上に搭載されている。しかし、この配置は例示的のみであり、他の配置が可能であることが理解されよう。ブラダープレート８１０は、ブラダー８２２、８４４、８４６、８４８、８６４、８６６、ハードシール８３８、８４３、８５２、８５３、シール８７１、８７２、８７３、８７４と共にブラダーアセンブリ８０８を形成し、例示的には、空気アクチュエータがパウチ５１０と接触して配置されるように、パウチ５１０に向かって移動し得る移動可能な支持構造上に搭載され得る。パウチ５１０が機器８００内に挿入されており、移動可能な支持メンバーが支持メンバー８０２に向かって移動している場合、空気アクチュエータの稼働がパウチ５１０のブリスターのうちの１つもしくは複数から液体を強制的に出させ得る、またはパウチ５１０の１つもしくは複数のチャネルと共にピンチ弁を形成し得るように、パウチ５１０の様々なブリスターは、ブラダーアセンブリ８１０の様々なブラダーおよびアセンブリ８０８の様々なシールに隣接して配置されている。パウチ５１０のブリスターとチャネルおよびアセンブリ８０８のブラダーとシールの関係は、図３により詳細に例示されている。

それぞれの空気アクチュエータは弁８９９を介して圧縮空気源８９５に接続されている。いくつかのホース８７８のみが図２Ａ〜Ｂに示されているが、それぞれの空気取付物はホース８７８を介して圧縮ガス源８９５に接続されていることが理解されよう。圧縮ガス源８９５はコンプレッサーであり得るか、または、圧縮ガス源８９５は二酸化炭素シリンダーなどの圧縮ガスシリンダーであり得る。可搬性が所望される場合は圧縮ガスシリンダーが特に有用である。他の圧縮ガス源が本発明の範囲内である。

アセンブリ８０８は例示的に移動可能な支持メンバー上に搭載されているが、他の構成が可能であることが理解されよう。

また、機器８１０のいくつかの他の構成要素も圧縮ガス源８９５に接続されている。支持メンバー８０２の第２の側面８１４上に搭載されている磁石８５０は、例示的にはホース８７８を介して圧縮ガス源８９５からのガスを使用して配備および格納されるが、磁石８５０を移動する他の方法が当技術分野で知られている。磁石８５０は支持メンバー８０２の凹部８５１に位置する。凹部８５１は、磁石８５０がパウチ５１０のブリスター５４６と接触できるように、支持メンバー８０２を貫く通路であることができることが理解されよう。しかし、磁石８５０が配備された際、磁石８５０がブリスター５４６で十分な磁場を提供するように十分に近く、磁石８５０が格納された際、磁石８５０はブリスター５４６中に存在するどの磁気ビーズ５３３にも顕著な影響を与えない限り、支持メンバー８０２の材料に応じて、凹部８５１は支持メンバー８０２全体にわたって伸びる必要がないことが理解されよう。磁石８５０の格納に言及するが、電磁石を使用してよく、電磁石を通る電気流を制御することによって電磁石を稼働および非稼働にしてよいことが理解されよう。したがって、本明細書では磁石の取除きまたは格納を記述するが、これらの用語は、磁場を取り除く他の方法を包含するほど十分に幅広いことが理解されよう。空気接続は空気ホースまたは空気分流板であってよく、したがって必要なホースまたは弁の数が減らされることが理解されよう。

また、空気ピストンアレイ８６９の様々な空気ピストン８６８もホース８７８を介して圧縮ガス源８９５と接続している。空気ピストン８６８を圧縮ガス源８９５と接続する２本のホース８７８のみが示されているが、空気ピストン８６８のそれぞれが圧縮ガス源８９５と接続していることが理解されよう。１２個の空気ピストン８６８を示す。

一対の加熱／冷却装置、例示的にはペルチェ加熱器が支持８０２の第２の側面８１４上に搭載されている。第１段階加熱器８８６は、第１段階ＰＣＲ用にブリスター５６４の内容物を加熱および冷却するために配置されている。第２段階加熱器８８８は、第２段階ＰＣＲ用にパウチ５１０の第２段階ブリスター５８２の内容物を加熱および冷却するために配置されている。しかし、これらの加熱器は他の加熱目的のためにも使用することができ、特定の応用に応じて他の加熱器を使用し得ることが理解されよう。他の構成が可能である。

蛍光検出が所望される場合、光学アレイ８９０を提供し得る。図２Ａ〜Ｂに示すように、光学アレイ８９０には、光源８９８、例示的にはフィルターＬＥＤ光源、フィルター白色光、またはレーザー照射、およびカメラ８９６が含まれる。カメラ８９６は、例示的にはそれぞれがパウチ５１０中の第２段階ウェル５８２に対応する複数の光検出器を有する。あるいは、カメラ８９６は第２段階ウェル５８２のすべてを含有する画像を撮影してよく、画像を、第２段階ウェル５８２のそれぞれに対応する別々の視野へと分割してよい。構成に応じて、光学アレイ８９０は不動であってよく、または光学アレイ８９０を１つまたは複数のモーターに取り付けられた移動体上に配置し、移動させて、それぞれの個々の第２段階ウェル５８２からのシグナルを得てもよい。他の配置が可能であることが理解されよう。

示すように、コンピュータ８９４は圧縮空気源８９５の弁８９９を制御しており、したがって機器８００のすべての空気力学を制御している。また、コンピュータ８９４は加熱器８８６および８８８、ならびに光学アレイ８９０も制御する。これらの構成要素のそれぞれは、電気的に、例示的にはケーブル８９１を介して接続されているが、他の物理的または無線接続が本発明の範囲内である。コンピュータ８９４は、機器８００内に収容され得る、または機器８００の外部であり得ることが理解されよう。さらに、コンピュータ８９４は、構成要素の一部またはすべてを制御する内蔵回路基板が含まれていてよく、増幅曲線、融解曲線、Ｃｐ、Ｃｔ、検量線、および他の関連データを計算してよく、また、光学アレイからのデータを受信して表示するためのデスクトップまたはラップトップＰＣなどの外部コンピュータが含まれていてもよい。インターフェース、例示的には温度、サイクル時間などの情報および変数を入力するためのキーを含めたキーボードインターフェースを提供し得る。例示的にはディスプレイ８９２も提供する。ディスプレイ８９２は、たとえばＬＥＤ、ＬＣＤ、または他のそのようなディスプレイであり得る。

