CN102108406A - 检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置和方法，使用本发明的试剂盒、装置和方法能够相对无创、经济地检测胚胎染色体的拷贝数。本发明主要基于发明人发现在母体血浆中的胚胎DNA大部分为100bp到250bp的片段，且各个染色体占总DNA的比例与各个染色体占母体血浆中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA的比例是一致的。因此本发明的方法仅需要测定100bp到250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA中的每段DNA来自几号染色体，并计算在同一样本内100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。

Description

检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置和方法
技术领域
本发明涉及一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置以及方法。
背景技术
染色体拷贝数异常和人类的疾病有着密切的关系。平均每1000个新生儿中，有9个会携带因染色体拷贝数异常而导致的疾病(1)。因此在胎儿尚未出生之前能够检测出染色体拷贝数是很重要的。然而，目前所用的诊断方法，包括羊膜穿刺和羊绒毛膜取样，都属于有创伤的方法，会给孕妇和胎儿带来一定的风险。用血清蛋白标记物和超声波来检测胎儿是否有染色体拷贝数异常的疾病虽无创伤，但不是直接检测致病因素，因而准确性和灵敏度都不太好(2)，也存在不能尽早地发现染色体拷贝数异常疾病的问题。这样的现状促使研究人员去开发一种精确而且灵敏度高的无创诊断和检测方法。
自从母体血液中的胚胎DNA被发现之后(3)，无创伤地直接诊断和检测胚胎染色体异常性成了一个重大的研究课题。2007年，卢煜明教授和他的同事们证明可以用母体血浆mRNA中胎盘特异基因4的突变位点比例来断定胚胎是否有21号染色体3倍体(4)。突变位点比例同时也被用来判断18号染色体是否为3倍体(5)。它的局限性在于突变位点在人群中并不普遍，所以这些方法只适用于一部分人群。在同一时期，数码PCR(digital PCR，或dPCR)被用来检测胚胎的染色体3倍体(6)，(7)。数码PCR的优势是不依赖任何突变位点，但它的精确度不够高，而且需要大量血样，加大了采样的困难。
近年来迅猛发展的高通量测序技术解决了以上的问题。这些技术包括Illumina公司的Genome Analyzer(8)，Life Technologies公司的SOLiD(9)，以及Helicos公司的Heliscope(10)，能一次性地检测出几亿乃至几十亿个序列。用这些技术来检测母体血浆DNA时，血浆中微量的胚胎DNA的染色体数目的变化能被检测出来(11)，(12)，(13)。但因为测序的成本太高，目前这些技术尚未被普遍使用。同时，从母体血液中检测胚胎染色体的局部拷贝数的变化还属于未解决的难题。用高通量测序来检测母体血浆中胚胎染色体的拷贝数变化有一些优势，但目前价钱昂贵，不能普及。而且测序的偏差(CV)比较高，检测的精确度和稳定性也都有待改进。测序的偏差也决定了这种方法只适合少数几个染色体，如21号染色体，18号染色体，而且目前还不适合于染色体局部拷贝数变化的检测。
用高通量测序来检测染色体数目的变化的高成本和难度主要因为母体血浆中胚胎DNA的含量比较低，低时只占5％，尤其在胚胎发育的早期。母体血浆中的大部分DNA还是母体DNA。胚胎染色体数目或局部拷贝数的变化很容易被母体DNA的背景所覆盖。因此分离母体和胚胎DNA的方法也就成为多年来研究的课题，但成效不大。比较成功的方法应属Baylor医学院发明的针对组蛋白的分离方法(14)。不过分离出来的DNA量太少，只适合于突变位点的检测，不宜用来检测染色体拷贝数的变化。
发明内容
针对上面检测胚胎染色体拷贝数的方法中的种种问题，发明人根据母体血浆中胚胎DNA和母体DNA的长度设计出一种能有效地低成本检测出胚胎染色体全部或局部拷贝数的试剂盒、装置及方法。
本发明是基于以下的事实：如在文献中报道的(15)，母体血浆中的胚胎DNA大部分为100bp到250bp的片段，且150bp到170bp的DNA尤其占多数，虽然母体的DNA也有很小部分分布在这个片段区域，但片段大于250bp的DNA基本上属于母体的DNA。本发明的发明人首次发现，虽然理由未知，各个染色体占总DNA的比例在100bp到250bp之间的任意一点或任意一个区间处的DNA是均匀分布的，即各个染色体在100bp到250bp之间的任何一点，比如110bp或167bp(此位点的DNA量最多)，与总DNA的比例代表了其他点的比例，因此，也就代表了各个染色体占100bp到250bp之间的所有DNA的比例。
基于以上的发现，本发明人发明了相对无创且经济方便地检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒、装置和方法。
本发明的一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒包括：从母体取血液的器械；适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械；抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；通过物理方法根据所述DNA的片段大小对其进行分离的试剂和器械；和取100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA进行测序的试剂和器械。
