JP6979029B2 - 定量的増幅方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国特許法119条(e)の下、その内容全体が本明細書中に参考として組み込まれている2016年3月24日に出願の米国仮出願第62/313,032号の優先権を主張するものである。
1)ワークフローをコントロールし、その正当性を実証するため(上述のSPCの古典的な役割)、および
2)試験した試料中の標的核酸の定量を援助するため(定量標準としても使用されるSPCの新しい役割)。
一例では、一般的な呼吸器ウイルスの標準の市販の免疫蛍光アッセイは、7つのウイルス、すなわち、アデノウイルス、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、インフルエンザA、およびインフルエンザBを検出できることが知られている。より完全なパネルには、例示的には、コロナウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ライノウイルス、および非HRVエンテロウイルスを含めた他のウイルスのアッセイが含まれるであろう。アデノウイルスまたはHRVなどの高度に変異性のウイルスでは、ウイルス系統のすべての分岐を標的とするために複数のプライマーを使用することが望ましい(例示的には、それぞれ4つの外部および4つの内部プライマー組)。コロナウイルスなどの他のウイルスでは、季節毎に変化しないが別々のプライマー組が必要なほどに分岐している、4つの明確な系統(229E、NL63、OC43、HKU1)が存在する。FilmArray(商標)呼吸器パネル(ユタ州Salt Lake CityのBioFire Diagnostics,LLC)には、アデノウイルス、コロナウイルスHKU1、コロナウイルスNL63、コロナウイルス229E、コロナウイルスOC43、ヒトメタニューモウイルス、ヒトライノウイルス/エンテロウイルス、インフルエンザA、インフルエンザA/H1、インフルエンザA/H3、インフルエンザA/H1−2009、インフルエンザB、パラインフルエンザウイルス1、パラインフルエンザウイルス2、パラインフルエンザウイルス3、パラインフルエンザウイルス4、および呼吸器合胞体ウイルスが含まれる。これらのウイルスに加えて、FilmArray(商標)呼吸器パネルには、百日咳菌(Bordetella pertussis)、肺炎クラミジア(Chlamydophila pneumoniae)、および肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)の3つの細菌が含まれる。高密度アレイ581は、単一のパウチ510でそのようなパネルを受け入れることができる。FilmArray(商標)の他のパネルが利用可能であり、それぞれが少なくとも20個の病原体のアッセイを行う。
例示的なFilmArray機器は、PCR後融解に基づいて、それぞれの第2段階反応について正または負のコールを行うようにプログラミングされている。コールが正となるためには、融解曲線は事前に定義された温度範囲内で融解ピーク(一次導関数最大または負の一次導関数最大)を生じなければならない。それぞれの第2段階反応のコールを行うこの方法は例示的のみであり、リアルタイム増幅データまたは当技術分野で知られている他の手段を使用してコールを行うことができることが理解されよう。
単一の多重PCRを1つの反応チャンバー内で行うFilmArrayなどのシステムでは、個々のレベルを容易に識別できないため、単一の参照鋳型の10倍希釈液を使用した検量線を作成することは好都合でない。たとえば、単一の参照鋳型を単一の第1段階反応チャンバーに10個のコピー、100個のコピー、および1000個のコピーの濃度で加えた場合、そのチャンバー内の参照鋳型の最終濃度は1110個のコピーとなり、何らかの他の標識が存在しない限り、個々の希釈液は識別可能でない。さらに、一重の標準鋳型増幅反応は試料が受ける上流の操作のすべてを正確に反映していな場合がある、または同様の効率で増幅されない場合があり、したがってプロセス全体を反映していない場合があるため、2ステップ多重PCRシステムでは、入れ子第2段階PCRにおいてのみ作成された検量線は、定量において価値が限定的であり得る。
図6Aは図5と同様であるが、3つの選択された較正用配列からのデータのみを示す。図6Aは、3つの例示的な定量標準の直線性およびほぼ同一の増幅効率を実証している。図6Bは、合計5つの希釈液にわたる3つの定量標準のそれぞれ3点の組合せから作成した複合検量線を示す。
濃度t=濃度*効率t (Cts−Ctt) [方程式1]、
[式中、下付き文字sおよびtは、それぞれ内部定量標準および標的生物を表す]、ならびに
効率t=1+効率の%/100 [方程式2]。
たとえば、それぞれのPCRサイクルで100%の増幅を有する標的の効率の変数は2に等しい。効率は事前に決定されており、ダイナミックレンジにわたって一定であると仮定されることに注意されたい。上述のように、内部較正用物質の効率はすべて同様であるべきであり、例示的には互いに1%以内、2%以内、5%以内、または10%以内である。同様に、標的の効率のそれぞれは較正用物質のそれと同様であるべきであり、例示的には較正用物質の2%以内、5%以内、10%以内、または12%以内である。正確な定量には、より狭い範囲内の効率、例示的には1%以内、2%以内、または5%以内が望ましいことが理解されよう。しかし、半定量的または「ビン化」結果には(以下を参照)、効率のより大きな変動が許容され得る。
