CN103298955B - 用于构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒 - Google Patents

用于构建血浆dna测序文库的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒。本发明的方法包括:抽提血浆DNA;将血浆DNA与测序接头连接,并对连接产物进行纯化;对纯化的连接产物进行PCR扩增,并对PCR扩增产物进行纯化,以获得所述血浆DNA测序文库,其中,该方法不包括对血浆DNA进行5’末端磷酸化的步骤。本发明的试剂盒包含:-将血浆DNA与测序接头连接的试剂,包括测序接头、连接酶、和连接缓冲液;以及对连接产物进行纯化的试剂和器械;-对纯化的连接产物进行PCR扩增的试剂,以及对PCR扩增产物进行纯化的试剂和器械;其中,所述试剂盒不包含用于对血浆DNA进行5’末端磷酸化的试剂。本发明简化了血浆DNA测序文库的构建流程,简化了实验步骤,使血浆样品文库构建更加低成本、高效、快速,便于大规模使用。

Description

用于构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及用于构建血浆DNA测序文库的方法和试剂盒,更具体地,本发明涉及用于构建第二代高通量测序用血浆DNA测序文库的方法和试剂盒。
背景技术
随着科技的进步,传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,对基因组测序,需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术应运而生。第二代测序技术的核心思想是边合成边测序,即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem等。以Illumina产品为例,GAII读长从2008年的36碱基发展到现在的100碱基,通量从2008年的48Mreads/run发展到现在的240Mreads/run,测序能力提高了14倍。到目前为止,HiSeq2000每个run可以达到3个人基因组30X覆盖的测序通量,约300G/run数据,上机操作时间也减少到了30分钟。而且随着第二代测序技术的成熟,将其应用于临床的研究迅猛发展。研究表明通过测序孕妇血浆DNA可以判断胎儿遗传健康状况,而测序检测者血浆DNA可以进行癌症早期筛查,并具有很强的应用前景。
血浆DNA又称循环DNA,是血液中的细胞外DNA,长约几十到几百核苷酸,可以以DNA-蛋白质复合物的形式存在,也可以是游离的DNA片段。正常情况下,血浆DNA来源于少量衰老死亡细胞的DNA释放。健康状态下,循环DNA的生成与清除处于动态平衡状态,维持在较恒定的低水平。循环DNA能反映人体内细胞新陈代谢的状况,是健康评判的一个重要指标。外周血循环DNA量和质的改变与多种疾病(包括肿瘤、复合性严重外伤、器官移植、妊娠相关疾病、感染性疾病、器官功能衰竭等)关系密切,作为一种无创性检测指标,有望成为某些疾病早期诊断、病情监测、疗效及预后评估的一种重要的分子标志物。
自从母体血液中的胚胎DNA被发现之后(3),无创伤地直接诊断和检测胚胎染色体异常性成了一个重大的研究课题。2007年,卢煜明教授和他的同事们证明可以用母体血浆mRNA中胎盘特异基因4的突变位点比例来断定胚胎是否有21号染色体3倍体(4)。突变位点比例同时也被用来判断18号染色体是否为3倍体(5)。它的局限性在于突变位点在人群中并不普遍,所以这些方法只适用于一部分人群。在同一时期,数码PCR(digitalPCR,或dPCR)被用来检测胚胎的染色体3倍体(6),(7)。数码PCR的优势是不依赖任何突变位点,但它的精确度不够高,而且需要大量血样,加大了采样的困难。
近年来迅猛发展的高通量测序技术解决了以上的问题。这些技术包括Illumina公司的GenomeAnalyzer(8),LifeTechnologies公司的SOLiD(9),以及Helicos公司的Heliscope(10),能一次性地检测出几亿乃至几十亿个序列。用这些技术来检测母体血浆DNA时,血浆中微量的胚胎DNA的染色体数目的变化能被检测出来(11),(12),(13)。但因为测序的成本太高,目前这些技术尚未被普遍使用。同时,从母体血液中检测胚胎染色体的局部拷贝数的变化还属于未解决的难题。用高通量测序来检测母体血浆中胚胎染色体的拷贝数变化有一些优势,但目前价钱昂贵,不能普及。而且测序的偏差(CV)比较高,检测的精确度和稳定性也都有待改进。测序的偏差也决定了这种方法只适合少数几个染色体,如21号染色体、18号染色体,而且目前还不适合于染色体局部拷贝数变化的检测。
测序效率的提升和多样品混合测序的普及对样品的制备效率提出了更高的要求,特别是大量临床样品制备;而现有的临床血浆样品制备方法发展,一直赶不上测序能力的提高。因此,第二代高通量测序临床血浆DNA样品的制备效率和成本,成为高通量测序能否得以普及的关键。