优选地，所述物理方法是琼脂糖凝胶电泳的方法。
优选地，所述检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒还包括：将所述DNA制成供双端测序的文库的试剂和器械。
优选地，所述检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒还包括：对所述从血浆中抽提的DNA或所述供双端测序的文库进行PCR扩增的试剂和器械。
优选地，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
优选地，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。
优选地，其中所述双端测序对所述DNA两端各20-100bp的双端短序列进行测试。
本发明的另一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒包括：从母体取血液的器械；适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械；抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；将所述DNA制成可供双端测序的文库的试剂和器械；和对所述DNA进行双端短序列测序的试剂和器械。
优选地，所述双端短序列是所述DNA两端各小于50bp的核苷酸。
优选地，本发明的另一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒还包括：对所述从血浆中抽提的DNA进行PCR扩增的试剂和器械。
本发明的一种检测胚胎染色体拷贝数的装置包括：检测模块，用于对母体血浆样本中的DNA进行测序；比对模块，用于将所述DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度；计算模块，用于计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数；以及输出模块，用于输出所述待测染色体的拷贝数。
优选地，对所述母体血浆样本中DNA进行测序仅包括对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序，通过物理方法可以分离出固定长度区间的DNA。
优选地，所述母体血浆样本中DNA在检测前被制作成可供双端测序的文库。
优选地，所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
优选地，对所述DNA的所述双端短序列进行测试后，通过与染色体组序列图谱进行比对确定每段所述DNA的长度。
优选地，所述母体血浆样本中DNA在检测前进行了PCR的扩增。
优选地，所述母体血浆样本中DNA在被制作成可供双端测序的文库之前或之后进行了PCR的扩增。
优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间是DNA是167bp的DNA。
优选地，所述参考染色体是2号、7号、12号、14号染色体或它们的任意组合。
优选地，所述待测染色体是13号、18号、21号、X、Y染色体或它们的任意组合。
本发明的一种检测胚胎染色体拷贝数的方法包括以下步骤：取母体血液；将所述血液中的血浆和血细胞分离；通过物理方法将所述血浆中的DNA根据所述DNA的片段大小对其进行分离；对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序；将所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中的每段DNA来自几号染色体；以及计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
优选地，所述物理方法是是琼脂糖凝胶电泳的方法。
优选地，本发明的上述检测胚胎染色体拷贝数的方法还包括：在通过物理方法分离所述DNA大小之前或之后将DNA制成可供双端测序的文库，其中对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序采用的是双端测序的方法。
优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。
优选地，所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
优选地，本发明的上述检测胚胎染色体拷贝数的方法还包括：将所述DNA的所述双端短序列的测试结果与染色体组序列图谱进行比对以确定每段所述DNA的长度的步骤。
优选地，本发明的上述检测胚胎染色体拷贝数的方法还包括：在通过所述物理方法分离所述DNA之前或所述测序之前对所述DNA进行PCR扩增的步骤。
本发明的另一种检测胚胎染色体拷贝数的方法，包括以下步骤：取母体血液；将所述血液中的血浆和血细胞分离；对所述血浆中的DNA制作成可供双端测序的文库；对所述DNA双端测序文库的双端短序列进行测序；将所述测序的结果与染色体组序列图谱进行比对，确定每段所述DNA序列来自几号染色体以及每段所述DNA序列的长度；以及取所述DNA的序列长度在100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序和比对结果，计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
优选地，所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。
