CN115491435A - 用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合和检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种利用寡核苷酸杂交和目标特异性扩增反应对混合样品进行分析而不需要再次检测的方法。具体而言，本发明涉及用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合和检测方法，涉及至少两个样本的样本混合和检测方法。更具体而言，核酸合成具有不同序列组成的一系列鉴定物寡核苷酸，使其与目标靶模板组合，其中每种鉴定物寡核苷酸对应于不同的样本。将上述产物混合在一起再对其进行扩增，并使用基于探针的杂交试验或尺寸分离模块来检测混合的样本，以鉴定样本混合池中的任意一个样本是否被检测为阳性，以及同时鉴定具体哪个样本是阳性的。

Description

用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合 和检测方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年6月20日提交的美国临时申请系列号 No.63/212,719的优先权，其全部内容通过引用并入本文，包括所有表、图或附图。

技术领域

本申请涉及医学检测领域。具体而言，涉及用于大规模人群中病毒病原体筛查的的快速且样本特异性混合和检测方法。

背景技术

快速的宿主间传播和国际旅行的便利已经成为诸如H1N1、Zika、SARS以及最近的COVID-19等流行病大规模流行的根本原因(参见文献“Broughton,J.P.；Deng,X.；Yu,G.；Fasching,C.L.；Servellita,V.； Singh,J.；Miao,X.；Streithorst,J.A.；Granados,A.；Sotomayor-Gonzalez,A.；Zorn,K.；Gopez,A.；Hsu,E.；Gu,W.；Miller, S.；Pan,C.Y.；Guevara,H.；Wadford,D.A.；Chen,J.S.；Chiu,C.Y. CRISPR–Cas12-Based Detection ofSARS-CoV-2.Nat.Biotechnol. 2020,38(7),870-874”)。由于危机的严重性，即使是发达国家也常常无法及时提供足够规模的疫苗接种和治疗用以遏制传染病的蔓延 (参见文献“Yan,Y.；Chang,L.；Wang,L.Laboratory Testing of SARS-CoV,MERS-CoV,and SARS-CoV-2(2019-NCoV):Current Status,Challenges,and Countermeasures.Rev.Med.Virol.2020,30(3), 1-14)。此外，开发可靠的疫苗通常需要花费数月或数年(参见文献“Excler,J.L.；Saville,M.；Berkley,S.；Kim,J.H.Vaccine Development for EmergingInfectious Diseases.Nat.Med.2021,27(4), 591-600”)。因此，世界上仍然依靠诸如接触追踪和物理隔离之类的经典流行病控制措施来减轻疾病的传播(参见文献“Ferretti,L.；Wymant,C.；Kendall,M.；Zhao,L.；Nurtay,A.；

L.； Parker,M.；Bonsall,D.；Fraser,C.Quantifying SARS-CoV-2 Transmission Suggests Epidemic Controlwith Digital Contact Tracing. Science(80-.).2020,368(6491),0-7”)，这些措施高度依赖于诊断疑似患者的准确性和速度(参见文献“Eberhardt,J.N.；Breuckmann,N. P.；Eberhardt,C.S.Multi-Stage Group Testing Improves Efficiency of Large-ScaleCOVID-19 Screening.J.Clin.Virol.2020,128(April), 104382”)。目前，病原体检测的黄金标准仍然是基于核酸诊断的聚合酶链式反应(PCR)(参见文献“Khan,P.；Aufdembrink,L.M.； Engelhart,A.E.Isothermal SARS-CoV-2 Diagnostics:Tools for EnablingDistributed Pandemic Testing as a Means of Supporting Safe Reopenings.ACSSynth.Biol.2020,9(11),2861-2880”；“Zhang,C.； Zheng,T.；Wang,H.；Chen,W.；Huang,X.；Liang,J.；Qiu,L.；Han,D.； Tan,W.Rapid One-Pot Detection of SARS-CoV-2Basedon a Lateral Flow Assay in Clinical Samples.Anal.Chem.2021”)。然而，单一 PCR检测的检测能力有限、成本高和分析时间长等因素往往会影响其抑制社区范围传播的有效性，特别是在资源贫乏的地区更是如此 (参见文献“Mutesa,L.；Ndishimye,P.；Butera,Y.；Souopgui,J.； Uwineza,A.；Rutayisire,R.；Ndoricimpaye,E.L.；Musoni,E.；Rujeni, N.；Nyatanyi,T.；Ntagwabira,E.；Semakula,M.；Musanabaganwa,C.； Nyamwasa,D.；Ndashimye,M.；Ujeneza,E.；Mwikarago,I.E.；Muvunyi, C.M.；Mazarati,J.B.；Nsanzimana,S.；Turok,N.；Ndifon,W.A Pooled Testing Strategy for IdentifyingSARS-CoV-2at Low Prevalence. Nature 2021,589(7841),276-280”)。

作为可选方案，将多个单独的样本混合在一起并检测的混合检测是一种扩大诊断样本容纳量并节省操作时间和成本的有吸引力的方法。这种策略首先由Dorfman提出。Dorfman建议可以将样本混合在一起并同时检测以减少所需检测的总次数(参见文献“Dorfman,R. The Detection of Defective Members of Large Populations Author(s): Robert Dorfman Source:The Annals of Mathematical Statistics,Dec., 1943,Vol.14,No.4(Dec.,1943),Pp.Published by:Institute of Mathematical StatisticsStable URL:Ht.Math.Stat.1943,14(4), 436-440”)。如果混合的样本检测结果为阴性，则意味着混合池中的单独样本均为阴性；而如果混合的样本为阳性，则必须单独检测混合池中的单个样本(参见文献“Johnson,N.L.；Kotz,S.；Rodriguez,R. N.Dorfman-SterrettScreening(Group Testing)Schemes and the Effects of Faulty Inspection.http://dx.doi.org/10.1080/03610928908829979 2007,18(4),1469-1484”)。Dorfman检测已经应用于献血者的HIV 筛查(参见文献“Van Zyl,G.U.；Preiser,W.；Potschka,S.；Lundershausen,A.T.；Haubrich,R.；Smith,D.Pooling Strategies to Reduce the Costof HIV-1RNA Load Monitoring in a Resource LimitedSetting.Clin.Infect.Dis.2011,52(2),264-270”)、粪便中沙门氏菌的检验(参见文献“Singer,R.S.；Cooke,C.L.；Maddox,C.W.； Isaacson,R.E.；Wallace,R.L.Use of PooledSamples for the Detection of Salmonella in Feces by Polymerase ChainReaction.J.Vet. Diagnostic Investig.2006,18(4),319-325”)以及流感病毒的检验(参见文献“Van,T.T.；Miller,J.；Warshauer,D.M.；Reisdorf,E.；Jernigan, D.；Humes,R.；Shulta,P.A.Pooling Nasopharyngeal/Throat Swab Specimens to Increase TestingCapacity for Influenza Viruses by PCR.J. Clin.Microbiol.2012,50(3),891-896”)。实际上对于最近爆发的 COVID-19，许多国家和地区已采用混合检测的方法来解决对快速和大量社区检测的巨大需求(参见文献“Verdun,C.M.；Fuchs,T.；Harar, P.；

D.；Fischer,D.S.；Berner,J.；Grohs,P.；Theis,F.J.； Krahmer,F.Group Testing forSARS-CoV-2 Allows for up to 10-Fold Efficiency Increase across RealisticScenarios and Testing Strategies. medRxiv 2020”；“Noriega,R.；Samore,M.H.Increasing Testing Throughput and Case Detection with a Pooled-SampleBayesian Approach in the Context of COVID-19.bioRxiv 2020”)。

尽管已经报道了将样本混合成4至10个一组可将总体检测次数减少50％至60％(参见文献“Z,Z.；RM,M.；J,G.；RE,W.；DA,M.；DP, M.；J,S.；YP,S.Pooled PCR TestingStrategy and Prevalence Estimation of Submicroscopic Infections UsingBayesian Latent Class Models in Pregnant Women Receiving IntermittentPreventive Treatment at Machinga District Hospital,Malawi,2010.Malar.J.2014,13(1)”)，但是此方法仍存在某些局限性。首先，由于来自阴性样本的稀释，灵敏度会降低(参见文献“S,F.；U,K.；AK,N.；A,A. Sample Pooling for Real-Time PCR Detection andVirulence Determination of the Footrot Pathogen DichelobacterNodosus.Vet.Res. Commun.2017,41(3),189-193”)；其次，由于交叉污染的可能性较高，方法的选择性会受到影响(参见文献“

C.； Thurmond,M.；Hietala,S.；Johnson,W.Factors Affecting Sensitivity and Specificity of Pooled-SampleTesting for Diagnosis of Low Prevalence Infections.Prev.Vet.Med.2006,74(4),309-322”)。此外，优化混合在一起的样本数量需要事先估计疾病的流行率(参见文献“Xiong,W.；Lu,H.；Ding,J.Determination of Varying Group Sizes for PoolingProcedure.Comput.Math.Methods Med.2019,2019”)；如果混合池的规模太大和/或疾病的流行率太高，则将不会减少检测的总数，因为许多混合的样本需要再检测。许多研究已经报道了通过使用数学和统计学算法来改善样本混合检测的性能，例如，基于携带率 (参见文献“Shental,N.；Levy,S.；Wuvshet,V.；Skorniakov,S.； Shalem,B.；Ottolenghi,A.；Greenshpan,Y.；Steinberg,R.；Edri,A.； Gillis,R.；Goldhirsh,M.；Moscovici,K.；Sachren,S.；Friedman,L.M.； Nesher,L.；Shemer-Avni,Y.；Porgador,A.；Hertz,T.Efficient High-Throughput SARS-CoV-2 Testing to Detect AsymptomaticCarriers.Sci.Adv.2020,5961,eabc5961”)预测最佳混合池的样本容纳量(参见文献“Mutesa,L.；Ndishimye,P.；Butera,Y.；Souopgui,J.； Uwineza,A.；Rutayisire,R.；Ndoricimpaye,E.L.；Musoni,E.；Rujeni, N.；Nyatanyi,T.；Ntagwabira,E.；Semakula,M.；Musanabaganwa,C.；Nyamwasa,D.；Ndashimye,M.；Ujeneza,E.；Mwikarago,I.E.；Muvunyi,C.M.；Mazarati,J.B.；Nsanzimana,S.；Turok,N.；Ndifon,W.A Pooled Testing Strategyfor Identifying SARS-CoV-2 at Low Prevalence. Nature 2021,589(7841),276-280”)；然而，这仍然不能根本消除此方法对再次检测步骤的需要。此外，结合多重条形码和下一代测序 (NGS)技术(参见文献“Schmid-burgk,J.L.；Li,D.；Feldman,D.； Strecker,J.；Cleary,B.；Regev,A.LAMP-Seq:Population-Scale COVID-19 Diagnostics Using aCompressed Barcode Space.bioRxiv 2020”；“Chappleboim,A.；Joseph-Strauss,D.；Rahat,A.；Sharkia,I.； Adam,M.；Kitsberg,D.；Fialkoff,G.；Lotem,M.；Gershon,O.；Schmidtner,A.K.；Oiknine-Djian,E.；Klochendler,A.；Sadeh,R.；Dor, Y.；Wolf,D.；Habib,N.；Friedman,N.ApharSeq:An Extraction-Free Early-Pooling Protocol forMassively Multiplexed SARS-CoV-2 Detection.medRxiv 2020,33”)的大规模平行诊断分析已经被应用于实现病毒病原体的样本特异性检测。Hossain及其同事开发了一种条形码测序方法，用于同时检测19,200个患者样本以进行COVID-19 筛查(参见文献“Hossain,A.；Reis,A.C.；Rahman,S.；Salis,H.M.A Massively Parallel COVID-19DiagnosticAssay for Simultaneous Testing of 19200 Patient Samples，Google文献,2020年3月”)。虽然NGS能够实现高通量，但是昂贵的NGS耗材以及对生物信息学工具和人力的相关需求限制了其有效运用以及对大规模场合的适用性。

因此，需要更有效的混合检测平台，其能够最大限度地降低(如果不能消除)对再次单独重新检测的需要。此外，该方法必须快速并且涉及简单方便的诊断平台，从而可以利用常用的仪器。

