WO2013104106A1

WO2013104106A1 - 用于构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒

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Publication number: WO2013104106A1
Application number: PCT/CN2012/070162
Authority: WO
Inventors: 张建光; 高扬; 石燕滨; 陈迪; 田凤
Original assignee: 北京贝瑞和康生物技术有限公司
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2013-07-18
Also published as: US20140228256A1; CN103298955B; CN103298955A

Abstract

本发明提供了用于构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒。本发明的方法包括：抽提血浆DNA；将血浆DNA与测序接头连接，并对连接产物进行纯化；对纯化的连接产物进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行纯化，以获得所述血浆DNA测序文库，其中，该方法不包括对血浆DNA进行5'末端磷酸化的步骤。还可以在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A。本发明还提供了实施上述方法的相应试剂盒。

Description

用于构建血浆 DNA测序文库的方法和试剂盒技术领域本发明涉及用于构建血浆 DNA测序文库的方法和试剂盒，更具体地，本发明涉及用于构建第二代高通量测序用血浆 DNA测序文库的方法和试剂盒。背景技术随着科技的进步，传统的 Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，对基因组测序，需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术，第二代测序技术应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定 DNA 的序列，现有的技术平台主要包括 Roche/454 FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和 Applied Biosystems SOLID system等。以 Illumina产品为例， GAII读长从 2008年的 36碱基发展到现在的 100碱基，通量从 2008年的 48M reads/run发展到现在的 240M reads/run, 测序能力提高了 14倍。到目前为止， HiSeq 2000每个 run可以达到 3个人基因组 30X覆盖的测序通量，约 300 G/run数据，上机操作时间也减少到了 30分钟。而且随着第二代测序技术的成熟，将其应用于临床的研究迅猛发展。研究表明通过测序孕妇血浆 DNA可以判断胎儿遗传健康状况，而测序检测者血浆 DNA可以进行癌症早期筛查，并具有很强的应用前景。血浆 DNA又称循环 DNA，是血液中的细胞外 DNA，长约几十到几百核苷酸，可以以 DNA-蛋白质复合物的形式存在，也可以是游离的 DNA片段。正常情况下，血浆 DNA来源于少量衰老死亡细胞的 DNA释放。健康状态下，循环 DNA的生成与清除处于动态平衡状态，维持在较恒定的低水平。循环 DNA能反映人体内细胞新陈代谢的状况，是健康评判的一个重要指标。外周血循环 DNA量和质的改变与多种疾病（包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等）关系密切，作为一种无创性检测指标，有望成为某些疾病早期诊断、病情监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。自从母体血液中的胚胎 DNA被发现之后 ⁽³⁾，无创伤地直接诊断和检测胚胎染色体异常性成了一个重大的研究课题。 2007年，卢煜明教授和他的同事们证明可以用母体血浆 mRNA中胎盘特异基因 4的突变位点比例来断定胚胎是否有 21号染色体 3倍体 ⁽⁴⁾。突变位点比例同时也被用来判断 18号染色体是否为 3倍体 ⁽⁵⁾。它的局限性在于突变位点在人群中并不普遍，所以这些方法只适用于一部分人群。在同一时期，数码 PCR (digital PCR, 或 dPCR)被用来检测胚胎的染色体 3倍体 ⁽⁶⁾'⁽⁷⁾。数码 PCR的优势是不依赖任何突变位点，但它的精确度不够高，而且需要大量血样，加大了采样的困难。近年来迅猛发展的高通量测序技术解决了以上的问题。这些技术包括 Illumina公司的 Genome Analyzer⁽⁸⁾, Life Technologies 公司的 SOLiD⁰⁵), 以及 Helicos 公司的 Heliscope⁽¹⁰⁾, 能一次性地检测出几亿乃至几十亿个序列。用这些技术来检测母体血浆 DNA时，血浆中微量的胚胎 DNA的染色体数目的变化能被检测出来 ⁽¹¹⁾，⁽¹²⁾，⁽¹³⁾。但因为测序的成本太高，目前这些技术尚未被普遍使用。同时，从母体血液中检测胚胎染色体的局部拷贝数的变化还属于未解决的难题。用高通量测序来检测母体血浆中胚胎染色体的拷贝数变化有一些优势，但目前价钱昂贵，不能普及。而且测序的偏差（CV) 比较高，检测的精确度和稳定性也都有待改进。测序的偏差也决定了这种方法只适合少数几个染色体，如 21号染色体、 18号染色体，而且目前还不适合于染色体局部拷贝数变化的检测。测序效率的提升和多样品混合测序的普及对样品的制备效率提出了更高的要求，特别是大量临床样品制备；而现有的临床血浆样品制备方法发展，一直赶不上测序能力的提高。因此，第二代高通量测序临床血浆 DNA样品的制备效率和成本，成为高通量测序能否得以普及的关键。