CN115786472A - 用于定量扩增的方法 - Google Patents

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M.A.波里茨
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Abstract

本发明涉及用于定量扩增的方法。提供了用于定量和半定量扩增的方法、样品器皿和仪器。

Description

用于定量扩增的方法
优先权声明
本申请是国际申请日为2017年3月20日的国际申请PCT/US2017/023151进入中国、申请号为201780032103.8的题为“用于定量扩增的方法”的发明专利申请的分案申请。本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2016年3月24日提交的美国临时申请序列号62/313,032的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域和背景技术
在美国、加拿大和西欧，传染病约占人类死亡率的大约7％，而在发展中地区，传染病占人类死亡率的超过40％。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现中有发烧，肺炎，脑膜炎，腹泻和含血的腹泻。虽然身体表现提示一些病原体并且消除其它病原体作为致病因子，但是仍然存在各种潜在的致病物，并且明确的诊断通常需要执行各种测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可能需要数天或数周，经常延迟适当的治疗过程。
近年来，聚合酶链式反应(PCR)已成为用于快速诊断传染因子的选择方法。PCR可以是诊断传染病的快速、灵敏和特异性的工具。使用PCR作为主要诊断手段的挑战是可能的致病生物的多样化和一些病理样本中存在的生物的低水平。运行对于每种可能的致病生物一个的PCR测定的大实验对象组经常是不切实际的，所述致病生物大多数预期是阴性的。当病原体核酸处于低浓度并且需要大体积的样品以收集足够的反应模板时，该问题恶化。在某些情况下，不存在足够的样品以测定所有可能的致病因子。一种解决方案是运行“多重PCR”，其中样品在单一反应中就多种靶同时进行测定。虽然多重PCR已证明在一些系统中是有价值的，但存在关于高水平多重反应的稳健性和难以清楚分析多种产物的缺点。为了解决这些问题，可以随后将测定分成多个二次PCR。在初级产物内嵌套二次反应经常增加稳健性。然而，这种进一步处理可能是昂贵的，并且可以导致污染或其它问题。
集成样品制备、扩增、检测和分析的完全整合的多重PCR系统是用户友好的，并且特别良好地适于诊断市场和综合征方法。
Figure BDA0004045399620000011
(BioFire Diagnostics，LLC，SaltLake City，UT)是这样的系统，开发用于诊断市场的用户友好的高度多重化PCR系统。单个样品仪器接受一次性使用的“小袋”，其整合了样品制备和嵌套多重PCR。集成的样品制备提供了易用性，而高度多重化PCR提供了PCR的灵敏度和同时测试高达30种不同生物的能力。该系统非常适合病原体鉴定，其中许多不同的病原体全都表现出相似的临床症状。目前可用的诊断实验对象组包括用于上呼吸道感染的呼吸实验对象组，用于血流感染的血液培养实验对象组，用于GI感染的胃肠实验对象组和用于脑脊液感染的脑膜炎实验对象组。其它实验对象组正在开发中。
由FilmArray实验对象组以及其它检测系统靶向的许多病原体可以在环境中并且在样品收集部位作为共生物发现。例如，在例如肺炎的疾病中，最常遇到的细菌病原体也可能作为口咽通道的“正常菌群”存在，其通常本身是样品采集的部位(痰和气管抽吸物或鼻咽拭子(NPS))或用于收集更侵入性样本如支气管肺泡灌洗液(BAL)的途径。在这种情况下，被正常菌群的频繁污染或正常菌群的共同收集是不可避免的。因此，微生物实验室的既定做法是执行半定量或定量培养，以区分细菌的致病负荷与非临床相关的共生运输。对于不同类型的样本存在不同的诊断滴度指南。定量PCR(qPCR)可以充当耗时且经常是主观的微生物学方法的快速和客观的分子替代物。
绝对定量，包括通过qPCR的扩增，经常使用标准曲线方法。在该方法中，通过针对已知数量的单个参考模板绘制从实时PCR获得的交叉点(Cp)值生成的标准曲线提供回归线，其可以用于推断目的样品中相同靶基因的数量。与含有需要定量的特定基因靶的样品一起建立参考模板的系列稀释(示例性地10倍稀释)。运行各种分开的反应，通常对于参考靶的每个水平和目的样品各一个。另外，因为PCR效率中的测定特异性差异经常影响定量，所以建立分开的标准曲线和分开的参考模板以定量不同的基因靶。
然而，使用该方法来定量多重化PCR情况中的靶可以是挑战性的。尽管已执行了来自多重化PCR的靶的定量，但是该方法需要对于多重化中包括的每个测定建立多个个别的PCR标准曲线(Phillips等人2014)。此外，该方法假设或要求测定在单重和多重反应中具有相同的PCR效率。迄今为止公布的所有基于标准曲线的定量方法都需要建立外部标准曲线，其中将不同水平的参考模板加入分开的反应室中。
这种方法在例如多重化FilmArray平台的系统中不容易获得，其中设计单个测试以提供采样-应答解决方案。FilmArray系统采用两阶段嵌套多重PCR，其中仅单个室可用于第一阶段多重反应。因此，不能包括关于每个PCR测定的外部标准曲线。此外，在单室反应中，不能容易地将参考模板的连续稀释保持分开，以便获得关于每个水平的Cp值。另外，因为来自患者样品的核酸纯化被整合到FilmArray系统内，所以不能通过外部标准曲线容易地估计核酸提取中样品驱动的变异性的效应，以及任何样品衍生的抑制剂对PCR和因此定量的作用。本发明提供了用于在多重反应中生成内部标准曲线的方法、系统和试剂盒，其可以提供多种靶物种的同时定量，其还考虑了测定特异性和基质衍生的变异在PCR结果中的效应。本发明还教导了使用方法对照或样品处理对照用于定量。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了对样品执行定量两步扩增的方法，所述方法包括在第一阶段多重扩增混合物中扩增样品，所述扩增混合物包含多种靶引物，每种靶引物配置为扩增可能存在于样品中的不同靶，所述扩增混合物进一步包含各自以不同的已知浓度提供的多个内部定量标准核酸，以及至少一种定量标准引物，所述定量标准引物配置为扩增定量标准核酸，将第一阶段扩增混合物分成多个第二阶段个别反应，第一组多个第二阶段反应各自包含至少一种引物，其配置为进一步扩增可能存在于样品中的不同靶之一，并且第二组多个第二阶段反应各自包含至少一种引物，其配置为进一步扩增定量标准核酸之一，并且使多个第二阶段个别反应经历扩增条件，以生成一种或多种靶扩增子和多种定量标准扩增子。
在本发明的另一个方面，提供了对样品执行定量PCR的方法，所述方法包括在扩增混合物中扩增样品，所述扩增混合物包含一对靶引物，其配置为扩增可能存在于样品中的靶，所述扩增混合物进一步包含各自以不同的已知浓度提供的多种定量标准核酸，以及至少一对定量标准引物，所述定量标准引物配置为扩增定量标准核酸，由定量标准扩增子生成标准曲线，并且使用标准曲线定量靶核酸。
在本发明的又一个方面，提供了用于对样品执行定量核酸扩增的方法，所述方法包括：a)裂解所述样品；b)从所述样品中提取核酸分子；c)执行核酸扩增；其中在步骤a)之前或期间以已知量将微生物加入所述样品中作为样品处理对照；其特征在于来自样品处理对照的核酸序列充当定量标准。还提供了样品处理对照作为用于定量样品中的核酸的方法中的定量标准的用途。
在本发明的另外一个方面，提供了用于对样品执行定量两步PCR的样品器皿，所述样品器皿包括扩增容器，所述扩增容器包含多对靶引物，每对靶引物配置为扩增可以存在于样品中的不同靶，所述扩增混合物进一步包含各自以不同的已知浓度提供的多种内部定量标准核酸，以及至少一对校准物引物，所述校准物引物配置为扩增校准物核酸，以及多个第二阶段个别反应孔，第一组多个第二阶段反应孔各自包含一对引物，其配置为进一步扩增可能存在于样品中的不同靶之一，并且第二组多个第二阶段反应各自包含一对引物，其配置为进一步扩增校准物核酸之一。
在本发明的又一个方面，提供了用于测试样品处理方法的方法，其包括将定量标准以已知量加入样品中；使用样品处理方法从样品中提取核酸；将第二定量标准以第二已知量加入样品中；执行核酸和定量标准的核酸扩增；并且测定定量标准和第二定量标准的扩增之间的差异；其中所述差异指示样品处理方法的效率。
在本发明的再一个方面，提供了用于对样品执行定量两步PCR的仪器，其包括用于接收如本文所公开的样品器皿的开口，用于使扩增容器经受扩增条件的第一加热器，用于使多个第二阶段个别反应孔经受扩增条件的第二加热器，编程为使用定量标准核酸的扩增生成标准曲线并且输出关于每种扩增靶的定量或半定量结果的计算机。
本发明的实施方案的另外特征和优点将在下述描述中阐述，或者可以通过此类实施方案的实践来学习。借助于所附权利要求中特别指出的仪器和组合，可以实施且获得此类实施方案的特点和优点。这些和其它特点根据下述描述和所附权利要求将变得更加明显，或者可以通过如下文阐述的此类实施方案的实践来学习。
附图说明
为了描述其中可以获得本发明的上述和其它优点和特点的方式，将通过参考在附图中示出的其特定实施方案来呈现上文简要描述的本发明的更具体的描述。应理解这些附图仅描绘了本发明的典型实施方案，并且因此不应视为对其范围的限制，本发明将通过使用附图用另外的特异性和细节进行描述和解释，在所述附图中：
