ES2936823T3 - Procedimientos para la amplificación cuantitativa - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos, recipientes de muestras e instrumentos para la amplificación cuantitativa y semicuantitativa. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para la amplificación cuantitativa

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

En los Estados Unidos, Canadá y Europa occidental, las enfermedades infecciosas representan aproximadamente el 7 % de la mortalidad humana, mientras que en las regiones en desarrollo las enfermedades infecciosas representan más del 40 % de la mortalidad humana. Las enfermedades infecciosas conducen a una variedad de manifestaciones clínicas. Entre las manifestaciones patentes comunes están la fiebre, la neumonía, la meningitis, la diarrea y la diarrea con sangre. Si bien las manifestaciones físicas sugieren algunos patógenos y eliminan a otros como agentes etiológicos, se mantiene una variedad de posibles agentes causales, y un diagnóstico claro a menudo requiere de la realización de una variedad de ensayos. Las técnicas tradicionales de microbiología para diagnosticar patógenos pueden tardar días o semanas, lo que a menudo retrasa un tratamiento adecuado.

En los últimos años, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en un procedimiento de elección para el diagnóstico rápido de agentes infecciosos. La PCR puede ser una herramienta rápida, sensible y específica para diagnosticar enfermedades infecciosas. Un desafío para la utilización de la PCR como medio principal de diagnóstico es la variedad de posibles organismos causales y los bajos niveles de organismos presentes en algunas muestras patológicas. A menudo no es práctico ejecutar grandes paneles de ensayos de PCR, uno para cada posible organismo causal, la mayoría de los cuales se espera que sean negativos. El problema se acentúa cuando el ácido nucleico del patógeno está a una concentración baja y requiere un gran volumen de muestra para reunir plantillas de reacción adecuadas. En algunos casos, la muestra es inadecuada para analizar todos los posibles agentes etiológicos. Una solución es ejecutar una “PCR múltiplex” en la que la muestra se analiza simultáneamente para múltiples dianas en una sola reacción. Si bien la PCR múltiplex ha demostrado ser valiosa en algunos sistemas, existen deficiencias relacionadas con la solidez de las reacciones múltiplex de alto nivel y las dificultades para un análisis claro de múltiples productos. Para resolver estos problemas, el ensayo se puede dividir posteriormente en múltiples PCR secundarias. El anidado de las reacciones secundarias dentro del producto primario a menudo aumenta la robustez. Sin embargo, esta manipulación adicional puede ser costosa y puede provocar contaminación u otros problemas.

Los sistemas de PCR múltiplex completamente integrados que integran la preparación de muestras, la amplificación, la detección y el análisis son fáciles de utilizar y están particularmente bien adaptados para el mercado de diagnóstico y para enfoques sindrómicos. El FilmArray@ (BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, Utah) es un sistema de este tipo, un sistema de PCR altamente multiplexada y fácil de utilizar desarrollado para el mercado de diagnóstico. El instrumento de muestra única acepta una “bolsa” desechable que integra la preparación de la muestra y la PCR múltiplex anidada. La preparación de muestras integrada proporciona facilidad de utilización, mientras que la PCR altamente multiplexada proporciona tanto la sensibilidad de la PCR como la capacidad de analizar hasta 30 organismos diferentes de forma simultánea. Este sistema es muy adecuado para la identificación de patógenos, en los que varios patógenos diferentes manifiestan síntomas clínicos similares. Entre los paneles de diagnóstico disponibles en la actualidad se incluyen un panel respiratorio para infecciones de las vías respiratorias superiores, un panel de cultivo de sangre para infecciones del torrente sanguíneo, un panel gastrointestinal para infecciones GI y un panel de meningitis para infecciones del líquido cefalorraquídeo. Otros paneles están en desarrollo.

Muchos de los patógenos a los que se dirigen los paneles FilmArray, así como otros sistemas de detección, se pueden encontrar en el medio ambiente y como comensales en el sitio de recolección de muestras. Por ejemplo, en enfermedades tales como la neumonía, los patógenos bacterianos que se encuentran con más frecuencia también pueden existir como “flora normal” del conducto orofaríngeo, que a menudo es como tal el sitio de recolección de la muestra (esputo y aspirados traqueales o hisopo nasofaríngeo (NPS, nasopharyngeal swab)) o la ruta para la recolección de muestras más invasivas, tales como el lavado broncoalveolar (BAL, bronchoalveolar lavage). La contaminación frecuente o la recolección conjunta de flora normal es inevitable en estos casos. Por lo tanto, la práctica establecida en los laboratorios microbiológicos es realizar cultivos semicuantitativos o cuantitativos para distinguir las cargas patógenas de bacterias del transporte comensal no relevante clínicamente. Existen diferentes pautas de títulos de diagnóstico para diferentes tipos de muestras. La PCR cuantitativa (qPCR) puede funcionar como una alternativa molecular rápida y objetiva a los procedimientos microbiológicos que consumen mucho tiempo y, a menudo, son subjetivos.

La realización de un análisis de cuantificación absoluta se describe, por ejemplo, en “LightCycler 480 Instrument Absolute Quantification Quick Reference Card” 2010. La cuantificación absoluta, que incluye la amplificación por qPCR, utiliza con frecuencia un enfoque de curva patrón. En este enfoque, una curva patrón generada a partir de la representación gráfica de los valores del punto de cruce (Cp, Crossing point) obtenidos a partir de la PCR en tiempo real frente a cantidades conocidas de una única plantilla de referencia proporciona una línea de regresión que se puede utilizar para extrapolar las cantidades del mismo gen diana en las muestras de interés. Las diluciones en serie (de forma ilustrativa, diluciones de 10 veces) de la plantilla de referencia se configuran junto con las muestras que contienen el gen diana específico que se debe cuantificar. Se ejecutan diversas reacciones separadas, generalmente una para cada nivel de la diana de referencia y una para cada una de las muestras de interés. Además, dado que las diferencias específicas del ensayo en las eficiencias de PCR a menudo afectan la cuantificación, se configuran curvas patrón separadas, con plantillas de referencia separadas, para cuantificar diferentes dianas genéticas.

Sin embargo, utilizar este enfoque para cuantificar dianas en un escenario de PCR multiplexada puede suponer un desafío. Aunque se ha realizado la cuantificación de las dianas de la PCR multiplexada, este enfoque requiere configurar múltiples curvas patrón de PCR individuales para cada ensayo incluido en la multiplexación (Phillips et al 2014). Además, este enfoque supone o requiere que los ensayos tengan la misma eficiencia de PCR en reacciones uniplex y múltiplex. Todos los enfoques de cuantificación basados en curvas patrón publicados hasta la fecha requieren la configuración de curvas patrón externas en las que los diferentes niveles de plantillas de referencia se añaden a cámaras de reacción separadas.

Este enfoque no está fácilmente disponible en un sistema, tal como la plataforma FilmArray multiplexada, en la que una sola prueba está diseñada para proporcionar una solución de muestra a respuesta. El sistema FilmArray utiliza una PCR múltiplex anidada de dos etapas en la que solo hay una cámara disponible para las reacciones múltiplex de primera etapa. Por lo tanto, no se pueden incluir las curvas patrón externas para cada ensayo de PCR. Además, en una reacción de una sola cámara, no es fácil mantener separadas las diluciones en serie de las plantillas de referencia para obtener valores de Cp para cada nivel. Además, dado que la purificación de ácido nucleico de una muestra de paciente está integrada en el sistema FilmArray, no se puede estimar el efecto de la variabilidad dirigida por la muestra en la extracción de ácido nucleico, así como el efecto de cualquier inhibidor derivado de la muestra en la PCR y, de este modo, no se puede estimar fácilmente la cuantificación mediante una curva patrón externa. Nygren et al., (“Quantification of HIV-1 Using Multiple Quantitative Polymerase Chain Reaction Standards and Bioluminometric Detection” Anal Biochem (2001) 288(1):28-38) describen la cuantificación de VIH-1 basada en PCR competitiva y detección bioluminométrica. Los patrones cuantitativos y el ADN de tipo salvaje comparten las mismas secuencias de unión al cebador y la misma longitud del amplicón, pero difieren en la secuencia interna debido a una extensión homopolimérica de tres pares de bases.

La Patente WO 2007/035475 A2 describe procedimientos de cuantificación de ácidos nucleicos diana en una muestra biológica, que permiten la determinación de los niveles de expresión génica de una o más secuencias génicas diana.

La Patente EP1319716A1 describe un procedimiento para analizar ácidos nucleicos utilizando ácidos nucleicos de control interno que se pueden discriminar de los ácidos nucleicos de interés.

La Patente WO2007061284A1 describe la detección múltiplex de ácidos nucleicos diana en una muestra utilizando sondas candado (“padlock probes”).

La Patente US 2015/232916 A1 describe procedimientos y dispositivos para la amplificación simultánea de una pluralidad de pocillos y procedimientos para analizar una secuencia de ácido nucleico diana utilizando curvas de fusión.

Se dan a conocer procedimientos, sistemas y kits para generar una curva de patrón interno en una reacción múltiplex que puede proporcionar la cuantificación simultánea de múltiples especies diana que también tiene en cuenta los efectos de las variaciones derivadas de la matriz y específicas del ensayo en los resultados de la PCR. La presente divulgación también enseña la utilización de controles de proceso o control o controles de procesamiento de muestras para la cuantificación.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto de la presente divulgación, se dan a conocer procedimientos para realizar una amplificación cuantitativa por PCR en dos etapas en una muestra, comprendiendo los procedimientos amplificar la muestra en una mezcla de amplificación múltiplex de primera etapa mediante un primer número de ciclos de PCR, comprendiendo la mezcla de amplificación una pluralidad de pares de cebadores diana, cada uno de los pares de cebadores diana configurado para amplificar una de una pluralidad de dianas diferentes que pueden estar presentes en la muestra en una concentración desconocida, comprendiendo, además, la mezcla de amplificación una pluralidad de ácidos nucleicos patrón de cuantificación interno, cada uno de los patrones de cuantificación una secuencia diferente y cada uno provisto a una concentración conocida diferente y, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación, el par de cebadores patrón de cuantificación configurado para amplificar ácidos nucleicos patrón de cuantificación, en el que todos los ácidos nucleicos patrón de cuantificación tienen eficiencias de amplificación similares; dividir la mezcla de amplificación de primera etapa en una pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, comprendiendo cada una de un primer grupo de la pluralidad de reacciones de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores diana de segunda etapa configurados para amplificar, adicionalmente, una de las diferentes dianas que pueden estar presentes en la muestra, y comprendiendo cada una de un segundo grupo de la pluralidad de reacciones de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa configurados para amplificar, adicionalmente, uno de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación en el que, como mínimo, un miembro de cada uno de los pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa es diferente de ese miembro de cada uno de los otros pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa, y someter la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa a un segundo conjunto de ciclos de PCR en condiciones de amplificación para generar uno o más amplicones diana a partir de la pluralidad de dianas diferentes, teniendo cada amplicón diana un Ct diana asociado, y una pluralidad de amplicones patrón de cuantificación, teniendo cada amplicón patrón de cuantificación un Ct patrón de cuantificación asociado, en el que cada Ct diana y cada Ct patrón de cuantificación se determina durante el segundo conjunto de ciclos de PCR; generar una curva patrón a partir de los Ct patrón de cuantificación y cuantificar cada una de las una o más dianas utilizando el Ct diana asociado y la curva patrón. También se describen en el presente documento, pero no forman parte de la presente invención, procedimientos para realizar la amplificación cuantitativa de ácidos nucleicos en una muestra, comprendiendo los procedimientos: a) lisar dicha muestra; b) extraer las moléculas de ácido nucleico de dicha muestra; c) realizar la amplificación de ácidos nucleicos; en los que se añade un microorganismo a dicha muestra antes de o durante la etapa a) en una cantidad conocida como control de procesamiento de muestras; caracterizado por que una secuencia de ácido nucleico del control de procesamiento de muestras sirve como patrón de cuantificación. También se dan a conocer utilizaciones de un control de procesamiento de muestras como patrón de cuantificación en un procedimiento para cuantificar un ácido nucleico en una muestra, pero no forman parte de la presente invención.

Aún en otro aspecto adicional de la presente divulgación, se dan a conocer recipientes de muestra para realizar una PCR cuantitativa en dos etapas en una muestra, comprendiendo los recipientes de muestra un recipiente de amplificación que comprende una pluralidad de pares de cebadores diana, cada par de cebadores diana configurado para amplificar una diana diferente que puede estar presente en la muestra, comprendiendo, además, la mezcla de amplificación una pluralidad de ácidos nucleicos patrón de cuantificación interno, cada uno de los patrones de cuantificación una secuencia diferente y cada uno proporcionado a una concentración conocida diferente y teniendo eficiencias de amplificación similares, y, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación configurado para amplificar los ácidos nucleicos patrón de cuantificación, y una pluralidad de pocillos de reacción individuales de segunda etapa en conexión de flujo con el recipiente de amplificación, comprendiendo cada una de un primer grupo de la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores diana de segunda etapa configurados para amplificar adicionalmente una de las diferentes dianas que pueden estar presentes en la muestra, y comprendiendo cada una de un segundo grupo de la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa configurado para amplificar adicionalmente uno de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación en el que, como mínimo, un miembro de cada uno de los pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa es diferente de ese miembro de cada uno de los otros pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa.

También se describen en el presente documento, pero no forman parte de la presente invención, procedimientos para probar un procedimiento de procesamiento de muestras, que comprenden añadir un patrón de cuantificación a una muestra en una cantidad conocida; extraer ácidos nucleicos de la muestra utilizando el procedimiento de procesamiento de muestras; añadir un segundo patrón de cuantificación a la muestra en una segunda cantidad conocida; realizar la amplificación de ácidos nucleicos de los ácidos nucleicos y los patrones de cuantificación; y determinar una diferencia entre la amplificación del patrón de cuantificación y el segundo patrón de cuantificación; en el que la diferencia es indicativa de la eficiencia del procedimiento de procesamiento de muestras.