高密度ＰＣＲ
一例では、一般的な呼吸器ウイルスの標準の市販の免疫蛍光アッセイは、７つのウイルス、すなわち、アデノウイルス、ＰＩＶ１、ＰＩＶ２、ＰＩＶ３、ＲＳＶ、インフルエンザＡ、およびインフルエンザＢを検出できることが知られている。より完全なパネルには、例示的には、コロナウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ライノウイルス、および非ＨＲＶエンテロウイルスを含めた他のウイルスのアッセイが含まれるであろう。アデノウイルスまたはＨＲＶなどの高度に変異性のウイルスでは、ウイルス系統のすべての分岐を標的とするために複数のプライマーを使用することが望ましい（例示的には、それぞれ４つの外部および４つの内部プライマー組）。コロナウイルスなどの他のウイルスでは、季節毎に変化しないが別々のプライマー組が必要なほどに分岐している、４つの明確な系統（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）が存在する。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）呼吸器パネル（ユタ州Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ ＣｉｔｙのＢｉｏＦｉｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ）には、アデノウイルス、コロナウイルスＨＫＵ１、コロナウイルスＮＬ６３、コロナウイルス２２９Ｅ、コロナウイルスＯＣ４３、ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス／エンテロウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＡ／Ｈ１、インフルエンザＡ／Ｈ３、インフルエンザＡ／Ｈ１−２００９、インフルエンザＢ、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、パラインフルエンザウイルス４、および呼吸器合胞体ウイルスが含まれる。これらのウイルスに加えて、ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）呼吸器パネルには、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、および肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の３つの細菌が含まれる。高密度アレイ５８１は、単一のパウチ５１０でそのようなパネルを受け入れることができる。ＦｉｌｍＡｒｒａｙ（商標）の他のパネルが利用可能であり、それぞれが少なくとも２０個の病原体のアッセイを行う。

例示的な第２段階ＰＣＲマスターミックスは、増幅のシグナル指標を生成するためにｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ（商標）Ｐｌｕｓを含有する。しかし、この色素は例示的のみであり、他のｄｓＤＮＡ結合色素、および当技術分野で知られているように蛍光、放射、化学発光、酵素などで標識したプローブを含めた他のシグナルを使用し得ることが理解されよう。
例示的なＦｉｌｍＡｒｒａｙ機器は、ＰＣＲ後融解に基づいて、それぞれの第２段階反応について正または負のコールを行うようにプログラミングされている。コールが正となるためには、融解曲線は事前に定義された温度範囲内で融解ピーク（一次導関数最大または負の一次導関数最大）を生じなければならない。それぞれの第２段階反応のコールを行うこの方法は例示的のみであり、リアルタイム増幅データまたは当技術分野で知られている他の手段を使用してコールを行うことができることが理解されよう。

多重ＰＣＲ用の定量標準の設計
単一の多重ＰＣＲを１つの反応チャンバー内で行うＦｉｌｍＡｒｒａｙなどのシステムでは、個々のレベルを容易に識別できないため、単一の参照鋳型の１０倍希釈液を使用した検量線を作成することは好都合でない。たとえば、単一の参照鋳型を単一の第１段階反応チャンバーに１０個のコピー、１００個のコピー、および１０００個のコピーの濃度で加えた場合、そのチャンバー内の参照鋳型の最終濃度は１１１０個のコピーとなり、何らかの他の標識が存在しない限り、個々の希釈液は識別可能でない。さらに、一重の標準鋳型増幅反応は試料が受ける上流の操作のすべてを正確に反映していな場合がある、または同様の効率で増幅されない場合があり、したがってプロセス全体を反映していない場合があるため、２ステップ多重ＰＣＲシステムでは、入れ子第２段階ＰＣＲにおいてのみ作成された検量線は、定量において価値が限定的であり得る。

この例示的な実施例では、様々な核酸鋳型（例示的には配列および／または長さが異なる）、例示的には合成定量標準を使用して、希釈系列の様々なレベルを表す。例示的な一実施形態では、すべての合成定量標準のアッセイは同様の増幅効率を有しており、多重設定におけるそれぞれの所定の希釈点において同じまたは同様のＣｐ値を生じる。例示的には、すべての標的アッセイは効率を含めて同じ性能特徴に最適化されているが、アッセイに特異的な効率の変動について調節するために補正を適応し得る。

例示的な一実施例では、定量標準の外部および内部単位複製配列の大きさは、定量的標的アッセイの単位複製配列の大きさの代表的なものであり得る。また、配列またはＧＣ含有率はプライム領域間で同じまたは同様であり得る。例示的には、配列は、内部アッセイ間の交差反応性を回避するために十分に異なっているべきである少なくとも１つの内部プライム領域を例外として、同一であり得る。配列が内部プライマー結合領域のみによって異なる場合、同じＰＣＲ１プライマーを使用してすべての定量標準を増幅してよく、したがって、ＰＣＲ１アッセイの性能の潜在的な相違が最小限となる。さらに、標識を使用する場合、配列は同一であってよく、標識を使用しない場合、配列のわずかな相違でさえもが、例示的には第２段階一重反応において検出を提供することができる。しかし、これらのパラメータは例示的のみであり、増幅効率を検出および制御する他の手段が可能であることが理解されよう。多重反応中に存在する定量標準は、Ｍｇ^２＋、プライマー濃度、Ｔｍ、およびサイクリング条件などの反応パラメータと一致するように設計するべきであることが理解されよう。また、多重ＰＣＲ反応における合成鋳型の非特異的な増幅を最小限にすることが望ましいことも理解されたい。

図５は、４つの予期される内部定量標準のＣｐ対濃度を示す。この例示的な実施形態では、内部定量標準は合成配列を有する。この例示的な実施例では、第２段階内部反応では４つの定量標準はすべて１つの共通プライマーを共有しており、それぞれがユニークな特異的プライマーを有する。また、これらは両方の外部プライマーを第１段階ＰＣＲで共有するように設計されていた。したがって、１つの定量標準のみがそれぞれのそのようのウェル内で増幅されるように、定量標準を検出するために使用する第２段階ウェルのそれぞれは、共通プライマーおよびその定量標準のプライマーで見つけられるであろう。しかし、これは例示的な実施例のみであり、他の構成が可能であることが理解されよう。Ｓｙｎ２、Ｓｙｎ３、およびＳｙｎ４はそれぞれ同様の増幅効率を有しており、さらなる研究に選択した。Ｓｙｎ１は異なる挙動であり、さらなる研究から省略された。したがって、一実施形態では、同様の増幅効率を有する複数の定量標準を有することが望ましい。