图1显示了根据本发明的一个实施方案的柔性小袋。
图2A-B一起形成根据本发明的示例性实施方案，用于与图1的小袋一起使用的仪器的分解透视图(其包括图1的小袋)。
图3显示了根据本发明的示例性实施方案，图2A-B的仪器的局部横截面视图，包括图2A的气囊部件，其中图1的小袋以虚线显示。
图4显示了在图2B的仪器的一个示例性实施方案中使用的电动机。
图5显示了跨越四种不同的预期合成定量标准的五个稀释度的Cp。
图6A类似于图5，但仅显示了关于三种定量标准的数据。图6B显示了使用来自所有三种定量标准的数据的单一曲线。
图7显示了连同由三种定量标准生成的曲线绘制的关于鲍氏不动杆菌(A.baumannii)的标准曲线。x轴是反应中包括的鲍氏不动杆菌或定量标准的量，并且y轴是Cp。
图8A显示了来自定量标准的复合标准曲线和对于鲍氏不动杆菌特异性的外部标准曲线，不含校正。图8B显示了与图8A相同的数据，具有测定特异性校正因子。
图9显示了抑制性基质对各种样品靶的Cp的作用。
图10绘制了对于鲍氏不动杆菌的来自图9的数据，其中x轴表示渐增浓度的抑制性基质，并且y轴是Cp。
图11A-11D显示了由三种定量标准生成的标准曲线，具有固定量的鲍氏不动杆菌。用PBS中的样品生成图11A中的数据，使用10x稀释的抑制性基质生成图11B中的数据，使用2x稀释的抑制性基质生成图11C中的数据，并且使用不稀释的抑制性基质生成图11D中的数据。
图12是实施例5的实验设计的流程图。
图13显示了跨越用于生成标准定量曲线的合成定量标准的4个稀释度的Cp图。
图14是用合成定量标准(QS)和样品处理对照(SPC)的定量之间的差异的箱式图表示，伴随校正因子(在该示例性实例中为0.46Log)的施加或不施加。
具体实施方式
下文参考附图描述了示例性实施方案。许多不同的形式和实施方案是可能的，而不背离本发明的精神和教导，并且因此公开内容不应被解释为限于本文阐述的示例性实施方案。相反，提供这些示例性实施方案使得本发明将是彻底和完整的，并且将本发明的范围传达给本领域技术人员。在附图中，为了清楚起见，可放大层和区域的尺寸和相对尺寸。在说明书自始至终，相同的参考数目指的是相同的元件。
除非另外定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。将进一步理解，术语例如在通常使用的词典中定义的那些，应当被解释为具有与其在本申请和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应该以理想化或过度形式化的意义来解释，除非在本文中明确如此定义。本文的本发明描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不预期限制本发明。虽然本文仅描述了某些示例性材料和方法，但与本文描述的那些类似或等价的许多方法和材料可以用于本发明的实践中。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利或其它参考文献均通过引用以其整体并入本文。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。
本发明的各个方面，包括装置、系统、方法等可以参考一个或多个示例性实施来说明。如本文使用的，术语“示例性”和“示例性”意指“充当示例、实例或说明”，并且不一定应该解释为比本文公开的其它实施优选或有利。另外，对本发明或本发明的“实施”或“实施方案”的提及包括对其一个或多个实施方案的具体提及，且反之亦然，并且预期提供示例性示例而不限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求而不是下述描述指示。
应注意，如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指示物，除非内容另有明确说明。因此，例如，对“分块(tile)”的提及包括一个、两个或更多个分块。类似地，除非内容和/或上下文另有明确说明，否则对多个指示物的提及应该被解释为包括单个指示物和/或多个指示物。因此，对“分块”的提及不一定需要多个此类分块。相反，应理解，不依赖于缀合；本文考虑了一个或多个分块。
如在本申请自始至终使用的，词语“可以”和“可能”以允许性意义(即，意味着具有潜力)，而不是强制性意义(即，意味着必须)使用。另外，术语“包括(including)”、“具有(having)”、“涉及(involving)”、“含有(containing)”、“特征在于”、其变体(例如，“包括”(includes)、“具有(has)”、“涉及(involves)”、“含有(contains)”等)、以及如本文包括权利要求使用的类似术语，应为包容性和/或开放性的，应具有与词语“包含(comprising)”及其变体(例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)相同的含义，并且不排除另外的未叙述的示例性元件或方法步骤。
如本文使用的，方向和/或任意术语，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内”、“外”、“内部”、“外部”、“内在”、“外在”、“近端”、“远端”、“前面”、“背面”等等可以仅用于指示相对方向和/或取向，并且可以不在其它方面预期限制本发明，包括说明书、发明和/或权利要求的范围。
应理解，当元件被称为“联接”、“连接”或“响应”另一个元件或“在另一个元件上”时，它可以直接联接、连接、或响应另一个元件或在另一个元件上，或者也可以存在插入元件。相反，当元件被称为“直接联接”、“直接连接”或“直接响应”另一个元件或“直接在另一个元件上”时，不存在插入元件。
本发明构思的示例性实施方案在本文中参考横截面图示进行描述，所述横截面图示是示例性实施方案的理想化实施方案(和中间结构)的示意图。像这样，预期由于例如制造技术和/或公差与图示形状的变化。因此，本发明构思的示例性实施方案不应被解释为限于本文示出的区域的特定形状，而是包括例如起因于制造的在形状中的偏差。相应地，附图中示出的区域本质上是示意性的，并且它们的形状不预期示出装置的区域的实际形状，并且不预期限制示例性实施方案的范围。
应理解，尽管术语“第一”、“第二”等在本文中可以用于描述各种元件，但这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元件与另一个元件。因此，“第一”元件可以被称为“第二”元件，而不背离本实施方案的教导。
还应理解，本文描述的各种实施可以与所描述或公开的任何其它实施组合利用，而不背离本发明的范围。因此，根据本发明的某些实施的产品、构件、元件、装置、设备、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒可以包括、掺入或以其它方式包含本文公开的其它实施(包括系统、方法、设备和/或类似物)中描述的性质、特点、部件、构件、元件、步骤和/或等等，而不背离本发明的范围。因此，对与一个实施有关的具体特点的提及不应被解释为仅限于在所述实施内的应用。
本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于限制说明书或权利要求的范围。为了便于理解，在可能时，相同的参考数目已用于指定附图共有的相同元件。此外，在可能时，在各个图中已使用了元件的相同编号。此外，特定元件的替代配置可以各自包括附加到元件编号的分开字母。
术语“约”在本文中用于意指大约、在大致或大概的区域。当术语“约”与数目范围结合使用时，它通过扩展在所述数目的之上和之下的边界来修改该范围。一般而言，术语“约”在本文中用于将所述值之上和之下的数值修改5％的变化。当表达此类范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点均为有意义的。
如本文使用的，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
“样品”意指动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者体内，直接取自受试者，或维持在培养物中或来自培养细胞系的细胞)；细胞裂解产物(或裂解产物级分)或细胞提取物；含有衍生自细胞、细胞材料或病毒材料(例如多肽或核酸)的一种或多种分子的溶液；或含有非天然存在的核酸示例性地cDNA或下一代测序文库的溶液，其如本文所述进行测定。样品也可以是任何体液或排泄物(例如，但不限于血液、尿、粪便、唾液、泪、胆汁或脑脊髓液)，其可能含有或不含有宿主或病原体细胞、细胞组分或核酸。
如本文使用的，短语“核酸”指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是DNA还是RNA或DNA-RNA杂交体、单链或双链、有义或反义，其能够通过沃森-克里克碱基配对与互补核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如BrdU)、经修饰或处理的碱基和非磷酸二酯核苷间键合(例如肽核酸(PNA)或硫代二酯键合)。特别地，核酸可以包括但不限于DNA、cDNA、gDNA、ssD NA、dsDNA、RNA包括所有RNA类型例如miRNA、mtRNA、rRNA、包括编码区或非编码区、或其任何组合。