第二代高通量测序的血浆 DNA样品的制备过程本质上是将符合测序长度的 DNA 插入到已有的测序载体中，即在待测序 DNA两端连上已知的测序接头序列。目前血浆 DNA文库的构建主要包括先将提取的血浆 DNA进行末端修复及 5'末端磷酸化、然后进行末端加 A、连接接头、 PCR等主要步骤（图 1 )，其中，在各个步骤之间几乎都需要进行纯化步骤。这种血浆 DNA测序文库的构建方法共需要 6种主要的酶， 4种酶反应体系，并经过 4次清洁纯化，因而成本较高，操作复杂，对实验者的分子生物学的操作能力要求很高，实现多样品同时处理的难度较大。发明内容鉴于临床血浆 DNA测序文库构建过程中所遇到的问题，本发明人发现了新的更加简化、更加快速的临床血浆 DNA测序文库的构建方法，其可适用于多种第二代测序平台，包括但不限于如 Roche/454 FLX、 Illumina/Solexa Genome Analyzer和 Applied Biosystems SOLID system, Life Technologies Ion Torrent等测序平台。本发明是基于以下的事实：本发明人发现，血浆中的 DNA末端自然地含有单磷酸基团，现有实验流程的末端补平步骤中所涉及的 5'末端磷酸化并不是必需的步骤，因而无需使用 T4多聚核苷酸激酶（Τ4 Ρ Κ) 和三磷酸腺苷（ΑΤΡ)。基于上述发现，本发明人还发现在无需使用 Τ4多聚核苷酸激酶（Τ4 Ρ Κ) 和三磷酸腺苷（ΑΤΡ) 的情况下，依赖于对末端悬 Α (末端加 A， dA-overhang) 中所采用的酶的选择，现有实验流程中的末端补平、末端悬 A和连接测序接头三步反应实际上可以不必在三个反应体系中进行，而是可以仅在两个反应体系中或者甚至仅在单独一个反应体系中进行，中间不需要纯化步骤。更进一步地，本发明人还发现，通过采用单链测序接头代替双链测序接头，可无需进行末端补平和末端悬 A步骤，而是将抽提得到的血浆 DNA直接进行接头连接，并随后进行纯化、 PCR扩增等步骤，同样能够获得合乎高通量测序要求的 DNA文库。基于上述发现，在一个方面，本发明提供了一种用于构建血浆 DNA测序文库的方法，该方法包括以下步骤：抽提血浆 DNA; 将血浆 DNA与测序接头连接，并对连接产物进行纯化；对纯化的连接产物进行 PCR扩增，并对 PCR扩增产物进行纯化，以获得所述血浆 DNA测序文库。其中，本发明方法的一个重要特征在于，其不包括对血浆 DNA进行 5'末端磷酸化的步骤。根据本发明的方法，优选地，所述将血浆 DNA与测序接头连接，是采用选自以下中的一种或多种而进行的： T4 DNA连接酶、 T4 RNA连接酶、以及 T7 DNA连接酶。根据本发明的方法，在一些实施方式中，所述测序接头为单链的测序接头；在另一些实施方式中，所述测序接头为双链的测序接头。在测序接头为双链测序接头的情况下，在一种实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤：在所述抽提血浆 DNA之后、但在所述将血浆 DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆 DNA进行末端悬 A并对经末端悬 A的血浆 DNA进行纯化。优选地，所述末端悬 A采用 klenow ex-酶、或 Taq酶、或 klenow ex-酶与 Taq酶的组合。可替换地，末端悬 A和测序接头的连接可以在一个反应体系中进行， SP，在末端悬 A 后可无需进行纯化，而是直接进行测序接头的连接，其中末端悬 A采用 Taq酶。在测序接头为双链测序接头的情况下，在另一种实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤：在所述抽提血浆 DNA之后、但在所述将血浆 DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆 DNA进行末端补平和末端悬 A。其中，所述末端补平和所述末端悬 A可以在两个反应体系中进行， SP，在末端补平后，需经过纯化后再进行末端悬 A; 可替换地且为优选地，所述末端补平和所述末端悬 A在一个反应体系中进行，在末端补平和末端悬 A之后对血浆 DNA进行纯化，其中所述末端补平采用 T4 DNA聚合酶，所述末端悬 A采用 Taq酶；或者更加优选地，所述末端补平和所述末端悬 A、以及所述将血浆 DNA与测序接头连接三者在一个反应体系中进行，其中所述末端补平采用 T4 DNA聚合酶，所述末端悬 A采用 Taq酶。在另一个方面，本发明提供一种用于构建血浆 DNA测序文库的试剂盒，该试剂盒包含： --将血浆 DNA与测序接头连接的试剂，包括测序接头、连接酶、和连接缓冲液；以及对连接产物进行纯化的试剂和器械； --对纯化的连接产物进行 PCR扩增的试剂，以及对 PCR扩增产物进行纯化的试剂和器械。其中，本发明试剂盒的一个重要特征在于，其不包含用于对血浆 DNA进行 5'末端磷酸化的试剂。根据本发明的试剂盒，优选地，所述连接酶为选自以下中的一种或多种： T4 DNA 连接酶、 T4 RNA连接酶、以及 T7 DNA连接酶。根据本发明的试剂盒，在一些实施方式中，所述测序接头为单链的测序接头；在另一些实施方式，所述测序接头为双链的测序接头。在测序接头为双链测序接头的情况下，在一种实施方式中，本发明的试剂盒还包含： - -对抽提得到的血浆 DNA进行末端悬 A的试剂，包括 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；以及对经末端悬 A的血浆 DNA进行纯化的试剂和器械。优选地，所述用于末端悬 A的酶为 klenow ex-酶、或 Taq酶、或 klenow ex-酶与 Taq酶的组合。在测序接头为双链测序接头的情况下，在另一种实施方式中，本发明的试剂盒还包含： - -对抽提得到的血浆 DNA分别进行末端补平和末端悬 A的试剂，包括用于末端补平的酶、 dNTP、末端补平缓冲液、 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；以及在末端补平之后、和末端悬 A之后分别对血浆 DNA进行纯化的试剂和器械。