发明内容

本申请涉及ID引物辅助的样本特异性混合检测策略(Uni-Pool)，其中可以提取(例如)天然样本中的病毒病原体的靶基因序列，并伴随样本特异性引物的标记进行扩增。本申请的方法通过将不同序列 (即具有可区分的吉布斯自由能和/或熔解温度)的样本特异性鉴定物链引入与靶核苷酸序列(例如病毒RNA)互补的引物的5'端，从而提供样本特异性读出。本申请的方法可以利用合理设计的经标记的寡核苷酸探针，例如荧光标记和淬灭剂标记以及荧光通道，其工作流程与病毒RNA病原体的逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)兼容。可以通过qPCR后的高分辨率熔解曲线分析(HRMCA)(参见文献“Huang,Q.；Liu,Z.；Liao,Y.；Chen,X.；Zhang,Y.；Li,Q.Multiplex Fluorescence Melting Curve Analysis forMutation Detection with Dual-Labeled,Self-Quenched Probes.PLoS One 2011,6(4)”；“Zhan, Y.；Zhang,J.；Yao,S.；Luo,G.High-Throughput Two-DimensionalPolymerase Chain Reaction Technology.Anal.Chem.2020”)直接获得一个混合池中的各样本的结果(阳性或阴性)。

本申请的方法可消除重新单独检测的需要，并允许在实时定量 PCR后通过多重熔解曲线分析来揭示混合池中所有样本的阳性或阴性的检测结果。本申请的方法可进一步显著缩短大规模筛查的总分析时间，且不会产生由混合样本稀释所引起的特异性和检测灵敏度损失。

在某些实施方案中，可以在一个混合池中区分至少2个至50个阳性和阴性样本，其中阳性和阴性样本之间的交叉反应性可以忽略。

附图说明

图1A至图1C.图1A.独特ID引物辅助的样本特异性混合检测 (Uni-Pool)的工作流程。向每个提取的样本中添加样本特异性ID 引物，然后收集在一个管中用于混合，随后进行实时定量PCR扩增和多重熔解曲线分析。图1B.逆转录(RT)的详细浏览。第一步包括通过RT将ID引物添加到各样本中。在这个阶段，含有病毒RNA 的样本将产生cDNA-RNA双链体。图1C.通过闭管2D多重PCR进行Uni-Pool分析。使用不同颜色(FAM和HEX)的五组熔解曲线检测探针来鉴定用ID引物扩增的匹配模板。在混合池中，cDNA-RNA 模板将通过使用大量正向引物的不对称PCR产生大量互补单链扩增子。接下来，匹配的荧光团和淬灭剂探针组在45℃与同源扩增子杂交。通过提高反应温度，荧光强度vs.温度的一阶导数(-dRFU/dT) 指示筛查结果的阳性(具有峰)或阴性(没有峰)。

图2A至图2K.具有三个ID样本的一个混合池的单FAM通道熔解曲线图。这里使用的合成RNA模板的浓度为10³拷贝/μL，这是唾液样本中SARS-CoV-2的平均病毒载量。RFU是指相对荧光单位。图2A至图2F.来自使用FRET探针(图2A至图2C)和自淬灭TaqMan探针(图2D至图2F)的熔解曲线分析的熔解峰信号的比较。图2B、图2C、图2E、图2F中的灰线是具有三个阳性样本的混合池的结果，黑线是无模板对照(NTC)的结果。RFU-T(图2B和图2E)为荧光信号随温度变化的记录，-dRFU/dT(图2C和图2F)为荧光信号的变化速率。对于自淬灭TaqMan探针，当其与靶序列杂交时，因为荧光团远离淬灭剂，所以发射出荧光信号。加热后，一旦达到探针的熔解温度(T_m)，自淬灭TaqMan探针能够从探针-靶双链体上释放，因此荧光信号将由于探针结构的游离状态而急剧降低。对于FRET探针，荧光信号变化与自淬灭TaqMan探针的荧光信号变化相反。图2G至图2K.示出了通过FAM通道检测的包括样本1、样本2和样本3的三个混合的靶标的熔解曲线。所有的灰线对应于FAM通道中的靶信号，黑线对应于PCR NTC。对应于样本1、样本2和样本3的熔解谷的T_m分别为48℃、60℃和70℃。“阳性”和“+”表示样本具有RNA，而“阴性”和“-”表示样本没有RNA。

图3A至图3G.在FAM和HEX这两个荧光通道中，含有五个样本的Uni-Pool的熔解曲线分析。图3A至图3B.具有不同数量的阳性样本的两个示例性混合池(混合池1：五个阳性样本，混合池2：第2个和第4个样本为阳性，其余样本为阴性)。左图灰线是FAM 中的样本，右图灰线是HEX中的样本，并且黑线是指无模板对照 (NTC)。图3C至图3F.五个样本的Uni-Pool的灵敏度检测。图 3C至图3D.具有一个阳性样本和四个阴性样本的混合池的熔解曲线结果，并且阳性样本具有不同的浓度。图3E至图3F.在两个阳性样本和三个阴性样本的情况下，这些阳性样本的T_m分别为50℃和60 ℃、或60℃和70℃。在这两个阳性样本中，一个样本的浓度固定为 10⁶拷贝/μL，另一个样本具有在50拷贝/μL至10⁶拷贝/μL范围的不同模板浓度。图3G.热图的交叉反应性示出了两种不同浓度(10⁵拷贝/μL和10³拷贝/μL)的合成SARS-CoV-2RNA样本和流感H1N1 RNA样本的熔解峰高的强度，其中使用SARS-CoV-2的引物组(ID引物和PCR引物)。

图4A至图4AC.使用Uni-Pool分析法和常规的传统的混检方法检测40个模拟唾液样本之间的比较。图4A.使用我们的Uni-Pool 和传统的混检方法检测40个模拟唾液样本的示意图。将流行率为 15％的40个模拟唾液样本随机分成8个含有5个单独样本的混合池。对于Uni-Pool分析法，首先对提取的样本进行逆转录，其中ID引物作为逆转录酶的引物，然后混合以用于一锅多重熔解曲线分析。对于常规的基于Dorfman的混合检验，将提取的样本混合在一起，并通过一步RT-qPCR进行分析，此方法额外的步骤是对具有阳性结果的混合池中的单独样本进行再检测。图4B至图4G.使用2D Uni-Pool 分析法和传统的混检方法对40个唾液样本的检测结果。在混合池1 中：样本1含有10拷贝/μL假病毒，并且其他样本为阴性。在混合池8中：样本36含有50拷贝/μL假病毒，样本40含有10³拷贝/μL 假病毒，并且其他样本为阴性。对于常规的组检验，Cq值小于40表明SARS-CoV-2的阳性结果。所有反应进行了三次重复，详细结果总结于图4H至图4AC中。

图5.ID引物的结构。其合理设计的寡核苷酸序列由三个核心部分组成：与目的RNA靶互补的靶特异性区域、提供独特鉴定序列并可通过其熔解温度区分(或者通过改变序列的组成和长度)的ID区域、以及用于随后的PCR引物结合的扩增序列区域。ID区域的设计为彼此正交(无相互作用)以消除引物二聚化，并且也将扩增序列设计为有所不同，以消除来自不同样本中的靶浓度差异的偏差。

图6.向各样本中添加ID引物并进行样本混合的原理。首先，在RNA提取后，将独特“ID引物”单独添加到各样本中。如果样本含有病毒RNA，如样本1和3所示，则ID引物将作为逆转录引物，由此在添加没有核糖核酸酶H(RNase H)活性的逆转录酶后产生 cDNA-RNA双链体。相反，在没有RNA靶标时，引物保持为单链DNA(如样本2所示)。然后，向各样本中添加核酸外切酶I。由于核酸外切酶I只能降解单链DNA(从3'端至5'端)，因此核酸外切酶I将选择性消化所有未被使用的ID引物，而只有cDNA-RNA双链体保持完整。因此，对于病毒RNA靶标呈阳性的各样本会被标记上特殊标签，然后可以在下一步骤混合后根据此特殊标签对不同样本进行区分。

图7.使用基于探针的熔解曲线分析的混合样本的检测方案。将策略设计为用于使用在ID区域具有不同T_m值的引物的样本混合。首先，通过不对称PCR扩增样本以由混合池中的cDNA靶标产生单链扩增子。熔解曲线探针组包括具有荧光团的探针(与ID区域互补) 和具有淬灭剂的探针(与邻近于F探针结合区域的cDNA区域互补)。 Q探针足够长以确保其T_m值为约80℃。在熔解曲线分析期间，F探针和Q探针将在约45℃下杂交到它们相应的位点，并且在这时，荧光信号被淬灭。当温度达到F探针的T_m值时，F探针将被释放，并会发生荧光信号的急剧提高。通过设计F探针的不同荧光团和T_m值，熔解曲线峰可以与特定的标记cDNA靶标的存在相关联。

图8.使用片段长度鉴定的混合样本检测方案。将策略设计为用于使用具有不同长度的ID区域的引物的样本混合。样本混合后，第一步包括混合样本的PCR或等温扩增以产生具有独特长度的双链扩增子，所述独特长度可以追溯到最初添加的ID引物的长度。因此，在该步骤中，初始RNA/DNA双链体将转变为双链DNA分子。然后使用片段分析仪检测该产物。通过将样本中的条带与DNA梯状条带进行比较，可以通过扩增自RNA/DNA双链体的产物的近似尺寸来推断阳性样本。如果没有检测到条带，则宣布所有的单独样本为阴性，但是如果在预期位置存在条带，则产物的长度将表明哪个样本为阳性。

图9.使用实时定量PCR的混合样本检测方案。将策略设计为用于使用约20bp至30bp的在ID区域具有不同的碱基组合的标签引物的样本混合。在PCR扩增过程中，用不同类型的荧光团标记的 TaqMan探针将与预期的靶标杂交，并且可被聚合酶的核酸外切酶活性水解，以发出实时荧光信号。如果存在病毒RNA靶标，则会表现出信号的指数增长。根据循环阈值，该分析法可以实现混合样本的定量和定性分析。

图10.使用电化学检测的混合样本检测方案。该策略涉及添加具有不同的碱基组成的约20bp至50bp的ID引物。首先，将cDNA 混合样本与扩增引物和同源探针混合，所述同源探针用具有非重叠性氧化还原电位的电活性报告基团(即，二茂铁、亚甲基蓝、蒽醌)标记。因为DNA聚合酶具有核酸外切酶性质，所以与正确靶标杂交的电化学探针将在延伸步骤期间被水解。因此，可以释放出具有短的单核苷酸的电活性报告基团。扩增后，将进行终点电化学检测。作为结果，通过在特定电位的高电流峰值，可以将含病毒的样本与不含病毒的样本区分开来。

图11.基于杂交添加ID引物和样本混合的原理。在该分析法中，通过核酸碱基的特定氢键结合模式实现ID引物的添加，并且在逆转录反应之前进行样本混合步骤。将靶特异性ID引物(图5)添加到提取的RNA模板中。通过在65℃下加热使单链RNA模板的二级结构松散，然后在较低温度下使ID引物与互补RNA链退火。退火后，使用核酸外切酶I消化未杂交的ID引物以防止混合样本中的交叉反应性。然后，所有的ID样本将以相同的体积混合，然后使用上述检测方案进行检测(图7至图10)。

图12.使用磁珠(MB)系统的样本混合检测原理。该步骤将样本制备和添加ID引物合并为一个步骤，其涉及原始RNA样本的无须样本提取制备方法。将裂解缓冲液添加到从个体收集的样本中。在孵育后，释放出核酸、蛋白质和其他物质。生物素标记的捕获链将首先通过链霉亲和素-生物素相互作用而连接到链霉亲和素包被的磁珠 (MB)。然后将连接有捕获链的链霉亲和素包被的磁珠和ID引物 (图5)引入上述混合物，并使RNA靶标与捕获链特异性杂交。同时，ID引物也将结合至RNA靶标的不同区域。之后，洗去不依赖于酶消化的未结合的引物和杂质，仅保留DNA-RNA双链体。接下来，将所有样本混合在一起，然后进行逆转录和检测步骤(图7至图10)。此外，也可以通过逆转录酶的置换活性从系统中分离出MB。多重逆转录后，带有捕获链的MB会从cDNA-RNA双链体中置换出来，接着可以使用磁场分离标记的cDNA靶标和具有RNA捕获链的MB。

图13.通用熔解曲线检测探针的工作原理。将F探针设计为与样本1的ID区域完全互补。当该F探针与样本2杂交时，将形成2nt 的悬垂端，与样本3杂交时将形成4nt的悬垂端。该2nt的悬垂端可导致在熔解曲线分析期间T_m值降低5℃。

图14.使用片段长度鉴定来检测混合样本的凝胶电泳结果。通过逆转录将三种不同长度的ID引物添加到三个单独的样本中。如果三个样本含有病毒RNA，则它们将产生三种分别具有132bp、120bp、 99bp的扩增子。具有不同阳性率的混合池都可以通过凝胶电泳中的条带的位置来进行区分。

图15.单个样本在逆转录加ID引物后的qPCR结果。灰线下方的点是指含有病毒RNA的样本，灰线上方的点是指不含RNA的样本。当Cq值低于40时，认为样本是“阳性”案例。当Cq值高于 40时，认为样本是“阴性”案例。