“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指具有限定序列的单链核酸分子，其可以与含有互补序列的第二核酸分子(“靶”)碱基配对。所得到的杂交体的稳定性取决于长度、GC含量和碱基配对发生的程度。碱基配对的程度受参数例如探针和靶分子之间的互补程度以及杂交条件的严格程度影响。杂交严格程度受参数例如温度、盐浓度和有机分子如甲酰胺的浓度影响，并且通过本领域技术人员已知的方法测定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员众所周知的方法，放射性、荧光或非放射性地可检测标记。dsDNA结合染料可以用于检测dsDNA。应理解，“引物”特别配置为通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以如此配置或不如此配置。作为探针，寡核苷酸可以用作本领域已知的许多荧光PCR引物和基于探针的化学物质的部分，包括共享荧光猝灭和/或荧光共振能量转移(FRET)配置的使用的那些，例如5′核酸酶探针(
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探针)、双杂交探针
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或
Figure BDA0004045399620000082
探针或分子信标、或
Figure BDA0004045399620000081
测定例如
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或
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引物，包括具有天然或经修饰的碱基的那些。
“dsDNA结合染料”意指当与双链DNA结合时比与单链DNA结合或在溶液中游离时差异发荧光的染料，通常通过更强烈地发荧光。虽然提及了dsDNA结合染料，但应理解本文可以使用任何合适的染料，其中一些非限制性示例性染料描述于美国专利号7,387，887中，其通过引用并入本文。其它产生信号的物质可以用于检测核酸扩增和解链，示例性地酶、抗体等，如本领域已知的。
“特异性杂交”意指探针、引物或寡核苷酸在高严格条件下识别基本上互补的核酸(例如，样品核酸)并与其物理相互作用(即，碱基配对)，并且基本上不与其它核酸碱基配对。
“高严格条件”意指在约解链温度(Tm)减5℃下(即，比核酸的Tm低5°)。功能上，高严格条件用于鉴定具有至少80％序列同一性的核酸序列。
虽然PCR是本文实例中使用的扩增方法，但应理解使用引物的任何扩增方法都是合适的。此类合适的程序包括任何类型的聚合酶链反应(PCR)(单步、两步或其它)；链置换扩增(SDA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；级联滚环扩增(CRCA)、DNA环介导的等温扩增(LAMP)；等温和嵌合引物引发的核酸扩增(ICAN)；基于靶的解旋酶依赖性扩增(HDA)；转录介导的扩增(TMA)、下一代测序技术等等。因此，当使用术语PCR时，它应理解为包括其它替代扩增方法，包括氨基酸定量方法。对于不含不连续循环的扩增方法，可以使用其中测量以循环或Cp进行的反应时间，并且可以添加其中在本文描述的实施方案中添加另外的PCR循环的另外反应时间。应理解可能需要相应地调整方案。
“样品处理对照”意指病原体、微生物、细胞(无论是否存活)、核酸、或者天然或合成的任何颗粒，具有模拟病原体或其一部分、或核酸及其在样品工作流期间的行为的能力。样品处理对照经常以已知量包括在装置中，以控制由样品遵循的工作流的一些或所有步骤，示例性地确保样品已被正确裂解，潜在感染靶病原体的核酸已被正确提取和纯化，并且靶病原体的特定序列的正确扩增和检测已发生。
示例性地，用作样品处理对照的微生物(示例性地粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(粟酒裂殖酵母(S.pombe))尽可能接近地模拟待检测和定量的靶微生物。样品处理对照颗粒可以复制待检测病原体的结构(例如膜和/或衣壳和/或包膜)，允许其模拟病原体及其靶核酸沿着工作流的行为。样品过程对照的目标是确保靶的裂解和核酸提取产率与样品处理对照的产率相似，并且适当地处理纯化的核酸以确保最佳扩增/检测。对于定性结果，病原体可以报告为阳性或阴性，或者如果运行对照失败，则可以报告为未确定的。样品处理对照可以是几种运行对照之一，并且应该是阳性的，并且可能在指定范围内，以验证运行，因为一些抑制条件可以降低提取、纯化或PCR扩增/检测的产率。样品处理对照可以用于监测这种抑制，产量的降低在样品处理对照和靶病原体之间是相似的。对于定性结果，如果未检测到此类抑制，则可以导致假阴性结果。对于定量结果，工作流的步骤之一的抑制可以提供低估的定量结果。因此，本发明的几个示例性实施方案使用至少一个样品处理对照(SPC)用于至少两个目标：
1)控制和验证工作流：如上所述的SPC的经典作用，和
2)帮助定量测试样品中的靶核酸：SPC的新作用，其也用作定量标准。
示例性地，SPC遵循样品所经受的一些或全部过程。因此，可以在样品裂解的步骤之前或期间添加SPC。可以基于靶病原体的类型来选择样品处理对照。例如，可以选择细菌噬菌体如PhiX174用于针对病毒的测定，细菌噬菌体是模拟靶病毒、或酵母例如粟酒裂殖酵母的良好候选物，用于广泛的细菌和酵母定量测定中。
如果待检测单一病原体，则可以设计两种扩增测定，示例性地PCR测定(靶病原体和用作定量标准的样品处理对照)，以达到相同或相似的热力学特征，并且使得能够使用合成定量标准准确定量(如实施例5中)。
对于多种病原体的定量(即多重扩增)，示例性地由于序列可变性和扩增子长度.可能难以使样品处理对照的扩增方案，示例性地PCR设计与扩增测定，示例性地关于每种病原体的PCR测定的方案拟合，以获得相同的热力学特征示例性。因此，不同靶病原体的PCR效率可能不同。为此，对于每种病原体可以计算校正因子，所述校正因子将获得的定量与定量标准和输入的标准曲线相关联。
在合成定量标准的替代方案中，可以针对具有已知浓度的已知天然微生物或针对其它天然存在的核酸模板进行校准。
在本发明的另一个实施方案中，还能够在具有至少两种不同的，示例性的三种或四种不同的样品处理对照的任何扩增系统中可靠地定量病原体，条件是这些样品处理对照可以经由已知的鉴定技术，例如荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的序列特异性探针进行鉴定，如本领域已知的。
虽然本文的各种实例提及人靶和人病原体，但这些实例仅是示例性的。本文描述的方法、试剂盒和装置可以用于检测和测序来自广泛多种样品，包括人、兽医、工业和环境的广泛多种核酸序列。
本文公开的各种实施方案使用独立的核酸分析小袋来测定样品中各种生物物质的存在(示例性地抗原和核酸序列，示例性地在单个封闭系统中)。此类系统，包括小袋和用于与小袋一起使用的仪器更详细地公开于美国专利号8,394,608；和8,895,295；以及美国专利申请号2014-0283945中，所述专利通过引用并入本文。然而，应理解，此类仪器和小袋仅是示例性的，并且本文讨论的核酸制备和扩增反应可以在如本领域已知的各种开放或封闭系统样品器皿中的任一种中执行，包括96孔板、其它配置的平板、阵列、转盘等等，使用各种核酸纯化和扩增系统，如本领域已知的。虽然本文使用术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”等等，但这些术语意欲涵盖如这些扩增系统中使用的孔、管和各种其它反应容器。此类扩增系统可以包括扩增容器中的单个多重步骤，并且可以任选地在多个个别反应孔中包括多个第二阶段个别或更低级的多重反应。在一个实施方案中，小袋用于测定多种病原体。小袋可以包括用作样品孔的一个或多个泡罩，示例性地在封闭系统中。示例性地，可以在任选的一次性使用的小袋中执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、初级扩增产物的稀释和二次PCR，最后为任选的实时检测或扩增后分析例如解链曲线分析。此外，应理解，虽然可以在本发明的小袋中执行各个步骤，但对于某些用途可以省略一个或多个步骤，并且小袋配置可以相应地改变。
图1显示了可以在各种实施方案中使用，或者可以对于各种实施方案重新配置的示例性小袋510。小袋510类似于美国专利号8,895,295的图15，其中相同的项目编号相同。配件590提供有入口通道515a到515l，其也充当试剂贮存器或废物贮存器。示例性地，试剂可以在配件590中冷冻干燥并且在使用前再水合。泡罩522、544、546、548、564和566以及它们各自的通道514、538、543、552、553、562和565类似于美国专利号8,895,295的图15的相同编号的泡罩。图1的第二阶段反应区580类似于美国专利申请号8,895,295的那种，但高密度阵列581的第二阶段反应区582以稍微不同的图案排列。图1的高密度阵列581的更圆形图案消除了拐角处的孔，并且可以导致第二阶段孔582的更均匀填充。如所示，高密度阵列581提供有102个第二阶段孔582。小袋510适用于