在测序接头为双链测序接头的情况下，在另一种实施方式中，本发明的试剂盒还包含： - -对抽提得到的血浆 DNA进行末端补平和末端悬 A的试剂，包括用于末端补平的酶、 dNTP、末端补平缓冲液、 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；以及在末端补平和末端悬 A之后对血浆 DNA进行纯化的试剂和器械；其中，所述末端补平和所述末端悬 A在一个反应体系中进行，且所述用于末端补平的酶为 T4 DNA聚合酶，所述用于末端悬 A的酶为 Taq酶。在测序接头为双链测序接头的情况下，在又一种实施方式中，本发明的试剂盒还包含： - -对抽提得到的血浆 DNA进行末端补平和末端悬 A的试剂，包括用于末端补平的酶、 dNTP、末端补平缓冲液、 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；其中，所述末端补平和所述末端悬 A、以及所述将血浆 DNA与测序接头在一个反应体系中进行，且所述用于末端补平的酶为 T4 DNA聚合酶，所述用于末端悬 A的酶为 Taq酶。本发明基于血浆 DNA末端自然含有单磷酸基团这一出乎意料的发现，在现有血浆 DNA测序文库的构建方法中省却了原本必需的 5'末端磷酸化步骤，不再使用 T4多聚核苷酸激酶和三磷酸腺苷；并且，在此基础上，本发明通过利用普通的 Taq聚合酶代替 klenow ex-酶进行末端悬 A步骤，使得多种反应的缓冲液可兼容，由此能够在两个或仅一个反应体系中进行末端补平、末端悬 A、连接接头的步骤；另外，本发明通过采用单链测序接头代替双链测序接头，使得可以省却现有技术中末端补平和末端悬 A步骤而直接进行接头连接。因此，本发明大大简化了血浆 DNA测序文库的构建流程，简化了实验步骤，使血浆样品文库构建更加低成本、高效、快速，便于大规模使用。附图说明图 1示出了现有技术中普遍采用的第二代高通量血浆 DNA测序文库的构建方法。图 2示出了根据本发明的一种实施方式的第二代高通量血浆 DNA测序文库的构建方法。图 3a、图 3b示出了通过本发明的方法所构建的血浆 DNA测序文库的电泳结果。图 3a为根据实施例 1-4所构建的血浆 DNA测序文库的电泳结果，其中，泳道 1为用作对照的根据现有方法构建的血浆 DNA测序文库；泳道 2-5分别为根据实施例 1-4构建的血浆 DNA测序文库。图 3b为根据实施例 5所构建的血浆 DNA测序文库的电泳结果，其中泳道 1-5分别为根据具体例 1-5构建的血浆测序文库。具体实施方式如前文所述，目前适用于第二代高通量测序平台的血浆 DNA文库的构建，主要包括以下步骤（请参见附图 1 ): 提取血浆 DNA (步骤 101 ) →对提取的血浆 DNA进行末端修复（补平）、 5'末端磷酸化、并纯化（步骤 102) →对 5'磷酸化平末端 DNA 片断进行 3'末端加 A、并纯化（步骤 103) →使3'末端加 A的 DNA与测序接头连接 (步骤 104)→对连接产物进行纯化，以去除未连接的接头（步骤 105)→对纯化后的产物进行聚合酶链反应（PCR) (步骤 106)→对？0 产物进行纯化，以获得血浆 DNA 测序文库（步骤 107)。其中，在各个步骤之间几乎都需要进行纯化步骤。因此，在第二代血浆 DNA测序文库的构建方法中共需要 6种主要的酶， 4种酶反应体系，并经过 4次清洁纯化，因而成本较高，操作复杂，对实验者分子生物学的操作能力要求很高，实现多样品同时处理的难度较大。本发明人经过反复的实验，出乎意料地发现，血浆中的 DNA末端自然地含有单磷酸基团，现有实验流程中的末端补平步骤中所涉及的 5'末端磷酸化并不是必需的步骤，因而在血浆 DNA测序文库的构建中无需使用 T4多聚核苷酸激酶（T4 P K) 和三磷酸腺苷（ATP)，因此，本发明构建血浆 DNA测序文库的一个重要特点是不包括 5'末端磷酸化的步骤。在此基础上，本发明人还发现，在不使用 T4多聚核苷酸激酶（T4 P K) 和三磷酸腺苷（ATP) 的情况下，依赖于对末端悬 A中所采用的酶的选择，现有实验流程中的末端补平、末端悬 A和连接测序接头三步反应实际上可以不必分别在三个反应体系中进行，而是可以仅在两个反应体系中或者甚至仅在单独一个反应体系中进行，中间不需要纯化步骤。此外，本发明人还发现，通过采用单链测序接头代替双链测序接头，可无需进行末端补平和末端悬 A步骤，而是将抽提得到的血浆 DNA直接进行接头连接，并随后进行纯化、 PCR扩增等步骤，同样能够获得合乎高通量测序要求的 DNA文库。图 2示出了根据本发明的一种实施方式的第二代高通量血浆 DNA测序文库的构建方法，其主要包括以下步骤：提取血浆 DNA (步骤 201 ) →使DNA与测序接头连接（步骤 204)→对连接产物进行纯化，以去除未连接的接头（步骤 205)→对纯化后的产物进行聚合酶链反应（PCR) (步骤 206) →对 PCR产物进行纯化，以获得血浆 DNA测序文库（步骤 207)。根据本发明的另一种实施方式，还可以在步骤 201与步骤 204之间包括：步骤 202--对提取的血浆 DNA进行末端修复、 5'末端磷酸化，和步骤 203--对 5'磷酸化平末端 DNA片断进行 3 '末端加 A (图中未示出），且步骤 202、步骤 203可在同一反应体系中进行；或者步骤 202、步骤 203、以及步骤 204可在同一反应体系中进行。与现有技术中用于构建血浆 DNA测序文库的方法相比，本发明的方法显著地简化了血浆 DNA测序文库的构建流程，精简了实验步骤，使得血浆样品文库的构建更加低成本、高效、快速，便于大规模使用。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。实施例：根据本发明适用于第二代高通量测序的血浆 DNA测序文库的构建方法实施例 1 实施例 1的血浆 DNA测序文库的构建方法主要包括以下步骤：