この例示的な実施例では、ｄｓＤＮＡ結合色素ＬＣＧｒｅｅｎ Ｐｌｕｓを使用して増幅を検出した。しかし、これは例示的のみであり、他のｄｓＤＮＡ結合色素、プローブ、シグナル、または増幅を検出する他の方法が本発明の範囲内である。

同様の増幅効率を有する定量標準を設計する様々な方法が存在することが理解されよう。一実施形態では、定量標準は内部プライマー間で同じ配列を有しており、内部プライマー結合配列のみが異なる。別の実施形態では、定量標準はすべて実質的に同じ長さであり、実質的に同じＧＣ含有率である。さらに別の実施形態では、配列は異なる長さであるが、それを補うためにＧＣ含有率も異なる。同様の増幅効率を有する核酸を設計する他の方法は当技術分野で知られている。

一実施形態、例示的には定量標準を２ステップ入れ子多重ＰＣＲ反応で使用する場合は、定量標準はすべて第１段階ＰＣＲ反応において同じ外部プライマーを使用してよく、潜在的には、二次構造の形成が原因の相違を回避するためにプライマーの周りで同一の領域を共有していてさえもよい。その後、個々の第２段階ＰＣＲ反応において異なる内部プライマーを使用して、ユニークな内部プライマー対を有する、または上述のように１つの内部プライマーを共有して１つのユニークな内部プライマーを有する、それぞれの較正用物質のどちらかを用いて、定量標準を識別し得る。そのような実施形態は、それぞれの定量標準が同じ動力学でその第１段階プライマーと結合し、第１段階多重ＰＣＲ反応の複雑さが最小限となり得るという利点を有する。

２ステップＰＣＲに言及するが、同じ原理を１ステップ多重ＰＣＲに使用することができる。この場合、定量標準は異なる順方向もしくは逆方向プライマーまたは同じ順方向および逆方向プライマーを有していてよく、例示的には、それぞれは特異的な蛍光プローブまたは他の同定可能な標識を有しており、たとえば、化学発光、生物発光、放射線発光、電気発光、電気化学発光、機械発光、結晶発光、熱発光、音発光、リン光、および他の形態の光ルミネセンス、酵素、放射性などが本明細書中で企図される。この応用は、当技術分野で知られている、標識を識別する任意のシステムまたは他の方法において利用可能な検出チャネルの数のみによって限定される。一部の標識は増幅後の処理を必要とし得る。さらに、標識した定量標準は、同じまたは異なるプライマー配列を使用し得る２ステップＰＣＲに使用してよく、標識を使用して第２段階ＰＣＲにおける検出を行うことが理解されよう。そのような実施形態では、標識した定量標準は第２段階ＰＣＲにおいて任意選択で多重化されていてよく、標識によって識別される。

本実施例では合成定量標準を使用するが、定量標準に使用する配列は天然のものであり得ることが理解されよう。たとえば、酵母をＳＰＣとして使用する場合、酵母配列を定量標準配列のうちの１つまたは複数に使用し得る。分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベでは、Ｔｆ２型のレトロ転位因子／トランスポゾンは１３個のコピーが存在する一方で、リボソームＲＮＡ遺伝子は４７回繰り返されている。別の例では、様々なコピー数で存在する遺伝子配列を使用し得る。例示的には、真菌病原体は核ゲノムあたり５０〜２００個のリボソームＲＮＡ遺伝子のコピーを有する。また、これらの病原体は、ゲノムあたり５〜２０個のコピーで変動するトランスポゾンも有する。細菌病原体はゲノムあたり１〜１５個のコピーを有するが、ほとんどは５個より多くのコピーを有する。ウイルスではバクテリオファージ、ならびに膜および／またはカプシドおよび／または外被構造を模倣することができる合成粒子など、他の天然または合成の鋳型を使用し得る。さらに、３つの定量標準を本明細書中の多くの実施例で使用するが、線形検量線を定義するためには２つの定量標準しか必要でなく、広範囲の標的濃度が予想される、または非線形検量線が予想される実施形態では、より多くの定量標準が所望され得ることが理解されよう。例示的には、定量標準の数はシステムのダイナミックレンジおよびアッセイの要件に基づいて選択し得る。

あるいは、実施例５に示すように、それぞれの実験ランにおいて１つの定量標準のみ（実施例５に記述する試料プロセスコントロール（ＳＰＣ）を参照）を使用し、定量標準範囲を用いて事前に作成された定量の移入検量線、例示的には、この分析用にソフトウェアに含まれている場合がある、少なくとも３つの定量標準（実施例５においてＱＳと命名）を用いたものに依存することも可能である。

多重較正
図６Ａは図５と同様であるが、３つの選択された較正用配列からのデータのみを示す。図６Ａは、３つの例示的な定量標準の直線性およびほぼ同一の増幅効率を実証している。図６Ｂは、合計５つの希釈液にわたる３つの定量標準のそれぞれ３点の組合せから作成した複合検量線を示す。

例示的な較正プロットが作成されたので、それぞれの標的アッセイについてアッセイに特異的な参照鋳型を使用した検量線を作成し得る。図７は、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）の良好に定量された合成参照鋳型を使用して外部作成した検量線を、定量標準を使用して作成した複合内部検量線と比較する。ここでは、３つの「Ｓｙｎ」鋳型を、反応チューブに加える前に事前に混合した。反応あたりＳｙｎ４は１０^３個のコピーで加え、Ｓｙｎ２は１０^４個のコピーで加え、Ｓｙｎ３は１０^５個のコピーで加えた。これらの鋳型からのＣｐ値を使用して、それぞれの反応の複合内部検量線を作成した。やはり「Ｓｙｎ」鋳型と同じ濃度で試験した合成参照鋳型Ａ．バウマンニ参照鋳型を使用して、外部検量線を作成した。複合内部検量線およびＡ．バウマンニ検量線は非常に類似している。同様の傾きは効率が同様であることを示している。内部検量線を使用してＡ．バウマンニ試料の未知の開始濃度を予測できることが予想される。しかし、２つの曲線間でｙ切片がシフトしているため、この内部検量線を使用する場合、Ａ．バウマンニの定量には補正係数が役立ち得る。