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仪器(BioFire Diagnostics，LLC，Salt Lake City，UT)。然而，应理解，小袋实施方案仅是示例性的。
虽然可以使用其它容器，但示例性地，小袋510由两层柔性塑料薄膜或其它柔性材料形成，所述其它柔性材料例如聚酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯及其混合物，其可以通过本领域已知的任何方法制备，所述方法包括挤出、等离子体沉积和层压。也可以使用具有铝层压结构的金属箔或塑料。其它阻隔材料是本领域已知的，其可以密封在一起以形成泡罩和通道。如果使用塑料薄膜，则可以示例性地通过热封将这些层粘合在一起。示例性地，该材料具有低核酸结合能力。
对于采用荧光监测的实施方案，优选吸光度足够低且在操作波长下自发荧光的塑料薄膜。可以通过测试不同的塑料、不同的增塑剂和复合比率以及不同厚度的薄膜来鉴定此类材料。对于具有铝或其它箔层压结构的塑料，待通过荧光检测装置读取的小袋的部分可以无需箔而留下。例如，如果在小袋510的第二阶段反应区580的第二阶段孔582中监测到荧光，则在孔582处的一个或两个层将无需箔而留下。在PCR的例子中，由约0.0048英寸(0.1219mm)厚的聚酯(Mylar，DuPont，Wilmington DE)和0.001-0.003英寸(0.025-0.076mm)厚的聚丙烯薄膜组成的薄膜层压结构表现良好。示例性地，小袋510由能够透射大约80％-90％的入射光的透明材料制成。
在示例性实施方案中，通过在泡罩和通道上施加压力，示例性地气动压力，使材料在泡罩之间移动。相应地，在采用压力的实施方案中，小袋材料示例性地足够柔性，以允许压力具有所需效应。术语“柔性”在本文中用于描述小袋的材料的物理特征。术语“柔性”在本文中定义为易于通过本文使用的压力水平变形，而不破裂、破坏、开裂等等。例如，薄的塑料片，例如SaranTM包装和
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小袋，以及薄金属箔，例如铝箔，是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施方案中，仅泡罩和通道的某些区域需要是柔性的。此外，泡罩和通道的仅一侧需要是柔性的，只要泡罩和通道易于变形。小袋510的其它区域可以由刚性材料制成，或者可以用刚性材料强化。
示例性地，塑料薄膜用于小袋510。可以研磨或以其它方式切割金属片，示例性地铝或其它合适材料，以产生具有凸起表面图案的模具。当安装到气动压力机(示例性地A-5302-PDS，Janesville Tool Inc.，Milton WI)时，示例性地在195℃的操作温度下调节，气动压力机像印刷机一样工作，熔化模具仅在其中接触薄膜的塑料薄膜的密封表面。随着小袋510形成，各种组分，例如PCR引物(示例性地点在薄膜上并干燥)、抗原结合基底、磁珠和硅酸锆珠可以密封在各种泡罩内。用于样品处理的试剂可以在密封之前共同地或分开地点在薄膜上。在一个实施方案中，核苷酸三磷酸将(NTP)与聚合酶和引物分开点在薄膜上，基本上消除了聚合酶的活性，直到反应被含水样品水合。如果含水样品在水合之前已加热，则这为真正的热启动PCR创造了条件，并且减少或消除了对于昂贵的化学热启动组分的需求。
小袋510可以以与美国专利号8,895,295中描述的那种类似的方式使用。在一个示例性实施方案中，将包含待测试样品(100μl)和裂解缓冲液(200μl)的300μl混合物注入入口通道515a附近的配件590中的注入口(未示出)，并且将样品混合物抽取到入口通道515a内。水也被注入到与入口通道5151相邻的配件590的第二注入口(未示出)内，并且经由配件590中提供的通道(未示出)分配，从而水合高达11种不同的试剂，所述试剂各自先前在入口通道515b到515l处以干燥形式提供。这些试剂示例性地可以包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA提取试剂、洗涤溶液、免疫测定试剂或其它化学实体。示例性地，所述试剂用于核酸提取、第一阶段多重PCR、多重反应的稀释和第二阶段PCR试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施方案中，所有需要注入的是一个注入口中的样品溶液和另一个注入口中的水。注入后，可以密封两个注入口。关于小袋510和配件590的各种配置的更多信息，参见已经引入作为参考的美国专利号8,895,295。
注入后，样品经由通道514从注入通道515a移动到裂解泡罩522。裂解泡罩522提供有珠或颗粒534，例如陶瓷珠，并且配置为使用在
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仪器中提供的旋转叶片或桨叶，经由撞击用于涡旋。通过在裂解颗粒如硅酸锆(ZS)珠534的存在下摇动或涡旋样品的珠磨，是形成裂解产物的有效方法。应理解，如本文使用的，术语例如“裂解(lyse)”、“裂解(lysing)”和“裂解产物”并不限于破裂细胞，而是此类术语包括非细胞颗粒例如病毒的破坏。
图4显示了珠击打电动机819，其包括叶片821，所述叶片821可以安装在图2A-B中所示的仪器800的支撑构件802的第一侧811上。叶片可以延伸穿过槽804以接触小袋510。然而，应理解，电动机819可以安装在仪器800的其它结构上。在一个示例性实施方案中，电动机819是安装在支撑构件802上的Mabuchi RC-280SA-2865 DC Motor(Chiba，日本)。在一个示例性实施方案中，电动机以5,000至25,000rpm，更示例性地10,000至20,000rpm，且再更示例性地大约15,000至18,000rpm转动。对于Mabuchi电动机，已发现7.2V提供足够的rpm用于裂解。然而，应理解，当叶片821撞击小袋510时，实际速度可能稍微慢一些。取决于所使用的电动机和桨叶，其它电压和速度可以用于裂解。任选地，可以将受控的小体积空气提供到与裂解泡罩522相邻的气囊822内。已发现，在一些实施方案中，用一个或多个小体积空气部分填充相邻气囊帮助在裂解过程期间定位和支撑裂解泡罩。可替代地，其它结构，示例性地裂解泡罩522周围的刚性或顺应性垫圈或其它保持结构，可以用于在裂解期间约束小袋510。还应理解，电动机819仅是示例性的，并且其它装置可以用于研磨、摇动或涡旋样品。
一旦细胞已被充分裂解，样品就通过通道538、泡罩544和通道543移动到泡罩546，在其中样品与核酸结合物质，例如二氧化硅涂布的磁珠533混合。允许混合物温育适当的时间长度，示例性地大约10秒至10分钟。位于与泡罩546相邻的仪器内的可伸缩磁体从溶液中捕获磁珠533，形成抵靠泡罩546内表面的团块。然后将液体移出泡罩546并且通过泡罩544返回并进入泡罩522内，所述泡罩522现在用作废物容器。来自注入通道515c至515e中的一个或多个的一种或多种洗涤缓冲液经由泡罩544和通道543提供至泡罩546。任选地，使磁体缩回，并且通过经由通道543从泡罩544和546来回移动珠来清洗磁珠533。一旦磁珠533被洗涤，就通过启动磁体将磁珠533重新捕获在泡罩546中，然后将洗涤溶液移至泡罩522。可以根据需要重复该过程，以从核酸结合磁珠533中洗涤裂解缓冲液和样品碎片。
洗涤后，将贮存在注入通道515f中的洗脱缓冲液移至泡罩548，并且使磁体缩回。溶液经由通道552在泡罩546和548之间循环，打碎泡罩546中的磁珠533的团块，并且允许捕获的核酸与珠脱离并进入溶液内。再次启动磁体，捕获泡罩546中的磁珠533，并且将洗脱的核酸溶液移入泡罩548内。
将来自注入通道515g的第一阶段PCR主混合物与泡罩548中的核酸样品混合。任选地，通过经由通道553迫使混合物在548和564之间来混合混合物。在几个混合循环之后，溶液包含在泡罩564中，在其中提供第一阶段PCR引物的团块，对于每种靶的至少一组引物，并且执行第一阶段多重PCR。如果存在RNA靶，则可以在第一阶段多重PCR之前或同时执行逆转录(RT)步骤。
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仪器中的第一阶段多重PCR温度循环示例性地执行15—30个循环，尽管根据具体应用的要求，其它水平的扩增可能是期望的。如本领域已知的，第一阶段PCR主混合物可以是各种主混合物中的任一种。在一个示例性实例中，第一阶段PCR主混合物可以是US2015/0118715中公开的任何化学物质，所述专利通过引用并入本文，用于与每个循环花费20秒或更少的PCR方案一起使用。
在第一阶段PCR已进行所需数目的循环后，可以将样品稀释，示例性地通过迫使大部分样品回到泡罩548内，在泡罩564中仅留下少量，并且从注入通道515i添加第二阶段PCR主混合物。可替代地，可以将来自515i的稀释缓冲液移至泡罩566，然后通过在泡罩564和566之间来回移动流体，与泡罩564中的扩增样品混合。如果需要的话，可以使用来自注入通道515j和515k的稀释缓冲液重复稀释几次，或者可以保留注入通道515k用于测序或用于其它PCR后分析，然后将来自注入通道515h的第二阶段PCR主混合物添加到一些或全部稀释的扩增样品中。应理解，可以通过改变稀释步骤的数目，或通过在与稀释缓冲液或第二阶段PCR主混合物混合之前改变丢弃的样品百分比来调节稀释水平，所述第二阶段PCR主混合物包含用于扩增的组分，示例性地聚合酶、dNTP和合适的缓冲液，尽管其它组分可能是合适的，特别是对于非PCR扩增方法。如果需要的话，样品和第二阶段PCR主混合物的这种混合物可以在移动到第二阶段孔582之前在泡罩564中预热，用于第二阶段扩增。此类预热可以避免在第二阶段PCR混合物中热启动组分(抗体、化学或其它)的需要。