优选地，所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
可替换地，上述的检测胚胎染色体拷贝数的方法也可以通过测试所述血浆中的DNA的单端长序列以代替双端测序，此时可以包括也可以不包括对所述血浆中的DNA制作成可供双端测序的文库的步骤，因为测试单端长序列的文库可以与供双端测序的文库是同一文库。
当用本发明的试剂盒、装置及方法来计算胚胎DNA的染色体数或染色体局部拷贝数的变化，发现计算出来的胚胎DNA的染色体数或染色体局部拷贝数不但精确，而且需要的血样很少，计算所需的序列数目可以大大减少，从而大幅度地降低测序成本。
附图说明
图1是将母体血浆的DNA制成可供双端测序的文库后，用1％的琼脂糖凝胶电泳后的图像。左边的通道是DNA 100bp标准样的图像，右边的通道是可供双端测序的文库DNA的图像，最明显的条带位于280bp左右，其中包含了120bp的连接引物。
图2是样品G367的DNA片段大小的分布图。
图3是比对后样品G367中确定来自X染色体的DNA片段根据片段大小所做的分布图。
图4是计算得出的和实际测得的G367X染色体的DNA片段根据片段大小所做的分布图，图中带星号的线表示G367样品的总DNA序列数乘以X染色体的百分比后得到的图形，圆圈代表实际检测到的X染色体的序列数。如图中所示，计算得出的G367X染色体的DNA片段的分布与实际测量得到的分布基本相同，两条线基本完全吻合。
具体实施方式
需要说明的是，在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。本发明的附图及其实施例仅仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。
名词解释
双端短序列是指紧接着5’端链接引物的小于50bp的序列和紧接着3’端链接引物的小于50bp的序列。优选地，双端短序列是指紧接着5’端链接引物的不大于36bp的序列和紧接着3’端链接引物的不大于36bp的序列。
单端长序列是指紧接着5’端链接引物的大于99bp的序列或紧接着3’端链接引物的大于99bp的序列。
双端测序是指分别测试位于序列两端的双端短序列。
DNA簇指由单一DNA分子扩增而成的位于一定固体面积的多个DNA分子。在该申请的实施例中，DNA簇指由单一DNA分子扩增而成的位于1平方微米内的大约1000个DNA分子。
乳化PCR指的是将PCR(Polymerase Chain Reaction)的反应物，包括PCR模板DNA、PCR引物、PCR聚合酶和碱基置于一个油珠内进行PCR反应。通常情况下，乳化PCR的模板只有一个DNA分子。
实施例
实施例1：一种检测胚胎染色体拷贝数的方法
步骤1：取母体血液，制备血浆
在本实施例中，总共抽取了5个母体血液样品，血液样品经高速离心后得到除去了血细胞的血浆样品，每个样品的血浆量大约为1ml，样品的代号为：G367、G374、G379、G435和G440。上述样品均由中南大学湘雅医学院的邬玲仟教授采集得到。
步骤2：提取血浆DNA
可以使用Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为57704)。
步骤3：将血浆DNA制成可供双端测序的文库
将提取的DNA末端补平并进行5’端磷酸化：将DNA30μl、纯水45μl、具有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液10μl、10mM dNTP Mix 4μl、T4DNA聚合酶5μl、Klenow酶1μl、T4PNK 5μl混合后，在20℃温浴30分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)。温浴后采用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。
末端悬A：将上步的产物溶解在32μl缓冲液中，加入Klenow缓冲液5μl、1mM dATP 10μl、Klenow Exo-3μl，在37℃保持30分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)，产物由QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒(part#28004)
连接：DNA溶解在10μl缓冲液中，加入DNA连接酶缓冲液2x 25μl、PE Adapter Oligo Mix10μl，DNA连接酶5μl，在20℃保持15分钟(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)。温浴后采用QIAGEN QIAquick PCR纯化试剂盒(part#28104)纯化DNA。
图1是每个样品的DNA被制作成可供双端测序的文库，将该文库中的DNA用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，图1是凝胶电泳的图像，最明显的条带在280bp左右，由于包含了120bp的连接引物，因此母体血浆DNA主要片段集中在160bp左右。
优选地，还可以对可供双端测序的文库进行PCR扩增：1μl DNA、22μl纯水、1μlPE PCR引物PE 2.0、1μl PE PCR引物PE 1.0、2x Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy)(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)。通过PCR仪器扩增DNA，程序为98℃30秒；98℃40秒，65℃30秒，72℃30秒，共进行12个循环；72℃5分钟。
步骤4：对所述DNA双端测序文库的双端短序列进行测序