En un aspecto adicional de la presente divulgación, se dan a conocer instrumentos para realizar una PCR cuantitativa de dos etapas en una muestra, que comprenden una abertura para recibir el recipiente de muestra, tal como se da a conocer en el presente documento, un primer calentador para someter el recipiente de amplificación a condiciones de amplificación, un segundo calentador para someter la pluralidad de pocillos de reacción individuales de segunda etapa a condiciones de amplificación, un ordenador programado para generar una curva patrón utilizando la amplificación de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación y generar un resultado cuantitativo o semicuantitativo para cada diana amplificada.

Las características y ventajas adicionales de las realizaciones de la presente invención se expondrán en la descripción siguiente o se pueden aprender mediante la práctica de estas realizaciones. Las características y ventajas de estas realizaciones se pueden alcanzar y obtener por medio de los instrumentos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones adjuntas. Estas y otras características resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, o se pueden aprender mediante la práctica de estas realizaciones, tal como se expone a continuación.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Con el fin de describir la manera en que se pueden obtener las ventajas y características de la presente invención mencionadas anteriormente y otras, se hará una descripción más particular de la presente invención descrita anteriormente de manera breve con referencia a realizaciones específicas de la misma que se ilustran en los dibujos adjuntos. Entendiendo que estos dibujos representan solo realizaciones normales de la presente invención y, por lo tanto, no deben considerarse como limitantes de su alcance, la presente invención se describirá y explicará con mayor especificidad y detalle mediante la utilización de los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 muestra una bolsa flexible, según una realización de la presente invención.

Las figuras 2A-B conjuntamente forman una vista en perspectiva en despiece ordenado de un instrumento para su utilización con la bolsa de la figura 1, que incluye la bolsa de la figura 1, según una realización de ejemplo de la presente invención.

La figura 3 muestra una vista en sección transversal parcial del instrumento de las figuras 2A-B, que incluye los componentes de vejiga de la figura 2A, con la bolsa de la figura 1 mostrada en líneas discontinuas, según una realización de ejemplo de la presente invención.

La figura 4 muestra un motor utilizado en una realización ilustrativa del instrumento de la figura 2B.

La figura 5 muestra el Cp en cinco diluciones de cuatro patrones de cuantificación sintéticos prospectivos diferentes. La figura 6A es similar a la figura 5, pero mostrando datos para solo tres de los patrones de cuantificación. La figura 6B muestra una sola curva utilizando los datos de los tres patrones de cuantificación.

La figura 7 muestra una curva patrón para A. baumannii trazada junto con una curva generada a partir de los tres patrones de cuantificación. El eje x es la cantidad de A. baumannii o patrones de cuantificación incluidos en la reacción, y el eje y es el Cp.

La figura 8A muestra la curva patrón compuesta de los patrones de cuantificación y la curva patrón externa específica para A. baumannii, sin corrección. La figura 8B muestra los mismos datos que la figura 8A, con un factor de corrección específico del ensayo.

La figura 9 muestra el efecto sobre Cp de una matriz inhibidora en diversas dianas de muestra.

La figura 10 representa gráficamente los datos de la figura 9 para A. baumannii, en la que el eje x representa el aumento de la concentración de la matriz inhibidora y el eje y es Cp.

Las figuras 11A-11D muestran curvas patrón generadas a partir de tres patrones de cuantificación, con una cantidad fija de A. baumannii. Los datos en la figura 11A se generaron con una muestra en PBS, los datos en la figura 11B se generaron utilizando una dilución 10x de una matriz inhibidora, los datos en la figura 11C se generaron utilizando una dilución 2x de una matriz inhibidora, y los datos en la figura 11D se generaron utilizando una matriz inhibidora sin dilución.

La figura 12 es un diagrama de flujo del diseño del experimento del ejemplo 5.

La figura 13 muestra un gráfico del Cp en 4 diluciones de un patrón de cuantificación sintético, utilizado para generar una curva de cuantificación patrón.

La figura 14 es una representación en diagrama de caja de las diferencias entre la cuantificación con un patrón de cuantificación sintético (QS, quantification standard) y con el control de procesamiento de muestras (SPC, sample Processing control), con o sin aplicación del factor de corrección (0,46 Log en este ejemplo ilustrativo).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Las realizaciones de ejemplo se describen a continuación con referencia a los dibujos adjuntos. Son posibles muchas formas y realizaciones diferentes sin desviarse de las enseñanzas de la presente divulgación y, por lo tanto, la divulgación no se debe interpretar como limitada a las realizaciones de ejemplo establecidas en el presente documento. Al contrario, estas realizaciones de ejemplo se proporcionan para que la presente divulgación sea exhaustiva y completa, y transmita el alcance de la divulgación a los expertos en la materia. En los dibujos, los tamaños y los tamaños relativos de las capas y regiones se pueden exagerar para mayor claridad. Números de referencia similares se refieren a elementos similares a lo largo de la descripción.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos (incluidos los términos técnicos y científicos) utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden de manera común los expertos en la materia a la que se refiere la presente divulgación. Se entenderá, además, que los términos, tales como los definidos en los diccionarios de utilización común, se deben interpretar con un significado que sea consistente con su significado en el contexto de la presente solicitud y la técnica pertinente y no se deben interpretar de una manera idealizada o en un sentido excesivamente formal a menos que así se defina expresamente en el presente documento. La terminología utilizada en el presente documento en la descripción de la presente invención tiene el único propósito de describir realizaciones particulares y no pretende ser limitativa de la presente invención. Si bien en la práctica de la presente divulgación se pueden utilizar varios procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, en el presente documento solo se describen ciertos materiales y procedimientos de ejemplo.

En caso de conflicto de terminología, prevalecerá la presente memoria descriptiva.

Diversos aspectos de la presente divulgación, entre los que se incluyen dispositivos, sistemas, procedimientos, etc., se pueden ilustrar con referencia a una o más implementaciones de ejemplo. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “de ejemplo” e “ilustrativo” significan “que sirven como ejemplo, caso o ilustración” y no se deben interpretar necesariamente como preferentes o ventajosos sobre otras implementaciones dadas a conocer en el presente documento. Además, la referencia a una “implementación” o “realización” de la presente divulgación o invención incluye una referencia específica a una o más realizaciones de la misma, y viceversa, y pretende proporcionar ejemplos ilustrativos sin limitar el alcance de la presente invención, que está indicado por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la siguiente descripción.

Se observará que, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen referentes en plural a menos que el contenido indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a “una pieza” incluye una, dos o más piezas. De manera similar, la referencia a una pluralidad de referentes se debe interpretar como que comprende un solo referente y/o una pluralidad de referentes, a menos que el contenido y/o el contexto indiquen claramente lo contrario. De este modo, la referencia a “piezas” no requiere necesariamente una pluralidad de dichas piezas. Al contrario, se apreciará que independientemente de la conjugación; una o más piezas están contempladas en el presente documento.

Tal como se utilizan a lo largo de la presente solicitud, las palabras “puede” y “pueden” se utilizan en un sentido permisivo (es decir, significando tener el potencial de), en lugar del sentido obligatorio (es decir, significando deber). Además, los términos “incluyendo”, “teniendo”, “involucrando”, “conteniendo”, “caracterizado por”, variantes de los mismos (por ejemplo, “incluye”, “tiene”, “involucra”, “contiene”, etc.), y términos similares, tal como se utilizan en el presente documento, incluidas las reivindicaciones, serán inclusivos y/o abiertos, tendrán el mismo significado que la palabra “comprendiendo” y variantes de la misma (por ejemplo, “comprender” y “comprende”), y no excluyen, de forma ilustrativa, elementos o etapas de procedimiento adicionales no enumerados.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos y expresiones direccionales y/o arbitrarios, tales como “de arriba”, “de abajo”, “izquierda”, “derecha”, “arriba”, “abajo”, “superior”, “inferior”, “interior”, “exterior”, “interno”, “externo”, “de dentro” “de fuera”, “proximal”, “distal”, “delantero”, “trasero” y similares se pueden utilizar únicamente para indicar direcciones y/u orientaciones relativas y no se pretende limitar el alcance de la divulgación, incluyendo la memoria descriptiva, la presente invención y/o las reivindicaciones.

Se entenderá que cuando se hace referencia a un elemento como “acoplado”, “conectado” o “en respuesta” a otro elemento, o “sobre” el mismo, puede estar directamente acoplado, conectado o en respuesta al otro elemento, o sobre el mismo, o también pueden estar presentes elementos intermedios. Por el contrario, cuando se hace referencia a un elemento como “directamente acoplado”, “directamente conectado” o “directamente en respuesta” a otro elemento o “directamente sobre” el mismo, no hay presentes elementos intermedios.

Realizaciones de ejemplo de los conceptos de la presente invención se describen en el presente documento con referencia a ilustraciones de secciones transversales que son ilustraciones esquemáticas de realizaciones idealizadas (y estructuras intermedias) de realizaciones de ejemplo. Como tal, se esperan variaciones de las formas de las ilustraciones como resultado, por ejemplo, de técnicas de fabricación y/o tolerancias. De este modo, las realizaciones de ejemplo de los conceptos de la presente invención no se deben interpretar como limitadas a las formas particulares de las regiones ilustradas en el presente documento, sino que deben incluir desviaciones en las formas que son resultado, por ejemplo, de la fabricación. Por consiguiente, las regiones ilustradas en las figuras son de naturaleza esquemática y sus formas no pretenden ilustrar la forma real de una región de un dispositivo y no pretenden limitar el alcance de las realizaciones de ejemplo.

Se entenderá que, aunque los términos “primero”, “segundo”, etc., se pueden utilizar en el presente documento para describir diversos elementos, estos elementos no deberían estar limitados por estos términos. Estos términos solo se utilizan para distinguir un elemento de otro. De este modo, un “primer” elemento podría denominarse “segundo” elemento sin apartarse de las enseñanzas de las presentes realizaciones.

También se entiende que diversas implementaciones descritas en el presente documento se pueden utilizar en combinación con cualquier otra implementación descrita o dada a conocer, sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Por lo tanto, los productos, miembros, elementos, dispositivos, aparatos, sistemas, procedimientos, procesos, composiciones y/o kits, según ciertas implementaciones de la presente divulgación pueden incluir, incorporar o comprender de otro modo propiedades, características, componentes, miembros, elementos, etapas, y/o similares descritos en otras implementaciones (incluyendo sistemas, procedimientos, aparatos y/o similares) dadas a conocer en el presente documento sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Por tanto, la referencia a una característica específica en relación con una implementación no se debe interpretar como limitada a aplicaciones solo dentro de dicha implementación.

Los encabezados utilizados en el presente documento son solo para fines organizativos y no pretenden limitar el alcance de la descripción o las reivindicaciones. Para facilitar la comprensión, se han utilizado números de referencia similares, cuando ha sido posible, para designar elementos comunes a las figuras. Además, cuando ha sido posible, se ha utilizado la misma numeración de elementos en diversas figuras. Además, cada una de las configuraciones alternativas de un elemento particular pueden incluir letras separadas, añadidas al número del elemento.

El término “aproximadamente” se utiliza en el presente documento para significar aproximadamente, en la región de, más o menos o alrededor. Cuando el término “aproximadamente” se utiliza junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo al extender los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término “aproximadamente” se utiliza en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor establecido en una variación del 5 %. Cuando se expresa tal intervalo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante la utilización del antecedente “aproximadamente”, se entenderá que el valor particular conforma otra realización. Se entenderá, además, que los valores extremos de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación con el otro valor extremo como independientemente del otro valor extremo.

La palabra “o”, tal como se utiliza en el presente documento, significa cualquier miembro de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.

Por “muestra” se entiende un animal; un tejido u órgano de un animal; una célula (ya sea dentro de un individuo, tomada directamente de un individuo, o una célula mantenida en cultivo o de una línea celular cultivada); un lisado celular (o fracción de lisado) o extracto celular; una solución que contiene una o más moléculas derivadas de una célula, material celular o material viral (por ejemplo, un polipéptido o ácido nucleico); o una solución que contiene un ácido nucleico no natural, de forma ilustrativa, una biblioteca de ADNc o de secuenciación de nueva generación, que se analiza tal como se describe en el presente documento. Una muestra también puede ser cualquier fluido o excreción corporal (por ejemplo, sin limitación a los mismos, sangre, orina, heces, saliva, lágrimas, bilis o líquido cefalorraquídeo) que puede o no contener células huésped o patógenas, componentes celulares o ácidos nucleicos.

La frase “ácido nucleico”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido natural o sintético, ya sea ADN o ARN o híbrido ADN-ARN, monocatenario o bicatenario, sentido o antisentido, que es capaz de hibridarse con un ácido nucleico complementario mediante apareamiento de bases de Watson-Crick. Entre los ácidos nucleicos de la presente invención también se pueden incluir análogos de nucleótidos (por ejemplo, BrdU), bases modificadas o tratadas y enlaces internucleósidos no fosfodiéster (por ejemplo, enlaces de ácido nucleico peptídico (PNA) o tiodiéster). En particular, entre los ácidos nucleicos se pueden incluir, sin limitación, ADN, ADNc, ADNg, ADNmc, ADNbc, A^rN, incluidos todos los tipos de ARN tales como miARN, ARNmt, ARNr, incluidas regiones codificantes o no codificantes, o cualquier combinación de los mismos.

Por “sonda”, “cebador” u “oligonucleótido” se entiende una molécula de ácido nucleico monocatenario de secuencia definida que puede aparear sus bases con una segunda molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia complementaria (la “diana”). La estabilidad del híbrido resultante depende de la longitud, el contenido de GC y la extensión del apareamiento de bases que se produce. La extensión del apareamiento de bases se ve afectada por parámetros tales como el grado de complementariedad entre la sonda y las moléculas diana y el grado de rigurosidad de las condiciones de hibridación. El grado de rigurosidad de la hibridación se ve afectado por parámetros tales como la temperatura, la concentración de sal y la concentración de moléculas orgánicas, tales como la formamida, y se determina mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Las sondas, los cebadores y los oligonucleótidos se pueden marcar de forma detectable, ya sea de forma radiactiva, fluorescente o no radiactiva, mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Los colorantes de unión a ADNbc pueden utilizarse para detectar ADNbc. Se entiende que un “cebador” está específicamente configurado para ser extendido por una polimerasa, mientras que una “sonda” u “oligonucleótido” puede estar configurado así o no. Como sonda, el oligonucleótido se podría utilizar como parte de muchas químicas basadas en cebadores y sondas de PCR fluorescentes conocidas en la técnica, entre las que se incluyen aquellas que comparten la utilización de configuraciones de extinción de fluorescencia y/o transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET, fluorescence resonance energy transfer), tales como como sondas de nucleasa 5' (sondas TaqMan®), sondas de hibridación dual (HybProbes®), o sondas Eclipse® o balizas moleculares, o ensayos Amplifluor®, tales como cebadores de PCR Scorpions®, LUX® o QZyme®, entre los que se incluyen aquellos con bases naturales o modificadas.