示例性的第二阶段PCR主混合物是不完整的，缺少引物对，并且102个第二阶段孔582中的每一个预加载有特异性PCR引物对(或有时多种引物对)。如果需要的话，第二阶段PCR主混合物可以缺少其它反应组分，并且这些组分也可以预加载在第二阶段孔582中。每种引物对可以与第一阶段PCR引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一阶段引物对内。样品从泡罩564移动到第二阶段孔582完成PCR反应混合物。一旦填充了高密度阵列581，就通过任何数目的手段将个别第二阶段反应密封在它们各自的第二阶段泡罩中，如本领域已知的。在已经引入作为参考的美国专利号8,895,295中讨论了填充和密封高密度阵列581而无交叉污染的示例性方法。示例性地，高密度阵列581的孔582中的各种反应同时进行热循环，示例性地使用一个或多个Peltier装置，尽管用于热循环的其它装置是本领域已知的。
在某些实施方案中，第二阶段PCR主混合物含有dsDNA结合染料
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Plus(BioFire Diagnostics，LLC)，以生成指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是示例性的，并且可以使用其它信号，包括其它dsDNA结合染料和荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的探针，如本领域已知的。可替代地，阵列581的孔582可以无需信号而提供，其中结果通过后续处理报告。
当气动压力用于移动小袋510内的材料时，在一个实施方案中，可以采用“气囊”。气囊组件810，其一部分在图2A-B和3中示出，包括容纳多个可充气气囊822、844、846、848、864和866的气囊板824，所述气囊各自可以示例性地通过压缩气体源个别地充气示例性。因为气囊组件810可以经受压缩气体并且多次使用，所以气囊组件810可以由比小袋更坚韧或更厚的材料制成。可替代地，气囊822、844、846、848、864和866可以由用垫圈、密封件、阀和活塞紧固在一起的一系列板形成。其它布置也在本发明的范围内。
第二PCR反应的成功取决于由多重第一阶段反应生成的模板。通常，使用高纯度的DNA执行PCR。方法例如苯酚提取或商业DNA提取试剂盒提供了高纯度的DNA。通过小袋510处理的样品可能需要调整以补偿较不纯的制剂。PCR可以被生物样品的组分抑制，这是潜在的障碍。示例性地，热启动PCR、更高浓度的taq聚合酶、MgCl2浓度中的调节、引物浓度中的调节和佐剂(例如DMSO、TMSO或甘油)的添加任选地可以用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题可能更多是第一阶段扩增和单一阶段PCR的关注，但应理解，也可以在第二阶段扩增中提供类似的调节。
当将小袋510放置在仪器800内时，将气囊组件810压靠在小袋510的一个面上，使得如果特定的气囊膨胀，则压力将迫使液体从小袋510中的相应泡罩中流出。除对应于小袋510的许多泡罩的气囊之外，气囊组件810可以具有另外的气动致动器，例如气囊或气动驱动的活塞，对应于小袋510的各种通道。图2A-B和3显示了示例性的多个活塞或硬密封件838、843、852、853和865，其对应于小袋510的通道538、543、553和565，以及密封件871、872、873、874，其最小化进入配件590内的回流。当启动时，硬密封件838、843、852、853和865形成夹管阀，以夹断且关闭相应的通道。为了将液体约束在小袋510的特定泡罩内，硬密封件在来回泡罩的通道上被启动，使得致动器充当夹管阀以将通道关闭。示例性地，为了在不同的泡罩中混合两个体积的液体，密封连接通道的夹管阀致动器被启动，并且泡罩上方的气动气囊被交替加压，迫使液体来回通过连接泡罩的通道，以混合在其中的液体。夹管阀致动器可以具有各种形状和尺寸，并且可以配置成一次夹断多于一个通道。虽然本文讨论了气动致动器，但应理解，考虑了向小袋提供压力的其它方式，包括各种机电致动器，例如线性步进电动机，电动机驱动的凸轮，由气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶，滚轴，摇臂，以及在某些情况下，旋塞弹簧。另外，除施加垂直于通道轴线的压力之外，还存在可逆或不可逆地关闭通道的各种方法。这些包括将袋子扭转跨越通道，热封，轧制致动器以及密封在通道中的各种物理阀，例如蝶形阀和球阀。另外，小型Peltier装置或其它温度调节器可以放置在通道附近，并且设定在足以冷冻流体的温度，有效地形成密封。另外，虽然图1的设计适于定位在每个泡罩和通道上的致动器元件特征性的自动化仪器，但也考虑了致动器可以保持静止，并且小袋510可以在一维或二维中过渡，使得少量致动器可以用于几个处理站，包括样品破坏、核酸捕获、第一和第二阶段PCR、以及小袋510的其它应用例如免疫测定和免疫PCR。作用于通道和泡罩的滚轴可以证明在其中小袋510在工位之间平移的配置中特别有用。因此，尽管在当前公开的实施方案中使用气动致动器，但当术语“气动致动器”在本文中使用时，应理解，可以使用其它致动器和提供压力的其它方式，取决于小袋和仪器的配置。
其它现有技术仪器教导了在密封的柔性容器内的PCR。参见例如，美国专利号6,645,758和6,780,617，以及美国专利申请号2014/0038272，其通过引用并入本文。然而，包括在密封的PCR容器内的细胞裂解可以改善易用性和安全性，特别是如果待测试的样品可能含有生物危害。在本文所示的实施方案中，来自细胞裂解以及所有其它步骤的废物保留在密封的小袋内。然而，应理解，可以取出小袋内容物用于进一步测试。
图2A-B显示了可以与小袋510一起使用的示例性仪器800。仪器800包括支撑构件802，其可以形成壳体的壁或安装在壳体内。仪器800还可以包括第二支撑构件(未示出)，其任选地可相对于支撑构件802移动，以允许小袋510的插入和撤回。示例性地，一旦小袋510已插入到仪器800内，盖子可覆盖小袋510。在另一个实施方案中，两个支撑构件可以是固定的，其中小袋510通过其它机械手段或通过气动压力固定就位。
在示例性实例中，加热器886和888安装在支撑构件802上。然而，应理解，这种布置仅是示例性的，并且其它布置也是可能的。具有气囊822、844、846、848、864、866的气囊板810，硬密封件838、843、852、853，形成气囊组件808的密封件871、872、873、874可以示例性地安装在可移动支撑结构上，所述可移动支撑结构可以朝向小袋510移动，使得气动致动器与小袋510接触放置。当小袋510插入仪器800内并且可移动支撑构件朝向支撑构件802移动时，小袋510的各种泡罩处于与气囊组件810的各个气囊和组件808的各种密封件相邻的位置，使得气动致动器的启动可以迫使来自小袋510的一个或多个泡罩的液体，或者可以形成具有小袋510的一个或多个通道的夹管阀。在图3中更详细地示出了小袋510的泡罩和通道与组件808的气囊和密封件之间的关系。
每个气动致动器经由阀899连接到压缩空气源895。虽然图2A-B中仅显示了几个软管878，但应理解，每个气动配件经由软管878连接到压缩气体源895。压缩气体源895可以是压缩机，或者可替代地，压缩气体源895可以是压缩气体气筒，例如二氧化碳筒。如果需要便携性，则压缩气筒是特别有用的。其它压缩气体源也在本发明的范围内。
组件808示例性地安装在可移动支撑构件上，尽管应理解其它配置也是可能的。
仪器810的几个其它部件也连接到压缩气体源895。安装在支撑构件802的第二侧814上的磁体850示例性地使用经由软管878来自压缩气体源895的气体展开和缩回，尽管移动磁铁850的其它方法是本领域已知的。磁体850位于支撑构件802中的凹部851中。应理解，凹部851可以是穿过支撑构件802的通道，使得磁体850可以接触小袋510的泡罩546。然而，取决于支撑构件802的材料，应理解，凹部851不需要一直延伸穿过支撑构件802，只要当磁体850展开时，磁体850足够接近以在泡罩546处提供足够的磁场，并且当磁体850缩回时，磁体850不显著影响泡罩546中存在的任何磁珠533。虽然提及了缩回磁体850，但应理解，可以使用电磁体，并且可以通过控制通过电磁体的电流来启动和停用电磁体。因此，虽然本说明书讨论了撤回或缩回磁体，但应理解这些术语足够宽泛，以掺入撤回磁场的其它方式。应理解，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因此减少了所需的软管或阀数目。
气动活塞阵列869的各种气动活塞868也经由软管878连接到压缩气体源895。虽然仅显示了将气动活塞868连接到压缩气体源895的两个软管878，但应理解气动活塞868各自连接到压缩气体源895。显示了十二个气动活塞868。