序列的简要描述

SEQ ID NO：1：合成的RNA(EURO-019)序列

SEQ ID NO：2：扩增具有ID引物的模板的PCR通用正向引物 SEQ ID NO：3：用于一个混合池中的第一个样本的多重ID引物1

SEQ ID NO：4：用于一个混合池中的第二个样本的多重ID引物2

SEQ ID NO：5：用于一个混合池中的第三个样本的多重ID引物3

SEQ ID NO：6：用于一个混合池中的第四个样本的多重ID引物4

SEQ ID NO：7：用于一个混合池中的第五个样本的多重ID引物5

SEQ ID NO：8：扩增具有ID引物1的样本的反向引物1

SEQ ID NO：9：扩增具有ID引物2的样本的反向引物2

SEQ ID NO：10：扩增具有ID引物3的样本的反向引物3

SEQ ID NO：11：扩增具有ID引物4的样本的反向引物4

SEQ ID NO：12：扩增具有ID引物5的样本的反向引物5

SEQ ID NO：13：检测具有ID引物1的扩增子的荧光团探针1

SEQ ID NO：14：检测具有ID引物2的扩增子的荧光团探针2

SEQ ID NO：15：检测具有ID引物3的扩增子的荧光团探针3

SEQ ID NO：16：检测具有ID引物4的扩增子的荧光团探针4

SEQ ID NO：17：检测具有ID引物5的扩增子的荧光团探针5

SEQ ID NO：18：检测扩增子的淬灭剂探针

SEQ ID NO：19：SARS-CoV-2N基因假病毒序列

SEQ ID NO：20：扩增SARS-CoV-2N基因的N基因正向引物

SEQ ID NO：21：扩增SARS-CoV-2N基因的N基因反向引物

SEQ ID NO：22：检测SARS-CoV-2N基因的N基因TaqMan 探针

具体实施方式

所选择的定义

除非上下文另有明确指示，否则如本文所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”旨在也包括复数形式。此外，在详细描述和 /或权利要求中使用的术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”、“带有”或它们的变体旨在以类似于术语“包含”的方式为包含性的。过渡术语/短语(以及它们的任何语法变体)“包含”、“包括”、“涵盖”、“基本上由……组成”、“基本上由……构成”、“由……组成”和“由……构成”可互换使用。

短语“基本上由……组成”或“基本上由……构成”表示权利要求包括这样的实施方案，该实施方案包括指定的材料或步骤以及对权利要求的基本特征和新颖特征没有实质影响的材料和步骤。

术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这部分地取决于如何测量该值，即测量系统的限制。在含有一定量成分的组合物使用术语“约”的上下文中，这些组合物含有所述成分的量在值附近的变化(误差范围)为0至10％(X±10％)。在其他情况下，术语“约”提供了在给定值附近的变化(误差范围) 为0至10％(X±10％)。显然，这种变化代表高于或低于给定值至多10％的范围，例如X±1％、X±2％、X±3％、X±4％、X±5％、X ±6％、X±7％、X±8％、X±9％或X±10％。

在本公开中，范围以简写方式描述，从而避免必须对范围内的各个值和所有值进行详细地陈述和描述。在适当的情况下，可以选择在范围内的任何适当的值作为该范围的上限值、下限值或端值。例如， 0.1至1.0的范围表示0.1和1.0的端值，以及0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9的中间值，并且包括在0.1至1.0内的所有中间范围，例如0.2至0.5、0.2至0.8、0.7至1.0等。可以设想在一个范围内具有至少两个有效数字的值，例如，5至10的范围表示在5.0和 10.0之间以及在5.00和10.00之间的所有值，包括端值。当在本文中使用范围时，明确包括范围的组合和子组合(例如，在所公开范围内的子范围)以及其中的具体实施方案。

如本文所使用的，“分离出的”或“纯化的”化合物基本上不含其他化合物。在某些实施方案中，纯化的化合物是至少60重量％ (干重)的目标化合物。优选地，制剂为至少75重量％的目标化合物，更优选至少90重量％的目标化合物，并且最优选至少99重量％的目标化合物。例如，纯化的化合物是至少90重量％、91重量％、 92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％或100重量％(w/w)的所需化合物。通过任何合适的标准方法测定纯度，例如通过柱色谱法、薄层色谱法或高效液相色谱法(HPLC) 分析。

“降低”是指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的负改变。

“提高”是指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％或100％的正改变。

术语“标记物”、“可检测的标记物”、“可检测的部分”以及类似术语是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理手段检测的组合。例如，有用的标记物包括荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密剂、酶(例如，如ELISA中常用的酶)、生物素、作用于底物的酶(例如，辣根过氧化物酶)、地高辛、³²P 和其他同位素、半抗原以及蛋白质，所述蛋白质可以(例如)通过将放射性标记物引入至肽中而变得可检测、或用于检测与肽特异性反应的抗体。该术语包括单一标记剂的组合，例如，在例如特定波长或波长组合下提供独特可检测信号的荧光团的组合。在检测核酸(例如靶序列)的情况下，探针通常可以用放射性同位素、荧光标记物(荧光团)或发光剂进行标记。该术语包括单一标记剂的组合，例如荧光团的组合。独特鉴定物是用于在序列分析期间区分不同样本的约5个至约30个核苷酸、约10个至约25个核苷酸或约15个至约20个核苷酸的序列。

如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)以及它们的聚合物。除非特别限定，否则该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子置换)、等位基因、同源序列、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子置换可通过产生其中一个或多个所选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(参见文献“Batzer等,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)； Ohtsuka等,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等, Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994)”)。术语核酸与基因、cDNA和由基因编码的mRNA可互换使用。

如本文所使用的，术语“分离出的核酸”分子是指与通常与该分离出的核酸分子缔合的其他核酸分子分开的核酸分子。因此，“分离出的核酸分子”包括但不限于，不含有在衍生出该分离出的核酸的生物的基因组中天然侧接该核酸的一个或两个末端的核苷酸序列的核酸分子(例如，通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA 或基因组DNA片段)。此外，分离出的核酸分子可以包括工程化的核酸分子，例如重组或合成的核酸分子。存在于(例如)核酸文库(例如cDNA或基因组文库)中或含有限制酶切消化的基因组DNA的凝胶(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺)中的数百至数百万个其他核酸分子中的核酸分子不是“分离出的核酸”。

如本文和权利要求中所使用的，“样本”是指细胞、组织或流体样本，包括但不限于(例如)皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官、肿瘤、包括水路、污水、土壤或空气的环境来源、体外细胞培养成分的样本(包括但不限于细胞培养基中细胞生长所产生的条件培养基、重组细胞和细胞组分)、或来源于生物体或包含生物体的任何其他来源。

如本文中使用的术语“生物体”包括病毒、细菌、真菌、植物和动物。生物体的其他实例是本领域普通技术人员已知的，并且此类实施方案在本文公开的材料和方法的范围内。本文所述的分析法可用于分析从任何生物体获得的任何遗传物质。

“受试者”是指动物，例如哺乳动物，例如人。本文所述的方法可用于人和非人动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物(例如疾病的动物模型)，并且在一些实施方案中，受试者是人。术语“受试者”和“患者”可以互换使用。动物可以是例如人、猪、马、山羊、猫、小鼠、大鼠、狗、猿、鱼、黑猩猩、猩猩、豚鼠、仓鼠、牛、绵羊、鸟、鸡以及任何其他脊椎动物或无脊椎动物。

如本文所使用的，术语“基因组”、“基因组的”、“遗传物质”或这些术语的其他语法变体是指来自任何生物体的遗传物质。遗传物质可为病毒基因组DNA或RNA、诸如基因组DNA之类的细胞核遗传物质、或诸如线粒体DNA或叶绿体DNA之类的存在于细胞器中的遗传物质。它还可以代表来自天然或人工混合物的遗传物质或来自几种生物体的遗传物质的混合物。

如本文所使用的，“靶序列”是包括“靶位点”的多核苷酸(例如，如本文中定义的，包括DNA、RNA或DNA/RNA杂合体、以及它们的修饰形式)。术语“靶位点”用于指存在于靶基因组序列(例如，宿主或病原体中的DNA或RNA)中的核酸序列，只要存在充分的结合条件(例如充分互补性)，引物和/或探针(例如，本文的任何引物和/或探针)就会与靶位点结合。合适的DNA/RNA结合条件包括细胞中正常存在的生理条件。其他合适的DNA/RNA结合条件 (例如，无细胞体系中的条件)是本领域已知的。

如本文所使用的，“充分互补性”或“充分互补”的序列是指允许互补序列的至少一部分彼此退火的序列。

当用于两个序列时，术语“杂交”表示两个序列彼此充分互补以使得两个序列之间的核苷酸碱基配对。如本文所使用的，具有“充分互补性”或“充分互补”的序列允许互补序列的至少一部分彼此退火，例如至少约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％或约99.9％。彼此杂交的序列可以是完全互补的，但也可以具有一定程度的错配。因此，本文所述的正向引物和反向引物的5'端和3'端的序列可以与靶核苷酸区域的5'端和3'端的相应靶序列具有少量错配，只要正向引物和反向引物可以与靶序列杂交即可。根据杂交的严格性，两个互补序列之间的错配至多为约5％至20％可使得在两个序列之间杂交。通常，高严格性条件具有较高的温度和较低的盐浓度，而低严格性条件具有较低的温度和较高的盐浓度。高严格性条件的杂交是优选的。

“杂交条件”是指温度、pH和反应物浓度的条件，这些条件使得至少一部分互补序列彼此退火。完成杂交所需的条件取决于待杂交的寡核苷酸的尺寸、寡核苷酸之间的互补程度和杂交反应混合物中其他物质的存在。各杂交步骤所需的实际条件是本领域公知的，或者可以由本领域普通技术人员容易地确定。典型的杂交条件包括使用缓冲至pH约7至约8.5的溶液和约30℃至约80℃的温度。杂交条件也可以包括这样的缓冲液，该缓冲液对于寡核苷酸和其他组分相容(即，化学惰性)，但仍允许互补碱基对之间杂交。

“引物”是能够在核酸扩增反应中启动核酸序列的合成的寡核苷酸。当置于诱导与模板核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时，引物启动核酸扩增反应。这些条件包括提供合适的核苷酸、诸如DNA 聚合酶之类的用于聚合的酶、合适的缓冲液和合适的温度。基于靶基因座的序列合成引物。例如，基于靶基因座的序列和靶基因座侧翼的序列，技术人员可以确定用于扩增靶基因座的引物或引物对的序列。

引物对是一对寡核苷酸，并被设计用于从模板核苷酸序列物质扩增特定基因座。设计引物对以在模板遗传物质中扩增特定基因座的指导原则是本领域公知的。

如本文所使用的，可互换使用的短语“能够连接”或“有效连接”或“有效相连”是指一种邻接关系，其中所述组分处于使它们能够以其预期方式发挥功能的关系。第一组分可以通过任何有用的键 (例如共价键、非共价键、和/或通过范德华力、氢键和/或其他分子间力，例如包括π-π相互作用、盐桥或阳离子-π相互作用在内的其他分子间力)或任何有用的连接子(例如本文的任何连接子)有效连接至第二组分。

贯穿本公开，通过特定的命名法描述不同的序列，例如引物结合序列、引物序列、ID区域、扩增序列和靶序列。当使用这种命名法时，应当理解，所指出的序列与相应序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补。例如，“引物序列”描述了与引物序列的至少一部分基本上相同或与引物序列的至少一部分基本上反向互补的序列。这是因为当捕获的靶基因组区域转化为包含引物结合序列的双链形式时，可以使用具有与引物结合序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补的序列的引物对双链靶基因组区域进行测序。因此，本文使用这种命名法对本文公开的方法中所使用的不同的多核苷酸和多核苷酸的部分进行简化描述；然而，本领域普通技术人员将认识到，与相应序列的至少一部分基本上相同或基本上反向互补的适当序列可用于实施本文公开的方法。

此外，彼此对应的两个序列(例如引物结合序列和引物序列) 在至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％并且最优选至少 95％的序列中，具有至少90％的序列同一性、优选至少95％的序列同一性、甚至更优选至少97％的序列同一性并且最优选至少99％的序列同一性。或者，彼此对应的两个序列彼此反向互补，并且在反向互补序列中，在至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％的序列中，具有至少90％的完全匹配，优选至少95％的完全匹配，甚至更优选至少97％的完全匹配并且最优选至少99％的完全匹配。因此，彼此对应的两个序列可以在至少70％、优选至少80％、甚至更优选至少90％并且最优选至少95％的序列中，彼此杂交或与共同参考序列杂交。优选地，彼此对应的两个序列在两个序列的整体长度上100％相同，或者在两个序列的整体长度上100％反向互补。