したがって、標的生物の濃度を、複合内部検量線を使用して計算することができる。内部標準はそれぞれ異なる既知濃度であり、標的生物と同じプロセスで増幅されることに注目されたい。この方法は、例示的には、標的および内部標準について、実験的に決定された、バックグラウンド蛍光を上回る蛍光シグナルを得るために必要なＰＣＲのサイクル数であるサイクル閾値（Ｃｔ）の値（またはＣｐ値もしくは他の同様の方法）を用いる。例示的にはその全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第６，３０３，３０５号に教示されているように、一次、二次、またはｎ次導関数を使用することなど、他の点も使用し得る。当技術分野で知られている他の点も使用してよく、任意のそのような点を、本明細書中に記述する方法のうちの任意のものにおいてＣｐまたはＣｔと置き換えてもよい。例示的には、２ステップ多重システムでは、Ｃｐ値は入れ子第２段階反応で決定する。しかし、他の実施形態では、Ｃｐは増幅システムに適するように決定し得ることが理解されよう。たとえば、そのそれぞれが定量標準配列に特異的であり、識別可能な蛍光シグナルを有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、Ｃｐを単一の多重反応または続く第２段階反応において決定し得る。

単一の内部標準を使用する例示的な実施例では、標的生物の濃度は、標的生物のＣｔ（ＣＴ_ｔ）、濃度および内部標準のＣｔ（濃度、Ｃｔ_ｓ）、ならびに標的生物の効率（効率_ｔ）を使用して、以下の式に従って計算し得る：
濃度_ｔ＝濃度＊効率_ｔ ^{（Ｃｔｓ−Ｃｔｔ）} ［方程式１］、
［式中、下付き文字ｓおよびｔは、それぞれ内部定量標準および標的生物を表す］、ならびに
効率_ｔ＝１＋効率の％／１００ ［方程式２］。
たとえば、それぞれのＰＣＲサイクルで１００％の増幅を有する標的の効率の変数は２に等しい。効率は事前に決定されており、ダイナミックレンジにわたって一定であると仮定されることに注意されたい。上述のように、内部較正用物質の効率はすべて同様であるべきであり、例示的には互いに１％以内、２％以内、５％以内、または１０％以内である。同様に、標的の効率のそれぞれは較正用物質のそれと同様であるべきであり、例示的には較正用物質の２％以内、５％以内、１０％以内、または１２％以内である。正確な定量には、より狭い範囲内の効率、例示的には１％以内、２％以内、または５％以内が望ましいことが理解されよう。しかし、半定量的または「ビン化」結果には（以下を参照）、効率のより大きな変動が許容され得る。

２つ以上の定量標準を使用する場合、図６Ａ〜６Ｂに例示するように、例示的には、内部定量標準には（Ｃｔ、ｌｏｇ_１０（濃度））データへの最小二乗回帰直線の当てはめを使用して、標準定量曲線を作成し得る。例示的には、回帰の当てはめは以下の形式のものである。
ｌｏｇ_１０（濃度）＝（Ｃｔ−ｂ）／ａ ［方程式３］、
［式中、ｂは切片であり、ｌｏｇ_１０（濃度）がゼロである場合のＣｔの値を表し、ａは傾きであり、鋳型濃度の単一単位の変化でＣｔが変化する度合を表す（効率の関数）］。未知の標的の計算Ｃｔ値が与えられると、この式は標的濃度をＬｏｇ_１０単位で与える。定量の精度および正確さを改善するために、他のアルゴリズムまたは方程式を必要に応じて適用し得る。これらには、抽出および／または増幅におけるプラットフォームに特異的、マトリックスに特異的、またはアッセイに特異的な偏りに必要な調節が含まれる。また、これらには、任意の複数ステップ増幅プロセスの別々のステップにおけるアッセイ効率の相違を考慮することができるアルゴリズムも含まれ得る。一部の実施形態では、定量検量線は非線形であってよく、または特定のダイナミックレンジ内でのみ線形であってもよい。例示的には、濃度依存性の変数の傾きが存在する場合、Ｓ字形用量応答曲線を使用し得る。他の非線形曲線が本発明の範囲内である。

標的の観察されたＣｔ値および内部定量標準を使用して作成した検量線の回帰方程式に基づいて、上述の方法を、未知の濃度を有する標的生物に使用することができる。理想的には、この手法を使用して定量するすべての標的は、内部定量標準アッセイと等価または同様のＰＣＲ効率を有するアッセイを有するべきである。しかし、標的アッセイの検量線の傾きまたは切片に一部の変動が存在し得る。標的アッセイが内部標準とは異なる増幅特徴を有し得ることを考慮し、アッセイに特異的な系統的な偏りを調節するためにアッセイに特異的な補正係数を使用して、未知の標的の計算濃度の正確さを改善することができる。例示的には、線形定量曲線を使用する場合、ａを、異なるアッセイに特異的な効率の補正係数指標で補正してもよい（これが傾きを変化させる）、または、ｂを、標的Ｃｔの遅延を引き起こす特定の標的に最適なＰＣＲ条件を欠くことが原因で補正してもよい。どちらの補正も必要に応じて使用し得る。別の例では、例示的には入れ子ＰＣＲを使用する場合、ＰＣＲ２で観察されるｂの差異は、ＰＣＲ１効率の変動が原因のＰＣＲ１アッセイの全体結果の結果であり得る。この場合、補正係数は、Ｃｔ値の関数として計算し得るか、または所望の定量の正確さに応じて定数であり得る。

たとえば、既知の標的生物濃度を用いて一組の制御された実験を実行し得る。単一の濃度で複数の反復試験を使用する場合、アッセイに特異的な補正係数は既知濃度と計算濃度との平均差異のＬｏｇ_１０単位として計算し得る。例示的には、標的生物の補正ｌｏｇ濃度を得るためには、アッセイに特異的な補正係数を標的生物のｌｏｇ濃度（内部定量標準方法によって上記で計算）に加算し得る。多重アッセイにおけるそれぞれの標的配列は、例示的にはそれ自身の補正を有するであろう（または、複合検量線に非常に類似している場合は、補正はまったくなし）。