log10(濃度)=(Ct−b)/a [方程式3]、
[式中、bは切片であり、log10(濃度)がゼロである場合のCtの値を表し、aは傾きであり、鋳型濃度の単一単位の変化でCtが変化する度合を表す(効率の関数)]。未知の標的の計算Ct値が与えられると、この式は標的濃度をLog10単位で与える。定量の精度および正確さを改善するために、他のアルゴリズムまたは方程式を必要に応じて適用し得る。これらには、抽出および/または増幅におけるプラットフォームに特異的、マトリックスに特異的、またはアッセイに特異的な偏りに必要な調節が含まれる。また、これらには、任意の複数ステップ増幅プロセスの別々のステップにおけるアッセイ効率の相違を考慮することができるアルゴリズムも含まれ得る。一部の実施形態では、定量検量線は非線形であってよく、または特定のダイナミックレンジ内でのみ線形であってもよい。例示的には、濃度依存性の変数の傾きが存在する場合、S字形用量応答曲線を使用し得る。他の非線形曲線が本発明の範囲内である。
阻害性試料、例示的には阻害性マトリックスは、内部定量標準および標的アッセイの抽出および増幅に多かれ少なかれ同じ程度の影響を与えることができる。内部標準は、標的配列と同様の様式でマトリックス主導の効果に動的に応答するため、これらは正規化の機能を果たすことができる。本実施例では、実施例3からの3つの内部較正用物質を、上記で使用した濃度で使用した。TA−89は、連鎖球菌属(Streptococcus)の種が陽性であり、下気道試料を試験するために使用される例示的なFilmArrayパウチにおいて内部酵母RNA対照の相当に遅延したCpに反映されているように阻害性特性を有することが示された、気管吸引液試料である。TA−89を3つの濃度、すなわち、そのまま、2倍希釈、および10倍希釈で使用した。それぞれの試料に106CFU/mLのA.バウマンニを添加した。実施例3と同様、103、104、および105個のコピー/mLの3つの内部定量標準鋳型もすべての試料アリコートに加えた。また、PBSマトリックスなし対照にも同じ濃度のA.バウマンニおよび内部較正用物質を添加した。
本実施例では、既知濃度の単一の合成定量標準(QS)の使用を既知濃度の単一の微生物の使用と比較し、ここで、微生物を病原体(例示的にはサイトメガロウイルス(CMV))を定量するための試料プロセスコントロール(SPC)としても使用した。本実施例ではカラムに基づく抽出を使用し、増幅をBio−Rad CFX機器で行ったが、これらの方法および機器は例示的のみであることが理解されよう。
−第1ステップには2パートが含まれる。(A)合成定量的標準(QS)を用いた定量的検量線の作成、および(B)それから作成された定量的検量線を用いた、単一の天然試料プロセスコントロールSPCの較正。
−第2ステップは、SPCである単一の天然定量標準を用いた標的核酸(CMV)の定量に対応する。この例示的な実施例では、標的核酸はCMVであり、SPCはS.ポンベである。
Ct=(a*Log10濃度)+b [方程式4]
または
Log10(濃度)=(Ct−b)/a [方程式3]
[式中、aおよびbは上記定義した通りである]。
得られた結果を以下の表2に示し、図13に例示する。
Log10(濃度)=(Ct−b’)/a [方程式5]、
[式中、aは合成定量的標準範囲の傾きに対応し、b’は較正された切片に対応し、定量的合成標準範囲に対して較正した場合にSPCのLog10(濃度)がゼロである場合に、Ctの理論値を表す]。
log10(濃度t)=log10(濃度)+κ [方程式6]
[式中、下付き文字sおよびtはそれぞれSPCおよび標的を表し、κは前記標的について事前に決定された補正係数である]。
514 チャネル
515a〜515l チャネル
522 溶解ブリスター
533 磁気ビーズ
534 ビーズまたは粒子
538 チャネル
543 チャネル
544 ブリスター
546 ブリスター
548 ブリスター
552 チャネル
553 チャネル
562 チャネル
565 チャネル
564 ブリスター
566 ブリスター
580 第2段階反応区域
581 高密度アレイ
582 第2段階ウェル
582 第2段階ブリスター
590 取付物
800 機器
802 支持メンバー
804 スロット
810 ブラダーアセンブリ
808 アセンブリ
810 ブラダープレート
811 支持メンバーの第1の側面
814 支持メンバーの第2の側面
819 ビーズ殴打モーター
821 刃
822 ブラダー
824 ブラダープレート
838 ピストンまたはハードシール
843 ピストンまたはハードシール
844 ブラダー
846 ブラダー
848 ブラダー
850 磁石
851 凹部
852 ピストンまたはハードシール
853 ピストンまたはハードシール
864 ブラダー
865 ピストンまたはハードシール
866 ブラダー
868 空気ピストン