Por “colorantes que se unen a ADNbc” se entiende colorantes que emiten fluorescencia de forma diferente cuando se unen a ADN bicatenarios que cuando se unen a ADN monocatenarios o libres en solución, normalmente mediante una fluorescencia más intensa. Si bien se hace referencia a colorantes de unión a ADNbc, se entiende que en el presente documento se puede utilizar cualquier colorante adecuado, con algunos colorantes ilustrativos no limitativos descritos en la Patente US 7,387,887. Se pueden utilizar otras sustancias productoras de señales para detectar la amplificación y fusión de ácidos nucleicos, de forma ilustrativa, enzimas, anticuerpos, etc., tal como se conocen en la técnica.

Por “se hibrida específicamente” se entiende que una sonda, cebador u oligonucleótido reconoce e interactúa físicamente (es decir, sus bases se aparean) con un ácido nucleico sustancialmente complementario (por ejemplo, un ácido nucleico de muestra) en condiciones de alta rigurosidad, y sus bases no se aparean sustancialmente con otros ácidos nucleicos.

Por “condiciones de alta rigurosidad” se entiende, aproximadamente, la temperatura de fusión (Tm) menos 5 °C (es decir, 5 °C por debajo de la Tm del ácido nucleico). Funcionalmente, se utilizan condiciones de alta rigurosidad para identificar secuencias de ácido nucleico que tienen, como mínimo, un 80 % de identidad de secuencia.

Si bien la PCR es el procedimiento de amplificación utilizado en los ejemplos del presente documento, se entiende que puede ser adecuado cualquier procedimiento de amplificación que utilice un cebador. Entre dichos procedimientos adecuados se incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de cualquier tipo (de una sola etapa, de dos etapas u otros); amplificación por desplazamiento de cadena (S^dA, strand displacement amplification); amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, nucleic acid sequence-based amplification); amplificación en cascada de círculo rodante (CRCA, cascade rolling circle amplification), amplificación isotérmica de ADN mediada por bucle (LAMP, loop-mediated isothermal amplification of DNA); amplificación de ácidos nucleicos iniciada por cebadores isotérmicos y quiméricos (ICAN, isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids); amplificación dependiente de helicasa basada en diana (HDA, target based-helicase dependent amplification); amplificación mediada por transcripción (TMA, transcription-med iated amplification), técnicas de secuenciación de nueva generación y similares. Por lo tanto, cuando se utiliza el término PCR, se debe entender que incluye otros procedimientos de amplificación alternativos, incluidos los procedimientos de cuantificación de aminoácidos. Para procedimientos de amplificación sin ciclos discretos, se puede utilizar el tiempo de reacción cuando las mediciones se realizan en ciclos o Cp, y se puede añadir tiempo de reacción adicional cuando se añaden ciclos de PCR adicionales en las realizaciones descritas en el presente documento. Se entiende que los protocolos pueden necesitar ser ajustados en consecuencia.

Por “control de procesamiento de muestras” se entiende un patógeno, un microorganismo, una célula, viva o no, un ácido nucleico o cualquier partícula, natural o sintética, que posea la capacidad de imitar un patógeno o una parte del mismo, o un ácido nucleico, y su comportamiento durante el flujo de trabajo de la muestra. A menudo se incluye un control de procesamiento de muestras en el dispositivo en una cantidad conocida para controlar algunas o todas las etapas del flujo de trabajo seguido por la muestra, de forma ilustrativa, para garantizar que la muestra se haya lisado correctamente, los ácidos nucleicos de los patógenos diana potencialmente infectantes hayan sido correctamente extraídos y purificados, y que haya tenido lugar la correcta amplificación y detección de secuencias específicas de los patógenos diana.

De forma ilustrativa, un microorganismo (de forma ilustrativa, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe)) que se utiliza como control de procesamiento de muestras imita lo más fielmente posible a los microorganismos diana que se van a detectar y cuantificar. La partícula de control de procesamiento de muestras puede reproducir la estructura (tal como membrana o membranas y/o cápside y/o envoltura) de los patógenos a detectar, permitiéndole imitar el comportamiento del patógeno y sus ácidos nucleicos diana a lo largo del flujo de trabajo. El objetivo del control de procesamiento de muestras es garantizar que el rendimiento de lisis y extracción de ácido nucleico de la diana sea similar al rendimiento del control de procesamiento de muestras, y que los ácidos nucleicos purificados se procesen adecuadamente para garantizar una amplificación/detección óptima. Para resultados cualitativos, se puede informar un patógeno como positivo o negativo, o se puede informar como indeterminado si falla un control de ejecución. El control de procesamiento de muestras puede ser uno de varios controles de ejecución y debe ser positivo, y quizás estar dentro de un intervalo especificado, para validar la ejecución, ya que algunas condiciones inhibidoras pueden disminuir el rendimiento de la extracción, purificación o amplificación/detección mediante PCR. El control de procesamiento de muestras se puede utilizar para supervisar este tipo de inhibición, siendo similar la reducción del rendimiento entre el control de procesamiento de muestras y el patógeno diana. Para resultados cualitativos, dicha inhibición, si no se detecta, puede conducir a un resultado de falso negativo. Para resultados cuantitativos, la inhibición de una de las etapas del flujo de trabajo puede proporcionar un resultado de cuantificación subestimado. Por lo tanto, varias realizaciones ilustrativas de la presente invención utilizan, como mínimo, un control de procesamiento de muestras (SPC) para, como mínimo, dos objetivos:

1) controlar y validar el flujo de trabajo: el papel clásico del SPC, tal como se describió anteriormente, y

2) ayudar en la cuantificación de uno o más ácidos nucleicos diana en una muestra analizada: una nueva función del SPC que también se utiliza como patrón de cuantificación.

De forma ilustrativa, el SPC sigue parte o la totalidad del proceso al que se somete la muestra. De este modo, el SPC se puede añadir antes o durante la etapa de lisis de la muestra. El control de procesamiento de muestras se puede elegir en función del tipo de patógeno o patógenos diana. Por ejemplo, se puede elegir un bacteriófago, tal como el PhiX 174 para un ensayo centrado en virus, siendo un bacteriófago un buen candidato para imitar los virus diana, o una levadura, tal como S. pombe, para su utilización en un ensayo de cuantificación amplio de bacterias y levaduras.

Si se va a detectar un solo patógeno, los dos ensayos de amplificación, de forma ilustrativa, los ensayos de PCR (patógeno diana y control de procesamiento de muestras utilizado como patrón de cuantificación) se pueden diseñar para alcanzar las mismas características termodinámicas o similares y permitir una cuantificación precisa (tal como en el ejemplo 5) utilizando un patrón de cuantificación sintético.

Para la cuantificación de múltiples patógenos (es decir, amplificación múltiplex), puede ser difícil adaptar los protocolos de amplificación, de forma ilustrativa, el diseño de PCR, del control de procesamiento de muestras, con el protocolo del ensayo de amplificación, de forma ilustrativa, un ensayo de PCR para cada patógeno, para obtener las mismas características termodinámicas debido, de forma ilustrativa, a la variabilidad de la secuencia y la longitud del amplicón. Como consecuencia, las eficiencias de PCR de los diferentes patógenos diana pueden ser diferentes. Para ello se puede calcular un factor de corrección para cada patógeno que correlacione la cuantificación obtenida con el patrón de cuantificación y la curva patrón importada.

Como alternativa al patrón de cuantificación sintético, la calibración se podría realizar frente a un microorganismo natural conocido con concentraciones conocidas o frente a otras plantillas de ácido nucleico natural.

En otra realización de la presente invención, es posible también tener una cuantificación fiable de un patógeno en cualquier sistema de amplificación con, como mínimo, dos controles de procesamiento de muestras diferentes, de forma ilustrativa, tres o cuatro diferentes, siempre que estos controles de procesamiento de muestras se puedan identificar a través de una técnica de identificación conocida, tal como sondas específicas de secuencia que están marcadas de forma fluorescente, radiactiva, quimioluminiscente, enzimática o similar, tal como se conoce en la técnica.

Si bien diversos ejemplos en el presente documento hacen referencia a dianas humanas y patógenos humanos, estos ejemplos son solo ilustrativos. Los procedimientos, kits y dispositivos descritos en el presente documento se pueden utilizar para detectar y secuenciar una amplia variedad de secuencias de ácidos nucleicos a partir de una amplia variedad de muestras, entre las que se incluyen muestras humanas, veterinarias, industriales y medioambientales.

Diversas realizaciones dadas a conocer en el presente documento utilizan una bolsa de análisis de ácido nucleico autónoma para analizar una muestra, en busca de la presencia de diversas sustancias biológicas, de forma ilustrativa, antígenos y secuencias de ácido nucleico, de forma ilustrativa, en un solo sistema cerrado. Dichos sistemas, que incluyen bolsas e instrumentos para su utilización con las bolsas, se dan a conocer con más detalle en las Patentes US 8,394,608; y US 8,895,295; y la Patente US 2014-0283945. Sin embargo, se entiende que dichos instrumentos y bolsas son solo ilustrativos, y las reacciones de preparación y amplificación de ácido nucleico discutidas en el presente documento se pueden realizar en cualquiera de una variedad de recipientes de muestra de sistema abierto o cerrado, tal como se conocen en la técnica, entre los que se incluyen las placas de 96 pocillos, placas de otras configuraciones, matrices, carruseles y similares, utilizando una variedad de sistemas de purificación y amplificación de ácidos nucleicos, tal como se conocen en la técnica. Si bien los términos “pocillo de muestra”, “pocillo de amplificación”, “recipiente de amplificación” o similares se utilizan en el presente documento, estos términos abarcan pocillos, tubos y diversos otros recipientes de reacción, tal como se utilizan en estos sistemas de amplificación. Dichos sistemas de amplificación pueden incluir una sola etapa múltiplex en un recipiente de amplificación y pueden incluir opcionalmente una pluralidad de reacciones múltiplex individuales de segunda etapa o de orden inferior en una pluralidad de pocillos de reacción individuales. En una realización, la bolsa se utiliza para analizar múltiples patógenos. La bolsa puede incluir uno o más blísteres utilizados como pocillos de muestra, de forma ilustrativa, en un sistema cerrado. De forma ilustrativa, se pueden realizar diversas etapas en la bolsa desechable opcional, incluida la preparación de ácido nucleico, la PCR primaria múltiplex de gran volumen, la dilución del producto de amplificación primaria y la PCR secundaria, que culmina con la detección opcional en tiempo real o el análisis posterior a la amplificación, tal como el análisis de curva de fusión. Además, se entiende que, aunque las diversas etapas se pueden realizar en las bolsas de la presente invención, una o más de las etapas se pueden omitir para ciertas utilizaciones y se puede modificar la configuración de la bolsa en consecuencia.

La figura 1 muestra una bolsa 510 ilustrativa que se puede utilizar en diversas realizaciones, o se puede reconfigurar para diversas realizaciones. La bolsa 510 es similar a la figura 15 de la Patente US 8,895,295, con artículos similares numerados de la misma manera. El accesorio 590 está provisto de canales de entrada 515a a 5151, que también sirven como depósitos de reactivos o depósitos de desechos. De forma ilustrativa, los reactivos se pueden liofilizar en el accesorio 590 y rehidratarse antes de su utilización. Los blísteres 522, 544, 546, 548, 564 y 566, con sus respectivos canales 514, 538, 543, 552, 553, 562 y 565 son similares a los blísteres del mismo número de la figura 15 de la Patente US 8,895,295. La zona de reacción de segunda etapa 580 de la figura 1 es similar a la de la Patente US 8,895,295, pero los pocillos de segunda etapa 582 de la matriz de alta densidad 581 están dispuestos en un patrón algo diferente. El patrón más circular de la matriz de alta densidad 581 de la figura 1 elimina los pocillos en las esquinas y puede dar como resultado un llenado más uniforme de los pocillos de segunda etapa 582. Tal como se muestra, la matriz de alta densidad 581 está provista de 102 pocillos de segunda etapa 582. La bolsa 510 es adecuada para su utilización en el instrumento FilmArray@ (BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, Utah). Sin embargo, se entiende que la realización de la bolsa es solo ilustrativa.

Si bien se pueden utilizar otros recipientes, de forma ilustrativa, la bolsa 510 está formada por dos capas de una película de plástico flexible u otro material flexible, tal como poliéster, tereftalato de polietileno (PET), policarbonato, polipropileno, polimetilmetacrilato y mezclas de los mismos que se pueden fabricar mediante cualquier proceso conocido en la técnica, que incluye extrusión, deposición por plasma y laminación. También se pueden utilizar láminas metálicas o plásticos con laminación de aluminio. En la técnica se conocen otros materiales de barrera que se pueden sellar entre sí para formar blísteres y canales. Si se utiliza una película plástica, las capas se pueden unir entre sí, de forma ilustrativa, mediante termosellado. De forma ilustrativa, el material tiene una baja capacidad de unión a ácidos nucleicos.