アッセイに特異的な検量線によって計算された標的生物の定量を、複合内部検量線によって計算されたものと比較するための実験を設定した。この実験では、既知量のＡ．バウマンニのゲノム核酸の１０倍段階希釈をベンチトップ反応において内部定量標準と多重化した。また、外部アッセイに特異的な検量線も、図７を参照して上述のように設定した。図８Ａは、定量標準からの複合検量線およびＡ．バウマンニに特異的な外部検量線を使用した結果を示す。複合検量線を補正なしで使用する場合、標的生物（Ａ．バウマンニ）の明らかな系統的過剰定量（約０．５ ｌｏｇコピー単位まで）がある一方で、０．５ ｌｏｇコピー単位の補正を適用した場合、補正されたアッセイに特異的な検量線は試料中のＡ．バウマンニ力価のかなり正確な推定を与える。図８Ｂは、上述のように作成したアッセイに特異的な補正係数の平均を内部検量線方法によって計算された量に適用することによって、定量におけるこの系統的な偏りをどう補正できるかを示す。同様の補正を多重反応中のそれぞれのアッセイに行い得る。

多くの実施形態では、絶対的定量は必要でなく、半定量的な結果が十分であり得る。結果は絶対的濃度（システムの誤差（例示的には９５％の予測区間）ありもしくはなし）として報告し得るか、または複数の範囲のうちの１つ、例示的にはそれぞれが１つもしくは複数の桁をカバーする「高い」、「中程度」、もしくは「低い」濃度を報告するものへとビンし得る。ビンの数は具体的なアッセイに適するように変動してよく、任意の数のビンを使用してよいことが理解されよう。また、半定量的結果のビン化の範囲（桁または他の測度）は、具体的な例に適するように調節し得る。

阻害性試料種における較正
阻害性試料、例示的には阻害性マトリックスは、内部定量標準および標的アッセイの抽出および増幅に多かれ少なかれ同じ程度の影響を与えることができる。内部標準は、標的配列と同様の様式でマトリックス主導の効果に動的に応答するため、これらは正規化の機能を果たすことができる。本実施例では、実施例３からの３つの内部較正用物質を、上記で使用した濃度で使用した。ＴＡ−８９は、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種が陽性であり、下気道試料を試験するために使用される例示的なＦｉｌｍＡｒｒａｙパウチにおいて内部酵母ＲＮＡ対照の相当に遅延したＣｐに反映されているように阻害性特性を有することが示された、気管吸引液試料である。ＴＡ−８９を３つの濃度、すなわち、そのまま、２倍希釈、および１０倍希釈で使用した。それぞれの試料に１０^６ＣＦＵ／ｍＬのＡ．バウマンニを添加した。実施例３と同様、１０^３、１０^４、および１０^５個のコピー／ｍＬの３つの内部定量標準鋳型もすべての試料アリコートに加えた。また、ＰＢＳマトリックスなし対照にも同じ濃度のＡ．バウマンニおよび内部較正用物質を添加した。

図９は、検出に対するＴＡ−８９などの阻害性マトリックスの希釈の効果を示す。阻害性マトリックス効果を可視化し、未希釈のマトリックス中のＡ．バウマンニのＣｐは遅く、マトリックスを希釈した場合により早いＡ．バウマンニのＣｐの傾向が見られ、ＴＡ−８９マトリックス（ＰＢＳのみ）を含有しない試料でＣｐが最も早かった。マトリックス希釈液にわたるＣｔ値の相違にかかわらず、Ａ．バウマンニの量はマトリックスのすべての希釈液において同じである。図１０では、定量標準およびＡ．バウマンニのアッセイのＣｐで同様の傾向が見られ、定量標準のうちの１つ（１０^３個／ｍＬ）は最も阻害性（未希釈）のマトリックスで実際に脱落している。

図１１Ａ〜Ｄでは、ＴＡ−８９希釈液およびＰＢＳマトリックスなし対照のそれぞれの内部定量標準から作成した検量線を示す（菱形）。Ａ．バウマンニのＣｐ（四角）は、すべての試料マトリックスにおいて１０^５個／ｍＬ点よりも一貫して早い。Ａ．バウマンニの計算濃度を以下の表１に示す。すべての予測値は１０^６ＣＦＵ／ｍＬの実際の濃度の３倍以内である。このことは、内部定量標準およびＡ．バウマンニの鋳型はすべて阻害性マトリックスによって同様に影響を受けること、また、内部定量標準のＣｐまたはＣｔ値から検量線を作成することが、阻害性マトリックス中においても標的を定量するための有益なツールを提供することを実証している。

試料プロセスコントロールを使用した定量
本実施例では、既知濃度の単一の合成定量標準（ＱＳ）の使用を既知濃度の単一の微生物の使用と比較し、ここで、微生物を病原体（例示的にはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ））を定量するための試料プロセスコントロール（ＳＰＣ）としても使用した。本実施例ではカラムに基づく抽出を使用し、増幅をＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ機器で行ったが、これらの方法および機器は例示的のみであることが理解されよう。

この実験の設計を図１２に示し、２ステップで行った。
−第１ステップには２パートが含まれる。（Ａ）合成定量的標準（ＱＳ）を用いた定量的検量線の作成、および（Ｂ）それから作成された定量的検量線を用いた、単一の天然試料プロセスコントロールＳＰＣの較正。
−第２ステップは、ＳＰＣである単一の天然定量標準を用いた標的核酸（ＣＭＶ）の定量に対応する。この例示的な実施例では、標的核酸はＣＭＶであり、ＳＰＣはＳ．ポンベである。

実験計画は以下の通りである。

例示的には、第１ステップを以下のように行った。

パートＡ）：

２つのプライマーおよび１つのプローブが含まれる５’ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲ技術を使用して第１のＰＣＲ混合物を提供し、ここで、プライマーおよびプローブは標的病原体を増幅および検出および定量するように具体的に設計されている。別のＰＣＲの同様の混合物を使用するが、これは合成定量標準の増幅および検出用に設計されている。第３のＰＣＲの同様の混合物を使用し、これは試料プロセスコントロールの増幅および検出用に設計されている。５’ヌクレアーゼリアルタイムＰＣＲ技術は例示的のみであり、他の検出手段を使用し得ることが理解されよう。