869 空気ピストンアレイ
878 ホース
886 第1段階加熱器
886 加熱器
888 加熱器
890 光学アレイ
891 ケーブル
892 ディスプレイ
894 コンピュータ
895 圧縮空気源
896 カメラ
898 光源
899 弁
Claims (15)
- 第1のPCRサイクルを介して第1段階多重増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は複数の標的プライマー対を含み、それぞれの標的プライマー対は試料中に未知の濃度で存在し得る異なる複数の標的の1つを増幅するように構成されており、前記増幅混合物は、それぞれが異なる配列を有しそれぞれが異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸、および少なくとも1つの定量標準プライマー対であって、定量標準核酸を増幅するように構成されている定量標準プライマー対をさらに含む、ステップと、
第1段階増幅混合物を複数の第2段階の個々の反応へと分割するステップであって、複数の第2段階の個々の反応のうちの第1群がそれぞれ、試料中に存在し得る様々な標的のうちの1つをさらに増幅するように構成されている少なくとも1つの第2段階標的プライマー対を含み、複数の第2段階の個々の反応のうちの第2群がそれぞれ、定量標準核酸のうちの1つをさらに増幅するように構成されている少なくとも1つの第2段階定量標準プライマー対を含んでいるステップと、
複数の第2段階の個々の反応を増幅条件下での第2のPCRサイクルに供して、前記複数の異なる標的から、それぞれが関連する標的Ctを有する1つまたは複数の標的単位複製配列を生じ、およびそれぞれが関連する定量標準Ctを有する複数の定量標準単位複製配列を生じるステップであって、各標的Ctおよび各定量標準Ctは前記第2のPCTサイクルの間に決定される、ステップと
を含む、試料において定量的2ステップPCR増幅を行う方法。 - 定量標準Ctから検量線を作成することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 関連する標的Ctおよび検量線を使用して1つまたは複数の標的のそれぞれを定量することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 請求項3に記載の方法であって、
それぞれの標的を、以下への最小二乗回帰直線の当てはめを使用して作成した検量線を使用して定量される、
log10(濃度)=(Ct−b)/a
[式中、Ctはそれぞれの標的について測定されたサイクル閾値であり、
bは切片であり、標的のlog10(濃度)がゼロである場合のCt値を表し、
aは傾きであり、濃度の単一単位の変化でCtが変化する度合を表す]
方法。 - 請求項3に記載の方法であって、
検量線が非線形である、または、
定量ステップが濃度を報告する、または、
定量ステップが複数の範囲のうちの1つの範囲に入る濃度を生成し、その1つの範囲を報告する、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
増幅混合物が一対の定量標準プライマーのみを含むものである、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
複数の定量標準核酸に少なくとも2つの定量標準核酸が含まれる、または、
内部定量標準核酸が試料中の天然に存在する配列である、
方法。 - 請求項1に記載の方法であって、
定量標準核酸がすべて同様の増幅効率を有する、
方法。 - 請求項3に記載の方法であって、
前記複数の内部定量標準核酸はそれぞれ、サンプル調製前に、プロセスコントロールとしても役割を果たすために既知量でサンプルに提供される、
方法。 - 請求項9に記載の方法であって、
定量標準核酸に特異的な標識を使用して、それぞれの定量標準核酸の増幅を検出するステップをさらに含む、
方法。 - 請求項1に記載の方法を行うための試料容器であって、
前記複数の標的プライマー対を含む増幅容器であって、前記複数の内部定量標準核酸、および前記少なくとも1つの定量標準プライマー対をさらに含む、増幅容器と、
前記複数の第2段階の個々の反応を行うための、前記増幅容器と流体接続した複数の第2段階の個々の反応ウェルと
を含む、試料容器。 - 請求項11に記載の試料容器を受けるための開口部と、
増幅容器を増幅条件に供するための第1の加熱器と、
複数の第2段階の個々の反応ウェルを増幅条件に供するための第2の加熱器と、
定量標準核酸の増幅を使用して検量線を作成し、それぞれの増幅された標的について定量的または半定量的な結果を出力するようにプログラミングされたコンピュータと
を備えた、試料において請求項1に記載の方法を行うための機器。 - 請求項4に記載の方法であって、
それぞれの標的を、最小二乗回帰直線および補正係数を使用して定量する、
方法。 - 請求項8に記載の方法であって、
すべての標的が同様の増幅効率を有する、
方法。 - 請求項10に記載の方法であって、
それぞれの標識が識別可能な標識したプローブである、
方法。
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