如本文所使用的，在描述两个或更多个多核苷酸序列的情况下，术语“相同的”或百分“同一性”是指，当使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量，在比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分率的相同核苷酸(例如，本申请的方法中使用的核苷酸探针与靶序列或其互补序列具有至少70％序列同一性，优选80％、85％、90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性)。这样的序列被称为“基本上相同的”。关于多核苷酸序列，该定义也可用于所检测序列的互补性。

如本文所使用的，术语“多重”是指将多个样本混合在一起以用于信号读出和处理的过程，例如，将来自多个受试者的序列混合到一个混合池中以用于样本的序列扩增和/或筛选；或者，在另一个实例中，产生来源于DNA和RNA的序列混合物，以用于一起扩增或测序。

本文对变量的任何定义中所列举的化学基团的叙述包括，将变量定义为任何单一基团或所列基团的组合。本文中对变量或方面的实施方案的叙述包括作为任何单一实施方案或与任何其他实施方案或其部分进行组合的实施方案。

本文提供的任何组合物或方法可与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种进行组合。

本发明的其他特征和优点将从优选实施方案的以下描述中以及从权利要求中变得显而易见。

引物和探针设计及检测

本文公开的方法提供了向两个或更多个样本中的一个或多个靶核苷酸序列添加不同的引物和/或探针，混合样本，并扩增混合的样本中的一个或多个靶核苷酸序列。该方法包括提供两个或更多个样本，每个样本可以不含或者含有一个或多个靶核苷酸序列，以及提供两个或更多个不同的引物，每个引物含有与目标靶核苷酸序列互补的靶特异性区域(即，ID区域)、和用于随后的PCR引物结合区域的扩增序列，ID区域提供了独特鉴定序列，并且可以通过其熔解温度进行区分，例如通过改变序列的核苷酸和/或序列的长度而不同。在某些实施方案中，可以将每个ID区域设计为彼此正交(无相互作用)以消除引物二聚化，并且也可以将各ID引物的扩增序列设计为有所不同，以消除来自不同样本中的不同靶浓度的偏差。

在某些实施方案中，在从样本中提取RNA之后，将独特ID引物添加到各样本中。如果样本含有RNA，则ID引物可以作为逆转录引物，由此在添加没有核糖核酸酶H(RNase H)活性的逆转录酶时产生cDNA-RNA双链体。如果样本含有DNA，则引物在没有RNA 靶标的情况下可以保持为单链DNA。然后，可以向各样本中添加核酸外切酶，例如核酸外切酶I。由于核酸外切酶只能降解单链DNA (从3'端到5'端)，核酸外切酶将选择性地消化所有未被使用的ID引物，只有cDNA-RNA双链体保持完整。因此，对RNA靶标呈阳性的各样本将被标记上特殊标签，当此类样本与一个或多个其他样本混合后可以被区分。

在可选的实施方案中，在通过核酸碱基的特定氢键模式从样本中提取RNA后，将独特ID引物添加到各样本中。通过加热至约65 ℃使单链RNA模板的二级结构松散，然后可以在约4℃至约30℃使 ID引物退火到互补RNA链。退火后，可以向各样本中添加核酸外切酶，例如核酸外切酶I，以消化未杂交的ID引物。因此，对RNA靶标呈阳性的各样本将被标记上特殊标签，当此类样本与一个或多个其他样本混合后可以被区分。

在可选的实施方案中，样本制备和添加ID引物可以合并成一个步骤，该步骤涉及对于原始RNA样本的免提取样本制备方法。在某些实施方案中，可以将任何市售可得的用于RNA提取的裂解缓冲液添加到样本中。在某些实施方案中，可以创建捕获靶核苷酸序列的单链寡核苷酸探针(即捕获链)，其中捕获链用(例如)生物素标记物进行标记，并通过链霉亲和素-生物素相互作用与链霉亲和素包被的磁珠(MB)连接。然后可以将与捕获链连接的链霉亲和素包被的磁珠和ID引物引入混合物，并使RNA靶标与捕获链特异性杂交。同时，ID引物也可以结合至RNA靶标的不同区域。之后，可以在不使用核酸外切酶的情况下洗去未结合的引物和杂质，并且仅保留 DNA-RNA双链体。接下来，将所有样本混合在一起，然后进行逆转录(RT)和检测步骤。在RT步骤期间，ID引物将作为RT引物并被延伸以产生ID样本。同时，通过逆转录酶的置换活性，与RNA 靶标杂交的具有MB的RNA捕获链将从DNA-RNA双链体上释放。因此，可以通过磁场分离出MB。在磁分离之后，分离出的ID样本可以通过PCR进行扩增，并且通过尺寸分离工具、多重熔解曲线分析或电化学站进行检测。

在某些实施方案中，可以将引物设计为与靶核酸序列或其部分以及来源于靶核酸序列的扩增子杂交或连接。在某些实施方案中，可以将引物设计为启动逆转录酶和/或聚合酶。在某些实施方案中，引物或探针的互补核苷酸区段的长度为1个、2个、3个、4个、5个、 10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、 19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、40个、 50个或100个碱基对或更长。此外，引物(例如，本文的任何引物，例如ID引物、正向引物或反向引物)可以用荧光标记物(例如，以便与淬灭剂探针一起使用)、电活性标记物进行标记，或可以不进行标记。可以优化引物和探针的浓度以提高扩增或逆转录酶反应效率。

在某些实施方案中，本文的引物和探针可以在核酸序列的任何有用位置(例如在3'末端和/或5'末端)包括任何有用的标记物，包括荧光标记物和淬灭剂标记物。示例性的荧光标记物包括量子点、荧光团。用于该方法的荧光标记物的实例包括荧光素、6-FAM^TM(Applied Biosystems公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、TET^TM (Applied Biosystems公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、VIC^TM (Applied Biosystems公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、MAX、 HEX^TM(Applied Biosystems公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、 TYE^TM(ThermoFisher Scientific公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)、 TYE665、TYE705、TEX、JOE、Cy^TM(Amersham Biosciences公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)染料(Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、 Cy7)、Texas

(Molecular Probes公司,Inc.，尤金，俄勒冈州)、 Texas Red-X、

(Molecular Probes公司,Inc.，尤金，俄勒冈州)染料(AlexaFluor 350、AlexaFluor 405、AlexaFluor 430、 AlexaFluor 488、AlexaFluor 500、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 610、AlexaFluor 633、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700、 AlexaFluor 750)、DyLight^TM(ThermoFisher Scientific公司，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)染料(DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、 DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 755)、 ATTO^TM(ATTO-TEC GmbH公司，锡根，德国)染料(ATTO 390、 ATTO 425、ATTO465、ATTO 488、ATTO 495、ATTO 520、ATTO 532、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rhol01、ATTO590、ATTO 594、 ATTO 610、ATTO 620、ATTO 633、ATTO 635、ATTO 637、ATTO 647、ATTO647N、ATTO 655、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、 ATTO 725、ATTO 740)、

(Molecular Probes公司，尤金，俄勒冈州)染料(BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BOPDIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、 HiLyte Fluor^TM(AnaSpec公司，菲蒙，加利福尼亚州)染料(HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 594、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750)、AMCA、AMCA-S、

蓝(Molecular Probes公司，尤金，俄勒冈州)、层叠黄(Cascade Yellow)、香豆素、羟基香豆素、罗丹明绿^TM-X(Molecular Probes公司，尤金，俄勒冈州)、罗丹明红^TM-X(Molecular Probes公司，尤金，俄勒冈州)、罗丹明6G、TMR、TAMRA^TM(Applied Biosystems公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、5-TAMRA、ROX^TM(Applied Biosystems 公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、Oregon

(Life Technologies 公司，格兰德岛，纽约州)、Oregon绿500、

700(Li-CorBiosciences公司，林肯，内布拉斯加州)、IRDye 800、WeIIRED D2、 WeIIRED D3、WeIIREDD4和

640(Roche Diagnostics GmbH公司，曼海姆，德国)。在一些实施方案中，可以使用消光系数＞50,000M^-1cm^-1且与荧光检测通道有适当光谱匹配的明亮荧光团。

在某些实施方案中，反应混合物中包含荧光标记的引物或探针，并且产生荧光标记的反应产物。本申请的方法的实施方案和组合物中所含的用作标记物以产生荧光标记的引物和/或探针的荧光团可以是下列众多荧光团中的任一种，包括但不限于：4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸茋-2,2'二磺酸；吖啶和衍生物，例如吖啶和异硫氰酸吖啶；4-氨基 -N-[3-乙烯磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐、荧光黄VS；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺、亮黄；BIODIPY 荧光团(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚)；香豆素和衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4- 三氟甲基香豆素(香豆满151)；四氯四溴荧光素(cyanosine)； DAPDXYL磺酰氯；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5"-二溴连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸酯基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰基二氢-茋 -2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基茋-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1- 磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；(4-4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸 (DABCYL)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)； EDANS(5-[(2-氨基乙基)氨基]萘-1-磺酸)、诸如曙红异硫氰酸酯之类的曙红和衍生物；赤藓红和衍生物，例如赤藓红B和异硫氰酸赤藓红；乙啡锭，例如溴化乙锭；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、 2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)和异硫氰酸荧光素(FITC)；荧光胺；绿色荧光蛋白和衍生物，例如EBFP、EBFP2、 ECFP和YFP；IAEDANS(5-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)萘-1- 磺酸)、异硫氰酸孔雀石绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副蔷薇苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二醛；芘和衍生物，例如芘丁酸酯、1-芘磺酰氯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；QSY 7；QSY 9；活性红4(

Brilliant Red 3B-A)；罗丹明和衍生物，例如6- 羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(Rhodamine 6G)、异硫氰酸罗丹明、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明B、罗丹明123、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(Texas Red)；N,N,N',N-四甲基-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物。在某些实施方案中，组合物和使用方法中的荧光探针或引物的浓度为约0.01μM至约100μM、约0.1μM至约100μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约10μM、或约1μM至约10μM。在某些实施方案中，荧光探针或引物的浓度为约0.01μM、0.1μM、1μM、1.1 μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、 1.9μM、2μM、2.5μM或5μM。

示例性的淬灭剂标记物包括荧光团、量子点、金属纳米颗粒等。合适的淬灭剂包括Black Hole

(Biosearch Technologies 公司，诺瓦托，加利福尼亚州)、BHQ-2、Dabcyl、Iowa

FQ (Integrated DNA Technologies公司，克拉尔维尔，爱荷华州)、IowaBlack RQ、QXL^TM(AnaSpec公司，菲蒙，加利福尼亚州)、QSY 7、QSY 9、QSY 21、QSY 35、IRDye QC、BBQ-650、Atto 540Q、 Atto 575Q、Atto 575Q、MGB 3'CDPI3、MGB-5'CDPI3和反向dT。在一个实例中，术语“淬灭剂”是指当接近供体时减少来自荧光供体的发射的物质。在优选的实施方案中，淬灭剂在荧光标记物的1个、 2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12 个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25 个或30个核苷酸碱基内。在某些实施方案中，可以将淬灭剂添加到探针或引物的3'端。当从荧光团发射的荧光可检测地减少，例如减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多时，荧光被淬灭。

在某些实施方案中，反应混合物包括电活性标记的引物或探针，并且产生电活性标记的反应产物。可以将电活性报告基团用作标记物以产生本申请的方法和组合物的实施方案所包括的电活性标记的探针或引物，所述电活性报告基团可以是下列众多电活性报告基团中的任一种，包括但不限于：亚甲基蓝、蒽醌、Ru(bpy)2dppz2+、 Ru(phen)2dppz2+、二茂铁衍生物、苏木精、磁珠、QD、生物素-advin HRP、纳米复合物和二茂铁。在某些实施方案中，组合物和使用方法中的电活性探针或引物的浓度为约0.01μM至约100μM、约0.1μM 至约100μM、约0.1μM至约50μM、约0.1μM至约10μM或约1μM 至约10μM。在某些实施方案中，电活性探针或引物的浓度为约0.01 μM、0.1μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、 1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.5μM或5μM。

其他标记物亦可用于本申请，包括能够进行比色法和化学发光或荧光检测的标记物。例如，生物素或地高辛是本领域公知的，并且生物素或地高辛可与偶联到碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光素或罗丹明(如上所述)的抗地高辛抗体和链霉亲和素一起使用，以能够进行比色法和化学发光或荧光检测。