Para realizaciones que utilizan supervisión fluorescente, son preferentes películas plásticas que sean adecuadamente bajas en absorbancia y autofluorescencia en las longitudes de onda operativas. Dicho material se podría identificar probando diferentes plásticos, diferentes plastificantes y proporciones de composición, así como diferentes espesores de la película. Para plásticos con lámina de aluminio u otro tipo de lámina, la parte de la bolsa que va a ser leída por un dispositivo de detección de fluorescencia se puede dejar sin la lámina. Por ejemplo, si se supervisa la fluorescencia en los pocillos de segunda etapa 582 de la zona de reacción de segunda etapa 580 de la bolsa 510, entonces una o ambas capas en los pocillos 582 se dejarían sin la lámina. En el ejemplo de PCR, los laminados de película compuestos de poliéster (Mylar, DuPont, Wilmington Delaware) de, aproximadamente, 0,0048 pulgadas (0,1219 mm) de espesor y películas de polipropileno de 0,001-0,003 pulgadas (0,025-0,076 mm) de espesor funcionan bien. De forma ilustrativa, la bolsa 510 está hecha de un material transparente capaz de transmitir, aproximadamente, el 80 %-90 % de la luz incidente.

En la realización ilustrativa, los materiales se mueven entre blísteres mediante la aplicación de presión, de forma ilustrativa, presión neumática, sobre los blísteres y los canales. Por consiguiente, en realizaciones que utilizan presión, el material de la bolsa es, de forma ilustrativa, lo suficientemente flexible para permitir que la presión tenga el efecto deseado. El término “flexible” se utiliza en el presente documento para describir una característica física del material de la bolsa. El término “flexible” se define en el presente documento como fácilmente deformable mediante los niveles de presión utilizados en el presente documento sin agrietarse, romperse, cuartearse o similares. Por ejemplo, las láminas de plástico delgadas, tales como el envoltorio Saran™ y las bolsas Ziploc®, así como las láminas metálicas delgadas, tales como el papel de aluminio, son flexibles. Sin embargo, solo ciertas regiones de los blísteres y los canales necesitan ser flexibles, incluso en realizaciones que utilizan presión neumática. Además, solo un lado de los blísteres y los canales necesita ser flexible, siempre que los blísteres y los canales sean fácilmente deformables. Otras regiones de la bolsa 510 pueden estar hechas de un material rígido o pueden estar reforzadas con un material rígido.

De forma ilustrativa, se utiliza una película de plástico para la bolsa 510. Una lámina de metal, de forma ilustrativa, aluminio u otro material adecuado, se puede pulir o cortar de otro modo, para crear una matriz que tenga un patrón de superficies elevadas. Cuando se instala en una prensa neumática (de forma ilustrativa, A-5302-PDS, Janesville Tool Inc., Milton Wisconsin), de forma ilustrativa, se regula a una temperatura de funcionamiento de 195 °C, la prensa neumática funciona como una imprenta, derritiendo las superficies de sellado de la película plástica sólo donde la matriz contacta con la película. Diversos componentes, tales como cebadores de PCR (de forma ilustrativa, colocados sobre la película y secados), sustratos de unión a antígeno, perlas magnéticas y perlas de silicato de circonio se pueden sellar dentro de diversos blísteres a medida que se conforma la bolsa 510. Los reactivos para el procesamiento de muestras se pueden colocar sobre la película antes del sellado, ya sea de forma conjunta o por separado. En una realización, los trifosfatos de nucleótido (NTP, nucleotide tri-phosphates) se colocan sobre la película por separado de la polimerasa y los cebadores, eliminando esencialmente la actividad de la polimerasa hasta que la reacción se hidrata con una muestra acuosa. Si la muestra acuosa se ha calentado antes de la hidratación, esto crea las condiciones para una verdadera PCR de inicio en caliente y reduce o elimina la necesidad de costosos componentes químicos de inicio en caliente.

La bolsa 510 se puede utilizar de una manera similar a la descrita en la Patente US 8,895,295. En una realización ilustrativa, se inyecta una mezcla de 300 p.l que comprende la muestra a analizar (100 p.l) y el tampón de lisis (200 p.l) en un puerto de inyección (no mostrado) en el accesorio 590 cerca del canal de entrada 515a, y se atrae la mezcla de muestra al interior del canal de entrada 515a. Se inyecta también agua en un segundo puerto de inyección (no mostrado) del accesorio 590 adyacente al canal de entrada 5151 y se distribuye a través de un canal (no mostrado) provisto en el accesorio 590, hidratando de esta manera hasta once reactivos diferentes, cada uno de los cuales había sido proporcionado previamente en forma seca en los canales de entrada 515b a 5151. Estos reactivos pueden incluir, de forma ilustrativa, reactivos de PCR liofilizados, reactivos de extracción de ADN, soluciones de lavado, reactivos de inmunoensayo u otras entidades químicas. De forma ilustrativa, los reactivos son para extracción de ácido nucleico, PCR múltiplex de primera etapa, dilución de la reacción múltiplex y preparación de reactivos de PCR de segunda etapa, así como reacciones de control. En la realización que se muestra en la figura 1, todo lo que se necesita inyectar es la solución de muestra en un puerto de inyección y agua en el otro puerto de inyección. Después de la inyección, los dos puertos de inyección pueden sellarse. Para obtener más información sobre las diversas configuraciones de la bolsa 510 y el accesorio 590, véase la Patente US 8,895,295.

Después de la inyección, la muestra se mueve desde el canal de inyección 515a al blíster de lisis 522 a través del canal 514. El blíster de lisis 522 está provisto de perlas o partículas 534, tales como perlas de cerámica, y está configurado para agitar en vórtice mediante impactación utilizando palas o paletas giratorias provistas dentro del instrumento FilmArray@. La molienda con perlas, mediante la agitación o agitación en vórtice de la muestra en presencia de partículas de lisis, tales como las perlas de silicato de circonio (ZS, zirconium silicate) 534, es un procedimiento eficaz para formar un lisado. Se entiende que, tal como se utilizan en el presente documento, términos tales como “lisar”, “que lisa” y “lisado” no se limitan a la ruptura de células, sino que dichos términos incluyen la ruptura de partículas no celulares, tales como virus.

La figura 4 muestra un motor 819 de percusión de perlas, que comprende palas 821 que pueden montarse en un primer lado 811 del miembro de soporte 802, del instrumento 800 que se muestra en las figuras 2A-B. Las palas pueden extenderse a través de la ranura 804 para entrar en contacto con la bolsa 510. Sin embargo, se entiende que el motor 819 puede montarse en otras estructuras del instrumento 800. En una realización ilustrativa, el motor 819 es un motor de CC Mabuchi RC-280SA-2865 (Chiba, Japón), montado en el miembro de soporte 802. En una realización ilustrativa, el motor gira de 5.000 a 25.000 rpm, de manera más ilustrativa, de 10.000 a 20.000 rpm, y de manera aún más ilustrativa de 15.000 a 18.000 rpm, aproximadamente. Para el motor Mabuchi, se ha descubierto que 7,2 V proporcionan suficientes rpm para la lisis. Sin embargo, se entiende que la velocidad real puede ser algo más lenta cuando las palas 821 impactan en la bolsa 510. Se pueden utilizar otros voltajes y velocidades para la lisis según el motor y las paletas que se utilicen. Opcionalmente, se pueden proporcionar pequeños volúmenes controlados de aire en la vejiga 822 adyacente al blíster de lisis 522. Se ha descubierto que, en algunas realizaciones, llenar parcialmente la vejiga adyacente con uno o más pequeños volúmenes de aire ayuda a situar y soportar el blíster de lisis durante el proceso de lisis. De manera alternativa, se puede utilizar otra estructura, de forma ilustrativa, una junta rígida o adaptable u otra estructura de retención alrededor del blíster de lisis 522, para sujetar la bolsa 510 durante la lisis. Se entiende también que el motor 819 es solo ilustrativo, y se pueden utilizar otros dispositivos para moler, agitar o agitar en vórtice la muestra.

Una vez que las células se han lisado adecuadamente, la muestra se mueve a través del canal 538, el blíster 544 y el canal 543 hasta el blíster 546, en el que la muestra se mezcla con una sustancia que se une al ácido nucleico, tal como las perlas magnéticas recubiertas de sílice 533. Se permite que la mezcla se incube durante un período de tiempo apropiado, de forma ilustrativa, de 10 segundos a 10 minutos, aproximadamente. Un imán retráctil ubicado dentro del instrumento adyacente al blíster 546 captura las perlas magnéticas 533 de la solución, formando un gránulo contra la superficie interior del blíster 546. A continuación, el líquido sale del blíster 546 y vuelve a través del blíster 544 al interior del blíster 522, que ahora se utiliza como receptáculo de residuos. Se proporcionan uno o más tampones de lavado a partir de uno o más de los canales de inyección 515c a 515e a través del blíster 544 y el canal 543 al blíster 546. Opcionalmente, el imán se retrae y las perlas magnéticas 533 se lavan moviendo las perlas hacia adelante y hacia atrás desde los blísteres 544 y 546 a través del canal 543. Una vez que se han lavado las perlas magnéticas 533, las perlas magnéticas 533 se vuelven a capturar en el blíster 546 mediante la activación del imán, y posteriormente la solución de lavado se mueve al blíster 522. Este proceso se puede repetir, según sea necesario, para lavar el tampón de lisis y los desechos de la muestra desde las perlas magnéticas 533 que se unen al ácido nucleico.

Después del lavado, el tampón de elución almacenado en el canal de inyección 515f se mueve al blíster 548 y el imán se retrae. La solución circula entre los blísteres 546 y 548 a través del canal 552, rompiendo el gránulo de perlas magnéticas 533 en el blíster 546 y permitiendo que los ácidos nucleicos capturados se disocien de las perlas y se disuelvan. El imán se activa una vez más, capturando las perlas magnéticas 533 en el blíster 546, y la solución de ácido nucleico eluida se mueve al blíster 548.

La mezcla maestra de PCR de primera etapa procedente del canal de inyección 515g se mezcla con la muestra de ácido nucleico en el blíster 548. Opcionalmente, la mezcla se mezcla forzando la mezcla entre 548 y 564 a través del canal 553. Después de varios ciclos de mezcla, la solución está contenida en el blíster 564, en el que se proporciona un gránulo de cebadores de PCR de primera etapa, como mínimo, un conjunto de cebadores para cada diana y se realiza PCR múltiplex de primera etapa. Si están presentes dianas de ARN, se puede realizar una etapa de transcripción inversa (RT, reverse transcription) antes de la PCR múltiplex de primera etapa o simultáneamente con la misma. El ciclo de temperatura de PCR múltiplex de primera etapa en el instrumento FilmArray@ se realiza, de forma ilustrativa, durante 15-30 ciclos, aunque pueden ser deseables otros niveles de amplificación, según los requisitos de la aplicación específica. La mezcla maestra de PCR de primera etapa puede ser cualquiera de diversas mezclas maestras, tal como se conocen en la técnica. En un ejemplo ilustrativo, la mezcla maestra de PCR de primera etapa puede ser cualquiera de las químicas dadas a conocer en la Patente US2015/0118715, para su utilización con protocolos de PCR que duran 20 segundos o menos por ciclo.

Después de que la PCR de primera etapa haya transcurrido durante el número deseado de ciclos, la muestra se puede diluir, de forma ilustrativa, forzando que la mayor parte de la muestra regrese al blíster 548, dejando solo una pequeña cantidad en el blíster 564 y añadiendo la mezcla maestra de PCR de segunda etapa procedente del canal de inyección 515i. De manera alternativa, se puede mover un tampón de dilución desde 515i hasta el blíster 566 y, a continuación, mezclarlo con la muestra amplificada en el blíster 564 moviendo los fluidos de un lado a otro entre los blísteres 564 y 566. Si se desea, la dilución se puede repetir varias veces, utilizando el tampón de dilución procedente de los canales de inyección 515j y 515k, o se puede reservar el canal de inyección 515k para la secuenciación o para otros análisis posteriores a la PCR y, a continuación, añadir la mezcla maestra de PCR de segunda etapa procedente del canal de inyección 515h a parte de la muestra amplificada diluida o a la totalidad de la misma. Se entiende que el nivel de dilución se puede ajustar alterando el número de etapas de dilución o alterando el porcentaje de la muestra desechada antes de mezclarla con el tampón de dilución o la mezcla maestra de PCR de segunda etapa, que comprende componentes para la amplificación, de forma ilustrativa, una polimerasa, dNTP y un tampón adecuado, aunque pueden ser adecuados otros componentes, especialmente para procedimientos de amplificación que no sean PCR. Si se desea, esta mezcla de la muestra y mezcla maestra de PCR de segunda etapa se puede precalentar en el blíster 564 antes del movimiento a los pocillos de segunda etapa 582 para la amplificación de segunda etapa. Dicho precalentamiento puede obviar la necesidad de un componente de inicio en caliente (anticuerpo, producto químico o de otro tipo) en la mezcla de PCR de segunda etapa.

La mezcla maestra de PCR de segunda etapa ilustrativa está incompleta, al carecer de pares de cebadores, y cada uno de los 102 pocillos de segunda etapa 582 está precargado con un par de cebadores de PCR específico (o, a veces, múltiples pares de cebadores). Si se desea, la mezcla maestra de PCR de segunda etapa puede carecer de otros componentes de reacción, y estos componentes se pueden precargar también en los pocillos de segunda etapa 582. Cada par de cebadores puede ser similar o idéntico a un par de cebadores de PCR de primera etapa o se puede anidar dentro del par de cebadores de primera etapa. El movimiento de la muestra desde el blíster 564 hasta los pocillos de segunda etapa 582 completa la mezcla de reacción de la PCR. Una vez que se llena la matriz de alta densidad 581, las reacciones de segunda etapa individuales se sellan en sus respectivos blísteres de segunda etapa mediante cualquier número de medios, tal como se conoce en la técnica. Las formas ilustrativas de llenar y sellar la matriz de alta densidad 581 sin contaminación cruzada se discuten en la Patente US 8,895,295. De forma ilustrativa, las diversas reacciones en los pocillos 582 de la matriz 581 de alta densidad se ciclan térmicamente de forma simultánea, de forma ilustrativa, con uno o más dispositivos Peltier, aunque en la técnica se conocen otros medios para el ciclado térmico.