所望の増幅プラットフォームでの第１の増幅ランでは、以下の形式の回帰直線を使用して、定量的合成標準の４つの希釈液の範囲（ＱＳ１〜ＱＳ４）を使用して標準定量曲線を作成した：
Ｃｔ＝（ａ＊Ｌｏｇ_１０濃度）＋ｂ ［方程式４］
または
Ｌｏｇ_１０（濃度）＝（Ｃｔ−ｂ）／ａ ［方程式３］
［式中、ａおよびｂは上記定義した通りである］。
得られた結果を以下の表２に示し、図１３に例示する。

例示的には、同じ増幅プラットフォームの第１のランでは、ＳＰＣ微生物Ｓ．ポンベの４つの希釈液の範囲を試験した。得られた結果は表３に示すとおりである。

例示的には、パートＢ）を以下のように行った。

ＳＰＣ Ｓ．ポンベで得られた結果を標準定量曲線に対して較正し、較正係数を決定する。例示的には検出する病原体の関連する定量範囲の真ん中となるように選択される、最適なＳＰＣ希釈液（例示的には希釈液２）を選択し、その上に、標準定量曲線を、その事前に定義された回帰直線の傾きを用いて置く。上述のように、ＰＣＲによる定量は検量線手法を頻繁に使用する。また、上述のように、検量線をパラメータ（切片および傾き）として保存し、単一の値（Ｃｔ）上に移入することができ、これがランにおけるＳＰＣの挙動に応じて定量をラン毎に調節することを可能にすることが、すでに実証されている。

本実施例では、標的ＣＭＶを定量するための定量標準としてＳＰＣを使用する場合に、値４．５４７が次の増幅ランの方程式を決定するために使用するＬｏｇ_１０濃度の値となる。例示的には、ＳＰＣは検量線を調節または較正する役割を果たすため、これを調節物質または較正用物質と呼ぶことができる。このステップでは、合成標準のうちの１つまたはＳＰＣ希釈液のうちの１つを、事前に定義された回帰直線の傾きにおける調節物質として使用することができ、合成標準ＱＳ３の使用では係数は４．９０３、試料プロセスコントロールの希釈液２の使用では係数は４．５４７である。係数４．５４７を使用して較正された切片を計算し、それにより、ＳＰＣを定量的標準として用いて、以下の形式の回帰直線を使用して、ＣＭＶ濃度の計算が可能となる：
Ｌｏｇ_１０（濃度）＝（Ｃｔ−ｂ’）／ａ ［方程式５］、
［式中、ａは合成定量的標準範囲の傾きに対応し、ｂ’は較正された切片に対応し、定量的合成標準範囲に対して較正した場合にＳＰＣのＬｏｇ_１０（濃度）がゼロである場合に、Ｃｔの理論値を表す］。

第２ステップ：

その後、定量標準ＱＳ３および試料プロセスコントロールＳＰＣ Ｓ．ポンベを８００００個のコピー／ｍＬの濃度で用いて、一連の試料を平行して試験した。参照ＣＭＶ株ＡＤ１６９の４つの希釈液を、それぞれ４回の反復試験で全血試料に添加した。ＱＣＭＤ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）から得た２つの全血試料および５つの全血臨床試料も使用した。

２３個の試料について、方程式３および５を適用することによって試料中のＣＭＶの濃度を決定した。

表４および５に例示するように、結果は予想された桁のものであった。

定量の検量線のパラメータを調節するために試料プロセスコントロールを定量標準として使用することは、この粒子が検体および試験試料が感染している潜在的な病原体とすべて同じステップを経るが、検出する病原体と同じ挙動も有することを活用している。

ＱＳ３標準を使用したＣＭＶの定量とＳＰＣ希釈液２を使用したＣＭＶの定量との間の平均定量ギャップはκ＝０．４６Ｌｏｇである。その後、これを次のランの補正係数として使用して、以下のようにＬｏｇ１０（濃度）を補正する：
ｌｏｇ１０（濃度ｔ）＝ｌｏｇ１０（濃度）＋κ ［方程式６］
［式中、下付き文字ｓおよびｔはそれぞれＳＰＣおよび標的を表し、κは前記標的について事前に決定された補正係数である］。

したがって、病原体の定量はワークフローに沿った収率および効率の潜在的な損失を考慮し、より正確となっている。

図１４に示すように、ＱＳおよびＳＰＣを用いた定量間の差異は、補正係数（κ＝０．４６）を適用せずに０．４３Ｌｏｇであり、補正後は−０．０４であった。

様々なコピー数で存在する試料プロセスコントロールからの２つ以上の配列を、多重アッセイ中の標的を定量するために使用できる標準定量曲線を作成するための内部定量標準として使用できることが理解されよう。同様に、やはり実施例２〜４に開示した方法のように使用できる標準定量曲線を作成するために、少なくとも２つの異なる試料プロセスコントロールを異なる濃度で使用し得る。

本明細書中に記述する定量方法に加えて、試料プロセス方法を試験、比較、または最適化するために本明細書中に記載の定量標準のうちの任意のものを適用できることが理解されよう。また、例示的には試料調製中の損失を考慮することによって、定量標準を使用して、元の試料中の分析物（生物）の真の力価の推定を支援することもできる。

例示的な一実施例では、定量標準を適用して、試料プロセス方法を比較または最適化することができる。例示的には、定量標準を以下のプロセスのうちの１つまたは複数において使用することができる：（１）様々な試料調製の下位特長、たとえば、インキュベーションステップの長さ、磁気ビーズの採取時間、洗浄ステップ、または溶出ステップの最適化、（２）最適なプラットフォームを採用するための、様々な市販もしくは市販でない試料調製プラットフォーム、たとえば、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ（商標）、ＱｉａＣｕｂｅ（商標）、もしくはＥａｓｙ Ｍａｇ（登録商標）の抽出効率の比較、または（３）抽出に対するマトリックス効果の比較（例示的には同じプラットフォームを使用するが、プラットフォームを横断する比較も可能である）。たとえば、痰などの複雑なマトリックスは、ＮＰＳまたはＢＡＬなどのより複雑でないマトリックスよりも、核酸抽出に対するより大きな妨害を引き起こし得る。試料調製の下位特長の改変によって、複数のマトリックスで同等に良好に作動する試料調製プロトコルを開発することができる。