第二代高通量测序的血浆DNA样品的制备过程本质上是将符合测序长度的DNA插入到已有的测序载体中,即在待测序DNA两端连上已知的测序接头序列。目前血浆DNA文库的构建主要包括先将提取的血浆DNA进行末端修复及5’末端磷酸化、然后进行末端加A、连接接头、PCR等主要步骤(图1),其中,在各个步骤之间几乎都需要进行纯化步骤。这种血浆DNA测序文库的构建方法共需要6种主要的酶,4种酶反应体系,并经过4次清洁纯化,因而成本较高,操作复杂,对实验者的分子生物学的操作能力要求很高,实现多样品同时处理的难度较大。
发明内容
鉴于临床血浆DNA测序文库构建过程中所遇到的问题,本发明人发现了新的更加简化、更加快速的临床血浆DNA测序文库的构建方法,其可适用于多种第二代测序平台,包括但不限于如Roche/454FLX、Illumina/SolexaGenomeAnalyzer和AppliedBiosystemsSOLIDsystem,LifeTechnologiesIonTorrent等测序平台。
本发明是基于以下的事实:本发明人发现,血浆中的DNA末端自然地含有单磷酸基团,现有实验流程的末端补平步骤中所涉及的5’末端磷酸化并不是必需的步骤,因而无需使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)和三磷酸腺苷(ATP)。基于上述发现,本发明人还发现在无需使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)和三磷酸腺苷(ATP)的情况下,依赖于对末端悬A(末端加A,dA-overhang)中所采用的酶的选择,现有实验流程中的末端补平、末端悬A和连接测序接头三步反应实际上可以不必在三个反应体系中进行,而是可以仅在两个反应体系中或者甚至仅在单独一个反应体系中进行,中间不需要纯化步骤。更进一步地,本发明人还发现,通过采用单链测序接头代替双链测序接头,可无需进行末端补平和末端悬A步骤,而是将抽提得到的血浆DNA直接进行接头连接,并随后进行纯化、PCR扩增等步骤,同样能够获得合乎高通量测序要求的DNA文库。
基于上述发现,在一个方面,本发明提供了一种用于构建血浆DNA测序文库的方法,该方法包括以下步骤:抽提血浆DNA;将血浆DNA与测序接头连接,并对连接产物进行纯化;对纯化的连接产物进行PCR扩增,并对PCR扩增产物进行纯化,以获得所述血浆DNA测序文库。其中,本发明方法的一个重要特征在于,其不包括对血浆DNA进行5’末端磷酸化的步骤。
根据本发明的方法,优选地,所述将血浆DNA与测序接头连接,是采用选自以下中的一种或多种而进行的:T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、以及T7DNA连接酶。
根据本发明的方法,在一些实施方式中,所述测序接头为单链的测序接头;在另一些实施方式中,所述测序接头为双链的测序接头。
在测序接头为双链测序接头的情况下,在一种实施方式中,本发明的方法还包括以下步骤:在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前,对抽提得到的血浆DNA进行末端悬A并对经末端悬A的血浆DNA进行纯化。优选地,所述末端悬A采用klenowex-酶、或Taq酶、或klenowex-酶与Taq酶的组合。可替换地,末端悬A和测序接头的连接可以在一个反应体系中进行,即,在末端悬A后可无需进行纯化,而是直接进行测序接头的连接,其中末端悬A采用Taq酶。
在测序接头为双链测序接头的情况下,在另一种实施方式中,本发明的方法还包括以下步骤:在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前,对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A。其中,所述末端补平和所述末端悬A可以在两个反应体系中进行,即,在末端补平后,需经过纯化后再进行末端悬A;可替换地且为优选地,所述末端补平和所述末端悬A在一个反应体系中进行,在末端补平和末端悬A之后对血浆DNA进行纯化,其中所述末端补平采用T4DNA聚合酶,所述末端悬A采用Taq酶;或者更加优选地,所述末端补平和所述末端悬A、以及所述将血浆DNA与测序接头连接三者在一个反应体系中进行,其中所述末端补平采用T4DNA聚合酶,所述末端悬A采用Taq酶。
在另一个方面,本发明提供一种用于构建血浆DNA测序文库的试剂盒,该试剂盒包含:--将血浆DNA与测序接头连接的试剂,包括测序接头、连接酶、和连接缓冲液;以及对连接产物进行纯化的试剂和器械;--对纯化的连接产物进行PCR扩增的试剂,以及对PCR扩增产物进行纯化的试剂和器械。其中,本发明试剂盒的一个重要特征在于,其不包含用于对血浆DNA进行5’末端磷酸化的试剂。
根据本发明的试剂盒,优选地,所述连接酶为选自以下中的一种或多种:T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、以及T7DNA连接酶。
根据本发明的试剂盒,在一些实施方式中,所述测序接头为单链的测序接头;在另一些实施方式,所述测序接头为双链的测序接头。