En ciertas realizaciones, la mezcla maestra de PCR de segunda etapa contiene el colorante de unión a ADNbc LCGreen® Plus (BioFire Diagnostics, LLC) para generar una señal indicativa de la amplificación. Sin embargo, se entiende que este colorante es solo ilustrativo, y que se pueden utilizar otras señales, incluyendo otros colorantes de unión a ADNbc y sondas que están marcadas de forma fluorescente, radiactiva, quimioluminiscente, enzimática o similar, tal como se conocen en la técnica. De manera alternativa, los pocillos 582 de la matriz 581 se pueden proporcionar sin señal, con los resultados que se informan mediante el procesamiento posterior.

Cuando se utiliza presión neumática para mover materiales dentro de la bolsa 510, en una realización se puede utilizar una “vejiga”. El conjunto de vejiga 810, una parte del cual se muestra en las figuras 2A-B y 3, incluye una placa de vejiga 824 que aloja una pluralidad de vejigas inflables 822, 844, 846, 848, 864 y 866, cada una de las cuales se puede inflar individualmente, de forma ilustrativa, mediante una fuente de gas comprimido. Debido a que el conjunto de vejiga 810 se puede someter a gas comprimido y utilizarse varias veces, el conjunto de vejiga 810 se puede fabricar con un material más resistente o más grueso que la bolsa. De manera alternativa, las vejigas 822, 844, 846, 848, 864 y 866 se pueden formar a partir de una serie de placas unidas entre sí con juntas, sellos, válvulas y pistones. Otras disposiciones quedan dentro del alcance de la presente invención.

El éxito de las reacciones secundarias de PCR depende de la plantilla generada mediante la reacción múltiplex de primera etapa. Normalmente, la PCR se realiza utilizando ADN de alta pureza. Los procedimientos, tales como la extracción con fenol o los kits comerciales de extracción de ADN proporcionan ADN de alta pureza. Las muestras procesadas mediante la bolsa 510 pueden requerir adaptaciones para compensar una preparación menos pura. La PCR se puede inhibir por componentes de muestras biológicas, lo que es un obstáculo potencial. De forma ilustrativa, se pueden utilizar opcionalmente la PCR de inicio en caliente, una mayor concentración de la enzima polimerasa taq, ajustes en la concentración de MgCl2, ajustes en la concentración de cebadores y la adición de adyuvantes (tales como DMSO, TMSO o glicerol) para compensar la menor pureza del ácido nucleico. Si bien es probable que los problemas de pureza sean más preocupantes con la amplificación de primera etapa y la PCR de etapa única, se entiende que también se pueden proporcionar ajustes similares en la amplificación de segunda etapa.

Cuando la bolsa 510 se coloca dentro del instrumento 800, se presiona el conjunto de vejiga 810 contra una cara de la bolsa 510, de modo que, si se infla una vejiga en particular, la presión obligará a que el líquido salga del blíster correspondiente en la bolsa 510. Además de las vejigas correspondientes a muchos de los blísteres de la bolsa 510, el conjunto de vejiga 810 puede tener actuadores neumáticos adicionales, tales como vejigas o pistones accionados neumáticamente, correspondientes a diversos canales de la bolsa 510. Las figuras 2A-B y 3 muestran una pluralidad ilustrativa de pistones o sellos duros 838, 843, 852, 853 y 865 que corresponden a los canales 538, 543, 553 y 565 de la bolsa 510, así como los sellos 871, 872, 873, 874 que minimizan el reflujo al interior del accesorio 590. Cuando se activan, los sellos duros 838, 843, 852, 853 y 865 forman válvulas de pinzamiento para apretar y cerrar los canales correspondientes. Para confinar el líquido dentro de un blíster particular de la bolsa 510, los sellos duros se activan sobre los canales que conducen hacia el blíster y desde el mismo, de modo que los actuadores funcionan como válvulas de pinzamiento para cerrar los canales apretándolos. De forma ilustrativa, para mezclar dos volúmenes de líquido en blísteres diferentes, se activa el actuador de la válvula de pinzamiento que sella el canal de conexión, y las vejigas neumáticas sobre los blísteres se presurizan de manera alternativa, forzando el líquido de un lado a otro a través del canal que conecta los blísteres para mezclar el líquido en los mismos. Los actuadores de las válvulas de pinzamiento pueden ser de diversas formas y tamaños y pueden estar configurados para apretar más de un canal a la vez. Si bien los actuadores neumáticos se discuten en el presente documento, se entiende que se contemplan otras formas de proporcionar presión a la bolsa, entre las que se incluyen diversos actuadores electromecánicos, tales como motores de control gradual, levas motorizadas, paletas rígidas accionadas por fuerzas neumáticas, hidráulicas o electromagnéticas, rodillos, balancines y, en algunos casos, resortes amartillados. Además, hay una variedad de procedimientos para cerrar canales de forma reversible o irreversible además de aplicar presión normal al eje del canal. Entre estos se incluyen doblar la bolsa a lo largo del canal, sellar con calor, hacer rodar un actuador y una variedad de válvulas físicas de sellado en el canal, tales como válvulas de mariposa y válvulas de bola. Además, se pueden colocar pequeños dispositivos Peltier u otros reguladores de temperatura adyacentes a los canales y ajustarlos a una temperatura suficiente para congelar el fluido, formando efectivamente un sello. Además, si bien el diseño de la figura 1 está adaptado para un instrumento automatizado que presenta elementos actuadores situados sobre cada uno de los blísteres y canales, se contempla también que los actuadores puedan permanecer estacionarios, y la bolsa 510 podría trasladarse en una o dos dimensiones, de modo que se podría utilizar un pequeño número de actuadores para varias de las estaciones de procesamiento, incluida la interrupción de la muestra, la captura de ácido nucleico, la PCR de primera y segunda etapa y otras aplicaciones de la bolsa 510, tales como inmunoensayo e inmuno-PCR. Los rodillos que actúan sobre canales y blísteres podrían resultar particularmente útiles en una configuración en la que la bolsa 510 se traslada entre estaciones. De este modo, aunque se utilizan actuadores neumáticos en las realizaciones dadas a conocer actualmente, cuando se utiliza en el presente documento el término “actuador neumático”, se entiende que se pueden utilizar otros actuadores y otras formas de proporcionar presión, dependiendo de la configuración de la bolsa y el instrumento.

Otros instrumentos de la técnica anterior enseñan PCR dentro de un recipiente flexible sellado. Véanse, por ejemplo, las Patentes US 6,645,758 y US 6,780,617 y la Patente US 2014/0038272. Sin embargo, incluir la lisis celular dentro del recipiente de PCR sellado puede mejorar la facilidad de utilización y la seguridad, particularmente si la muestra que se analizará puede contener un riesgo biológico. En las realizaciones ilustradas en el presente documento, los desechos de la lisis celular, así como los de todas las demás etapas, permanecen dentro de la bolsa sellada. Sin embargo, se entiende que el contenido de la bolsa podría retirarse para realizar más pruebas.

Las figuras 2A-B muestran un instrumento ilustrativo 800 que podría utilizarse con la bolsa 510. El instrumento 800 incluye un miembro de soporte 802 que podría formar una pared de una carcasa o montarse dentro de una carcasa. El instrumento 800 también puede incluir un segundo miembro de soporte (no mostrado) que se puede mover opcionalmente con respecto al miembro de soporte 802, para permitir la inserción y extracción de la bolsa 510. De forma ilustrativa, una tapa puede cubrir la bolsa 510 una vez que la bolsa 510 se haya insertado en el instrumento 800. En otra realización, ambos miembros de soporte pueden estar fijos, con la bolsa 510 mantenida en su lugar por otros medios mecánicos o por presión neumática.

En el ejemplo ilustrativo, los calentadores 886 y 888 están montados en el miembro de soporte 802. Sin embargo, se entiende que esta disposición es únicamente ilustrativa y que son posibles otras disposiciones. La placa de vejiga 810, con vejigas 822, 844, 846, 848, 864, 866, sellos duros 838, 843, 852, 853, sellos 871,872, 873, 874 que forman el conjunto de vejiga 808 se pueden montar, de forma ilustrativa, en una estructura de soporte móvil que puede moverse hacia la bolsa 510, de modo que los actuadores neumáticos entren en contacto con la bolsa 510. Cuando la bolsa 510 se inserta en el instrumento 800 y el miembro de soporte móvil se mueve hacia el miembro de soporte 802, los diversos blísteres de la bolsa 510 están en una posición adyacente a las diversas vejigas del conjunto de vejiga 810 y los diversos sellos del conjunto 808, de modo que la activación de los actuadores neumáticos puede expulsar líquido de uno o más de los blísteres de la bolsa 510 o pueden formar válvulas de pinzamiento con uno o más canales de la bolsa 510. La relación entre los blísteres y los canales de la bolsa 510 y las vejigas y sellos del conjunto 808 se ilustra en más detalle en la figura 3.

Cada actuador neumático está conectado a la fuente de aire comprimido 895 a través de las válvulas 899. Mientras que solo se muestran varias mangueras 878 en las figuras 2A-B, se entiende que cada accesorio neumático está conectado a través de una manguera 878 a la fuente de gas comprimido 895. La fuente de gas comprimido 895 puede ser un compresor o, de manera alternativa, la fuente de gas comprimido 895 puede ser un cilindro de gas comprimido, tal como un cilindro de dióxido de carbono. Los cilindros de gas comprimido son particularmente útiles si se desea portabilidad. Otras fuentes de gas comprimido quedan dentro del alcance de la presente invención.

El conjunto 808 está montado, de forma ilustrativa, sobre un miembro de soporte móvil, aunque se entiende que son posibles otras configuraciones.

Varios otros componentes del instrumento 810 están conectados también a la fuente de gas comprimido 895. Un imán 850, que está montado en un segundo lado 814 del miembro de soporte 802, se despliega y retrae, de forma ilustrativa, utilizando gas procedente de la fuente de gas comprimido 895 a través de la manguera 878, aunque en la técnica se conocen otros procedimientos para mover el imán 850. El imán 850 se asienta en el rebaje 851 en el miembro de soporte 802. Se entiende que el rebaje 851 puede ser un pasaje a través del miembro de soporte 802, de modo que el imán 850 pueda entrar en contacto con el blíster 546 de la bolsa 510. Sin embargo, dependiendo del material del miembro de soporte 802, se entiende que el rebaje 851 no necesita extenderse completamente a través del miembro de soporte 802, siempre que cuando se despliegue el imán 850, el imán 850 esté lo suficientemente cerca para proporcionar un campo magnético suficiente en el blíster 546, y cuando el imán 850 se retraiga, el imán 850 no afecte significativamente a las perlas magnéticas 533 presentes en el blíster 546. Si bien se hace referencia al imán retráctil 850, se entiende que se puede utilizar un electroimán y que el electroimán se puede activar e inactivar controlando el flujo de electricidad a través del electroimán. De este modo, aunque la presente memoria descriptiva discute la retirada o retracción del imán, se entiende que estos términos son lo suficientemente amplios para incorporar otras formas de retirar el campo magnético. Se entiende que las conexiones neumáticas pueden ser mangueras neumáticas o colectores neumáticos de aire, reduciendo así el número de mangueras o válvulas requeridas.

Los diversos pistones neumáticos 868 del conjunto de pistones neumáticos 869 también están conectados a la fuente de gas comprimido 895 a través de las mangueras 878. Si bien solo se muestran dos mangueras 878 que conectan los pistones neumáticos 868 a la fuente de gas comprimido 895, se entiende que cada uno de los pistones neumáticos 868 está conectado a la fuente de gas comprimido 895. Se muestran doce pistones neumáticos 868. Un par de dispositivos de calentamiento/enfriamiento, de forma ilustrativa, calentadores Peltier, están montados en un segundo lado 814 del soporte 802. El calentador de primera etapa 886 está situado para calentar y enfriar el contenido del blíster 564 para la PCR de primera etapa. El calentador de segunda etapa 888 está situado para calentar y enfriar el contenido de los blísteres de segunda etapa 582 de la bolsa 510, para la PCR de segunda etapa. Sin embargo, se entiende que estos calentadores se podrían utilizar también para otros propósitos de calefacción, y que se pueden utilizar otros calentadores, según sea apropiado para la aplicación particular. Son posibles otras configuraciones.

Cuando se desea la detección fluorescente, se puede proporcionar una matriz óptica 890. Tal como se muestra en las figuras 2A-B, la matriz óptica 890 incluye una fuente de luz 898, de forma ilustrativa, una fuente de luz LED filtrada, luz blanca filtrada o iluminación láser, y una cámara 896. La cámara 896 tiene, de forma ilustrativa, una pluralidad de fotodetectores, cada uno correspondiente a un pocillo de segunda etapa 582 en la bolsa 510. De manera alternativa, la cámara 896 puede tomar imágenes que contengan todos los pocillos de segunda etapa 582, y la imagen se puede dividir en campos separados correspondientes a cada uno de los pocillos de segunda etapa 582. Dependiendo de la configuración, la matriz óptica 890 puede ser estacionaria, o la matriz óptica 890 se puede colocar en impulsores conectados a uno o más motores y moverse para obtener señales de cada pocillo de segunda etapa individual 582. Se entiende que son posibles otras disposiciones.

Tal como se muestra, un ordenador 894 controla las válvulas 899 de la fuente de aire comprimido 895 y, de este modo, controla todos los componentes neumáticos del instrumento 800. El ordenador 894 también controla los calentadores 886 y 888 y la matriz óptica 890. Cada uno de estos componentes está conectado eléctricamente, de forma ilustrativa, a través de cables 891, aunque otras conexiones físicas o inalámbricas están dentro del alcance de la presente invención. Se entiende que el ordenador 894 puede estar alojado dentro del instrumento 800 o puede ser externo al instrumento 800. Además, el ordenador 894 puede incluir placas de circuito incorporadas que controlen algunos o todos los componentes, puede calcular curvas de amplificación, curvas de fusión, Cp, Ct, curvas patrón y otros datos relacionados, y también puede incluir un ordenador externo, tal como un PC de escritorio o portátil, para recibir y mostrar datos de la matriz óptica. Se puede proporcionar una interfaz, de forma ilustrativa, una interfaz de teclado, que incluye teclas para introducir información y variables tales como temperaturas, tiempos de ciclo, etc. De forma ilustrativa, también se proporciona un monitor 892. El monitor 892 puede ser, por ejemplo, un monitor LED, LCD u otro similar.