一对加热/冷却装置，示例性地珀尔帖加热器，安装在支撑件802的第二侧814上。第一阶段加热器886定位于加热和冷却泡罩564的内容物用于第一阶段PCR。第二阶段加热器888定位于加热和冷却小袋510的第二阶段泡罩582的内容物，用于第二阶段PCR。然而，应理解，这些加热器也可以用于其它加热目的，并且如对于特定应用适当地，可以使用其它加热器。其它配置也是可能的。
当需要荧光检测时，可以提供光学阵列890。如图2A-B所示，光学阵列890包括光源898，示例性地经过滤的LED光源、经过滤的白光或激光照射以及照相机896。照相机896示例性地具有多个光电探测器，其各自对应于小袋510中的第二阶段孔582。可替代地，照相机896可以拍摄含有所有第二阶段孔582的图像，并且图像可以被分成对应于每个第二阶段孔582的分开视野。取决于配置，光学阵列890可以是固定的，或者光学阵列890可以放置在附接到一个或多个电动机的移动器上，并且移动以从每个个别第二阶段孔582获得信号。应理解，其它布置也是可能的。
如所示，计算机894控制压缩空气源895的阀899，并且因此控制仪器800的所有气动装置。计算机894还控制加热器886和888，以及光学阵列890。这些部件中的每一个都是电连接的，示例性地经由电缆891，尽管其它物理或无线连接也在本发明的范围内。应理解，计算机894可以容纳在仪器800内或者可以在仪器800外部。此外，计算机894可以包括控制一些或所有组件的内置电路板，可以计算扩增曲线、解链曲线、Cps、Cts、标准曲线和其它相关数据，并且还可以包括外部计算机，例如台式或膝上型PC，以接收且展示来自光学阵列的数据。可以提供界面，示例性地键盘界面，包括用于输入信息和变量例如温度、循环时间等的键。示例性地，还提供了显示器892。例如，显示器892可以是LED、LCD或其它此类显示器。
实施例1：高密度PCR
在一个实例中，已知用于常见呼吸道病毒的标准商业免疫荧光测定可以检测七种病毒：腺病毒、PIVl、PIV2、PIV3、RSV、甲型流感和乙型流感。更完整的实验对象组示例性地包括用于其它病毒的测定，所述其他病毒包括：冠状病毒、人偏肺病毒、鼻病毒和非HRV肠道病毒。对于高度可变的病毒，例如腺病毒或HRV，期望使用多种引物以靶向病毒谱系的所有分支(示例性地分别为4个外部和4个内部引物组)。对于其它病毒如冠状病毒，存在4个不同的谱系(229E、NL63、OC43、HKU1)，所述谱系从一个季节到另一个季节不改变，但它们已充分分歧，使得需要分开的引物组。
Figure BDA0004045399620000182
Respiratory Panel(BioFire Diagnostics，LLCof Salt Lake City，UT)包括腺病毒、冠状病毒HKUl、冠状病毒NL63、冠状病毒229E、冠状病毒OC43、人偏肺病毒、人鼻病毒/肠病毒、甲型流感、甲型H1流感、甲型/H3流感、甲型/H1-2009流感、乙型流感、1型副流感病毒、2型副流感病毒、3型副流感病毒、4型副流感病毒和呼吸道合胞病毒。除这些病毒之外，
Figure BDA0004045399620000183
Respiratory Panel还包括三种细菌：百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)。高密度阵列581能够将此类实验对象组容纳在单个小袋510中。其它实验对象组可用于
Figure BDA0004045399620000181
各自测定至少20种病原体。
示例性第二阶段PCR主混合物含有dsDNA结合染料
Figure BDA0004045399620000184
Plus，以生成指示扩增的信号。然而，应理解，该染料仅是示例性的，并且可以使用其它信号，包括其它dsDNA结合染料，以及荧光、放射性、化学发光、酶促等等标记的探针，如本领域已知的。
将示例性FilmArray仪器编程，以基于PCR后解链对于每个第二阶段反应进行正或负调用。解链曲线必须在预定温度范围内产生解链峰(一阶导数最大值或负一阶导数最大值)，用于调用为正的。应理解，这种调用每个第二阶段反应的方法仅是示例性的，并且可以使用实时扩增数据或通过其它手段进行调用，如本领域已知的。
实施例2-设计用于多重PCR的定量标准
在系统例如FilmArray中，其中在一个反应室中执行单一多重PCR，使用10倍稀释的单一参考模板生成标准曲线是不方便的，因为不能容易地区分各个水平。例如，如果将单一参考模板以10个拷贝、100个拷贝和1000个拷贝的浓度加入单个第一阶段反应室中，则该室中参考模板的最终浓度将为1110个拷贝，并且缺乏一些其它标签，个别稀释度是无法区分的。此外，在两步多重PCR系统中，仅在嵌套的第二阶段PCR中生成的标准曲线可能具有用于定量的有限价值，因为单重标准模板扩增反应可能无法准确反映样品经历的所有上游操作，或可能不以相似的效率扩增，并且因此，可能不反映整个过程。
在该示例性实例中，不同的核酸模板(示例性地在序列和/或长度上变化)，示例性地合成的定量标准，用于表示不同水平的稀释系列。在一个示例性实施方案中，用于所有合成的定量标准的测定具有相似的扩增效率，并且在多重设置中的每个给定稀释点产生相同或相似的Cp值。示例性地，所有靶测定都针对相同的性能特征(包括效率)进行优化，尽管可以应用校正来调节效率中的测定特异性变化。
在一个示例性实例中，用于定量标准的外部和内部扩增子大小可以代表用于定量靶测定的扩增子大小。此外，序列或GC含量在引发区域之间可以是相同或相似的。示例性地，序列可以是相同的，除了至少一个内部引发区域之外，其应该足够不同以避免内部测定之间的交叉反应性。如果序列仅通过内部引物结合区而不同，则相同的PCR1引物可以用于扩增所有定量标准，因此最小化PCR1测定性能中的潜在差异。此外，如果使用标签，则序列可以是相同的，并且如果不使用标签，即使序列中的轻微差异也可以提供用于检测，示例性地在第二阶段单重反应中。然而，应理解，这些参数仅是示例性的，并且用于检测和控制扩增效率的其它手段也是可能的。应理解，多重反应中存在的定量标准应该设计成匹配反应参数，例如Mg2+、引物浓度、Tm和循环条件。还应理解，期望最小化多重PCR反应中合成模板的非特异性扩增。
图5显示了四种预期内部定量标准的Cp相对于浓度。在该示例性实施方案中，内部定量标准具有合成序列。在该示例性实施方案中，对于第二阶段内部反应，四种定量标准均共享一种共同引物，并且各自具有一种独特的特异性引物。它们还被设计为共享两种外部引物用于第一阶段PCR。因此，用于检测定量标准的每个第二阶段孔将用共同引物和用于该定量标准的引物点样，使得在每个此类的孔中应该仅扩增一种定量标准。然而，应理解，这仅是示例性实例，并且其它配置是可能的。Syn2、Syn3和Syn4各自具有相似的扩增效率，并且选择用于另外的研究。Syn1表现不同，并且从进一步的工作中省略。因此，在一个实施方案中，期望具有多种定量标准，其具有相似的扩增效率。
在该示例性实例中，使用dsDNA结合染料LCGreen Plus检测扩增。然而，这仅是示例性的，并且其它dsDNA结合染料、探针、信号或检测扩增的其它方式在本发明的范围内。
应理解，存在设计具有类似扩增效率的定量标准的各种方法。在一个实施方案中，定量标准具有在内部引物之间相同的序列，并且仅在内部引物结合序列上不同。在另一个实施方案中，定量标准全部具有基本上相同的长度和基本上相同的GC含量。在另外一个实施方案中，序列具有不同的长度且GC含量也不同。设计具有相似扩增效率的核酸的其它方法是本领域已知的。
在一个实施方案中，示例性地当定量标准用于两步嵌套多重PCR反应时，定量标准可以在第一阶段PCR反应中全部使用相同的外部引物，潜在地甚至共享引物周围的相同区域，以避免由于二级结构形成的差异。然后可以通过在各个第二阶段PCR反应中使用不同的内部引物来区分定量标准，或者每种校准物具有独特的内部引物对，或者如上文，共享一种内部引物并具有一种独特的内部引物。此类实施方案的优点在于定量标准各自以相同的动力学结合其第一阶段引物，并且可以最小化第一阶段多重PCR反应的复杂性。
虽然提及了两步PCR，但相同的原理可以用于单步多重PCR中。在这种情况下，定量标准可以具有不同的正向或反向引物或者相同的正向和反向引物，并且示例性地各自具有特定的荧光探针或其它可鉴定的标签，本文考虑了例如化学发光、生物发光、辐射发光、电致发光、电化学发光、机械发光、结晶发光、热致发光、声致发光、磷光和其它形式的光致发光、酶促、放射性等等。该应用仅受限于用于区分标签的任何系统或其它方法中可用的检测通道的数目，如本领域中已知的。一些标签可能需要扩增后处理。此外，应理解，标记的定量标准可以用于两步PCR中，其中可以使用相同或不同的引物序列，并且标签用于在第二阶段PCR中检测。在此类实施方案中，标记的定量标准任选地可以在第二阶段PCR中多重化并且通过标签区分。
虽然在该实例中使用合成定量标准，但应理解用于定量标准的序列可以是天然存在的。例如，如果酵母用作SPC，则酵母序列可以用于一种或多种定量标准序列。对于裂殖酵母栗酒裂殖酵母，Tf2型逆转录转座子元件/转座子以13个拷贝存在，而核糖体RNA基因重复47次。在另一个实例中，可以使用以不同拷贝数存在的基因序列。示例性地，真菌病原体具有50至200个拷贝的核糖体RNA基因/核基因组。这些病原体还具有5至20个拷贝不等的转座子/基因组。细菌病原体具有1至15个拷贝/基因组，但大多数具有多于5个拷贝。可以使用其它天然存在的或合成的模板，例如用于病毒的细菌噬菌体和能够模拟膜和/或衣壳和/或包膜结构的合成颗粒。此外，尽管在本文的许多实例中使用了三种定量标准，但应理解，仅需要两种定量标准来定义线性标准曲线，并且在其中预期具有广泛范围的靶浓度、或者预期非线性标准曲线的实施方案中可能需要更多的定量标准。示例性地，可以基于系统的动态范围和测定的要求来选择定量标准的数目。