在测序接头为双链测序接头的情况下,在一种实施方式中,本发明的试剂盒还包含:--对抽提得到的血浆DNA进行末端悬A的试剂,包括dATP、用于末端悬A的酶、末端悬A缓冲液;以及对经末端悬A的血浆DNA进行纯化的试剂和器械。优选地,所述用于末端悬A的酶为klenowex-酶、或Taq酶、或klenowex-酶与Taq酶的组合。
在测序接头为双链测序接头的情况下,在另一种实施方式中,本发明的试剂盒还包含:--对抽提得到的血浆DNA分别进行末端补平和末端悬A的试剂,包括用于末端补平的酶、dNTP、末端补平缓冲液、dATP、用于末端悬A的酶、末端悬A缓冲液;以及在末端补平之后、和末端悬A之后分别对血浆DNA进行纯化的试剂和器械。
在测序接头为双链测序接头的情况下,在另一种实施方式中,本发明的试剂盒还包含:--对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A的试剂,包括用于末端补平的酶、dNTP、末端补平缓冲液、dATP、用于末端悬A的酶、末端悬A缓冲液;以及在末端补平和末端悬A之后对血浆DNA进行纯化的试剂和器械;其中,所述末端补平和所述末端悬A在一个反应体系中进行,且所述用于末端补平的酶为T4DNA聚合酶,所述用于末端悬A的酶为Taq酶。
在测序接头为双链测序接头的情况下,在又一种实施方式中,本发明的试剂盒还包含:--对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A的试剂,包括用于末端补平的酶、dNTP、末端补平缓冲液、dATP、用于末端悬A的酶、末端悬A缓冲液;其中,所述末端补平和所述末端悬A、以及所述将血浆DNA与测序接头在一个反应体系中进行,且所述用于末端补平的酶为T4DNA聚合酶,所述用于末端悬A的酶为Taq酶。
本发明基于血浆DNA末端自然含有单磷酸基团这一出乎意料的发现,在现有血浆DNA测序文库的构建方法中省却了原本必需的5’末端磷酸化步骤,不再使用T4多聚核苷酸激酶和三磷酸腺苷;并且,在此基础上,本发明通过利用普通的Taq聚合酶代替klenowex-酶进行末端悬A步骤,使得多种反应的缓冲液可兼容,由此能够在两个或仅一个反应体系中进行末端补平、末端悬A、连接接头的步骤;另外,本发明通过采用单链测序接头代替双链测序接头,使得可以省却现有技术中末端补平和末端悬A步骤而直接进行接头连接。因此,本发明大大简化了血浆DNA测序文库的构建流程,简化了实验步骤,使血浆样品文库构建更加低成本、高效、快速,便于大规模使用。
附图说明
图1示出了现有技术中普遍采用的第二代高通量血浆DNA测序文库的构建方法。
图2示出了根据本发明的一种实施方式的第二代高通量血浆DNA测序文库的构建方法。
图3a、图3b示出了通过本发明的方法所构建的血浆DNA测序文库的电泳结果。图3a为根据实施例1-4所构建的血浆DNA测序文库的电泳结果,其中,泳道1为用作对照的根据现有方法构建的血浆DNA测序文库;泳道2-5分别为根据实施例1-4构建的血浆DNA测序文库。图3b为根据实施例5所构建的血浆DNA测序文库的电泳结果,其中泳道1-5分别为根据具体例1-5构建的血浆测序文库。
具体实施方式
如前文所述,目前适用于第二代高通量测序平台的血浆DNA文库的构建,主要包括以下步骤(请参见附图1):提取血浆DNA(步骤101)→对提取的血浆DNA进行末端修复(补平)、5’末端磷酸化、并纯化(步骤102)→对5’磷酸化平末端DNA片断进行3’末端加A、并纯化(步骤103)→使3’末端加A的DNA与测序接头连接(步骤104)→对连接产物进行纯化,以去除未连接的接头(步骤105)→对纯化后的产物进行聚合酶链反应(PCR)(步骤106)→对PCR产物进行纯化,以获得血浆DNA测序文库(步骤107)。其中,在各个步骤之间几乎都需要进行纯化步骤。因此,在第二代血浆DNA测序文库的构建方法中共需要6种主要的酶,4种酶反应体系,并经过4次清洁纯化,因而成本较高,操作复杂,对实验者分子生物学的操作能力要求很高,实现多样品同时处理的难度较大。
本发明人经过反复的实验,出乎意料地发现,血浆中的DNA末端自然地含有单磷酸基团,现有实验流程中的末端补平步骤中所涉及的5’末端磷酸化并不是必需的步骤,因而在血浆DNA测序文库的构建中无需使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)和三磷酸腺苷(ATP),因此,本发明构建血浆DNA测序文库的一个重要特点是不包括5’末端磷酸化的步骤。
在此基础上,本发明人还发现,在不使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)和三磷酸腺苷(ATP)的情况下,依赖于对末端悬A中所采用的酶的选择,现有实验流程中的末端补平、末端悬A和连接测序接头三步反应实际上可以不必分别在三个反应体系中进行,而是可以仅在两个反应体系中或者甚至仅在单独一个反应体系中进行,中间不需要纯化步骤。
此外,本发明人还发现,通过采用单链测序接头代替双链测序接头,可无需进行末端补平和末端悬A步骤,而是将抽提得到的血浆DNA直接进行接头连接,并随后进行纯化、PCR扩增等步骤,同样能够获得合乎高通量测序要求的DNA文库。