上記応用のすべてについて、例示的には、１つまたは複数の定量標準（鋳型Ａ）を固定量で試料調製前に試料に加えることによって比較を行い得る。その後、鋳型Ａは、試料が供されるすべてのプロセスを受ける。試料調製中に失われる鋳型Ａの量は、試料中の分析物からの核酸損失の量の良好な近似であると予想される。その後、１つまたは複数の第２の定量標準（鋳型Ｂ）を、鋳型Ａと同じ量で溶出液に加え得る。しかし、１対１の比は必要ではなく、他の既知量の鋳型Ｂを加え得ることが理解されよう。ＰＣＲを溶出液で実行し、鋳型ＡのＣｐを鋳型ＢのＣｐと比較する。試料調製中に鋳型Ｂは全く失われないことを考えると、鋳型Ｂがより早く増幅されると予想される。例示的には、鋳型ＡおよびＢ間の最も小さなＣｐの差異を与えるプロトコルまたはプラットフォームが、より効率的な試料調製方法であり得る。

別の例示的な実施例では、定量標準を使用して、試料調製中の損失を考慮することによって、元の試料中の分析物（たとえば生物）の真の力価を推定することができる。したがって、試料抽出効率の問題が原因の損失を推定することによって、鋳型ＡおよびＢ間の差異を使用して試料中の真の力価の値を逆算し得る。損失の規模を補正係数に変換することができ、その後、これを従来のｑＰＣＲ方法によって決定される分析物の量に適用することができる。

鋳型ＡおよびＢは、実施例５のようにそれぞれ単一の定量標準であってもよく、または実施例２〜４にように、一方もしくは両方が例示的には異なる濃度の定量標準の組合せであってもよいことが理解されよう。

本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で具体化し得る。記載した実施形態は、すべての観点で例示的のみとしてみなされ、制限的であるとしてみなされない。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。本発明を例示する目的で、特定の実施形態および詳細が本明細書中および添付の発明の開示中に含められているが、当業者には、添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲から逸脱せずに、本明細書中に開示する方法および器具に様々な変更を行い得ることが明らかであろう。特許請求の範囲と均等の意味および範囲内となるすべての変更は、その範囲内に包含される。

５１０ パウチ
５１４ チャネル
５１５ａ〜５１５ｌ チャネル
５２２ 溶解ブリスター
５３３ 磁気ビーズ
５３４ ビーズまたは粒子
５３８ チャネル
５４３ チャネル
５４４ ブリスター
５４６ ブリスター
５４８ ブリスター
５５２ チャネル
５５３ チャネル
５６２ チャネル
５６５ チャネル
５６４ ブリスター
５６６ ブリスター
５８０ 第２段階反応区域
５８１ 高密度アレイ
５８２ 第２段階ウェル
５８２ 第２段階ブリスター
５９０ 取付物
８００ 機器
８０２ 支持メンバー
８０４ スロット
８１０ ブラダーアセンブリ
８０８ アセンブリ
８１０ ブラダープレート
８１１ 支持メンバーの第１の側面
８１４ 支持メンバーの第２の側面
８１９ ビーズ殴打モーター
８２１ 刃
８２２ ブラダー
８２４ ブラダープレート
８３８ ピストンまたはハードシール
８４３ ピストンまたはハードシール
８４４ ブラダー
８４６ ブラダー
８４８ ブラダー
８５０ 磁石
８５１ 凹部
８５２ ピストンまたはハードシール
８５３ ピストンまたはハードシール
８６４ ブラダー
８６５ ピストンまたはハードシール
８６６ ブラダー
８６８ 空気ピストン
８６９ 空気ピストンアレイ
８７８ ホース
８８６ 第１段階加熱器
８８６ 加熱器
８８８ 加熱器
８９０ 光学アレイ
８９１ ケーブル
８９２ ディスプレイ
８９４ コンピュータ
８９５ 圧縮空気源
８９６ カメラ
８９８ 光源
８９９ 弁

Claims (39)