( 1 )抽提血浆 DNA: 可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于抽提血浆 DNA 的方法、和试剂进行此步骤。

(2)末端补平，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端补平以及随后清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可利用 T4 DNA 聚合酶、 Klenow酶作为用于末端补平的酶。

(3 )末端悬 A，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端悬 A以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可以使上步产物在 klenow ex- (New England Biolabs) (是一种改进的 Klenow酶，其 3 ' -5 ' 外切活性缺失）的作用下将双链末端悬出 A碱基。

(4)与测序接头连接，之后对产物进行清洁纯化：可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于连接接头以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如，可在 T4 DNA连接酶、 T4 RNA连接酶、 T7 DNA连接酶或其中两种或更多种的组合的作用下，使末端悬 A产物与双链测序接头连接。其中，测序接头可商购或自行合成而获得。

( 5 ) 将上步清洁产物进行聚合酶链反应扩增，之后对产物进行清洁纯化： PCR 反应已是本领域非常成熟的技术，对于 PCR反应的引物和聚合酶的选择，以及 PCR 反应循环的设计，也在本领域技术人员的能力范围之内。此外，在高通量测序之前，还需要对上述文库进行以下操作：

( 6) 利用定量工具如 nano drop (nano drop 科技有限公司）、 Bioanalyser 2100 (agilent)、 Qubit (life technologies) 或 qPCR，对测序文库进行定量；

(7) 根据上机通道的安排及标签序列的不同将样品等量混合；

( 8) 样品上机。以下示出利用根据本发明实施例 1的方法进行血浆 DNA样品测序的一个具体实例。步骤 1 : 抽提血浆 DNA约 5 ng。步骤 2: 制备如表 1所示的末端补平反应混合液，在 20°C温浴 30分钟；在纯化柱上纯化 DNA样品，并在 42 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。其中，本文中所使用的洗脱缓冲液为 10mM Tris-Cl， pH 8.0，但适用于本发明的洗脱缓冲液并不局限于此。表 1

血浆 DNA溶液 40.5 μΐ

Τ4 DNA聚合酶缓冲液（10X) 5 μΐ

10 mM dNTP混合液 2 μΐ

Τ4 DNA聚合酶 2 μΐ

Klenow酶 0.5μ1

无菌 Η₂0 Ο μΐ

总体积 50 μΐ 步骤 3 : 制备如表 2所示的用于在 3'末端加多聚腺嘌吟尾的反应混合液，在 37°C 温浴 30分钟；在纯化柱上纯化 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 2