图2示出了根据本发明的一种实施方式的第二代高通量血浆DNA测序文库的构建方法,其主要包括以下步骤:提取血浆DNA(步骤201)→使DNA与测序接头连接(步骤204)→对连接产物进行纯化,以去除未连接的接头(步骤205)→对纯化后的产物进行聚合酶链反应(PCR)(步骤206)→对PCR产物进行纯化,以获得血浆DNA测序文库(步骤207)。根据本发明的另一种实施方式,还可以在步骤201与步骤204之间包括:步骤202--对提取的血浆DNA进行末端修复、5’末端磷酸化,和步骤203--对5’磷酸化平末端DNA片断进行3’末端加A(图中未示出),且步骤202、步骤203可在同一反应体系中进行;或者步骤202、步骤203、以及步骤204可在同一反应体系中进行。
与现有技术中用于构建血浆DNA测序文库的方法相比,本发明的方法显著地简化了血浆DNA测序文库的构建流程,精简了实验步骤,使得血浆样品文库的构建更加低成本、高效、快速,便于大规模使用。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是,本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的,并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例:根据本发明适用于第二代高通量测序的血浆DNA测序文库的构建方法
实施例1
实施例1的血浆DNA测序文库的构建方法主要包括以下步骤:
(1)抽提血浆DNA:可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于抽提血浆DNA的方法、和试剂进行此步骤。
(2)末端补平,之后对产物进行清洁纯化:可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端补平以及随后清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如,可利用T4DNA聚合酶、Klenow酶作为用于末端补平的酶。
(3)末端悬A,之后对产物进行清洁纯化:可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于末端悬A以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如,可以使上步产物在klenowex-(NewEnglandBiolabs)(是一种改进的Klenow酶,其3’-5’外切活性缺失)的作用下将双链末端悬出A碱基。
(4)与测序接头连接,之后对产物进行清洁纯化:可利用本领域技术人员所熟知的任何适用于连接接头以及随后对产物进行清洁纯化的方法和试剂进行此步骤。例如,可在T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、T7DNA连接酶或其中两种或更多种的组合的作用下,使末端悬A产物与双链测序接头连接。其中,测序接头可商购或自行合成而获得。
(5)将上步清洁产物进行聚合酶链反应扩增,之后对产物进行清洁纯化:PCR反应已是本领域非常成熟的技术,对于PCR反应的引物和聚合酶的选择,以及PCR反应循环的设计,也在本领域技术人员的能力范围之内。
此外,在高通量测序之前,还需要对上述文库进行以下操作:
(6)利用定量工具如nanodrop(nanodrop科技有限公司)、Bioanalyser2100(agilent)、Qubit(lifetechnologies)或qPCR,对测序文库进行定量;
(7)根据上机通道的安排及标签序列的不同将样品等量混合;
(8)样品上机。
以下示出利用根据本发明实施例1的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1:抽提血浆DNA约5ng。
步骤2:制备如表1所示的末端补平反应混合液,在20°C温浴30分钟;在纯化柱上纯化DNA样品,并在42μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。其中,本文中所使用的洗脱缓冲液为10mMTris-Cl,pH8.0,但适用于本发明的洗脱缓冲液并不局限于此。
表1
步骤3:制备如表2所示的用于在3’末端加多聚腺嘌呤尾的反应混合液,在37°C温浴30分钟;在纯化柱上纯化DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表2
步骤4:制备如表3所示的DNA片段连接测序接头的反应混合液,在20°C温浴15分钟;在Qiagen柱上纯化回收DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表3
步骤5:制备如表4所示的PCR反应混合液,通过PCR富集接头修饰的DNA片段;在Qiagen柱上提取DNA样品并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表4
PCR反应方案为:a.98℃30秒→b.18个如下的循环:98℃10秒,65℃30秒,72℃30秒→c.72℃5分钟→d.保持在4℃。
