JP2019509051A5

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Publication number: JP2019509051A5
Application number: JP2018549796A
Authority: JP
Filing date: 2017-03-20
Publication date: 2020-04-16
Anticipated expiration: 2037-03-20

Claims

第１段階多重増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は複数の標的プライマーを含み、それぞれの標的プライマーは試料中に存在し得る異なる標的を増幅するように構成されており、増幅混合物は、それぞれの定量標準が異なる配列でありそれぞれが異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸、および少なくとも１つの定量標準プライマーをさらに含み、定量標準プライマーは定量標準核酸を増幅するように構成されているステップと、
第１段階増幅混合物を複数の第２段階の個々の反応へと分割するステップであって、複数の第２段階の個々の反応のうちの第１群がそれぞれ、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている少なくとも１つのプライマーを含み、複数の第２段階の個々の反応のうちの第２群がそれぞれ、定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている少なくとも１つのプライマーを含んでいるステップと、
複数の第２段階の個々の反応を増幅条件に供して、１つまたは複数の標的単位複製配列および複数の定量標準単位複製配列を生じるステップであって、それぞれの定量標準単位複製配列が関連する定量標準Ｃｐを有するステップと
を含む、試料において定量的２ステップ増幅を行う方法。
定量標準Ｃｐから検量線を作成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
検量線を使用して１つまたは複数の標的のそれぞれを定量することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
請求項３に記載の方法であって、
それぞれの標的を、以下への最小二乗回帰直線の当てはめを使用して作成した検量線を使用して定量され、
ｌｏｇ_１０（濃度）＝（Ｃｔ−ｂ）／ａ
［式中、Ｃｔはそれぞれの標的について測定されたサイクル閾値であり、
ｂは切片であり、標的のｌｏｇ_１０（濃度）がゼロである場合のＣｔ値を表し、
ａは傾きであり、濃度の単一単位の変化でＣｔが変化する度合を表す］
ここで任意選択により、それぞれの標的を、最小二乗回帰直線および補正係数を使用して定量してもよい、
方法。
請求項３に記載の方法であって、
検量線が非線形である、または、
定量ステップが濃度を報告する、または、
定量ステップが複数の範囲のうちの１つの範囲に入る濃度を生成し、その１つの範囲を報告する、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、それぞれのプライマーがプライマー対で提供され、
ここで任意選択により、増幅混合物が一対の定量標準プライマーのみを含むものであってもよい、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
複数の定量標準核酸に少なくとも２つの定量標準核酸が含まれる、または、
内部定量標準核酸が試料中の天然に存在する配列である、
方法。
請求項１に記載の方法であって、
定量標準核酸がすべて同様の増幅効率を有し、
ここで任意選択により、すべての標的が同様の増幅効率を有してもよい、
方法。
増幅混合物中の試料を増幅するステップであって、増幅混合物は、試料中に存在し得る標的を増幅するように構成されている一対の標的プライマーを含み、増幅混合物は、それぞれの定量標準が異なる配列でありそれぞれが異なる既知濃度で提供される複数の定量標準核酸、および少なくとも一対の定量標準プライマーをさらに含み、定量標準プライマーは、定量標準核酸を増幅して複数の増幅標準単位複製配列を作製するように構成されているステップと、
定量標準単位複製配列から検量線を作成するステップと、
検量線を使用して標的核酸を定量するステップと
を含む、試料において定量的増幅を行う方法。
請求項９に記載の方法であって、
増幅混合物が、試料中に存在し得る複数の追加の標的を増幅するように構成されている複数の追加の標的プライマー対をさらに含み、
ここで任意選択により、前記方法は、
増幅ステップに続いて、
増幅混合物を複数の個々の反応へと分割するステップであって、複数の個々の反応のうちの第１群は、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含み、複数の個々の反応のうちの第２群は、定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含むステップと、
複数の個々の反応を増幅条件に供して、１つまたは複数の標的単位複製配列および複数の定量標準単位複製配列を作製するステップと
をさらに含んでもよく、その場合、作成および定量ステップが供するステップに続いて起こる、
方法。
請求項９に記載の方法であって、
定量標準核酸に特異的な標識を使用して、それぞれの定量標準核酸の増幅を検出するステップをさらに含み、
ここで任意選択により、それぞれの標識が識別可能な標識したプローブであってもよい、
方法。
それぞれの複数の内部定量標準核酸を、プロセスコントロールとしても役割を果たすために既知量で増幅混合物に提供する、請求項９に記載の方法。
ａ）第１の定量標準を試料に第１の既知量で加えるステップと、
ｂ）試料プロセス方法を使用して第１の定量標準の存在下で核酸を試料から抽出するステップと、
ｃ）第２の定量標準を試料中の抽出した核酸に第２の既知量で加えるステップと、
ｄ）核酸および定量標準の核酸増幅を行うステップと、
ｅ）第１の定量標準と第２の定量標準との間の増幅の差異を決定するステップであって、
差異は試料プロセス方法の効率の指標であるステップと
を含む、試料プロセス方法を試験する方法。
複数対の標的プライマーを含む増幅容器であって、それぞれの標的プライマー対は試料中に存在し得る異なる標的を増幅するように構成されており、それぞれの定量標準が異なる配列でありそれぞれが異なる既知濃度で提供される複数の内部定量標準核酸、および少なくとも一対の較正用プライマーをさらに含み、較正用プライマーは内部定量標準核酸を増幅するように構成されている、増幅容器と、
複数の第２段階の個々の反応ウェル、すなわち、試料中に存在し得る様々な標的のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含む、複数の第２段階反応ウェルのうちの第１群、および内部定量標準核酸のうちの１つをさらに増幅するように構成されている一対のプライマーをそれぞれ含む、複数の第２段階反応のうちの第２群と
を含む、試料において定量的２ステップＰＣＲを行うための試料容器。
請求項１４に記載の試料容器を受けるための開口部と、
増幅容器を増幅条件に供するための第１の加熱器と、
複数の第２段階の個々の反応ウェルを増幅条件に供するための第２の加熱器と、
定量標準核酸の増幅を使用して検量線を作成し、それぞれの増幅された標的について定量的または半定量的な結果を出力するようにプログラミングされたコンピュータと
を備えた、試料において定量的２ステップＰＣＲを行うための機器。