平末端 DNA 32 μΐ

Klenow反应缓冲液（ 10X) 5 μΐ

dATP溶液 10 μΐ

klenow ex- (3 ' -5 ' 外切活性缺失） 3 μΐ

无菌 Η₂0 Ο μΐ

总体积 5 步骤 4: 制备如表 3所示的 DNA片段连接测序接头的反应混合液，在 20°C温浴 15分钟；在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 3

末端补平的、 dA-尾 DNA 33 μΐ

快速连接反应缓冲液（5Χ) 10 μΐ

5 μΜ DNA接头 2 μΐ

快速 Τ4 DNA连接酶（NEB) 5 μΐ

总体积 5 步骤 5 : 制备如表 4所示的 PCR反应混合液，通过 PCR富集接头修饰的 DNA片段；在 Qiagen柱上提取 DNA样品并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 4

DNA 12.5 μΐ

Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶混合物） 25 μΐ

PCR引物混合物 2 μ1

超纯水 10.5μ1

总体积 50 μΐ

PCR反应方案为： a. 98°C 30秒一b. 18个如下的循环： 98°C 10秒， 65 °C 30秒， 72 °C 3(^4、→c. 72°C 5分钟→d. 保持在 4°C。步骤 6: 文库定量及混合：取 Ιμί文库 Qubit定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取 Ιμί混合样品 Qubit定量。步骤 7:上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成 100 μΜ; 按照 Illmina GAIIx操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例 1构建的血浆 DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验，发现其与传统方法构建得到的 DNA文库具有类似的条带（参见附图 3a，泳道 2)。实施例 2 实施例 2的血浆 DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例 1，不同之处在于，实施例 2省却了末端补平的步骤，将抽提得到的血浆 DNA直接进行末端悬 A、并纯化。以下示出利用根据本发明实施例 2的方法进行血浆 DNA样品测序的一个具体实例。步骤 1 : 抽提血浆 DNA约 5 ng。步骤 2: 制备如表 5所示的反应混合液，在 37°C温浴 30分钟，以在 DNA片段的 3'末端加多聚腺嘌吟尾；在柱上纯化 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 5

平末端 DNA 32 μΐ

Klenow反应缓冲液（ 10X) 5 μΐ

klenow ex- ( 3 ' -5 ' 外切活性缺失） 3 μΐ

dATP溶液 10 μΐ

无菌 Η₂0 Ο μΐ

总体积 5 " 步骤 3 : 制备如表 6所示的反应混合液，在 20°C温浴 15分钟，为 DNA片段连接双链接头；在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 6

末端补平的、 dA-尾 DNA 33 μΐ

快速连接反应缓冲液（5Χ) 10 μΐ

5 μΜ DNA接头 2 μΐ

快速 Τ4 DNA连接酶（NEB ) 5 μ1

总体积 5 步骤 4: 制备如表 7所示的 PCR反应混合液，通过 PCR富集接头修饰的 DNA片段；在 Qiagen柱上提取 DNA样品并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 7

DNA 12.5 μΐ

Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶混合物） 25 μΐ

PCR引物混合物 2 μ1

超纯水 10.5μ1

总体积 5

PCR反应方案为： a. 98°C 30秒一b. 18个如下的循环： 98°C 10秒， 65 °C 30秒， 72 °C 3(^4、→c. 72°C 5分钟→d. 保持在 4°C。步骤 5 : 文库定量及混合：取 Ι μί文库 Qubit定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取 Ι μί混合样品 Qubit定量。步骤 6:上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成 ΙΟΟμΜ; 按照 Illmina GAIIx操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例 2构建的血浆 DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验，发现其与传统方法构建得到的 DNA文库具有类似的条带（参见附图 3a，泳道 3 )。实施例 3 实施例 3的血浆 DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例 1，不同之处在于，在实施例 3中，末端补平和末端悬 A在一个反应体系中进行，末端补平和末端悬 A之间不进行清洁纯化步骤，其中末端悬 A采用普通 Taq酶代替常用的 klenow ex-酶，以使两种反应的缓冲体系得以兼容。以下示出利用根据本发明实施例 3的方法进行血浆 DNA样品测序的一个具体实例。步骤 1 : 抽提血浆 DNA约 5 ng。步骤 2: 制备如表 8所示的反应混合液，在 37°C温浴 20分钟（末端补平），并在 72°C温浴 20分钟（末端悬 A)，从而在一个反应体系中进行末端补平和末端悬 A; 在纯化柱上纯化 DNA样品，并在 42 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。根据适用于不同设计需要的不同的反应混合液的组成，末端补平和末端悬 A的温度和时间可以有所不同。表 8