能够检测标记的反应产物的任何检测方法或系统都可用于根据本申请的实施方案的方法中，并且这样的合适的检测方法和系统是本领域公知的。在某些实施方案中，靶核苷酸序列可直接检测或通过释放出的探针间接检测。可以通过选自凝胶电泳、片段分析仪或生物分析仪、嵌入染料检测、PCR、实时定量PCR、荧光、荧光共振能量转移(FRET)、质谱、侧流层析分析、比色分析和基于CRISPR的检测系统中的方法进行扩增核酸的检测。例如，使用二极管检测来自荧光标记的反应产物的信号。

在某些实施方案中，反应中的探针或引物可以具有至少一个、两个、三个、四个或更多个便于进一步处理或检测的序列。这样的序列包括限制性引物结合位点，特别是扩增序列位点。在优选的实施方案中，当与可被核酸内切酶识别的核苷酸序列比较时，扩增位点中的至少一个具有至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个核苷酸的核苷酸置换、添加或缺失。在优选的实施方案中，探针或引物具有一个扩增位点，优选为能够连接至标记物的扩增位点，其可被 DNA引物识别从而用于PCR中。

在某些实施方案中，可以在引物和探针中添加、缺失、置换或修饰包括DNA或RNA碱基的其他序列以赋予有利的性质。可以对 5'区域或3'区域进行修饰，具体地，可以添加、缺失或置换一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个 DNA或RNA碱基。在优选的实施方案中，将3'反向dT二聚体添加到探针中以阻止由聚合酶引起的延伸。

在某些实施方案中，可以使用样本特异性引物和/或探针。当与用于各后续样本的引物和/或探针相比时，样本特异性引物和/或探针可以具有不同的标记物、不同的熔解温度、不同的序列、不同的序列长度或它们的任意组合。

检测混合样本中的靶核苷酸序列

在优选的实施方案中，通过片段长度鉴定直接确定靶核酸的存在，或如上所述通过探针从逆转录的靶RNA(cDNA)或靶DNA的混合样本中间接确定靶核酸的存在。在某些实施方案中，当存在靶核苷酸序列时，在扩增靶序列之后释放出探针和/或标记物。该标记物的检测可以使用各种公知的方法进行。检测方法的实例包括电活性分析法或荧光分析法。在聚合酶链反应分析法中，可释放出荧光团或电活性报告基团。

在某些实施方案中，可以使用通用正向引物和两种或更多种不同的反向引物，通过不对称PCR扩增靶序列，由混合的样本中的 cDNA产生单链扩增子，所述反向引物对各ID引物、特别是ID引物的扩增区域具有特异性。大量通用正向引物将与不含ID引物的靶序列杂交，以产生单链形式的ID样本的互补序列，而不同的反向引物将与ID引物部分的互补序列结合，以辅助这些扩增反应。之后，将产生的单链扩增子用作以下分析中的检测靶标。探针组包含1种、2 种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种(至多为已混合的样本的总个数)具有荧光团的探针(F探针；与ID引物的ID区域互补)和一种具有淬灭剂的探针(Q探针；与邻近于F 探针结合区域的cDNA区域互补)。Q探针可包含核苷酸，其使得探针能够具有约70℃至约80℃的熔解温度(T_m)值、或比每种F探针的熔解温度至少高约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10 ℃或更高的T_m。F探针和Q探针将在约45℃时杂交到它们相应的位点，并且在此时，荧光信号被淬灭。当温度达到F探针的T_m值时， F探针将被释放，并会发生荧光信号的急剧提高，这可以通过熔解曲线分析进行检测。通过设计F探针的不同荧光团和T_m值，熔解曲线峰可以与特定的带有标签的cDNA靶标的存在相关联。在可选的实施方案中，可以使用通用F探针和Q探针。可以将F探针设计成与第一样本的ID区域完全互补。可以将F探针设计成与其他样本杂交，但在杂交时产生悬垂端。例如，在与第二样本杂交时，其可形成2- 核苷酸的悬垂端，与第3样本杂交时产生4-核苷酸的悬垂端。在熔解曲线分析时，悬垂端会降低T_m值。

在可选的实施方案中，包含1种、2种、3种、4种、5种、6 种、7种、8种、9种、10种或更多种(至多为已混合的样本的总个数)具有荧光团和淬灭剂的探针(例如TaqMan探针)的探针组可以用于在样本混合后鉴定靶序列的存在。可以使用通用正向引物和两种或更多种不同的反向引物，通过PCR扩增混合的样本中的靶序列，以由cDNA产生扩增子，所述反向引物各自对ID引物、特别是ID 引物的扩增区域具有特异性。在PCR扩增过程中，用不同的荧光团标记的探针将与靶标杂交，并且可被聚合酶的核酸外切酶活性水解，从而提供实时荧光信号。如果存在靶核苷酸，则荧光信号会有指数增长。根据循环阈值，该分析法可以实现混合样本的定量和定性分析。

在可选的实施方案中，在样本混合后，第一步骤包括使用通用正向引物和两种或更多种不同的反向引物对混合的样本进行PCR或等温扩增，以产生具有独特长度的双链扩增子，所述反向引物各自对 ID引物、特别是ID引物的扩增区域具有特异性。扩增子的长度由最初添加至靶序列的ID引物的长度决定。各ID引物可以具有不同的长度。因此，在该步骤中，初始RNA/DNA双链体将转变为双链DNA 分子。然后使用片段分析仪、凝胶电泳或生物分析仪检测该产物。通过将样本中的条带与DNA梯状条带进行比较，可以通过由RNA/DNA 双链体扩增的产物的近似尺寸来推断阳性样本。如果没有检测到条带，则宣布所有的单独样本为阴性，但是如果在预期位置存在条带，则产物的长度将表明哪个样本为阳性。

在可选的实施方案中，所述方法包括将混合的样本与扩增引物、通用正向引物和对各ID引物特异的两种或更多种不同的反向引物、具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶和用具有非重叠氧化还原电位的电活性报告基团(例如二茂铁、亚甲基蓝或蒽醌)标记的同源探针混合。因为DNA聚合酶具有核酸外切酶性质，所以与靶序列杂交的电化学探针将在延伸步骤期间被水解。因此，可以释放出具有短单核苷酸的电活性报告基团，这可以在特定电位产生高电流峰值。在扩增后，将进行终点电化学测试。作为结果，通过在特定电位存在的高电流峰值，可以将具有靶序列的样本与不含靶标的样本区分开来。

例如，可以使用丝网印刷用碳电极或任何其他基于电化学标记物的生物测定来检测来自电活性标记反应的信号。使用丝网印刷用碳电极的两种类型可用于本申请的方法。第一类型包括在恒温加热设备或PCR热循环仪上进行反应，然后，将适当体积的反应溶液滴加到电极表面上，从而确保反应溶液充分覆盖全部电极(工作电极、对电极和参比电极)。然后，可以记录无模板对照(NTC)和使用电化学站的样品的电化学信号。第二类型包括在电化学检测室中进行反应，其中丝网印刷用碳电极在电池下方。然后，可以记录使用电化学站的实时电化学信号变化。

试剂盒

在某些实施方案中，本申请的组合物和使用方法可以进一步以试剂盒的形式提供。试剂盒可以包括以下中的一种或多种：一种或多种引物(ID引物；正向引物和反向引物)、一种或多种探针(F探针、Q探针)、其他试剂(例如，本文所述的任何试剂，例如酶、缓冲液、核苷酸或增强剂)、特别是本领域技术人员将认识到对逆转录、 PCR、环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、或依赖核酸序列的扩增(NASBA)必要或有益的试剂，以及使用说明书(例如，包括本文所述的任何方法的使用说明书)。试剂盒的各组分可以单独包装或一起包装。在一个实例中，将组分包装在一起以允许单个室或单个试管反应。

酶

在某些实施方案中，可以使用一种或多种酶，包括多种聚合酶和核酸外切酶。如果靶核酸包括RNA序列或RNA序列的一部分，那么可以使用逆转录酶将RNA靶标逆转录为DNA(例如，cDNA) 序列。

在某些实施方案中，可以使用DNA聚合酶，包括具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶。示例性的聚合酶包括Bst DNA聚合酶(包括 Bst 3.0；New England BioLabs公司，伊普斯威奇，马萨诸塞州)、Bca (外)DNA聚合酶、DNA聚合酶I Klenow片段、Vent DNA聚合酶、 Vent(外)DNA聚合酶(缺乏核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)、 Vent^TMDNA聚合酶、9°N^TM聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶,Deep Vent(外)DNA聚合酶(缺乏核酸外切酶活性的Deep VentDNA聚合酶)、129噬菌体DNA聚合酶、MS-2噬菌体DNA聚合酶、Z-Taq DNA 聚合酶(TakaraShuzo Co.,Ltd.)、Taq聚合酶和KOD DNA聚合酶 (Toyobo Co.,Ltd.)以及它们的变体。

示例性核酸外切酶包括核酸外切酶I。

可用于本申请的逆转录酶可以是表现出逆转录酶活性的任何聚合酶。本领域已知几种逆转录酶，并且其是市售可得的(例如，购自 Boehringer Mannheim公司，印第安纳波利斯，印第安纳州；Life Technologies公司，罗克维尔，马里兰州；New England Biolabs公司，贝弗利，马萨诸塞州；Perkin Elmer公司，诺沃克，康涅狄格州； Pharmacia LKBBiotechnology公司，皮斯卡塔韦，新泽西州；Qiagen 公司，瓦伦西亚，加利福尼亚州；Stratagene公司，拉荷亚，加利福尼亚州)。在一些实施方案中，逆转录酶可以是禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)、莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)、人免疫病毒逆转录酶(HIV-RT)、EIAV-RT、RAV2-RT、生氢氧化碳嗜热菌(C.hydrogenoformans)DNA聚合酶、rTthDNA聚合酶、 SUPERSCRIPT I、SUPERSCRIPT II，以及它们的突变体、变体和衍生物。在优选的实施方案中，逆转录酶是减RNase H(即缺乏RNase 活性)的逆转录酶。应当理解，在不背离本文公开的范围或优选实施方案的情况下，包括上文未具体公开的逆转录酶的多种逆转录酶可以用于本申请。

核苷酸碱基

可用于本申请的核苷酸碱基可以是可用于核酸聚合的任何核苷酸。核苷酸可以是天然存在的、不常见的、经修饰的、衍生的或人工的。核苷酸可以是未标记的，或者通过本领域已知的方法可检测地标记的(例如，使用放射性同位素、维生素、荧光或化学发光部分、地高辛配基(dioxigenin))。优选地，核苷酸为脱氧核苷三磷酸、dNTP (例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-硫代-dNIT、生物素-dUTP、荧光素-dUTP、地高辛配基-dUTP、7-脱氮-dGTP)。 dNTP也是本领域公知的，并且可从供应商处购得(例如，购自 BoehringerMannheim公司，印第安纳波利斯，印第安纳州；New England Biolabs公司，贝弗利，马萨诸塞州；Pharmacia LKB Biotechnology公司，皮斯卡塔韦，新泽西州)。

本发明的核苷酸可以以任何浓度存在。在一些实施方案中，核苷酸的存在量为约0.001μM至约40μM、约0.005μM至约20μM或者优选为约0.01μM至约4μM。本领域技术人员将理解，其他浓度的核苷酸可用于本申请。

缓冲剂和盐

用于本发明的缓冲剂和盐为核酸酶活性和/或核酸合成(例如，为逆转录酶和DNA聚合酶活性)提供了合适的稳定pH和离子条件。本领域已知的多种缓冲液和盐溶液以及改性缓冲液可用于本申请，包括本文未具体公开的试剂。优选的缓冲剂包括(但不限于)Tris-HCl、 NaCl、MgCl₂和BSA。优选的盐溶液包括(但不限于)乙酸钾、硫酸钾、氯化钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂和乙酸锂的溶液。

本发明的缓冲剂可以以任何浓度存在。在一些实施方案中，缓冲剂的存在量为约0.01mM至约4000mM、约0.05mM至约2000mM，或者优选为约0.1mM至约400mM。本领域技术人员将理解，其他浓度的缓冲液可用于本发明。

使用方法

在某些实施方案中，本申请的探针、引物、分析法和方法可用于检测任何目的靶标。特别地，所述探针、引物、分析法和方法能够进行样本特异性检测而不需要再检测。在一些实施方案中，组合物和方法可以被配置为用于探测核酸(例如RNA和/或DNA)，以及用于检测病原体(例如病毒病原体，如本文中的任何病原体)。