用Illumina的cBot仪器将DNA双端测序文库中单一的DNA分子制成DNA簇，这一步也可由乳化PCR将单一DNA分子变成珠子上的多分子。将上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在Illumina的Genome Analyzer或HiSeq2000测序仪进行双端测序。此过程均由仪器本身自动完成。
可替换地，也可将上面生成的DNA簇或乳化PCR得到的DNA珠在Illumina的GenomeAnalyzer或HiSeq2000测序仪进行单端长序列的测序。在Illumina的Genome Analyzer和HiSeq2000测序仪上的测序步骤和反应条件与以上描述的一样。
步骤5：确定血浆中的DNA片段来自几号染色体，并确定待测染色体的拷贝数是否正常
在进行了DNA文库的双端测序后(可替换地，也可以是测定单端长序列)，当已知了一个DNA片段两端各36bp的碱基序列后，可以将这两端的序列与人类基因组标准序列37.1(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc/human/data/？build＝37)，该数据库也称hg19比对，确定了这两端的序列分别在染色体上的位置，该两端序列之间的距离就是该DNA片段的长度，同时该两端序列所在的染色体位置即确定了该DNA片段来自几号染色体。
图2是根据上述的方法确定得到的样品G367的DNA片段大小的分布图，从图中可以看出，母体血浆的短DNA主要集中在100bp到220bp之间。
图3是将比对后样品G367中确定来自X染色体的DNA片段根据片段大小所做的分布图。所得到的图形与图2几乎一致。
步骤6：取DNA的序列长度在100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的比对结果，计算并确定待测染色体的拷贝数
在本实施例中我们取了长度在150bp到175bp区间的DNA片段的比对结果，将7号和14号染色体作为参考染色体，X、Y和21号染色体作为待测染色体。表1中列出了在150bp到175bp区间，来自7、14、X、Y和21号染色体的DNA片段占该区间的总DNA片段的百分数：
样品          chr7         chr14        chr21        chrX         chrY
G367_46xx     5.440913867  3.168290974  1.359162104  4.011180933  0.010527261
G374_46xx     5.451782745  3.164119016  1.353677894  3.962889744  0.012214554
G379_46xx     5.445655908  3.170272522  1.352268625  4.037545306  0.009586766
G452_47xyT21  5.371282594  3.174026866  1.501053312  3.490446542  0.060654459
G440_45x      5.467367816  3.189015757  1.356664568  3.679299238  0.0101686
根据比对的结果，得知G367的X染色体的序列数占总序列数的4.0112％，可以验证本发明的发现的是：将图2的纵坐标乘以4.0112％得到了与图3非常吻合的图形，具体参见图4，图中带星号的线表示G367样品的总DNA序列数乘以X染色体的百分比后得到的图形，圆圈代表实际检测到的X染色体的序列数。
在表2中列出了5个样品中来自X和Y染色体的DNA片段数占150bp到175bp区间的总DNA片段数的百分数与来自7号和14号染色体的DNA片段数占150bp到175bp区间的总DNA片段数的百分数的比值，也列出了这些比值的平均值和标准误差。根据平均值和标准误差，得到Z数值Z＝(样品比值-平均值)/标准误差。在该实施例中，根据Z数值可以判断胚胎中X和21号染色体的个数以及Y染色体是否存在，在此声明，本发明不用于非医学需要的胎儿性别鉴定或者性别选择性的人工终止妊娠的性别鉴定。
Figure BDA0000039321070000071
一般情况下，将Z的绝对值小于3视为正常检测误差，Z的绝对值大于3视为异常检测误差。表2中样品G452的X染色体同7号染色体和14号染色体的比值的z数值为-11.4和-15.4，绝对值均明显大于3，表明样品G452的X染色体少于用来作参考值的样品G367，G374和G379的X染色体数(都是女婴，所以参考值为2条)，因此样品G452是一个男婴。样品G452的Y染色体同7号染色体和14号染色体的比值的z数值明是38.3和37.1，均显超过3，所以Y染色体在样品G452中存在，进一步证明G452是一个男婴。样品G452的21号染色体的Z数值为35.5和36.9，明显高出3，可以断定为21号染色体3体(该胚胎经羊膜穿刺确实诊断为21号染色体3体)。依此类推，样品G440的X染色体明显小于-3，但是它的Y染色体的Z数值为-0.49和-0.50，介于-3和+3之间，因此Y染色体也不存在。所以样品G440只有一条X染色体而且没有Y染色体，很可能为特纳综合症(Tuner Syndrome)婴儿。
实施例2：另一种检测胚胎染色体的方法
本发明另一种检测胚胎染色体的方法，其与实施例1的不同之处在于操作中我们并不是对所有的序列进行测序，而是通过物理的方法，优选地通过琼脂糖凝胶电泳的方法分离出100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA，对100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序。其余的操作或计算的步骤可与实施例1中的相同。