EJEMPLO 1: PCR DE ALTA DENSIDAD

En un ejemplo, se sabe que los ensayos de inmunofluorescencia comerciales estándar para los virus respiratorios comunes pueden detectar siete virus: adenovirus, PIV1, PIV2, PIV3, RSV, gripe A y gripe B. Un panel más completo incluiría, de forma ilustrativa, ensayos para otros virus, entre los que se incluyen: coronavirus, metapneumovirus humano, rinovirus y enterovirus no HRV. Para virus altamente variables, tales como Adenovirus o HRV, es deseable utilizar múltiples cebadores para apuntar a todas las ramas del linaje del virus (de forma ilustrativa, 4 conjuntos de cebadores externos y 4 internos, respectivamente). Para otros virus, tales como el coronavirus, hay 4 linajes distintos (229E, NL63, OC43, HKU1) que no varían de una temporada a otra, pero han divergido lo suficiente como para que se requieran conjuntos de cebadores separados. El panel respiratorio FilmArray® (BioFire Diagnostics, LLC de Salt Lake City, Utah) incluye adenovirus, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus 229E, coronavirus OC43, metapneumovirus humano, rinovirus/enterovirus humano, gripe A, gripe A/H1, gripe A/H3, gripe A/HI-2009, gripe B, virus de la paragripe de tipo 1, virus de la paragripe de tipo 2, virus de la paragripe de tipo 3, virus de la paragripe de tipo 4 y virus respiratorio sincitial. Además de estos virus, el panel respiratorio FilmArray@ incluye tres bacterias: Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumoniae y Mycoplasma pneumoniae. La matriz de alta densidad 581 puede acomodar un panel de este tipo en una sola bolsa 510. Hay otros paneles disponibles para FilmArray@, cada uno de los cuales analiza, como mínimo, 20 patógenos.

La mezcla maestra de PCR de segunda etapa ilustrativa contiene el colorante de unión a ADNbc LCGreen® Plus para generar una señal indicativa de amplificación. Sin embargo, se entiende que este colorante es solo ilustrativo y que se pueden utilizar otras señales, entre las que se incluyen otros colorantes de unión a ADNbc y sondas que están marcadas de forma fluorescente, radiactiva, quimioluminiscente, enzimática o similar, tal como se conocen en la técnica.

El instrumento ilustrativo FilmArray está programado para hacer llamadas positivas o negativas para cada reacción de segunda etapa en función de una fusión posterior a la PCR. La curva de fusión debe producir un pico de fusión (máximo de primera derivada o máximo negativo de primera derivada) dentro de un intervalo de temperatura predefinido, para que la llamada sea positiva. Se entiende que este procedimiento de llamada de cada reacción de segunda etapa es solo ilustrativo, y que las llamadas se pueden realizar utilizando datos de amplificación en tiempo real o mediante otros medios, tal como se conoce en la técnica.

EJEMPLO 2 - DISEÑO DE PATRONES DE CUANTIFICACIÓN PARA PCR MÚLTIPLEX

En sistemas tales como el FilmArray, en el que se realiza una sola PCR múltiplex en una cámara de reacción, no es conveniente generar curvas patrón utilizando diluciones de 10 veces de una sola plantilla de referencia, ya que los niveles individuales no se pueden distinguir fácilmente. Por ejemplo, si se añade una sola plantilla de referencia en la cámara de reacción única de primera etapa en concentraciones de 10 copias, 100 copias y 1.000 copias, la concentración final de la plantilla de referencia en esa cámara será de 1.110 copias, y en ausencia de algún otro marcador, las diluciones individuales no serán distinguibles. Además, en un sistema de PCR múltiplex de dos etapas, las curvas patrón generadas únicamente en la PCR de segunda etapa anidada pueden tener un valor limitado para la cuantificación, ya que las reacciones de amplificación de la plantilla patrón uniplex pueden no reflejar con precisión todas las manipulaciones anteriores que la muestra sufre o puede no ser amplificada con eficiencias similares y, por lo tanto, puede no ser un reflejo de todo el proceso.

En este ejemplo ilustrativo, se utilizan diferentes plantillas de ácido nucleico (que varían, de forma ilustrativa, en secuencia y/o longitud), de forma ilustrativa patrones de cuantificación sintéticos, para representar diferentes niveles de una serie de diluciones. Los ensayos para todos los patrones de cuantificación sintéticos tienen una eficiencia de amplificación similar y producen valores de Cp iguales o similares en cada punto de dilución dado en la configuración múltiplex. De forma ilustrativa, todos los ensayos frente a diana están optimizados para las mismas características de rendimiento, incluida la eficiencia, aunque se pueden aplicar correcciones para ajustar la variación de eficiencia específica del ensayo.

En un ejemplo ilustrativo, los tamaños de los amplicones externos e internos para los patrones de cuantificación pueden ser representativos de los tamaños de los amplicones para los ensayos frente a diana cuantitativos. Además, la secuencia o el contenido de GC puede ser el mismo o similar entre las regiones de cebado. De forma ilustrativa, las secuencias pueden ser idénticas con la excepción de, como mínimo, una región de cebado interna, que debe ser lo suficientemente diferente para evitar la reactividad cruzada entre los ensayos internos. Si las secuencias difieren solo en la región de unión del cebador interno, se pueden utilizar los mismos cebadores de PCR1 para amplificar todos los patrones de cuantificación, minimizando de este modo las posibles diferencias en el rendimiento de los ensayos de PCR1. Además, si se utilizan marcadores, las secuencias pueden ser idénticas, y si no se utilizan marcadores, incluso una ligera diferencia en la secuencia puede proporcionar detección, de forma ilustrativa, en una reacción uniplex de segunda etapa. Sin embargo, se entiende que estos parámetros son únicamente ilustrativos y que son posibles otros medios para la detección y el control de las eficiencias de amplificación. Se entiende que los patrones de cuantificación presentes en la reacción múltiplex se deben diseñar para que coincidan con los parámetros de reacción, tales como concentración de Mg2+, de cebador, Tm y condiciones de ciclo. También se entiende que es deseable minimizar la amplificación no específica de las plantillas sintéticas en la reacción de PCR múltiplex.

La figura 5 muestra el Cp frente a la concentración de cuatro patrones de cuantificación internos prospectivos. En esta realización ilustrativa, los patrones de cuantificación internos tienen secuencias sintéticas. En este ejemplo ilustrativo, para la reacción interna de segunda etapa, los cuatro patrones de cuantificación comparten un cebador común y cada uno tiene un cebador específico único. También se diseñaron para compartir ambos cebadores externos para la PCR de primera etapa. De este modo, cada uno de los pocillos de segunda etapa utilizados para detectar los patrones de cuantificación reaccionaría con el cebador común y el cebador para ese patrón de cuantificación, de modo que solo debería amplificarse un patrón de cuantificación en cada pocillo. Sin embargo, se entiende que este es solo un ejemplo ilustrativo y que son posibles otras configuraciones. Syn2, Syn3 y Syn4 tienen eficiencias de amplificación similares y se eligieron para un estudio adicional. Syn1 se comporta de manera diferente y se omitió en trabajos posteriores. Los patrones de cuantificación múltiple tienen eficiencias de amplificación similares.

En este ejemplo ilustrativo, la amplificación se detectó utilizando el colorante de unión a ADNbc LCGreen Plus. Sin embargo, esto es solo ilustrativo y otros colorantes de unión a ADNbc, sondas, señales u otras formas de detección de amplificación quedan dentro del alcance de la presente invención.

Se entiende que existen diversas formas de diseñar patrones de cuantificación que tengan eficiencias de amplificación similares. En una realización, los patrones de cuantificación tienen la misma secuencia entre los cebadores internos y difieren solo en la secuencia de unión del cebador interno. En otra realización, todos los patrones de cuantificación tienen sustancialmente la misma longitud y sustancialmente el mismo contenido de GC. Aún en otra realización, las secuencias tienen diferentes longitudes, pero también difieren en el contenido de GC para compensar. En la técnica se conocen otras formas de diseñar ácidos nucleicos con eficiencias de amplificación similares.

En una realización, de forma ilustrativa, cuando los patrones de cuantificación se utilizan en una reacción de PCR múltiplex anidada de dos etapas, todos los patrones de cuantificación pueden utilizar los mismos cebadores externos en la reacción de PCR de primera etapa, potencialmente compartiendo incluso regiones idénticas que rodean los cebadores para evitar diferencias debidas a las formaciones de estructuras secundarias. Los patrones de cuantificación se pueden distinguir posteriormente mediante la utilización de diferentes cebadores internos en las reacciones de PCR individuales de segunda etapa, ya sea con cada calibrador teniendo un par único de cebadores internos o, tal como se ha indicado anteriormente, compartiendo un cebador interno y teniendo un cebador interno único. Dicha realización tiene ventajas en el sentido de que cada uno de los patrones de cuantificación se une a sus cebadores de primera etapa con la misma cinética, y se puede minimizar la complejidad de la reacción de PCR múltiplex de primera etapa.

Si bien se hace referencia a la PCR de dos etapas, se puede utilizar el mismo principio en una PCR múltiplex de una sola etapa. En este caso, los patrones de cuantificación pueden tener cebadores directos o inversos diferentes o los mismos cebadores directos e inversos y, de forma ilustrativa, cada uno tiene una sonda fluorescente específica u otro marcador identificable, tal como quimioluminiscencia, bioluminiscencia, radioluminiscencia, electroluminiscencia, electroquimioluminiscencia, mecanoluminiscencia, cristaloluminiscencia, termoluminiscencia, sonoluminiscencia, fosforescencia y otras formas de fotoluminiscencia, enzimática, radiactiva y similares que se contemplan en el presente documento. La aplicación solo está limitada por el número de canales de detección disponibles en cualquier sistema u otros procedimientos para distinguir los marcadores, como se conocen en la técnica. Algunos marcadores pueden requerir un procesamiento posterior a la amplificación. Además, se entiende que los patrones de cuantificación marcados se pueden utilizar en una PCR de dos etapas en la que se pueden utilizar secuencias de cebadores iguales o diferentes y el marcador se utiliza para la detección en la PCR de segunda etapa. En dicha realización, los patrones de cuantificación marcados se pueden multiplexar opcionalmente en la PCR de segunda etapa y distinguirse por el marcador.

Aunque en este ejemplo se utilizan patrones de cuantificación sintéticos, se entiende que las secuencias utilizadas para los patrones de cuantificación pueden ser naturales. Por ejemplo, si se utiliza levadura como SPC, las secuencias de levadura se pueden utilizar para una o más de las secuencias patrón de cuantificación. Para la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe, el elemento/transposón retrotransponible de tipo Tf2 está presente en 13 copias mientras que los genes de ARN ribosómico se repiten 47 veces. En otro ejemplo, se pueden utilizar secuencias de genes que existen en diferentes números de copias. De forma ilustrativa, los patógenos fúngicos tienen de 50 a 200 copias del gen del ARN ribosómico por genoma nuclear. Estos patógenos también tienen transposones que varían entre cinco y 20 copias por genoma. Los patógenos bacterianos tienen entre 1 y 15 copias por genoma, pero la mayoría tiene más de 5 copias. Se pueden utilizar otras plantillas naturales o sintéticas, tales como bacteriófagos para virus y partículas sintéticas capaces de imitar estructuras de membrana y/o cápside y/o envoltura. Además, aunque se utilizan tres patrones de cuantificación en muchos de los ejemplos del presente documento, se entiende que solo se necesitan dos patrones de cuantificación para definir una curva patrón lineal, y se pueden desear más patrones de cuantificación en realizaciones en las que se espera un amplio intervalo de concentraciones diana o en las que se espera una curva patrón no lineal. De forma ilustrativa, el número de patrones de cuantificación se puede elegir en función del intervalo dinámico del sistema y los requisitos del ensayo.

De manera alternativa, como se muestra en el ejemplo 5, también es posible utilizar solo un patrón de cuantificación (véase el control de procesamiento de muestras (SPC) discutido en el ejemplo 5) en cada ejecución experimental y confiar en una curva patrón importada para la cuantificación generada previamente con un intervalo de patrones de cuantificación, de forma ilustrativa con, como mínimo, 3 patrones de cuantificación (denominados QS en el ejemplo 5) que se pueden incluir en el software para este análisis.

EJEMPLO 3 - CALIBRACIÓN MÚLTIPLEX

La figura 6A es similar a la figura 5, pero muestra datos solo de las tres secuencias de calibrador elegidas. La figura 6A demuestra la linealidad y las eficiencias de amplificación casi idénticas para los tres patrones de cuantificación ilustrativos. La figura 6B muestra una curva patrón compuesta generada a partir de la combinación de tres puntos de cada uno de los tres patrones de cuantificación en un total de cinco diluciones.

Ahora que se ha generado el gráfico de calibración ilustrativo, se puede generar una curva patrón utilizando plantillas de referencia específicas del ensayo para cada ensayo frente a diana. La figura 7 compara la curva patrón generada externamente utilizando una plantilla de referencia sintética bien cuantificada para Acinetobacter baumannii con una curva de patrón interno compuesta generada utilizando los patrones de cuantificación. Aquí, las tres plantillas “Syn” se mezclaron previamente antes de añadirlas al tubo de reacción; se añadieron 103 copias de Syn4, se añadieron 104 copias de Syn2 y se añadieron 105 copias de Syn3 por reacción. Los valores de Cp de estas plantillas se utilizaron para generar una curva de patrón interno compuesta para cada reacción. Se generó una curva patrón externa utilizando una plantilla de referencia sintética de A. baumannii, probada también a las mismas concentraciones que las plantillas “Syn”. La curva de patrón interno compuesta y las curvas patrón de A. baumannii son muy similares. La pendiente similar muestra que las eficiencias son similares. Se espera que se pueda predecir una concentración inicial desconocida de una muestra de A. baumannii utilizando la curva de patrón interno. Sin embargo, debido a que la intersección con el eje y se desplaza entre las dos curvas, la cuantificación de A. baumannii se puede beneficiar de un factor de corrección cuando se utiliza esta curva de patrón interno.