本申请的组合物和方法可用于检测任何有用的靶标(例如，靶核酸或来自于靶标或可鉴定为靶标的核酸序列)。示例性靶标包括 RNA病毒，例如沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，马秋波病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，汉坦病毒或裂谷热病毒)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，SARS-CoV、MERS-CoV、 SARS-CoV-2)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)、丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒和马尔堡病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，日本脑炎病毒和黄热病毒)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，呼吸道合胞体病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒或副流感病毒)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人类嗜T细胞淋巴病毒(HTLV)和人体免疫缺陷病毒(HIV))、弹状病毒科 (Rhabdoviridae)(例如，狂犬病病毒)和披膜病毒科(Togaviridae) (例如，脑炎病毒、黄热病毒和风疹病毒)；病原体；环境污染物；水添加剂；农业标记物；核酸(例如，寡核苷酸、多核苷酸、核苷酸、核苷或RNA分子、病毒基因组、引物或任何有用病原体的基因，如本文所述的那些)；或基因修饰(例如，抗生素抗性标记基因)。靶标还包括食物传播病原体，例如诺如病毒(Norovirus)(例如，诺沃克病毒)；以及武器化病原体，例如丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒和马尔堡病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，拉沙病毒和马秋波病毒)、甲病毒属(Alphavirus)(例如，委内瑞拉马脑炎病毒、东方马脑炎病毒或西方脑炎病毒)、亨德拉尼帕病毒属(Henipavirus)(例如，尼帕病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae) (例如，汉坦病毒(Hantavirus)或裂谷热病毒)和黄病毒科 (Flaviviridae)(例如，日本脑炎病毒和黄热病毒)。

检测样本可以包括任何有用的样本，例如病毒、细胞、组织、流体、拭子、生物样本(例如，血液、血清、血浆、唾液等)、植物、环境样本(例如，空气、土壤和/或水)等。

材料和方法

RNA样本和DNA寡核苷酸的制备

合成的SARS-CoV-2RNA靶标购自欧盟委员会联合研究中心，用于选择性检测的合成的流感A(H1N1)RNA样本得自GeneWell公司(深圳，中国)。所有RNA样本用1×TE缓冲液(10mM Tris，1 mM EDTA，pH＝8.0，Invitrogen)连续稀释并等分，然后贮存于-80 ℃以备进一步使用。合成的寡核苷酸购自Generay公司(上海，中国)，经HPLC纯化。将所有寡核苷酸在1×TE缓冲液中重悬至100nM，并在获得该溶液后于4℃储存。使用Nanovue Plus分光光度计(GE Healthcare)测定它们的浓度。所用的所有RNA样本和DNA寡聚物的序列列于表1中。

表1靶RNA样本、引物和探针的详细序列

模拟唾液样本的制备

SARS-CoV-2假病毒得自Beyotime生物技术公司(上海，中国)。为了模拟临床RNA样本，将得自Scientific Phygene公司(福州，中国)的人工唾液掺入已知浓度的SARS-CoV-2假病毒和人基因组DNA (7.89ng/μL，Sigma Aldrich)中。对于RNA提取，应用购自TIANGEN公司(北京，中国)的TIANamp病毒RNA试剂盒根据制造商的说明书提取所有模拟样本。

ID引物、PCR引物和探针设计

对于ID引物，我们通过NUPACK来预测具有合理设计的T_m值的ID序列。使用MATLAB计算热力学参数，从而设计PCR引物和检测探针。SARS-CoV-2假病毒的PCR正向引物为2019-nCoV_N1 正向引物(美国疾病管制与预防中心(CDC)批准的)。对于淬灭剂探针，将反向扭转的dT添加至3'端以防止DNA聚合酶延伸。我们还在BLAST分析工具中筛查了所有这些序列以避免不期望的结合，并利用NUPACK检查并避免二级结构。

逆转录

添加1×PrimeScript缓冲液和200U PrimeScript逆转录酶 (Takarabio)、13μL模板、20nM ID引物、20U RNase抑制剂(人胎盘素，新英格兰生物实验室公司)和0.5μL dNTP混合物(10mM，新英格兰生物实验室公司)，在42℃进行20μL逆转录反应15分钟，并在90℃持续5分钟以终止。然后，将40U不耐热核酸外切酶I(新英格兰生物实验室公司)和2.5μL10×NE缓冲液3.1(新英格兰生物实验室公司)与上述混合物以总体积25μL在37℃下孵育4分钟，并在80℃持续1分钟以灭活。

混合样本的PCR扩增和熔解曲线分析

对于我们的方法，每个25μL PCR反应含有2.5μL的混合样本、 10μL预混合Ex Taq(Takarabio)、80nM的各荧光团探针、80nM 淬灭剂探针、800nM PCR通用正向引物、40nM的各反向引物(ID 引物4为80nM)。不对称扩增的PCR程序设定如下：95℃持续30 秒，95℃持续5秒且45个循环，64℃持续30秒。熔解曲线分析通过以下程序进行：开始为95℃持续1分钟的变性步骤，35℃持续5 分钟的杂交步骤，然后从35℃逐步升温至80℃，每步升温0.5℃，以在FAM和HEX通道中进行荧光测定。对于基于Dorfman的混合检测，每个20μL PCR混合物包含2μL混合的样本、200nM每种PCR 正向引物和反向引物、400nM TaqMan探针和10.8μL一步PrimeScript RT-PCR混合物(Takarabio)。相应的PCR程序设定为 42℃持续10分钟，95℃持续30秒，95℃持续5秒且45个循环，60 ℃持续30秒。所有PCR反应都在CFX Opus96实时定量PCR系统 (Bio-Rad)上进行。

本文所参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物的全部内容均通过引用并入本文，包括所有附图和表格，在一定程度上它们不违背本说明书的明确教导。

以下是说明如何实施本发明的方案的实施例。不应将这些实施例解释为限制性的。除非另有说明，否则所有的百分比都是重量百分比，并且所有的溶剂混合比例都是体积百分比。

实施例1-工作原理

Uni-Pool的工作流程包括逆转录(RT)、样本混合、PCR扩增和熔解曲线分析(图1A)。首先，通过RT用独特ID引物标记提取的样本。ID引物的序列由三部分组成(图1B)：与目的RNA靶标互补的靶特异性区域、提供由其T_m区分(通过改变序列)的独特鉴定序列的ID区域、以及用于随后的PCR引物结合的扩增序列区域。将样本特异性“ID引物”特异性地添加到各样本中。如果样本含有病毒RNA，如图1B的样本2所示，则ID引物作为RT引物，由此在添加没有核糖核酸酶H(RNase H)活性的逆转录酶时产生 cDNA-RNA双链体。相反，在没有RNA靶标的情况下，引物保持为单链DNA(如样本1中所示)。然后，向各样本中添加核酸外切酶I。由于核酸外切酶I只能从3'端至5'端降解单链DNA，因此核酸外切酶I选择性消化所有未被使用的引物，而只有cDNA-RNA双链体保持完整。因此，具有病毒RNA的各阳性样本被标记上特定的ID 序列，其可以在下一步中被区分出来。然后将ID样本混合在一起，以用于下游分析。在如图1C所示的混合的样本的PCR熔解曲线分析的情况下，通过不对称PCR扩增同组样本以由混合池中的标记 cDNA-RNA靶标产生单链扩增子。熔解曲线探针组包括具有荧光团的探针(与ID区域互补，称为F探针)和具有淬灭剂的探针(与邻近于F探针结合区域的cDNA区域互补，称为Q探针)。将Q探针设计为足够长以确保其T_m值高于所有F探针，因此Q探针将保持锚定于靶标链，并且只有F探针与任何信号变化有关。在熔解曲线分析期间，F探针和Q探针将在45℃杂交到它们的相应位点，并且在此时，荧光信号被淬灭。当温度达到F探针的T_m值时，F探针将被释放，并会发生荧光信号的急剧提高。通过设计不同T_m值的F探针，熔解曲线分析的一阶导数-dRFU/dT峰可以与其相应的阳性样本的存在相关联。此外，通过使用由不同的荧光团标记的F探针的“2D”设计，可以进一步扩展混合在Uni-Pool系统中的样本量。

实施例2-混合的样本在一个荧光通道中的样本特异性检测

我们的分析法首先检测了其在FAM通道中的鲁棒性。三个样本标记有三种不同的ID引物，每种引物都具有其相应的F探针。三种 F探针用FAM共价修饰，并设计其彼此之间的T_m值差异为10℃。具体而言，在FAM通道中，50℃、60℃、70℃的T_m值分别对应于样本1、样本2和样本3。为了检测采用RT向各靶序列添加ID引物的可行性，通过RNA特异性qPCR分别分析单独的样本。如图15 所示，可以将具有病毒RNA的样本与不含病毒RNA的样本区分开来，这表明使用RT成功地将ID引物添加到各样本中。接下来，在多重熔解曲线分析中，我们利用了两种设计不同的荧光探针和淬灭剂探针对：一种设计采用两个分开的荧光探针(F探针)和淬灭剂探针 (Q探针)(即，荧光共振能量转移(FRET)探针)，另一种设计采用标记有淬灭剂和报告染料的一个单链探针(例如，自淬灭TaqMan 探针)。如图2A至图2F所示，在获得荧光v.s.温度的一阶导数图 (-dRFU/dT)之后，采用分开的F探针和Q探针的信号开启FRET 探针法示出了比用自淬灭TaqMan探针的信号关闭法更尖锐的熔解峰。尽管两种设计都能够鉴定混合池中的三个含有RNA的样本，但是在无模板对照(NTC)中，使用自淬灭TaqMan探针的熔解曲线图的一阶导数示出了随着温度逐渐增大的背景信号，从而不利于与阳性样本信号的清楚区分(图2F)。然而在NTC中，FRET探针设计显示出稳定的背景-dRFU/dT曲线，容易与阳性样本区分开(图2C)。此外，在基于TaqMan探针的策略中，如果没有通过核酸外切酶I完全除去未反应的ID引物，则可能产生假阳性结果，正如在利用类似策略的多重NGS测定中观察到的那样(参见文献“Enroth,C.H.； Fehler,A.O.；Poulsen,L.D.；Vinther,J.ExcessPrimer Degradation by Exo i Improves the Preparation of 3′CDNA Ligation-BasedSequencing Libraries.Biotechniques 2019,67(3),110–116”)。另一方面，设计了基于FRET探针的策略，以使Q探针靶向扩增子的cDNA区域，从而避免由未反应的ID引物引起的假阳性结果。因此，在下列研究中，我们的Uni-Pool系统中将使用产生的信号比背景信号更尖锐的基于FRET探针的策略(图2C)。

为了检查可能导致假阳性/阴性结果的同一混合池中的阴性和阳性样本之间的任何交叉相互作用，我们表征了一个混合池中三个样本的所有可能的组合(全为阳性的情况、全为阴性的情况、三个中有一个为阳性的情况、三个中有两个为阳性的情况)。在图2G至图2K 中鉴定了不同情况的样本。

实施例3-2D熔解曲线系统的分析能力

多重熔解曲线分析的一个优点是，通过使用具有不同的T_m值和不同的荧光通道(2D)的多重检测探针，可以扩展检测能力。在 Uni-Pool分析法中，用具有其相应的F探针的五种不同的ID引物标记五个样本。分别用T_m值为50℃、60℃和70℃的FAM共价修饰三个F探针。另两个F探针分别用T_m值为50℃和60℃的HEX荧光团进行共价修饰。通过相应的扩增子的探针的不同荧光团和T_m值的组合来揭示混合池中各靶标的鉴定结果。作为结果，一个混合池中的五个单独样本的2的5次方个组合都可以由Uni-Pool进行区分(图3A 至图3B)。