可替代地，如实施例5中所示，在每次实验运行中还能够仅使用一种定量标准(参见实施例5中讨论的样品处理对照(SPC))并且依赖输入的标准曲线用于定量，标准曲线所述先前用定量标准范围生成，示例性地用可以包括在用于该分析的软件中的至少3种定量标准(在实施例5中命名为QS)。
实施例3-多重校准
图6A类似于图5，但仅显示了来自三种所选校准物序列的数据。图6A证实了关于三种示例性定量标准的线性和几乎相同的扩增效率。图6B显示了在总共五个稀释度中，由三种定量标准各自的三个点的组合生成的复合标准曲线。
现在已生成了示例性校准曲线，可以生成使用关于每种靶测定的测定特异性参考模板的标准曲线。图7比较了使用鲍氏不动杆菌的良好定量的合成参考模板外部生成的标准曲线与使用定量标准生成的复合内部标准曲线。此处将三个“Syn”模板在加入反应管之前预混合；Syn4以103个拷贝添加，Syn2以104个拷贝添加，并且Syn3以105个拷贝/反应添加。来自这些模板的Cp值用于生成关于每个反应的复合内部标准曲线。使用合成参考模板生成外部标准曲线。鲍氏不动杆菌参考模板也在与“Syn”模板相同的浓度下测试。复合内部标准曲线和鲍氏不动杆菌标准曲线非常相似。相似的斜率显示效率是相似的。预期使用内部标准曲线可以预测鲍氏不动杆菌样品的未知起始浓度。然而，因为y-截距在两条曲线之间转变，所以当使用该内部标准曲线时，鲍氏不动杆菌的定量可以受益于校正因子。
因此，可以使用复合内部标准曲线计算靶生物的浓度。注意，内部标准各自处于不同的已知浓度，并且在与靶生物相同的过程中被扩增。该方法示例性地采用循环阈值(Ct)(或可替代地Cp值或其它类似方法)，其是对于靶和内部标准获得高于背景荧光的荧光信号所需的PCR循环数，如实验确定的。也可以使用其它点，例如使用第一、第二或第n阶导数，示例性地如美国专利号6,303,305中教导的，所述专利以引用的方式整体并入本文。如本领域中已知的，也可以使用其它点，并且在本文讨论的任何方法中，任何此类点都可以取代Cp或Ct。示例性地，在两步多重系统中，在嵌套的第二阶段反应中确定Cp值。然而，在其它实施方案中，应理解如对于扩增系统适当的，可以确定Cp。例如，可以通过使用寡核苷酸探针在单个多重反应或随后的第二阶段反应中测定Cp，所述寡核苷酸探针各自对于定量标准序列是特异性的并且具有可区分的荧光信号。
在其中使用单一内部标准的示例性实例中，根据下式，可以使用靶生物的Ct(Ctt)、内部标准的浓度(浓度，Cts)和Ct、以及靶生物的效率(效率t)来计算靶生物的浓度。
浓度t＝浓度s*效率t (Cts-Ctt) [等式1]，
其中下标s和t分别表示内部定量标准和靶生物，和
效率t＝1+作为百分比的效率/100 [等式2]。
例如，关于每个PCR循环具有100％扩增的靶的效率变量将等于2。注意，假设效率跨越动态范围是预定和恒定的。如上文讨论的，内部校准物的效率应该都是相似的，示例性地在彼此1％、2％、5％或10％内。类似地，靶的效率应该各自与校准物的效率相似，示例性地在校准物的2％、5％、10％或12％内。应理解，对于精确定量，期望在较窄范围内，例如在1％、2％或5％内的效率。然而，对于半定量或“建仓(binning)”结果(参见下文)，可以容忍效率中的更大变化。
当使用两种或更多种定量标准时，可以生成标准定量曲线，示例性地使用对关于部定量标准的数据的最小二乘回归线拟合(Ct，log10(浓度))，如图6A-6B所示。示例性地，回归拟合具有以下形式：
log10(浓度)＝(Ct-b)/a [等式3]，
其中b是截距并且表示当log10(浓度)为零时的Ct值，并且a是斜率，其表示Ct随着模板浓度中的单个单位变化而变化的程度(效率的函数)。给定关于未知靶的计算Ct值，该式给出以Log10单位的靶浓度。根据需要，可以应用其它算法或等式，以改善定量的精度和准确度。这些可以包括在提取和/或扩增中关于平台特异性、基质特异性或测定特异性偏差所需的调节。这些还可以包括可以解释任何多步扩增过程的分开步骤中的测定效率差异的算法。在一些实施方案中，定量标准曲线可以是非线性的，或者可以仅在某个动态范围内是线性的。示例性地，如果存在浓度依赖性可变斜率，则可以使用S形剂量-响应曲线。其它非线性曲线也在本发明的范围内。
基于对于靶观察到的Ct值和对于使用内部定量标准生成的标准曲线的回归方程，上述方法可以用于具有未知浓度的靶生物。理想地，使用该方法定量的所有靶都应该具有测定，所述测定与内部定量标准测定具有等价或相似的PCR效率。然而，靶测定标准曲线的斜率或截距中可能存在一些变化。鉴于靶测定可能具有与内部标准不同的扩增特征，测定特异性校正因子可以用于调节系统测定特异性偏差，以改善未知靶的计算浓度的准确度。示例性地，当使用线性定量曲线时，a可以用指示不同测定特异性效率的校正因子(其改变斜率)进行校正，或者b可以由于缺乏促使靶Ct延迟的关于特定靶的最佳PCR条件进行校正。适当时，可以使用这两种校正。在另一个实例中，示例性地，当使用嵌套PCR时，由于PCR1效率中的变化，PCR2中观察到的b中的差异可能是PCR1测定的总结果的结果。在这种情况下，校正因子可以作为Ct值的函数来计算，或者是取决于所需定量准确度的常数。
例如，可以用已知的靶生物浓度运行一组对照实验。如果使用以单一浓度的多次重复，则可以将测定特异性校正因子计算为以Log10单位表示的已知浓度和计算浓度的平均差异。示例性地，为了获得靶生物的校正对数浓度，可以将测定特异性校正因子添加到靶生物的log浓度(如上文通过内部定量标准方法计算的)。多重测定中的每种靶序列示例性地将具有其自身的校正(或者如果非常类似于复合标准曲线，则根本不校正)。
建立实验以比较通过测定特异性标准曲线计算的靶生物的定量与通过复合内部标准曲线计算的定量。在该实验中，已知量的鲍氏不动杆菌基因组核酸的10倍连续稀释与台式反应中的内部定量标准多重化。还如上文参考图7所述的建立外部测定特异性标准曲线。图8A显示了使用来自定量标准的复合标准曲线和对于鲍氏不动杆菌特异性的外部标准曲线的结果。如果复合标准曲线无需校正而使用，则存在靶生物(鲍氏不动杆菌)的明显系统过定量(～0.5log拷贝单位)，而当应用0.5log拷贝单位校正时，校正的测定特异性标准曲线给出了样品中的鲍氏不动杆菌滴度的相当准确的估计。图8B显示了如何通过将如上所述生成的平均测定特异性校正因子应用于通过内部标准曲线方法计算的量，来校正该系统的定量偏差。可以对于多重反应中的每个测定进行类似的校正。
在许多实施方案中，绝对定量不是必需的，并且半定量结果可能是足够的。结果可以报告为绝对浓度(伴随或不伴随系统误差(示例性地95％预测间隔))，或者可以建仓到多个范围之一内，示例性地报告“高”、“中”或“低”浓度，各自覆盖一个或多个数量级。应理解，框的数目可以变化，如使用特定测定适当的，并且可以使用任何数目的框。另外，可以调节关于半定量结果的建仓范围(数量级或其它度量)，如对于特定实例适当的。
实施例4-抑制样品类型中的校准
抑制性样品，示例性地抑制性基质，可以或多或少地相同程度地影响内部定量标准和靶测定的提取和扩增。因为内部标准以类似于靶序列的方式动态响应基质驱动的效应，所以它们也可以发挥标准化功能。在该实例中，来自实施例3的三种内部校准物以上文使用的浓度使用。TA-89是对于链球菌属(Streptococcus)物种呈阳性的气管抽吸物样品，并且显示具有抑制性质，如用于测试下呼吸道样品的示例性FilmArray小袋中的内部酵母RNA对照的显著延迟的Cps所反映的。TA-89以三种浓度使用：照原样、稀释2倍和稀释10倍。每个样品用以106CFU/mL的鲍氏不动杆菌进行掺料。如在实施例3中，还将以103、104和105拷贝/mL的三种内部定量标准模板添加到所有样品等分试样中。PBS无基质对照也用相同浓度的鲍氏不动杆菌和内部校准物进行掺料。
图9显示了抑制性基质如TA-89的稀释对检测的作用。在未稀释的基质中用关于鲍氏不动杆菌的较后Cp显现抑制性基质效应，并且当基质稀释时，可见关于鲍氏不动杆菌的较早Cp的趋势，其中样品中的最早Cp不含TA-89基质(仅PBS)。尽管跨越基质稀释的Ct值中的差异，但鲍氏不动杆菌的量在基质的所有稀释中都是相同的。在图10中，可见关于定量标准和鲍氏不动杆菌测定在Cp中的相似趋势，其中定量标准之一(103/mL)实际上在最抑制性(未稀释的)基质中掉落。
在图11A-D中，显示了由关于每种TA-89稀释和PBS无基质对照的内部定量标准生成的标准曲线(菱形)。鲍氏不动杆菌(方块)的Cp始终早于所有样品基质中的105/mL点。关于鲍氏不动杆菌的计算浓度显示于下表1中。所有预测值都在106CFU/mL的实际浓度的三倍内。这证实内部定量标准和鲍氏不动杆菌模板都类似地受抑制性基质影响，并且由关于内部定量标准的Cp或Ct值生成标准曲线提供了用于定量靶的有价值工具，即使在抑制基质中。
表1
Figure BDA0004045399620000251
实施例5-使用样品处理对照的定量
在该实例中，将以已知浓度的单一合成定量标准(QS)的使用与以已知浓度的单一微生物的使用进行比较，其中所述微生物也用作样品处理对照(SPC)，用于病原体(示例性地巨细胞病毒(CMV))的定量。在该实例中，使用基于柱的提取，并且在Bio-Rad CFX仪器上执行扩增，尽管应理解这些方法和仪器仅是示例性的。