De este modo, la concentración de organismos diana se puede calcular utilizando la curva de patrón interno compuesta. Cabe señalar que cada uno de los patrones internos está en diferentes concentraciones conocidas y se amplifican en el mismo proceso que los organismos diana. Los procedimientos utilizan, de forma ilustrativa, valores de umbral de ciclo (Ct) (o, de manera alternativa, un valor de Cp u otros procedimientos similares), que es el número de ciclos de PCR necesarios para obtener una señal de fluorescencia por encima de la fluorescencia de fondo, para la diana y el patrón interno, según se determina experimentalmente. También se pueden utilizar otros puntos, tales como la utilización de una derivada de primer, segundo o n-ésimo orden, de forma ilustrativa, tal como se enseña en la Patente US 6,303,305. También se pueden utilizar otros puntos, tal como se conoce en la técnica, y cualquiera de dichos puntos se puede sustituir por Cp o Ct en cualquiera de los procedimientos discutidos en el presente documento. De forma ilustrativa, en un sistema múltiplex de dos etapas, el valor de Cp se determina en las reacciones anidadas de segunda etapa. Sin embargo, en otras realizaciones, se entiende que el Cp se puede determinar según sea apropiado para el sistema de amplificación. Por ejemplo, el Cp se puede determinar en una única reacción múltiplex o en una segunda etapa de reacción posterior mediante la utilización de sondas de oligonucleótidos, cada una de las cuales es específica para una secuencia patrón de cuantificación y tiene una señal fluorescente distinguible.

En un ejemplo ilustrativo en el que se utiliza un patrón interno único, la concentración del organismo diana se puede calcular utilizando el Ct del organismo diana (Ctt), la concentración y el Ct del patrón interno (Concentraciones, Cts), y la eficiencia del organismo diana (Eficienciat), según la siguiente fórmula.

Concentraciónt = Concentracións * Eficiencia[cts Ctt'> [Ecuación 1]

En la que los subíndices s y t representan el patrón de cuantificación interno y el organismo diana, respectivamente, y

Eficienciat = 1 — ----------^ ---------— [Ecuación 2]

Por ejemplo, la variable Eficiencia para una diana con el 100 % de amplificación en cada ciclo de PCR sería igual a 2. Cabe señalar que se supone que la eficiencia está predeterminada y es constante en un intervalo dinámico. Tal como se ha discutido anteriormente, las eficiencias de los calibradores internos deben ser todas similares, de forma ilustrativa, dentro del 1 %, dentro del 2 %, dentro del 5 % o dentro del 10 % entre sí. De manera similar, las eficiencias de las dianas deben ser similares a las de los calibradores, de forma ilustrativa dentro del 2 %, dentro del 5 %, dentro del 10 % o dentro del 12 % de la de los calibradores. Se entiende que, para una cuantificación precisa, son deseables eficiencias dentro de un intervalo más estrecho, de forma ilustrativa, dentro del 1 %, dentro del 2 % o dentro del 5 %. Sin embargo, para resultados semicuantitativos o de “clasificación” (véase a continuación), se puede tolerar una mayor variación en las eficiencias.

Cuando se utilizan dos o más patrones de cuantificación, se puede generar una curva de cuantificación patrón, de forma ilustrativa, utilizando una línea de regresión de mínimos cuadrados ajustada a los datos (Ct, logio(Concentración)) para los patrones de cuantificación internos, tal como se ilustra en las figuras 6A-6B. De forma ilustrativa, el ajuste de regresión tiene la forma:

logio(Concentración) = (Ct - b) / a [Ecuación 3]

en la que b es la intersección y representa el valor de Ct cuando logio(Concentración) es cero, y a es la pendiente que representa el grado en que Ct cambia con un solo cambio de unidad en la concentración de la plantilla (una función de la eficiencia). Dado un valor de Ct calculado para una diana desconocida, esta fórmula proporciona la concentración diana en unidades log10. Se pueden aplicar otros algoritmos o ecuaciones, según sea necesario, para mejorar la precisión y exactitud de la cuantificación. Estos pueden incluir ajustes necesarios para sesgos específicos de la plataforma, de la matriz o del ensayo en la extracción y/o amplificación. Estos también pueden incluir algoritmos que pueden cuantificar las diferencias en la eficiencia del ensayo en las etapas separadas de cualquier proceso de amplificación de varias etapas. En algunas realizaciones, la curva patrón de cuantificación puede ser no lineal o puede ser lineal solo dentro de un cierto intervalo dinámico. De forma ilustrativa, si hay una pendiente variable dependiente de la concentración, se puede utilizar una curva de dosis-respuesta sigmoidal. Otras curvas no lineales quedan dentro del alcance de la presente invención.

El procedimiento descrito anteriormente se puede utilizar para un organismo diana con una concentración desconocida en función de los valores de Ct observados para la diana y la ecuación de regresión para la curva patrón generada utilizando patrones de cuantificación internos. Idealmente, todas las dianas que se cuantifican utilizando este enfoque deben tener ensayos que tengan eficiencias de PCR equivalentes o similares a las de los ensayos de patrones de cuantificación internos. Sin embargo, pueden existir algunas variaciones en las pendientes o intersecciones de las curvas patrón de los ensayos frente a diana. Dado que los ensayos frente a diana pueden tener características de amplificación diferentes de los patrones internos, se pueden utilizar factores de corrección específicos del ensayo para ajustar el sesgo sistemático específico del ensayo para mejorar la precisión de la concentración calculada de la diana desconocida. De forma ilustrativa, cuando se utiliza una curva de cuantificación lineal, a se puede corregir con un factor de corrección que indica una eficiencia específica del ensayo diferente (lo que cambia la pendiente) o b se puede corregir debido a la falta de condiciones óptimas de PCR para una diana específica, lo que provoca que se retrase la Ct diana. Ambas correcciones se pueden utilizar cuando corresponda. En otro ejemplo, cuando se utiliza de forma ilustrativa PCR anidada, las diferencias en b observadas en PCR2 pueden ser el resultado del resultado total de los ensayos de PCR1, debido a variaciones en las eficiencias de PCR1. En este caso, el factor de corrección se podría calcular en función de los valores de Ct o ser una constante dependiendo de la precisión de cuantificación deseada.

Por ejemplo, se puede realizar un conjunto de experimentos controlados con una concentración de organismo diana conocida. Si se utilizan múltiples réplicas en una sola concentración, entonces se puede calcular el factor de corrección específico del ensayo como la diferencia promedio de la concentración conocida y las concentraciones calculadas en unidades log10. De forma ilustrativa, para obtener la concentración logarítmica corregida del organismo diana, el factor de corrección específico del ensayo se puede añadir a la concentración logarítmica del organismo diana (tal como se ha calculado anteriormente mediante el procedimiento de patrones de cuantificación internos). De forma ilustrativa, cada secuencia diana en el ensayo múltiplex tendrá su propia corrección (o ninguna corrección en absoluto, si es muy similar a la curva patrón compuesta).

Se preparó un experimento para comparar la cuantificación de un organismo diana calculada mediante la curva patrón específica del ensayo con la calculada mediante la curva de patrón interno compuesta. En este experimento, se multiplexaron diluciones en serie de 10 veces de cantidades conocidas de ácido nucleico genómico de A. baumannii con patrones de cuantificación internos en reacciones de sobremesa. También se estableció una curva patrón específica del ensayo externo, tal como se ha descrito anteriormente en referencia a la figura 7. La figura 8A muestra los resultados de la utilización de la curva patrón compuesta de patrones de cuantificación y la curva patrón externa específica para A. baumannii. Si la curva patrón compuesta se utiliza sin corrección, existe una sobrecuantificación sistemática aparente (-0,5 unidades logarítmicas de copias) del organismo diana (A. baumannii), mientras que cuando se aplica la corrección de 0,5 unidades logarítmicas de copias, la curva patrón específica corregida por los ensayos proporciona una estimación bastante precisa del título de A. baumannii en la muestra. La figura 8B muestra cómo se puede corregir este sesgo sistemático en la cuantificación aplicando un factor de corrección específico del ensayo promedio, generado tal como se ha descrito anteriormente, a las cantidades calculadas mediante el procedimiento de la curva de patrón interno. Se pueden hacer correcciones similares para cada ensayo en la reacción múltiplex.

En muchas realizaciones, la cuantificación absoluta no es necesaria y los resultados semicuantitativos pueden ser suficientes. Los resultados se pueden informar como concentraciones absolutas (con o sin error del sistema (intervalo de predicción ilustrativo del 95 %)), o se pueden agrupar en uno de una pluralidad de intervalos, informando, de forma ilustrativa, de una concentración “alta”, “media” o “baja”, cubriendo cada una de las cuales uno o más órdenes de magnitud. Se entiende que el número de agrupamientos puede variar, según sea apropiado con un ensayo específico, y se puede utilizar cualquier número de agrupamientos. Además, el intervalo de agrupamiento (órdenes de magnitud u otras medidas) para resultados semicuantitativos se puede ajustar, según sea apropiado para el ejemplo específico.

EJEMPLO 4 - CALIBRACIÓN EN TIPOS DE MUESTRA INHIBIDORA

Las muestras inhibidoras, de forma ilustrativa, las matrices inhibidoras, pueden afectar la extracción y amplificación de los patrones de cuantificación internos y los ensayos frente a diana en más o menos la misma medida. Dado que los patrones internos responden dinámicamente a los efectos controlados por matriz de una manera similar a las secuencias diana, estos también pueden cumplir una función de normalización. En este ejemplo, se utilizaron los tres calibradores internos del ejemplo 3 en las concentraciones utilizadas anteriormente. ^t A-89 es una muestra de aspirado traqueal que resultó positiva para Streptococcus spp. y se demostró que tenía propiedades inhibidoras, tal como se refleja en los Cp considerablemente retrasados del control interno de ARN de levadura en una bolsa FilmArray ilustrativa utilizada para analizar muestras de las vías respiratorias inferiores. TA-89 se utilizó en tres concentraciones: tal cual, diluido dos veces y diluido 10 veces. Cada muestra se enriqueció con A. baumannii a 106 CFU/ml. Tal como en el ejemplo 3, también se añadieron a todas las alícuotas de muestra las tres plantillas patrón de cuantificación interno a 103, 104 y 105 copias/ml. Se enriqueció también un control de PBS sin matriz con la misma concentración de A. baumannii y calibradores internos.

La figura 9 muestra el efecto de la dilución de una matriz inhibidora, tal como TA-89, sobre la detección. El efecto de la matriz inhibidora se visualiza con los Cp más tardíos para A. baumannii en matriz sin diluir y se observa la tendencia a Cp más tempranos para A. baumannii cuando la matriz se diluye, con el Cp más temprano en la muestra que no contenía la matriz TA-89 (solo PBS). A pesar de las diferencias en los valores de Ct mediante la dilución de la matriz, la cantidad de A. baumannii es la misma en todas las diluciones de la matriz. En la figura 10, se ve una tendencia similar en los Cp para los patrones de cuantificación y los ensayos de A. baumannii, con uno de los patrones de cuantificación (103/ml) que desaparece en realidad en la matriz más inhibidora (sin diluir).

En las figuras 11A-D, se muestran las curvas patrón generadas a partir de los patrones de cuantificación internos para cada una de las diluciones de TA-89 y el control sin matriz de PBS (rombos). El Cp de A. baumannii (cuadrados) es sistemáticamente anterior al punto de 105/ml en todas las matrices de muestra. Las concentraciones calculadas para A. baumannii se muestran a continuación en la tabla 1. Todos los valores pronosticados se encuentran dentro del triple de la concentración real de 106 CFU/ml. Esto demuestra que los patrones de cuantificación internos y la plantilla de A. baumannii se ven afectados de manera similar por la matriz inhibidora, y la generación de una curva patrón a partir de los valores de Cp o Ct para los patrones de cuantificación internos proporciona una herramienta valiosa para cuantificar la diana, incluso en condiciones de matrices inhibidoras.

TABLA 1

EJEMPLO 5 - CUANTIFICACIÓN UTILIZANDO UN CONTROL DE PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

En este ejemplo, se comparó la utilización de un único patrón de cuantificación (QS) sintético a una concentración conocida con la utilización de un solo microorganismo a una concentración conocida, en el que el microorganismo se utiliza también como control de procesamiento de muestras (SPC), para la cuantificación de un patógeno (de forma ilustrativa, citomegalovirus (CMV)). En este ejemplo, se utilizó la extracción basada en columnas y la amplificación se realizó en un instrumento Bio-Rad CFX, aunque se entiende que estos procedimientos e instrumentos son solo ilustrativos.

El diseño de este experimento se muestra en la figura 12 y se realizó en dos etapas:

- una primera etapa que incluye dos partes: (A) la generación de una curva patrón cuantitativa con el patrón cuantitativo (QS) sintético y (B) la calibración de un único SPC de control de procesamiento de muestras natural con la curva patrón cuantitativa generada a partir del mismo.

- una segunda etapa correspondiente a la cuantificación del ácido nucleico diana (CMV) con el único patrón de cuantificación natural que es el SPC. En este ejemplo ilustrativo, el ácido nucleico diana es CMV y el SPC es S. pombe.

El plan del experimento es el siguiente:

De forma ilustrativa, la primera etapa se realizó de la siguiente manera:

Parte A):

Se proporciona una primera mezcla de PCR utilizando la tecnología de PCR en tiempo real de nucleasa 5' que incluye dos cebadores y una sonda, en la que los cebadores y la sonda están diseñados específicamente para amplificar y detectar y cuantificar el patógeno diana. Se utiliza otra mezcla similar a la PCR, pero diseñada para la amplificación y detección del patrón de cuantificación sintético. Se utiliza una tercera mezcla similar a PCR, diseñada para la amplificación y detección del control de procesamiento de muestras. Se entiende que la tecnología de PCR en tiempo real de nucleasa 5' es solo ilustrativa y que se pueden utilizar otros medios de detección.

En una primera ejecución de amplificación en la plataforma de amplificación deseada, se utilizó un intervalo de 4 diluciones de un patrón cuantitativo sintético (QS1 a QS4) para generar una curva de cuantificación patrón, utilizando una línea de regresión de la forma:

Ct = (a * Log10 Concentración) b [Ecuación 4]

o

Log10(Concentración) = (Ct - b) / a [Ecuación 3]

en las que a y b son tal como se han definido anteriormente.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2, a continuación, y se ilustran en la figura 13.