在验证了Uni-Pool中的这种2D多重熔解曲线分析的可行性之后，通过对5×10¹拷贝/μL至10⁶拷贝/μL的连续稀释的合成RNA样本进行检测来评价这种Uni-Pool分析法的灵敏度和特异性(图3C至图3G)。在混合池中，最低可检测浓度为5×10¹拷贝/μL，FAM或 HEX通道中只有一个阳性案例，显示出与NTC的熔解峰明显不同的熔解峰。为了评价浓度变化对两个相邻的阳性熔解峰的重叠的影响，我们对含有对应于两个相邻熔解峰的两个阳性样本和三个阴性样本的5个样本的混合池进行了灵敏度检测。当两个阳性样本之一的浓度固定为10⁶拷贝/μL时，另一个阳性样本在FAM通道中的最低可检测浓度为5×10¹拷贝/μL，在HEX通道中的最低可检测浓度为10²拷贝/μL(图3E至图3F)。HEX中的这种最低可检测浓度高于在仅具有一个阳性样本的混合池中观察到的浓度。这可能是因为在一个反应中，在竞争扩增引物和检测探针时，高浓度样本可能胜过混合池中的其他较低浓度样本。事实上，Uni-Pool策略显示出的灵敏度低于市售的RT-PCR试剂盒(参见文献“Corman,V.M.；Landt,O.；Kaiser,M.； Molenkamp,R.；Meijer,A.；Chu,D.K.W.；Bleicker,T.；Brünink,S.；Schneider,J.；Schmidt,M.L.；Mulders,D.G.J.C.；Haagmans,B.L.； Van Der Veer,B.；VanDen Brink,S.；Wijsman,L.；Goderski,G.； Romette,J.L.；Ellis,J.；Zambon,M.；Peiris,M.；Goossens,H.；Reusken, C.；Koopmans,M.P.G.；Drosten,C.Detection of 2019 NovelCoronavirus(2019-NCoV)by Real-Time RT-PCR.Eurosurveillance 2020,25(3),1-8”)。这可能是由单独的RT步骤后的稀释作用和混合的样本间的竞争抑制作用所引起的。值得注意的是，先前的研究表明，在大规模筛查的情况下，检测效率尤为重要，10²拷贝/μL的检测限就足够了(参见文献“Fozouni,P.；Son,S.；Díaz de León Derby,M.；Knott,G.J.；Gray,C.N.；D’Ambrosio,M.V.；Zhao,C.；Switz,N.A.； Kumar,G.R.；Stephens,S.I.；Boehm,D.；Tsou,C.L.；Shu,J.；Bhuiya, A.；Armstrong,M.；Harris,A.R.；Chen,P.Y.；Osterloh,J.M.；Meyer-Franke,A.；Joehnk,B.；Walcott,K.；Sil,A.；Langelier,C.； Pollard,K.S.；Crawford,E.D.；Puschnik,A.S.；Phelps,M.；Kistler,A.； DeRisi,J.L.；Doudna,J.A.；Fletcher,D.A.；Ott,M.Amplification-Free Detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and Mobile Phone Microscopy.Cell 2020,323-333”)。接下来，通过检验我们的Uni-Pool 分析法对不同浓度的流感H1N1 RNA的交叉反应性来检测Uni-Pool 分析法对SARS-CoV-2的特异性，并且没有观察到非特异性反应(图 3G)。结果显示该系统与其他呼吸道病原体没有交叉反应，因而表明该分析法具有良好的特异性。

实施例4-模拟唾液样本的检测

为了研究Uni-Pool分析法在临床环境中的可行性，我们使用 Uni-Pool检测了模拟唾液样本，同时与传统混合检测进行了对比。我们制备了40个模拟唾液样本。其中6个样本掺入不同载量(最小： 10拷贝/μL，最大：10³拷贝/μL)的SARS-CoV-2假病毒，而其余34 个样本均为阴性，因此在该检测中的流行率被确定为15％。将这40 个样本随机分成8个混合池，每个混合池含有五个单独的样本。用于鉴定来自40个样本组的6个阳性样本的Uni-Pool分析法的周转时间 (turnaround time)为115分钟，这比传统混合检测所耗费的140分钟要短(图4A)。在我们的实验中，传统混合检测对于流行率高达 15％的样本无效，这与先前关于Dorfman样本混合策略的研究一致 (参见文献“Chong,B.S.W.；Tran,T.；Druce,J.；Ballard,S.A.； Simpson,J.A.；Catton,M.Sample Pooling Is a Viable Strategy forSARS-CoV-2 Detection in Low-Prevalence Settings.Pathology 2020,52 (7),796-800”)。另一方面，与传统混合检测中二次检测使用的78 个RT-qPCR反应相比，本实验中的Uni-Pool分析法仅需8个混合的 PCR反应以及以下熔解曲线分析，从而显著降低了试剂和人力资源的成本。如图4B至图4G所示，在一轮混合反应中，从阴性试样中样本特异性地鉴定出了病毒载量为10拷贝/μL至10³拷贝/μL的所有阳性试样。值得注意的是，发现使用Uni-Pool分析法检测 SARS-CoV-2假病毒的灵敏度(10拷贝/μL)高于检测合成RNA样本的灵敏度(5×10¹拷贝/μL)，这可能是由于在运输过程中反复冻融使 RNA靶标降解从而损失。另外，如图4B至图4X所示，我们的样本特异性混合检测的结果与qPCR结果吻合良好。这表明无论传染性病原体的流行率如何，我们的方法都可以实现对混合的样本的有效、准确且灵敏的检测。

实施例5-通过多重熔解曲线系统检测混合的RNA样本

三个样本被设计为用三种不同的ID引物通过逆转录进行标记，每种ID引物具有其自身相应的含荧光团的杂交探针(F探针)(图 6)。将三个ID引物的ID区域设计为使其彼此之间的T_m值差异为 10℃。将三个F探针用FAM共价修饰，并设计为具有约50℃、60 ℃和70℃的T_m。接下来，将ID样本混合在一起，然后直接用于一锅多重熔解曲线分析。在混合池中，标记的cDNA-RNA模板将通过使用大量正向引物的不对称PCR产生大量互补单链扩增子。接下来，匹配的荧光团和淬灭剂探针组在45℃与同源扩增子杂交。通过提高反应温度，与未杂交的荧光团探针相比，荧光强度相对于温度的一阶导数(-dRFU/dT)指示筛查结果的阳性(具有峰)或阴性(没有峰) (图7)。同时，通过使用具有不同的T_m值和在不同荧光通道中的多重检测探针，可进一步扩展检测能力。例如，六个单独的样本可以用具有六种F探针的六种不同的ID引物进行标记。其中三种F探针用FAM进行修饰且T_m值分别为50℃、60℃和70℃。另外三种F探针用HEX荧光团进行标记且T_m值分别为50℃、60℃和70℃。

实施例6-使用片段长度鉴定来检测混合的RNA样本

在这种情况下，我们设计了三种不同长度(10nt、15nt、20nt) 的ID序列，附加到三种ID引物的5'端，这三种ID引物对目标靶RNA 具有特异性(图8)。提取RNA后，将这些ID引物中的每一种添加到单独的样本中，只有当样本含有病毒时，添加逆转录酶后才会产生 RNA/DNA双链体。然后，将这些样本混合在一起，并添加扩增引物以产生独特长度的双链产物，所述独特长度可以追溯到最初添加的 ID引物的长度。在对混合的样本进行对称PCR扩增或基于等温的扩增之后，可以分离出产物并通过凝胶电泳进行分析。基于尺寸选择原则，根据出现在凝胶的预期区域中的条带来鉴定混合池中的各样本。如果没有检测到信号，则宣布所有的单独样本为阴性，但是如果存在信号，则产物的长度将揭示哪个样本为阳性(图8)。通过设计多种不同长度的ID引物，以及通过提高尺寸分离技术的分离分辨率，也可以扩大检测量。

实施例7-使用TaqMan水解探针的RT-qPCR分析实时定量检测混合的RNA样本

通过引入TaqMan水解探针，可以实现对混合的样本的定性和定量分析，所述水解探针用不同的荧光团及其相应的淬灭剂进行双重标记。使用在ID区域中具有不同碱基组成的不同ID引物标记不同的样本，并且所述ID区域与相关的双重标记的TaqMan水解探针完全互补。如图9所示，在实时定量qPCR期间，TaqMan探针与其互补靶标杂交，然后通过聚合酶的核酸外切酶活性水解以示出扩增曲线。因此，根据这些扩增曲线的循环阈值，我们可以确定混合池中的哪些样本为阳性或为阴性，以及阳性样本中存在多少拷贝数的病毒RNA，从而对患者感染的严重程度做出判断。此外，检测能力取决于PCR 热循环仪上的荧光检测通道的数量。

实施例8-使用电化学读出检测混合的RNA样本

通过使用标记有电活性报告基团的检测探针，可以引入对先前实施例的改良，所述电活性报告基团具有非重叠氧化还原电位，即二茂铁、亚甲基蓝、蒽醌。多通道电化学工作站可以用来检测扩增之后的混合样本的终点信号。由于只有那些含有RNA病毒的样本会产生大量的扩增子，因此特定电活性报告基团在特定电位的氧化还原峰对应于阳性样本(图10)。

实施例9-通过磁力分离的多个RNA样本的患者特异性混合检测方案

本发明提供了另外一种方案，其中不需要提取RNA以及用酶消化未反应的ID引物(图11)。生物素修饰的RNA捕获链通过链霉亲和素-生物素相互作用连接至链霉亲和素修饰的磁珠(MB)(图 12)。首先将裂解缓冲液、具有MB的RNA捕获链和ID引物添加到单独的原始样本中。在室温孵育10分钟后，样本与具有RNA捕获链的MB和ID引物杂交，然后可以用洗涤缓冲液洗去未反应的ID 引物。在这个阶段，标记的单独样本将被分组在一起以用于多重逆转录、扩增和检测。考虑到MB会影响信号读出，另一种选择是通过逆转录酶的置换能力除去具有捕获链的MB。因为可以将RNA捕获链设计在将作为逆转录引物的ID引物的右边(3'端)，因此在多重逆转录和磁力分离后，具有捕获链的MB将从该系统中分离出来，而无需任何额外的复杂步骤(图12)。

实施例10-使用通用探针组通过熔解曲线系统来检测混合的 RNA样本

可以使用通用探针组以进一步降低熔解曲线检测系统的复杂性。本文中，通用探针组由两种探针组成(图13)，一种标记有荧光团 (F探针)，另一种标记有淬灭剂(Q探针)。与之前的设计(图7) 相比，这种设计的主要区别在于，这种F探针可以同时检测三种ID 序列。如果混合池中有三个ID阳性样本(样本1、样本2和样本3)，则将F探针设计成与样本1的ID区域完全互补。对于样本1，其在 ID区域比样本2多2个核苷酸(CG)，并且比样本3多4个核苷酸 (CGCG)，这样的2个或4个核苷酸的差异会导致ID序列在熔解曲线分析期间具有不同的T_m值，因为当F探针与样本2杂交时，将形成2个核苷酸的悬垂端，并且对于样本3会形成4个核苷酸的悬垂端。这种设计可以产生更高的通量和同时对多个靶标的有效检测。

实施例11-使用近距离淬灭的熔解曲线探针组检测混合的样本

设计五种不同的ID引物来标记五个不同的样本，每种ID引物具有其自身相应的含荧光团的杂交探针(F探针)。将三个F探针用 FAM共价修饰，并设计为具有约50℃、60℃和70℃的T_m，将另外两个F探针用HEX荧光团共价修饰，并具有50℃和60℃的T_m。所使用的合成的SARS-CoV-2阳性模板的浓度为10³拷贝/μL。只有在设计的T_m处具有尖锐的下行峰，才能够将其看作为混合池中存在阳性样本的证据。即使在不同的流行率下，也可以鉴定出五个样本的混合池的总共32种可能的组合(图3A至图3B)。对于灵敏度检测，具有一个或两个阳性样本的混合池的熔解曲线结果显示，在FAM通道中可检测到的最低浓度为5×10¹拷贝/μL，在HEX通道中可检测到的最低浓度为1×10²拷贝/μL(图3C至图3F)。

实施例12-使用片段长度鉴定来检测混合的样本

通过逆转录，用三种不同长度(39nt、60nt、72nt)的ID引物标记三个单独的样本。然后将三种ID样本混合在一起。在对混合的样本进行对称PCR扩增后，当一个混合池中的三个样本均为阳性时，产生具有相应长度(99bp、120bp、132bp)的扩增子，并通过凝胶电泳进行分离。基于尺寸选择原则，根据凝胶的预期区域中出现的条带来鉴定具有不同阳性率的混合池。结果显示，标签引物之间的12 个核苷酸的差异足以区分同一混合池中的两个样本(图14)。

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且本领域技术人员将想到根据本申请的实施例和实施方案的各种修改或变化，并且这些修改或变化将包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外，本文公开的任何发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文公开的任何和/或所有其他要素或限制 (单独地或以任何组合)或任何其他发明或其实施方案进行组合，并且认为所有这些组合在本申请的范围内，但不限于此。