血浆 DNA溶液 40.5 μΐ

Τ4 DNA聚合酶缓冲液（10X) 5 μΐ

10 mM dNTP混合液 2 μΐ

Τ4 DNA聚合酶 2 μΐ

Taq聚合酶 0.5μ1

无菌 Η₂0 Ο μΐ

总体积 50 μΐ 步骤 3 : 制备如表 9所示的反应混合液，在 20°C温浴 15分钟，为 DNA片段连接接头；在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 9

末端补平的、 dA-尾 DNA 33 μΐ

快速连接反应缓冲液（5Χ) 10 μΐ

5 μΜ DNA接头 2 μΐ

快速 Τ4 DNA连接酶（NEB ) 5 μΐ 总体积 50 μΐ 步骤 4: 制备如表 10所示的 PCR反应混合液，通过 PCR富集接头修饰的 DNA 片段，在 Qiagen柱上提取 DNA样品并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 10

DNA 12.5 μΐ

Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶混合物） 25 μΐ

PCR引物混合物 2 μ1

超纯水 10.5 μΐ

总体积 50 μΐ

PCR反应方案为： a. 98°C 30秒一b. 18个如下的循环： 98°C 10秒， 65°C 30秒， 72 °C 3(^4、→c. 72°C 5分钟→d. 保持在 4°C。步骤 5: 文库定量及混合：取 1 文库 Qubit定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取 Ιμί混合样品 Qubit定量。步骤 6:上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成 100 μΜ; 按照 Illmina GAIIx操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例 3构建的血浆 DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验，发现其与传统方法构建得到的 DNA文库具有类似的条带（参见附图 3a，泳道 4)。实施例 4 实施例 4的血浆 DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例 1，不同之处在于，在实施例 4中，末端补平、和末端悬、以及测序接头的连接，三者在一个反应体系中进行，末端补平和末端悬 A之间、以及末端悬 A和测序接头连接之间不进行清洁纯化步骤，其中末端悬 A采用普通 Taq酶代替常用的 klenow ex-酶，以使三种反应的缓冲体系得以兼容。以下示出利用根据本发明实施例 4的方法进行血浆 DNA样品测序的一个具体实例。步骤 1 : 抽提血浆 DNA约 5 ng。步骤 2: 制备如表 11所示的反应混合液，在 37°C温浴 20分钟（末端补平）， 72°C 温浴 20分钟（末端悬 A)，以完成末端补平和末端悬 A，此时不进行纯化步骤。表 11

血浆 DNA溶液 40.5 μΐ

Τ4 DNA聚合酶缓冲液（10X) 5 μΐ

10 mM dNTP混合液 2 μΐ

Τ4 DNA聚合酶 2 μΐ

Taq聚合酶 0.5μ1

无菌 Η₂0 Ο μΐ

总体积 50μ1 步骤 3 :向上步反应溶液中加入另外的反应试剂，制备如表 12所示的反应混合液，在 20°C温浴 15分钟，以为 DNA片段连接双链测序接头；在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 12

上步反应溶液 50 μΐ

快速连接反应缓冲液（10X) 10 μΐ

5 μΜ DNA接头 2 μΐ

快速 Τ4 DNA连接酶（NEB ) 5 μ1

总体积 100 μΐ 步骤 4: 制备表 13所示的 PCR反应混合液，通过 PCR富集接头修饰的 DNA片段；在 Qiagen柱上提取 DNA样品并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。表 13

DNA 12.5 μΐ

Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶混合物） 25 μΐ

PCR引物混合物 2 μ1

超纯水 10.5μ1

总体积 5

PCR反应方案为： a. 98 °C 30秒一b. 18个如下的循环： 98 °C 10秒， 65 V 30秒， 72 V 3(^4、→c. 72°C 5分钟→d. 保持在 4°C。步骤 5: 文库定量及混合：取 1 文库 Qubit定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取 1 混合样品 Qubit定量。步骤 6:上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成 100 μΜ; 按照 Illmina GAIIx操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例 3构建的血浆 DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验，发现其与传统方法构建得到的 DNA文库具有类似的条带（参见附图 3a，泳道 5 )。实施例 5 实施例 5的血浆 DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例 1，不同之处在于，在实施例 5中，省却了末端补平、和末端悬 A步骤，将抽提得到的血浆 DNA直接进行与测序接头的连接，且采用单链测序接头代替实施例 1中的双链测序接头。本发明人发现，通过采用单链测序接头代替双链测序接头，能够无需进行末端补平和末端悬 A步骤，同样可获得符合高通量测序要求的血浆 DNA文库。以下示出利用根据本发明实施例 5的方法进行血浆 DNA样品测序的具体例 1-5。步骤 1 : 抽提血浆 DNA约 5 ng。步骤 2: 分别制备如表 14所示的反应混合液，在 20°C温浴 60分钟，从而为 DNA 片段连接接头；在 Qiagen柱上纯化回收 DNA样品，并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。可替换地， T4 DNA连接酶和 T4 RNA酶可具有不同于各具体实例的比例关系。表 14