Tabla 2

De forma ilustrativa, en la misma primera ejecución de la plataforma de amplificación, se probó un intervalo de 4 diluciones del microorganismo SPC S. pombe. Los resultados obtenidos son los que se muestran en la tabla 3.

Tabla 3

De forma ilustrativa, la parte B) se realizó de la siguiente manera:

Los resultados obtenidos para el SPC S. pombe se calibraron frente a la curva de cuantificación patrón y se determinó el factor de calibración. Se selecciona la dilución de SPC óptima (de forma ilustrativa, la dilución 2), elegida de forma ilustrativa para que esté en el medio del intervalo de cuantificación relevante de los patógenos a detectar, en el que se colocará la curva de cuantificación patrón con su pendiente de línea de regresión predefinida. Tal como se ha discutido anteriormente, la cuantificación por PCR utiliza frecuentemente un enfoque de curva patrón. Tal como se ha discutido anteriormente también, ya se ha demostrado que una curva patrón se podría almacenar, como parámetros (intersección y pendiente), e importarse en un solo valor (Ct) que permita ajustar la cuantificación ejecución por ejecución, dependiendo del comportamiento del SPC en la ejecución.

En este ejemplo, el valor 4,547 será el valor de Log10Concentración utilizado para determinar la ecuación de las próximas ejecuciones de amplificación cuando se utilice el SPC como patrón de cuantificación para la cuantificación del CMV diana. De forma ilustrativa, el SPC se puede denominar ajustador o calibrador, porque sirve para ajustar o calibrar la curva patrón. En esta etapa, uno de los patrones sintéticos o una de las diluciones de SPC se podría utilizar como ajustador en la pendiente de la línea de regresión predefinida, con un factor de 4,903 para la utilización del patrón sintético QS3 y un factor de 4,547 para la utilización de la dilución de control de procesamiento de muestras 2. El factor 4,547 se utiliza para calcular la intersección calibrada, lo que permite calcular la concentración de CMV con el SPC como patrón cuantitativo utilizando la línea de regresión de la forma:

Logi0Concentración = (Ct - b’) / a [Ecuación 5]

con a correspondiente a la pendiente del intervalo del patrón cuantitativo sintético y b' correspondiente a la intersección calibrada y que representa el valor teórico de Ct cuando Logi0(concentración) del SPC es cero cuando se calibra frente al intervalo del patrón cuantitativo sintético.

Segunda etapa:

A continuación, se analizaron una serie de muestras en paralelo con el patrón de cuantificación QS3 y el control de procesamiento de muestras SPC S. pombe a una concentración de 80.000 copias/ml: 4 diluciones de la cepa de CMV de referencia AD169 enriquecidas en muestras de sangre completa cada una en 4 réplicas. También se utilizaron dos muestras de sangre completa obtenidas de QCMD (Quality Control Molecular Diagnostics) y 5 muestras clínicas de sangre completa.

Para las 23 muestras, la concentración de CMV en las muestras se determinó aplicando las ecuaciones 3 y 5. Los resultados estuvieron en el orden de magnitud esperado, tal como se ilustra en las tablas 4 y 5.

TABLA 4

TABLA 5

La utilización del control de procesamiento de muestras como patrón de cuantificación para ajustar los parámetros de la curva patrón para la cuantificación, aprovecha el hecho de que esta partícula pasa por todas las mismas etapas que una muestra y un patógeno potencial que infecta la muestra de prueba, pero también tiene el mismo comportamiento que el patógeno a detectar.

La diferencia de cuantificación promedio entre la cuantificación de CMV utilizando el patrón QS3 y la cuantificación de CMV utilizando el SPC dil 2 es ^k =0,46 Log. A continuación, esta se utiliza como un factor de corrección para las próximas ejecuciones para corregir Log10(concentración), de la siguiente manera:

log1ü(concentraciónt) = log^concentracións) ^k [Ecuación 6] en la que los subíndices s y t representan, respectivamente, el SPC y la diana y ^k es un factor de corrección determinado previamente para dicha diana.

De este modo, la cuantificación del patógeno puede tener en cuenta una posible pérdida de rendimiento y eficiencia a lo largo del flujo de trabajo, para ser más precisa.

Tal como se muestra en la figura 14, las diferencias entre la cuantificación con QS y con SPC fue de 0,43 Log, sin aplicar el factor de corrección (^k = 0,46) y -0,04 después de la corrección.

Se entiende que dos o más secuencias del control de procesamiento de muestras que se dan en un número de copias diferente se podrían utilizar como patrones de cuantificación internos para generar una curva de cuantificación patrón que se podría utilizar para cuantificar dianas en un ensayo múltiplex. De manera similar, se pueden utilizar, como mínimo, dos controles de procesamiento de muestras diferentes a diferentes concentraciones, nuevamente para generar una curva de cuantificación patrón que podría utilizarse como en los procedimientos dados a conocer en los ejemplos 2-4.

Además de los procedimientos de cuantificación discutidos en el presente documento, se entiende que cualquiera de los patrones de cuantificación descritos en el presente documento se puede aplicar para probar, comparar u optimizar los procedimientos de procesamiento de muestras. Los patrones de cuantificación se pueden utilizar también para ayudar a estimar los títulos reales de analitos (organismos) en la muestra original, de forma ilustrativa, al factorizar la pérdida durante la preparación de la muestra.

En un ejemplo ilustrativo, los patrones de cuantificación se pueden aplicar para comparar u optimizar los procedimientos de procesamiento de muestras. De forma ilustrativa, los patrones de cuantificación se pueden utilizar en uno o más de los siguientes procesos: (1) optimización de diversas subcaracterísticas de preparación de muestras, por ejemplo, la duración de las etapas de incubación, el tiempo de recolección de perlas magnéticas, las etapas de lavado o las etapas de elución; (2) comparación de la eficiencia de extracción de diferentes plataformas de preparación de muestras comerciales o no comerciales, por ejemplo, MagNA Pure®, QiaCube® o Easy Mag™, para adoptar una plataforma óptima; o (3) comparación del efecto de la matriz sobre la extracción, de forma ilustrativa utilizando la misma plataforma, aunque también son posibles las comparaciones entre plataformas. Por ejemplo, las matrices complejas, tales como el esputo, pueden dificultar más la extracción de ácidos nucleicos que las matrices menos complejas, tales como n Ps o BAL. Mediante modificaciones de subcaracterísticas de preparación de muestras, se pueden desarrollar protocolos de preparación de muestras que funcionen igualmente bien para múltiples matrices.

Para todas las aplicaciones anteriores, se pueden realizar comparaciones, de forma ilustrativa, añadiendo uno o más patrones de cuantificación (Plantilla A) en una cantidad fija a la muestra antes de la preparación de la muestra. La plantilla A se someterá a todos los procesos a los que se somete la muestra. Se espera que la cantidad de Plantilla A perdida durante la preparación de la muestra sea una buena aproximación de la cantidad de pérdida de ácido nucleico a partir de los analitos en la muestra. A continuación, se pueden añadir al eluido uno o más segundos patrones de cuantificación (Plantilla B) en la misma cantidad que la Plantilla A. Sin embargo, se entiende que no se requiere una proporción de 1 a 1 y que se pueden añadir otras cantidades conocidas de la Plantilla B. Se realizará una PCR en el eluido y se compararán los Cp de la Plantilla A con los Cp de la Plantilla B. Dado que no se pierde nada de la Plantilla B durante la preparación de la muestra, se espera que la Plantilla B se amplifique antes. De forma ilustrativa, el protocolo o plataforma que produzca la diferencia más pequeña en los Cp entre las Plantillas A y B puede ser un procedimiento de preparación de muestras más eficiente.

En otro ejemplo ilustrativo, los patrones de cuantificación se pueden utilizar para estimar títulos reales de analitos (por ejemplo, organismos) en la muestra original factorizando la pérdida durante la preparación de la muestra. Por tanto, la diferencia entre las Plantillas A y B se puede utilizar para retrocalcular los valores de título reales en las muestras mediante la estimación de la pérdida debido a problemas de eficiencia de extracción de la muestra. La magnitud de la pérdida se puede convertir en un factor de corrección que posteriormente se puede aplicar a las cantidades de analito determinadas por los procedimientos tradicionales de qPCR.

Se entiende que las Plantillas A y B pueden ser, cada una, un solo patrón de cuantificación, tal como en el ejemplo 5, o cualquiera o ambas pueden ser combinaciones de patrones de cuantificación, de forma ilustrativa, a diferentes concentraciones, tal como en los ejemplos 2-4.

Las realizaciones descritas deben considerarse en todos los aspectos solo como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la presente invención está, por lo tanto, indicado por las reivindicaciones adjuntas en lugar de por la descripción anterior. Si bien ciertas realizaciones y detalles se han incluido en el presente documento y en la descripción de la presente invención adjunta con el fin de ilustrar la presente invención, será evidente para los expertos en la materia que se pueden realizar diversos cambios en los procedimientos y aparatos dados a conocer en el presente documento sin apartarse del alcance de la presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para realizar la amplificación cuantitativa por PCR en dos etapas en una muestra, que comprende amplificar la muestra en una mezcla de amplificación múltiplex de primera etapa mediante un primer número de ciclos de PCR, comprendiendo la mezcla de amplificación

una pluralidad de pares de cebadores diana, cada uno de los pares de cebadores diana configurados para amplificar una de una pluralidad de dianas diferentes que pueden estar presentes en la muestra en una concentración desconocida, y

comprendiendo, además, una pluralidad de ácidos nucleicos patrón de cuantificación interno, cada uno de los patrones de cuantificación una secuencia diferente y cada uno proporcionado a una concentración conocida diferente y, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación, el par de cebadores patrón de cuantificación configurado para amplificar ácidos nucleicos patrón de cuantificación, en el que todos los ácidos nucleicos patrón de cuantificación tienen eficiencias de amplificación similares;

dividir la mezcla de amplificación de primera etapa en una pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, comprendiendo cada una de un primer grupo de la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores diana de segunda etapa configurados para amplificar adicionalmente una de las diferentes dianas que puede estar presente en la muestra, y comprendiendo cada una de un segundo grupo de la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa configurados para amplificar adicionalmente uno de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación en el que, como mínimo, un miembro de cada uno de los pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa es diferente de ese miembro de cada uno de los otros pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa; y

someter la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa a un segundo conjunto de ciclos de PCR en condiciones de amplificación para generar uno o más amplicones diana a partir de la pluralidad de dianas diferentes, teniendo cada amplicón diana un Ct diana asociado, y una pluralidad de amplicones patrón de cuantificación, teniendo cada amplicón patrón de cuantificación un Ct patrón de cuantificación asociado, en el que cada Ct diana y cada Ct patrón de cuantificación se determinan durante el segundo conjunto de ciclos de PCR;

generar una curva patrón a partir de los Ct patrón de cuantificación y cuantificar cada una de las una o más dianas utilizando el Ct diana asociado y la curva patrón.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada una de las dianas se cuantifica utilizando la curva patrón generada utilizando una línea de regresión de mínimos cuadrados ajustada a

logio(Concentración) = (Ct - b) / a

en el que Ct es un umbral de ciclo medido para cada diana,

b, la intersección, representa el valor de Ct cuando el log10(concentración) de la diana es cero, y

a es la pendiente que representa el grado en que cambia Ct con un cambio de una sola unidad en la concentración, en el que opcionalmente cada una de las dianas se cuantifica utilizando la línea de regresión de mínimos cuadrados y un factor de corrección.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la curva patrón es no lineal, o en el que la etapa de cuantificación informa una concentración, o en el que la etapa de cuantificación genera una concentración que se encuentra dentro de uno de una pluralidad de intervalos e informa de ese un intervalo.

4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la mezcla de amplificación comprende solo un par de cebadores patrón de cuantificación.

5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que los ácidos nucleicos patrón de cuantificación interno son secuencias naturales en la muestra.

6. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que todas las dianas tienen eficiencias de amplificación similares.

7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que cada uno de la pluralidad de ácidos nucleicos patrón de cuantificación interno se proporciona a la muestra en cantidades conocidas antes de la preparación de la muestra para servir también como controles del proceso.

8. Procedimiento, según la reivindicación 7, que comprende, además, detectar la amplificación de cada uno de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación utilizando un marcador específico para ese ácido nucleico patrón de cuantificación, en el que opcionalmente cada uno de los marcadores es una sonda marcada distinguible.

9. Recipiente de muestra para realizar el procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende un recipiente de amplificación que comprende la pluralidad de pares de cebadores diana, comprendiendo además el recipiente de amplificación la pluralidad de ácidos nucleicos patrón de cuantificación interno, cada uno de los patrones de cuantificación una secuencia diferente y cada uno proporcionado a una concentración conocida diferente y teniendo eficiencias de amplificación similares, y el, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación, según se define en la reivindicación 1, y

la pluralidad de pocillos de reacción individuales de segunda etapa en conexión de flujo con el recipiente de amplificación, comprendiendo cada una del primer grupo de la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores diana de segunda etapa configurados para amplificar adicionalmente una de las diferentes dianas que pueden estar presente en la muestra, y comprendiendo cada una del segundo grupo de la pluralidad de reacciones individuales de segunda etapa, como mínimo, un par de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa configurado para amplificar adicionalmente uno de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación en el que, como mínimo, un miembro de cada uno del par de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa es diferente de ese miembro de cada uno de los otros pares de cebadores patrón de cuantificación de segunda etapa.

10. Instrumento para realizar el procedimiento, según la reivindicación 1, en una muestra, que comprende una abertura para recibir el recipiente de muestra, según la reivindicación 9,

un primer calentador para someter el recipiente de amplificación a condiciones de amplificación,

un segundo calentador para someter la pluralidad de pocillos de reacción individuales de segunda etapa a condiciones de amplificación,

un ordenador programado para generar una curva patrón utilizando la amplificación de los ácidos nucleicos patrón de cuantificación y generar un resultado cuantitativo o semicuantitativo para cada diana amplificada.