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SEQUENCE LISTING

<110> 香港科技大学

<120> 用于大规模人群中病毒病原体筛查的快速且样本特异性混合和检测方法

<130> FI-220465-5952

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 880

<212> RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

gggagacgaa uugggcccuc uagaugcaug cucgagcggc cgccagugug auggauaucu 60

gcagaauucg cccuuauuca aguauugagu gaaaugguca uguguggcgg uucacuauau 120

guuaaaccag guggaaccuc aucaggagau gccacaacug cuuaugcuaa uaguguuuuu 180

aacauuuguc aagcuguccg gaagagacag guacguuaau aguuaauagc guacuucuuu 240

uucuugcuuu cgugguauuc uugcuaguua cacuagccau ccuuacugcg cuucgauugu 300

gugcguacug cugcaauauu guuaacguau aauggacccc aaaaucagcg aaaugcaccc 360

cgcauuacgu uugguggacc cucagauuca acuggcagua accagaaugg agaacgcauu 420

gcaacugagg gagccuugaa uacaccaaaa gaucacauug gcacccgcaa uccugcuaac 480

aaugcugcaa ucgugcuaca acuuccucaa ggaaauuuug gggaccagga acuaaucaga 540

caaggaacug auuacaaaca uuggccgcaa auugcacaau uugcccccag cgcuucagcg 600

uucuucggaa ugucgcgcau uggcauggaa gucacaccuu cgggaacgug guugaccuac 660

acaggugcca ucaaauugga gugugacaua cccauuggug cagguauaug cgcuaguuau 720

cagacucaga cuaauucucc ucggcgggca cguaguguag cuagucaacc ugcuuuugcu 780

cgcuuggauc cgaauucaaa ggugaaauug uuauccgcuc acaauuccac acaacauacg 840

agccggaagc auaaagugua aagccugggg ugccuaauga 880

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

cgtataatgg accccaaaat cagcg 25

<210> 3

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

gcagagtcgg cctacaggtt tatgtatcat aagtcaaatg tctggttact gccagttgaa 60

t 61

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

ctcactgcct actactccac atagcaactg taagttttat ggccttctct tctggttact 60

gccagttgaa t 71

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

ctctcaacct ccaccccttc agtctgctaa ggtcatacgt ccccttggct ctctggttac 60

tgccagttga at 72

<210> 6

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

ccattagaac ctaagctact ccacgctatg tatcataagt caaatgtctg gttactgcca 60

gttgaat 67

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

cgagagccag gtaacgaatg gtcatgttgt taaggagcga attaaatctc tggttactgc 60

cagttgaat 69

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

gcagagtcgg cctacaggtt t 21

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

ctcactgcct actactccac atagca 26

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

ctctcaacct ccaccccttc a 21

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

ccattagaac ctaagctact ccacgct 27

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

cgagagccag gtaacgaatg gt 22

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

atgtatcata agtcaaatg 19

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 14

actgtaagtt ttatggcctt ctct 24

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 15

gtctgctaag gtcatacgtc cccttggctc 30

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 16

atgtatcata agtcaaatg 19

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 17

catgttgtta aggagcgaat taaatc 26

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 18

ctgagggtcc accaaacgta atgcggggtg catttcgctg 40

<210> 19

<211> 1261

<212> RNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 19

augucugaua auggacccca aaaucagcga aaugcacccc gcauuacguu ugguggaccc 60

ucagauucaa cuggcaguaa ccagaaugga gaacgcagug gggcgcgauc aaaacaacgu 120

cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180

aaggaagacc uuaaauuccc ucgaggacaa ggcguuccaa uuaacaccaa uagcagucca 240

gaugaccaaa uuggcuacua ccgaagagcu accagacgaa uucguggugg ugacgguaaa 300

augaaagauc ucaguccaag augguauuuc uacuaccuag gaacugggcc agaagcugga 360

cuucccuaug gugcuaacaa agacggcauc auauggguug caacugaugg gagccuugaa 420

uacaccaaaa gaucacauug gcacccgcaa uccugcuaac aaugcugcaa ucgugcuaca 480

acuuccucaa ggaacaacau ugccaaaagg cuucuacgca gaagggagca gaggcggcag 540

ucaagccucu ucucguuccu caucacguag ucgcaacagu ucaagaaauu caacuccagg 600

cagcaguagg ggaacuucuc cugcuagaau ggcuggcaau ggcggugaug cugcucuugc 660

uuugcugcug cuugacagau ugaaccagcu ugagagcaaa augucuggua aaggccaaca 720

acaacaaggc caaacuguca cuaagaaauc ugcugcugag gcuucuaaga agccucggca 780

aaaacguacu gccacuaaag cauacaaugu aacacaagcu uucggcagac gugguccaga 840

acaaacccaa ggaaauuuug gggaccagga acuaaucaga caaggaacug auuacaaaca 900

uuggccgcaa auugcacaau uugcccccag cgcuucagcg uucuucggaa ugucgcgcau 960

uggcauggaa gucacaccuu cgggaacgug guugaccuac acaggugcca ucaaauugga 1020

ugacaaagau ccaaauuuca aagaucaagu cauuuugcug aauaagcaua uugacgcaua 1080

caaaacauuc ccaccaacag agccuaaaaa ggacaaaaag aagaaggcug augaaacuca 1140

agccuuaccg cagagacaga agaaacagca aacugugacu cuucuuccug cugcagauuu 1200

ggaugauuuc uccaaacaau ugcaacaauc caugagcagu gcugacucaa cucaggccua 1260

a 1261

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 20

gaccccaaaa tcagcgaaat 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 21

tctggttact gccagttgaa tctg 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（artificial sequence）

<400> 22

accccgcatt acgtttggtg gacc 24

Claims (33)

1.一种至少两个样本的样本混合方法，该方法包括：

a)将第一个样本与第一ID引物组合，并且将第二个样本与第二ID引物组合，其中：

i)所述第一ID引物包含与靶核酸中的第一位点具有充分互补性的第一核酸序列区域，所述第一核酸序列区域有效连接至扩增区域和第一独特ID区域，和

ii)所述第二ID引物包含与所述靶核酸中的所述第一位点具有充分互补性的第二核酸序列，所述第二核酸序列有效连接至扩增区域和第二独特ID区域；

b)使所述第一ID引物和所述第二ID引物与所述第一个样本和所述第二个样本中的靶核酸序列杂交或连接，或者使用逆转录酶和所述第一ID引物或所述第二ID引物逆转录所述第一样本和所述第二样本中的所述靶核酸序列；

c)用核酸外切酶消化未被使用的第一ID引物和第二ID引物；

d)将所述第一个样本和所述第二个样本混合在一起；以及

e)任选地，检测所述靶核酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述逆转录酶为缺乏RNase H活性的逆转录酶。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶为核酸外切酶I。

4.根据权利要求1所述的方法，其中靶核酸序列为RNA或DNA。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一ID引物和所述第二ID引物的熔解温度相差约5℃至约15℃，或相差约10℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一ID引物和所述第二ID引物的长度彼此相差至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个核苷酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括使用实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括，向混合的样本中添加至少两种荧光团标记的探针(F探针)和至少一种淬灭剂标记的探针(Q探针)，所述至少两种荧光团标记的探针包括第一F探针和第二F探针，其中所述第一F探针的标记物包括荧光标记物，并且所述第一F探针与所述第一ID引物的所述第一独特ID区域互补，所述第二F探针包含荧光标记物并与所述第二ID引物的所述第二独特ID区域互补，并且所述Q探针包含淬灭剂标记物并与邻近所述靶核酸的所述第一位点的靶核酸区域互补。

9.根据权利要求8所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括使用RT-PCR，包括：

i)向所述混合的样本中添加聚合酶和多种引物以提供反应混合物，所述多种引物包含正向引物和至少两种不同的反向引物；

ii)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列，则扩增所述靶核酸序列，以产生所述靶核酸序列的单链扩增子；

iii)使所述至少两种F探针和所述Q探针与所述单链扩增子杂交，其中所述第一F探针和所述第二F探针的熔解温度均低于所述Q探针，并且所述Q探针具有淬灭剂标记物，当相应的F探针和Q探针与所述靶核酸的所述单链扩增子杂交时，所述淬灭剂标记物使相应的F探针的荧光淬灭；

iv)升高所述反应混合物的温度，直至从单链扩增子释放出相应的F探针；以及

v)检测释放出的F探针的荧光。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述反应混合物还包含至少一种或更多种试剂，所述试剂选自由缓冲液、核苷酸、脱氧核苷酸和DNA聚合酶组成的组。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述F探针的荧光标记物被标记在3'端。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述Q探针的淬灭剂被标记在5'端。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述Q探针的熔解温度为约70℃至约80℃。

14.根据权利要求8所述的方法，其中所述Q探针具有3'反向扭转的dT。

15.根据权利要求9所述的方法，其中第一反向引物与所述第一ID引物的所述扩增区域互补，并且第二反向引物与所述第二ID引物的所述扩增区域互补。

16.根据权利要求9所述的方法，其中所述正向引物与所述靶核酸序列互补。

17.根据权利要求7所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括向混合的样本中添加至少两种标记有荧光团和淬灭剂的探针，其中第一探针的标记物包括第一荧光标记物，并且该第一探针与所述第一ID引物的所述第一独特ID区域互补，并且第二探针的标记物包括第二荧光标记物，并且该第二探针与所述第二ID引物的所述第二独特ID区域互补。

18.根据权利要求17所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括：

i)向所述混合的样本中添加聚合酶、至少两种标记有荧光团和淬灭剂的探针、包含一种正向引物和至少两种不同的反向引物的多种引物，以提供反应混合物，其中第一反向引物与所述第一ID引物的扩增区域互补，并且第二反向引物与所述第二ID引物的扩增区域互补；

ii)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列，则扩增所述靶核酸序列，由此通过聚合酶的核酸外切酶活性水解所述探针；以及

iii)检测释放出的荧光标记物的荧光。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一探针或所述第二探针的荧光标记物被标记在3'端，并且所述第一探针或所述第二探针的淬灭剂被标记在5'端。

20.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括核酸等温扩增和检测。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述核酸等温扩增和检测为环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)或依赖核酸序列的扩增(NASBA)。

22.根据权利要求6所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括尺寸分离技术。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述尺寸分离技术包括向所述混合的样本中添加至少两种反向引物以及至少一种正向引物，所述至少两种反向引物包括第一反向引物和第二反向引物，其中所述第一反向引物与所述第一ID引物的第一扩增区域互补，并且所述第二反向引物与所述第二ID引物的第二扩增区域互补。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述尺寸分离技术包括：

i)向所述混合的样本中添加DNA聚合酶和多种引物以提供反应混合物，所述多种引物包含正向引物和至少两种不同的反向引物；

ii)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列，则扩增所述靶核酸序列，由此产生具有独特长度的双链扩增子；以及

iii)检测所述扩增子的长度尺寸。

25.根据权利要求24所述的方法，其中使用凝胶电泳、片段分析仪或生物分析仪检测所述扩增子的长度尺寸。

26.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括电化学检测。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述电化学检测包括向所述混合的样本中添加具有电活性报告基团的探针、以及至少两种反向引物和至少一种正向引物，所述至少两种反向引物包括第一反向引物和第二反向引物，其中所述第一反向引物与所述第一ID引物的第一扩增区域互补，并且所述第二反向引物与所述第二ID引物的第二扩增区域互补。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述电化学检测包括：

i)向所述混合的样本中添加聚合酶、具有电活性报告基团的探针以及多种引物以提供反应混合物，所述多种引物包含一种正向引物和至少两种不同的反向引物；

ii)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列，则扩增所述靶核酸序列，由此通过聚合酶的核酸外切酶活性释放出所述电活性报告基团；以及

iii)检测释放出的电活性报告基团的电活性信号。

29.根据权利要求27所述的方法，其中电化学检测是终点检测。

30.根据权利要求28所述的方法，其中所述电化学信号由亚甲基蓝、二茂铁或另一种电活性报告基团产生。

31.一种至少两个样本的样本混合检测方法，所述方法包括：

a)将第一样本与第一ID引物和至少一种标记的捕获链组合，并将第二样本与第二ID引物和至少一种标记的捕获链组合，其中：

i)所述第一ID引物包含与靶核酸中的第一位点具有充分互补性的第一核酸序列，所述第一核酸序列有效连接至扩增区域和第一独特ID区域，

ii)所述第二ID引物包含与所述靶核酸中的所述第一位点具有充分互补性的第二核酸序列，所述第二核酸序列有效连接至扩增区域和第二独特ID区域，其中所述第一ID引物和所述第二ID引物具有可区分的熔解温度，和

iii)所述捕获链的标记物包括生物素标记物，并且所述捕获链与所述靶核酸中的邻近于所述第一位点的靶核苷酸序列互补，或与所述靶核酸中的第二位点互补；

b)将生物素标记的捕获链与链霉亲和素包被的磁珠连接；

c)使所述第一ID引物、所述第二ID引物和所述至少一种捕获链与所述第一样本和所述第二样本中的所述靶核酸序列杂交；

d)洗去未结合的引物和捕获链；

e)将所述第一样本和所述第二样本混合在一起；以及

f)任选地，检测所述靶核酸序列。

32.根据权利要求31所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括：

i)向混合的样本中添加逆转录酶；

ii)如果所述反应混合物中存在所述靶核酸序列，则逆转录所述靶核酸序列，由此置换掉结合的捕获链；以及

iii)使用磁场将未结合的捕获链与经逆转录的靶核酸分离。

33.根据权利要求31所述的方法，其中检测所述靶核酸序列包括实时定量PCR(RT-PCR)、核酸等温扩增和检测、尺寸分离技术或电化学检测。

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