实施例3：检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒
对应于实施例1的检测方法，本申请的发明人开发了一种能够用于检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒，其包括：
从母体取血液的器械，可以是任何能用于取血的采血针、注射器等等；
适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械，可以是适合于在离心机上用于盛装血液的微管或其他任何适合分离的容器或器械；
抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械，可以包括：蛋白酶、饱和酚、氯仿∶异戊醇(24∶1)、醋酸钠、无水乙醇、70％乙醇、TE溶液等。也可以选取Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为57704)以及其它任何可以用于进行DNA提取的试剂或容器；
将所述DNA制成可供双端测序的文库的试剂和器械，可以包括：具有10mM ATP的T4DNA连接酶缓冲液、10mM dNTP Mix、T4DNA聚合酶、Klenow酶、T4PNK(以上这些试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)以及在特定环境下对DNA具有亲和性的离子交换脂以实现对DNA的分离。也可以选取QIAGEN QIAquick PCR产物分离试剂盒(产品号#28104)或QIAGEN MinElute PCR产物分离试剂盒(产品号#28004)。
和对所述DNA进行双端短序列测序的试剂和器械，可以包括：PE PCR引物PE 2.0、PE PCR引物PE 1.0、Phusion DNA聚合酶(Finnzymes Oy)(试剂为Illumina样本准备试剂盒PE-102-1001提供)。
实施例4：另一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒
对应于实施例2的检测方法，本申请的发明人开发了另一种能够用于检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒，其包括：
从母体取血液的器械，可以是任何能用于取血的采血针、注射器等等；
适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械，可以是适合于在离心机上用于盛装血液的微管或其他任何适合分离的容器或器械；
抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械，可以包括：蛋白酶、饱和酚、氯仿∶异戊醇(24∶1)、醋酸钠、无水乙醇、70％乙醇、TE溶液等。也可以选取Qiagen公司生产的DNA抽提试剂盒来提取血浆中的DNA(产品号为57704)以及其它任何可以用于进行DNA提取的试剂或容器；
通过物理方法根据所述DNA的片段大小对其进行分离的试剂和器械，可以包括：琼脂糖粉(Biowest 11860)，marker(Takara 100bp DNAmarker，产品号D505A)等；
和取100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA进行测序的试剂和器械，可以包括：如切取一定区间的琼脂糖凝胶的切刀。
优选地，可以包括将从切取的琼脂糖凝胶回收DNA进行扩增并将其制成可供双端测序的文库的试剂和器械。
实施例5：一种检测胚胎染色体拷贝数的装置
一种检测胚胎染色体拷贝数的装置，包括：
检测模块，用于对母体血浆样本中的DNA进行测序，可以包括Illumina的cBot仪器和Illumina的Genome Analyzer或HiSeq2000测序仪或ABI公司的SOLiD系列的测序仪；
比对模块，用于将所述DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度，可以使用人类基因组标准序列数据库hg19；
计算模块，用于计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间，如150bp到175bp的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数，用如实施例1中具体的计算方法对测序和比对的结果进行计算以得到待测染色体拷贝数的结果；以及
输出模块，用于输出所述待测染色体的拷贝数。
优选地，检测模块可以检测样品中所有的DNA片段，也可以仅仅检测100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间如150bp到175bp的所有DNA，这可以通过在检测装置的上游包括一个根据所述DNA的片段大小，对母体血浆中的DNA进行分离的试剂和器械，可以是进行琼脂糖凝胶电泳的模块或装置。
显然，本领域的技术人员应该明白，上述的本发明的一些模块或一些步骤可以用通用的计算装置来实现，它们可以集中在单个的计算装置上，或者分布在多个计算装置所组成的网络上，可选地，它们可以用计算装置可执行的程序代码来实现，从而，可以将它们存储在存储装置中由计算装置来执行，或者将它们分别制作成各个集成电路模块，或者将它们中的多个模块或步骤制作成单个集成电路模块来实现。这样，本发明不限制于任何特定的硬件和软件结合。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (35)