该实验的设计显示于图12中，并且在两步中执行：
-第一步包括两部分：(A)用合成定量标准(QS)生成定量标准曲线，和(B)用由此生成的定量标准曲线校准单个天然样品处理对照SPC。
-第二步对应于使用其为SPC的单一天然定量标准定量靶核酸(CMV)。在该示例性实例中，靶核酸是CMV，并且SPC是粟酒裂殖酵母。
实验计划如下：
示例性地，第一步如下执行：
部分A)：
使用包括两种引物和一种探针的5′核酸酶实时PCR技术提供第一PCR混合物，其中所述引物和探针被特异性设计为扩增并检测并定量靶病原体。使用另一种PCR类似混合物，但设计用于扩增和检测合成定量标准。使用第三种PCR类似混合物，设计用于扩增和检测样品处理对照。应理解，5′核酸酶实时PCR技术仅是示例性的，并且可以使用其它检测手段。
在所需扩增平台上的第一次扩增运行中，使用定量合成标准(QS 1至QS4)的一系列4个稀释度以生成标准定量曲线，使用以下形式的回归线：
Ct＝(a*Log10浓度)+b [等式4]
或
Log10(浓度)＝(Ct-b)/a [等式3]，
其中a和b如上定义。
所得到的结果显示于下表2中且在图13中示出。
表2
Figure BDA0004045399620000261
示例性地，在扩增平台的相同的第一次运行中，测试了SPC微生物粟酒裂殖酵母的一系列4个稀释度。所得到的结果显示于表3中。
表3
Figure BDA0004045399620000271
示例性地，部分B)如下执行：
对于SPC栗酒裂殖酵母获得的结果针对标准定量曲线进行校准，并且确定校准因子。选择最佳SPC稀释度(示例性稀释度2)，示例性地选择在待检测的病原体的相关定量范围的中间，在其上放置标准定量曲线及其预定的回归线斜率。如上文所讨论的，通过PCR的定量频繁使用标准曲线方法。同样如上文所讨论的，已经证实标准曲线可以作为参数(截距和斜率)贮存，并且在单个值(Ct)上输入，这允许按运行调节定量，取决于SPC在运行中的行为。
在该实例中，值4.547将是关于Log10浓度的值，当SPC用作用于定量靶CMV的定量标准时，所述值用于确定下一次扩增运行的等式。示例性地，SPC可以被称为调节物或校准物，因为它作用于调节或校准标准曲线。在此步骤中，合成标准之一或SPC稀释之一可以用作预定回归线斜率的调节物，其中4.903的因子用于合成标准QS3，并且4.547的因子用于样品处理对照稀释度2。因子4.547用于计算校准截距，从而允许使用以下形式的回归线以SPC作为定量标准计算CMV浓度：
Log10(浓度)＝(Ct-b′)/a [等式5]，
其中a对应于合成定量标准范围的斜率，并且b′对应于当针对定量合成标准范围校准时的校准截距，且表示当SPC的Log10(浓度)为零时的Ct理论值。
第二步：
一系列样品然后与定量标准QS3和浓度为80000拷贝/mL的样品处理对照SPC栗酒裂殖酵母平行地进行测试：参考CMV菌株AD169的4个稀释度在全血样品中掺料，各自为4个重复。还使用从QCMD(Quality Control Molecular Diagnostics)获得的两个全血样品和5个全血临床样品。
对于23个样品，通过应用等式3和5确定样品中CMV的浓度。
结果在预期的数量级中，如表4和表5中所示。
表4
Figure BDA0004045399620000281
表5
Figure BDA0004045399620000291
使用样品处理对照作为定量标准以便调整用于定量的标准曲线参数利用了以下事实：该颗粒经历与样本和感染测试样品的潜在病原体全部相同的步骤，也具有与待检测病原体相同的行为。
使用QS3标准的CMV定量与使用SPC稀释度2的CMV定量之间的平均定量间隙为κ＝0.46Log。然后将其用作下一次运行的校正因子，以如下校正Log10(浓度)：log10(浓度t)＝log10(浓度s)+κ [等式6]
其中下标s和t分别表示SPC和靶，并且κ是先前对于所述靶确定的校正因子。
因此，病原体的定量可以考虑到沿着工作流的产量和效率的潜在损失，以变得更准确。
如图14所示，如果不应用校正因子(κ＝0.46)，用QS和SPC定量之间的差异为0.43Log，并且在校正后为-0.04。
应理解，以不同拷贝数出现的来自样品处理对照的两个或更多个序列可以用作内部定量标准，以生成可以用于定量多重测定中的靶的标准定量曲线。类似地，至少两种不同的样品处理对照可以以不同浓度使用，再次生成标准定量曲线，其可以如实施例2-4中公开的方法使用。
除本文讨论的定量方法之外，应理解，本文描述的任何定量标准都可以用于测试、比较或优化样品处理方法。定量标准也可以用于帮助估计原始样品中分析物(生物)的真实滴度，示例性地通过考虑样品制备过程中的损失。
在一个示例性实例中，可以应用定量标准来比较或优化样品处理方法。示例性地，定量标准可以用于下述过程的一个或多个中：(1)各种样品制备子特点，例如温育步骤的长度、磁珠收集时间、洗涤步骤或洗脱步骤的优化；(2)不同商业或非商业样品制备平台，例如MagNA
Figure BDA0004045399620000301
或Easy MagTM的提取效率比较，以采用最佳平台；或者(3)对提取的基质作用的比较，示例性地使用相同的平台，尽管跨平台比较也是可能的。例如，复杂基质例如痰可以引起比更不复杂的基质例如NPS或BAL更大的核酸提取障碍。通过样品制备子特点修改，可以开发对于多个基质同样良好地起作用的样品制备方案。
对于所有上述应用，示例性的比较可以通过在样品制备之前将固定数量的一种或多种定量标准(模板A)加入样品中来完成。然后，模板A将经历样品所经历的所有过程。在样品制备期间损失的模板A的量预期为来自样品中的分析物的核酸损失量的良好近似值。然后可以将一种或多种第二定量标准(模板B)以与模板A相同的量加入洗脱物中。然而，应理解，不需要1/1的比率，并且可以加入其它已知量的模板B。对洗脱物执行PCR，并且将模板A的Cp与模板B的Cp进行比较。鉴于在样品制备过程中模板B无一损失，预期模板B将更早地扩增。示例性地，在模板A和B之间产生Cp的最小差异的方案或平台可以是更有效的样品制备方法。
在另一个示例性实例中，通过考虑在样品制备期间的损失，定量标准可以用于估计原始样品中分析物(例如生物)的真实滴度。因此，模板A和B之间的差异可以用于通过估计由于样品提取效率问题的损失来反向计算样品中的真实滴度值。损失的量级可以转换成校正因子，然后可以将其应用于通过常规qPCR方法确定的分析物数量。
应理解，模板A和B可以各自是单个定量标准，如实施例5中，或者任一或两者可以是定量标准的组合(示例性地以不同的浓度)，如实施例2-4中。
本发明可以以其它特定形式实施，而不背离其精神或基本特征。所述实施方案在所有方面都视为仅是示例性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是前文说明书指示。虽然某些实施方案和细节已在本文和所附发明公开内容中包括用于说明本发明的目的，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以对本文公开的方法和设备进行各种改变，而不背离在所附权利要求中限定的本发明的范围。在权利要求的含义和等价范围内的所有变化都包含在其范围内。

Claims (10)

1.一种用于对样品中的核酸分子执行定量核酸扩增的方法，其包括：
a)裂解所述样品；
b)从所述样品中提取核酸分子；
c)执行所述核酸分子的核酸扩增；
其中至少一种样品处理对照在步骤a)之前或在步骤a)期间以已知量加入所述样品中；
其特征在于来自所述样品处理对照的核酸序列充当定量标准。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤c)包括使用扩增混合物扩增所述样品中包含的核酸分子，所述扩增混合物包含至少一种靶引物，所述靶引物配置为扩增可能存在于所述样品中的靶；和
所述扩增混合物进一步包含至少一种定量标准引物组，其配置为扩增所述定量标准。
3.根据权利要求2的方法，其进一步包括通过将对于所述定量标准和所述靶获得的信号与输入的标准曲线进行比较来定量所述靶。
4.根据权利要求3的方法，其中所述输入的标准曲线已使用与以下的最小二乘回归线拟合来生成：
log10(浓度)＝(Ct–b’)/a
其中
Ct是对于每种靶测量的循环阈值，
a对应于所述合成定量标准范围的斜率，并且其表示Ct随着log10浓度中的单个单位变化而变化的程度，和
b’对应于当针对定量合成标准范围校准时的校准截距，且表示当SPC的Log10(浓度)为零时的Ct理论值。
5.根据权利要求4的方法，其进一步包括在所述定量标准和所述靶之间应用预定的校正因子。
6.根据权利要求5的方法，其中所述靶的浓度根据下述等式进行确定：
log10(浓度t)＝log10(浓度s)+κ
其中下标s和t分别表示样品处理对照和靶，并且κ是先前对于所述靶确定的校正因子。
7.根据权利要求6的方法，其中所述定量扩增是定量PCR。
8.根据权利要求7的方法，其中所述扩增是多重PCR，用于扩增多种靶。
9.根据权利要求2的方法，其进一步包括在步骤c)之前添加第二定量标准，并且在步骤c)之后比较所述定量标准的扩增。
10.权利要求9的方法，其中所述定量标准和所述第二定量标准之间的扩增差异指示所述步骤b)的效率。
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