1. 第１段階多重増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は複数の標的プライマーを含み、それぞれの標的プライマーは試料中に存在し得る異なる標的を増幅するように構成されており、増幅混合物はそれぞれ異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸および少なくとも１つの定量標準プライマーをさらに含み、定量標準プライマーは定量標準核酸を増幅するように構成されているステップと、
   第１段階増幅混合物を複数の第２段階の個々の反応へと分割するステップであって、複数の第２段階の個々の反応のうちの第１群がそれぞれ、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている少なくとも１つのプライマーを含み、複数の第２段階の個々の反応のうちの第２群がそれぞれ、定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている少なくとも１つのプライマーを含んでいるステップと、
   複数の第２段階の個々の反応を増幅条件に供して、１つまたは複数の標的単位複製配列および複数の定量標準単位複製配列を生じるステップであって、それぞれの定量標準単位複製配列が関連する定量標準Ｃｐを有するステップと
   を含む、試料において定量的２ステップ増幅を行う方法。
2. 定量標準Ｃｐから検量線を作成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 検量線を使用して１つまたは複数の標的のそれぞれを定量することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. それぞれの標的を、以下への最小二乗回帰直線の当てはめを使用して作成した検量線を使用して定量する、請求項３に記載の方法：
   ｌｏｇ_１０（濃度）＝（Ｃｔ−ｂ）／ａ
   ［式中、Ｃｔはそれぞれの標的について測定されたサイクル閾値であり、
   ｂは切片であり、標的のｌｏｇ_１０（濃度）がゼロである場合のＣｔ値を表し、
   ａは傾きであり、濃度の単一単位の変化でＣｔが変化する度合を表す］。
5. それぞれの標的を、最小二乗回帰直線および補正係数を使用して定量する、請求項４に記載の方法。
6. 検量線が非線形である、請求項３に記載の方法。
7. 定量ステップが濃度を報告する、請求項３に記載の方法。
8. 定量ステップが複数の範囲のうちの１つの範囲に入る濃度を生成し、その１つの範囲を報告する、請求項３に記載の方法。
9. 増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それぞれのプライマーがプライマー対で提供される、請求項１に記載の方法。
10. 増幅混合物が一対の定量標準プライマーのみを含む、請求項９に記載の方法。
11. 複数の定量標準核酸に少なくとも２つの定量標準核酸が含まれる、請求項１に記載の方法。
12. 定量標準核酸がすべて同様の増幅効率を有する、請求項１に記載の方法。
13. すべての標的が同様の増幅効率を有する、請求項１２に記載の方法。
14. 内部定量標準核酸が試料中の天然に存在する配列である、請求項１に記載の方法。
15. 増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は、試料中に存在し得る標的を増幅するように構成されている一対の標的プライマーを含み、それぞれ異なる既知濃度で提供される複数の定量標準核酸および少なくとも一対の定量標準プライマーをさらに含み、定量標準プライマーは定量標準核酸を増幅するように構成されているステップと、
    定量標準単位複製配列から検量線を作成するステップと、
    検量線を使用して標的核酸を定量するステップと
    を含む、試料において定量的増幅を行う方法。
16. 増幅混合物が、試料中に存在し得る複数の追加の標的を増幅するように構成されている複数の追加の標的プライマー対をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
17. 増幅ステップに続いて、
    増幅混合物を複数の個々の反応へと分割するステップであって、複数の個々の反応のうちの第１群は、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含み、複数の個々の反応のうちの第２群は、定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含むステップと、
    複数の個々の反応を増幅条件に供して、１つまたは複数の標的単位複製配列および複数の定量標準単位複製配列を作製するステップと
    をさらに含み、作成および定量ステップが供するステップに続いて起こる、請求項１６に記載の方法。
18. 定量標準核酸に特異的な標識を使用して、それぞれの定量標準核酸の増幅を検出するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
19. それぞれの標識が識別可能な標識したプローブである、請求項１５に記載の方法。
20. それぞれの複数の内部定量標準核酸を、プロセスコントロールとしても役割を果たすために既知量で増幅混合物に提供する、請求項１５に記載の方法。
21. ａ）前記試料を溶解するステップと、
    ｂ）前記試料から核酸分子を抽出するステップと、
    ｃ）核酸分子の核酸増幅を行うステップと
    を含み、少なくとも１つの試料プロセスコントロールを、前記試料に、ステップａ）の前またはステップａ）の間に既知量で加え、
    試料プロセスコントロールからの核酸配列が定量標準として役割を果たすことを特徴とする、試料中の核酸分子の定量的核酸増幅を行う方法。
22. ステップｃ）が、試料中に含有される核酸分子を増幅混合物で増幅するステップを含み、増幅混合物が、試料中に存在し得る標的を増幅するように構成されている少なくとも１つの標的プライマーを含み、
    増幅混合物が、定量標準を増幅するように構成された少なくとも１つの定量標準プライマー組をさらに含む、
    請求項２１に記載の方法。
23. 定量標準および標的について得られたシグナルを移入検量線と比較することによって標的を定量することさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 移入検量線が以下への最小二乗回帰直線の当てはめを使用して作成されている、請求項２３に記載の方法：
    ｌｏｇ１０（濃度）＝（Ｃｔ−ｂ’）／ａ
    ［式中、Ｃｔはそれぞれの標的について測定されたサイクル閾値であり、
    ａは合成定量的標準範囲の傾きに対応し、ｌｏｇ１０濃度の単一単位の変化でＣｔが変化する度合を表し、ｂ’は較正された切片に対応し、定量的合成標準範囲に対して較正した場合にＳＰＣのＬｏｇ_１０（濃度）がゼロである場合に、Ｃｔの理論値を表す］。
25. 定量標準と標的との間の事前に決定された補正係数を適用することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 標的の濃度を以下の方程式に従って決定する、請求項２５に記載の方法：
    ｌｏｇ１０（濃度ｔ）＝ｌｏｇ１０（濃度）＋κ
    ［式中、下付き文字ｓおよびｔはそれぞれ試料プロセスコントロールおよび標的を表し、κは前記標的について事前に決定された補正係数である］。
27. 前記定量的増幅が定量的ＰＣＲである、２６に記載の方法。
28. 前記増幅が複数の標的の増幅用の多重ＰＣＲである、請求項２７に記載の方法。
29. ステップｃ）の前に第２の定量標準を加え、ステップｃ）に続いて定量標準の増幅を比較することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
30. 定量標準と第２の定量標準との間の増幅の差異がステップｂ）の効率の指標である、請求項２９に記載の方法。
31. ａ）第１の定量標準を試料に第１の既知量で加えるステップと、
    ｂ）試料プロセス方法を使用して核酸を試料から抽出するステップと、
    ｃ）第２の定量標準を試料に第２の既知量で加えるステップと、
    ｄ）核酸および定量標準の核酸増幅を行うステップと、
    ｅ）第１の定量標準と第２の定量標準との間の増幅の差異を決定するステップであって、
    差異は試料プロセス方法の効率の指標であるステップと
    を含む、試料プロセス方法を試験する方法。
32. 第１の既知量が第２の既知量と同じであり、差異が第１の定量標準のＣｐと第２の定量標準のＣｐとの間の差異である、請求項３１に記載の方法。
33. 差異を使用して試料の真の力価を推定する、請求項３２に記載の方法。
34. 試料中の核酸を定量する方法における定量標準としての、少なくとも１つの試料プロセスコントロールの使用。
35. 複数対の標的プライマーを含む増幅容器であって、それぞれの標的プライマー対は試料中に存在し得る異なる標的を増幅するように構成されており、増幅混合物は、それぞれ異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸および少なくとも一対の較正用プライマーをさらに含み、較正用プライマーは内部定量標準核酸を増幅するように構成されている、増幅容器と、
    複数の第２段階の個々の反応ウェル、すなわち、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含む、複数の第２段階反応ウェルのうちの第１群、および内部定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含む、複数の第２段階反応のうちの第２群と
    を含む、試料において定量的２ステップＰＣＲを行うための試料容器。
36. 増幅容器が複数の第２段階の個々の反応ウェルと流体接続している、請求項３５に記載の試料容器。
37. 増幅容器および複数の第２段階の個々の反応ウェルを柔軟なパウチ中に提供する、請求項３６に記載の試料容器。
38. 請求項３５に記載の試料容器を受けるための開口部と、
    増幅容器を増幅条件に供するための第１の加熱器と、
    複数の第２段階の個々の反応ウェルを増幅条件に供するための第２の加熱器と、
    定量標準核酸の増幅を使用して検量線を作成し、それぞれの増幅された標的について定量的または半定量的な結果を出力するようにプログラミングされたコンピュータと
    を備えた、試料において定量的２ステップＰＣＲを行うための機器。
39. コンピュータが、標的のうちの少なくとも１つの検量線に補正係数を適用するようにさらにプログラミングされている、請求項３８に記載の機器。