1.一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒，包括：
从母体取血液的器械；
适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械；
抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；
通过物理方法根据所述DNA的片段大小对其进行分离的试剂和器械；和
取100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA进行测序的试剂和器械。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述物理方法是琼脂糖凝胶电泳的方法。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，还包括：将所述DNA制成供双端测序的文库的试剂和器械。
4.根据权利要求1或3所述的试剂盒，还包括：对所述从血浆中抽提的DNA或所述供双端测序的文库进行PCR扩增的试剂和器械。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
9.一种检测胚胎染色体拷贝数的试剂盒，包括：
从母体取血液的器械；
适合将所述血液中的血细胞和血浆分离的器械；
抽提所述血浆中的DNA的试剂和器械；
将所述DNA制成可供双端测序的文库的试剂和器械；和
对所述DNA进行双端短序列测序的试剂和器械。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中所述双端短序列是所述DNA两端各小于50bp的核苷酸。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，还包括：对所述从血浆中抽提的DNA进行PCR扩增的试剂和器械。
12.一种检测胚胎染色体拷贝数的装置，包括：
检测模块，用于对母体血浆样本中的DNA进行测序；
比对模块，用于将所述DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度；
计算模块，用于计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数；以及
输出模块，用于输出所述待测染色体的拷贝数。
13.根据权利要求12所述的装置，其中对所述母体血浆样本中DNA进行测序仅包括对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序，通过物理方法可以分离出100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA。
14.根据权利要求12或13所述的装置，其中所述母体血浆样本中DNA在检测前被制作成可供双端测序的文库。
15.根据权利要求14所述的装置，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
16.根据权利要求15所述的装置，其中对所述DNA的所述双端短序列进行测试后，通过将所测得的DNA的双端短序列与染色体组序列图谱进行比对能够确定每段所述DNA的长度以及每段所述DNA来自几号染色体。
17.根据权利要求12所述的装置，其中所述母体血浆样本中DNA在检测前进行了PCR的扩增。
18.根据权利要求14所述的装置，其中所述母体血浆样本中DNA在被制作成可供双端测序的文库之前或之后进行了PCR的扩增。
19.根据权利要求13或15所述的装置，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
20.根据权利要求19所述的装置，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间是DNA是167bp的DNA。
21.根据权利要求12所述的装置，其中所述参考染色体是2号、7号、12号、14号染色体或它们的任意组合。
22.根据权利要求12或21所述的装置，其中所述待测染色体是13号、18号、21号、X、Y染色体或它们的任意组合。
23.一种检测胚胎染色体拷贝数的方法，包括以下步骤：
取母体血液；
将所述血液中的血浆和血细胞分离；
通过物理方法将所述血浆中的DNA根据所述DNA的片段大小对其进行分离；
对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序；
将所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序结果与染色体组序列图谱进行比对，以确定所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中的每段DNA来自几号染色体以及所述每段DNA的序列长度；以及
计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述物理方法是是琼脂糖凝胶电泳的方法。
25.根据权利要求24所述的方法，还包括在通过物理方法分离所述DNA大小之前或之后将DNA制成可供双端测序的文库，其中对所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA进行测序采用的是双端测序的方法。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
29.根据权利要求28所述的方法，还包括将所述DNA的所述双端短序列的测试结果与染色体组序列图谱进行比对以确定每段所述DNA的长度的步骤。
30.根据权利要求24-26或28中任一项所述的方法，还包括在通过所述物理方法分离所述DNA之前或所述测序之前对所述DNA进行PCR扩增的步骤。
31.一种检测胚胎染色体拷贝数的方法，包括以下步骤：
取母体血液；
将所述血液中的血浆和血细胞分离；
对所述血浆中的DNA制作成可供双端测序的文库；
对所述DNA双端测序文库的双端短序列进行测序；
将所述测序的结果与染色体组序列图谱进行比对，确定每段所述DNA序列来自几号染色体以及每段所述DNA序列的长度；以及
取所述DNA的序列长度在100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA的测序和比对结果，计算在同一样本内所述DNA中100bp-250bp之间的任意一点或任意一个区间的所有DNA中来自待测染色体与来自参考染色体的DNA片段数的比值，并计算各个样本间所述比值的变异，根据所述变异的数值确定待测染色体的拷贝数。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是150bp-170bp的DNA。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述100-250bp之间的任意一点或任意一个区间的DNA是167bp的DNA。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中所述双端测序对所述DNA两端各小于50bp的双端短序列进行测试。
35.根据权利要求31所述的方法，其中通过测试所述血浆中的DNA的单端长序列以代替双端测序。
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Assignor: Auspicious and the health gene diagnosis Technology Co., Ltd. of Hangzhou shellfish

Contract record no.: 2014430000143

Date of cancellation: 20160722

EM01 Change of recordation of patent licensing contract

Change date: 20160722

Contract record no.: 2014430000143

Assignor after: Auspicious and the health gene diagnosis Technology Co., Ltd. of Hangzhou shellfish

Assignor before: Beijing Berry Genomics Co., Ltd.

LICC Enforcement, change and cancellation of record of contracts on the licence for exploitation of a patent or utility model