试剂具体例 1 具体例 2 具体例 3 具体例 4 具体例 5 血浆 DNA溶液 42 μΐ 39 μΐ 37 μΐ 37 μΐ 42 μΐ 快速连接反应缓冲液（10X) 5 μΐ 5 μΐ 5 μΐ 5 μΐ 5 μΐ

5 μΜ单链 DNA接头 2 μΐ 2 μΐ 2 μΐ 2 μΐ 2 μΐ

T4 DNA连接酶（ ΕΒ) 0 μΐ 2 μΐ 4 μΐ 5 μΐ 1 μΐ

T4 RNA连接酶（ ΕΒ) 1 μΐ 2 μΐ 2 μΐ 1 μΐ 0 μΐ 总体积 50 μΐ 50 μΐ 50 μΐ 50 μΐ 50 μΐ 步骤 3 : 制备如表 15所示的 PCR反应混合液，通过 PCR富集接头修饰的 DNA 片段；在 Qiagen柱上提取 DNA样品并在 25 μΐ的无菌 dH₂0或洗脱缓冲液中洗脱。 DNA 23 μΐ

Phusion DNA聚合酶（Phusion DNA聚合酶混合物） 25 μΐ

PCR引物混合物 2 μ1

超纯水 Ομΐ

总体积 5 由于采用单链测序接头，将 PCR反应方案调整为： 72°C 5分钟→98°C 30 秒→4 个如下的循环： 98°C 10秒， 30°C 30秒， 72°C 30秒→(1. 98°C 30秒→6. 16个如下的循环： 98°C 10秒， 65 °C 30秒， 72°C 30秒一f. 72°C 5分钟→g. 保持在 4°C。步骤 4: 文库定量及混合：取 Ι μί文库 Qubit定量；根据通道安排，将同一通道内不同接头的样品文库等量混合；再次取 1 混合样品 Qubit定量。步骤 5 :上机测序：将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成 100 μΜ; 按照 Illmina GAIIx操作说明上机。可替换地，可以进行双端测序，也可以进行单端测序，在进行单端测序时不需要第二端测序引物。结果：经上机测序验证后表明，根据本发明实施例 5构建的血浆 DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验（如图 3b)，发现其与传统方法构建得到的 DNA文库具有类似的条带，且采用不同比例的 T4 DNA 连接酶和 T4 RNA酶均能得到类似的电泳条带。此外，本发明还提供用于根据本发明的实施例 1-5构建 DNA血浆测序文库的试剂盒。根据不同的实施例，该试剂盒可包含用于对血浆 DNA末端进行补平修复的酶；用于为 DNA的 3'端加上腺嘌吟的酶，包括 T4 DNA聚合酶、 Klenow酶、 DNA聚合酶、 Taq酶和 klenow ex- ( 3'-5'外切活性缺失）；用于接头连接的酶，包括 T4 DNA连接酶、 T4 RNA连接酶、 T7 DNA连接酶、或它们的组合；用于进行 PCR扩增所需的聚合酶，包括 Phusion DNA聚合酶等；和各种酶所需要的缓冲液；以及末端补平和 PCR 扩增所需的 dNTP、末端悬 A所需的 dATP、接头连接所需的双链测序接头或单链测序接头、 PCR扩增所需的引物等等。由于本发明发现在血浆 DNA测序文库的构建中可以不进行 5'末端磷酸化步骤，因而，本发明试剂盒的一个重要特征是，可以不包含对血浆 DNA进行 5'末端磷酸化的试剂。此外，由于本发明发现在不进行 5'末端磷酸化的情况下，通过采用 Taq酶进行末端悬 A，可以实现末端补平和末端悬 A在一个反应体系中进行，或者末端补平和末端悬、连同测序接头连接三步反应在一个反应体系中进行，因而，本发明的试剂盒可以不包含末端补平后纯化的试剂和器械和 /或不包含末端悬 A后纯化的试剂和器械，从而可降低文库构建成本，简化了文库构建流程。本发明的试剂盒在必要情况下，还包含用于纯化末端补平产物的试剂和器械；用于纯化末端悬 A产物的试剂和器械；用于纯化测序接头连接产物的试剂和器械；用于纯化 PCR产物的试剂和器械等。纯化试剂可包括无菌 dH₂0或洗脱缓冲液；纯化器械可包括纯化柱或 Qiagen柱。所使用的纯化试剂和器械不局限本文中所列出的具体的试剂和器械，本领域中常用的各种纯化试剂和器械均可根据技术人员的判断而应用于本发明中。需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。例如，上述末端悬 A步骤和连接测序接头的步骤也可以两反应一体系进行，即，可以对提取的血浆 DNA进行末端悬 A步骤，在其后无需进行纯化步骤，可直接进行连接接头的步骤。另外，虽然示出的用于连接测序接头的酶为 T4 DNA聚合酶和 /或 T4 RNA聚合酶，但还可以单独使用 T7 DNA聚合酶或其与 T4 DNA聚合酶和 /或 T4 RNA聚合酶的组合。而血浆 DNA 测序文库构建中所涉及的反应缓冲液、 PCR反应流程等当然可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。参考文献：

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Claims

权利要求书

1. 用于构建血浆 DNA测序文库的方法，其特征在于，包括：

抽提血浆 DNA;

将血浆 DNA与测序接头连接，并对连接产物进行纯化；

对纯化的连接产物进行 PCR扩增，并对 PCR扩增产物进行纯化，以获得所述血浆 DNA测序文库，

其中，所述方法不包括对血浆 DNA进行 5'末端磷酸化的步骤。

2. 根据权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述将血浆 DNA与测序接头连接，是采用选自以下中的一种或多种而进行的： T4 DNA连接酶、 T4 RNA连接酶、以及 T7 DNA连接酶。

3. 根据权利要求 1或 2所述的方法，其特征在于，所述测序接头为单链的测序接头。

4. 根据权利要求 1或 2所述的方法，其特征在于，所述测序接头为双链的测序接头。

5. 根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，在所述抽提血浆 DNA之后、但在所述将血浆 DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆 DNA进行末端悬 A 并对经末端悬 A的血浆 DNA进行纯化。

6. 根据权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述末端悬 A采用 klenow ex-酶、或 Taq酶、或 klenow ex-酶与 Taq酶的组合。

7. 根据权利要求 4所述的方法，其特征在于，在所述抽提血浆 DNA之后、但在所述将血浆 DNA与测序接头连接之前，对抽提得到的血浆 DNA进行末端补平和末端悬 A。

8. 根据权利要求 7所述的方法，其特征在于，所述末端补平和所述末端悬 A在一个反应体系中进行，并在末端补平和末端悬 A之后对血浆 DNA进行纯化。

9. 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于，所述末端补平采用 T4 DNA聚合酶；所述末端悬 A采用 Taq酶。

10. 根据权利要求 7所述的方法，其特征在于，所述末端补平和所述末端悬 A、以及所述将血浆 DNA与测序接头连接在一个反应体系中进行。

11. 根据权利要求 10所述的方法，其特征在于，所述末端补平采用 T4 DNA聚合酶；所述末端悬 A采用 Taq酶。

12. 用于构建血浆 DNA测序文库的试剂盒，其特征在于，包含：

将血浆 DNA与测序接头连接的试剂，包括测序接头、连接酶、和连接缓冲液；以及对连接产物进行纯化的试剂和器械；

对纯化的连接产物进行 PCR扩增的试剂，以及对 PCR扩增产物进行纯化的试剂和器械；

其中，所述试剂盒不包含用于对血浆 DNA进行 5'末端磷酸化的试剂。

13. 根据权利要求 12所述的试剂盒，其特征在于，所述连接酶为选自以下中的一种或多种： T4 DNA连接酶、 T4 RNA连接酶、以及 T7 DNA连接酶。

14. 根据权利要求 12或 13所述的试剂盒，其特征在于，所述测序接头为单链的测序接头。

15. 根据权利要求 12或 13所述的试剂盒，其特征在于，所述测序接头为双链的测序接头。

16. 根据权利要求 15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：

对抽提得到的血浆 DNA进行末端悬 A的试剂，包括 dATP、用于末端悬 A 的酶、末端悬 A缓冲液；以及对经末端悬 A的血浆 DNA进行纯化的试剂和器械。

17. 根据权利要求 16所述的试剂盒，其特征在于，所述用于末端悬 A的酶为 klenow ex-酶、或 Taq酶、或 klenow ex-酶与 Taq酶的组合。

18. 根据权利要求 15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：

对抽提得到的血浆 DNA分别进行末端补平和末端悬 A的试剂，包括用于末端补平的酶、 dNTP、末端补平缓冲液、 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；以及在末端补平之后、和末端悬 A之后分别对血浆 DNA进行纯化的试剂和器械。

19. 根据权利要求 15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：对抽提得到的血浆 DNA进行末端补平和末端悬 A的试剂，包括用于末端补平的酶、 dNTP、末端补平缓冲液、 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；以及在末端补平和末端悬 A之后对血浆 DNA进行纯化的试剂和器械；其中，所述末端补平和所述末端悬 A在一个反应体系中进行。

20. 根据权利要求 19所述的试剂盒，其特征在于，所述用于末端补平的酶为 T4 DNA 聚合酶；所述用于末端悬 A的酶为 Taq酶。

21. 根据权利要求 15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：

对抽提得到的血浆 DNA进行末端补平和末端悬 A的试剂，包括用于末端补平的酶、 dNTP、末端补平缓冲液、 dATP、用于末端悬 A的酶、末端悬 A缓冲液；

其中，所述末端补平和所述末端悬 A、以及所述将血浆 DNA与测序接头在一个反应体系中进行。

22. 根据权利要求 21所述的试剂盒，其特征在于，所述用于末端补平的酶为 T4 DNA 聚合酶；所述用于末端悬 A的酶为 Taq酶。