步骤6:文库定量及混合:取1μL文库Qubit定量;根据通道安排,将同一通道内不同接头的样品文库等量混合;再次取1μL混合样品Qubit定量。
步骤7:上机测序:将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM;按照IllminaGAIIx操作说明上机。可替换地,可以进行双端测序,也可以进行单端测序,在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果:经上机测序验证后表明,根据本发明实施例1构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验,发现其与传统方法构建得到的DNA文库具有类似的条带(参见附图3a,泳道2)。
实施例2
实施例2的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1,不同之处在于,实施例2省却了末端补平的步骤,将抽提得到的血浆DNA直接进行末端悬A、并纯化。
以下示出利用根据本发明实施例2的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1:抽提血浆DNA约5ng。
步骤2:制备如表5所示的反应混合液,在37°C温浴30分钟,以在DNA片段的3’末端加多聚腺嘌呤尾;在柱上纯化DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表5
步骤3:制备如表6所示的反应混合液,在20°C温浴15分钟,为DNA片段连接双链接头;在Qiagen柱上纯化回收DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表6
步骤4:制备如表7所示的PCR反应混合液,通过PCR富集接头修饰的DNA片段;在Qiagen柱上提取DNA样品并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表7
PCR反应方案为:a.98℃30秒→b.18个如下的循环:98℃10秒,65℃30秒,72℃30秒→c.72℃5分钟→d.保持在4℃。
步骤5:文库定量及混合:取1μL文库Qubit定量;根据通道安排,将同一通道内不同接头的样品文库等量混合;再次取1μL混合样品Qubit定量。
步骤6:上机测序:将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM;按照IllminaGAIIx操作说明上机。可替换地,可以进行双端测序,也可以进行单端测序,在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果:经上机测序验证后表明,根据本发明实施例2构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验,发现其与传统方法构建得到的DNA文库具有类似的条带(参见附图3a,泳道3)。
实施例3
实施例3的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1,不同之处在于,在实施例3中,末端补平和末端悬A在一个反应体系中进行,末端补平和末端悬A之间不进行清洁纯化步骤,其中末端悬A采用普通Taq酶代替常用的klenowex-酶,以使两种反应的缓冲体系得以兼容。
以下示出利用根据本发明实施例3的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1:抽提血浆DNA约5ng。
步骤2:制备如表8所示的反应混合液,在37°C温浴20分钟(末端补平),并在72°C温浴20分钟(末端悬A),从而在一个反应体系中进行末端补平和末端悬A;在纯化柱上纯化DNA样品,并在42μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。根据适用于不同设计需要的不同的反应混合液的组成,末端补平和末端悬A的温度和时间可以有所不同。
表8
步骤3:制备如表9所示的反应混合液,在20°C温浴15分钟,为DNA片段连接接头;在Qiagen柱上纯化回收DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表9
步骤4:制备如表10所示的PCR反应混合液,通过PCR富集接头修饰的DNA片段,在Qiagen柱上提取DNA样品并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表10
PCR反应方案为:a.98℃30秒→b.18个如下的循环:98℃10秒,65℃30秒,72℃30秒→c.72℃5分钟→d.保持在4℃。
步骤5:文库定量及混合:取1μL文库Qubit定量;根据通道安排,将同一通道内不同接头的样品文库等量混合;再次取1μL混合样品Qubit定量。
步骤6:上机测序:将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM;按照IllminaGAIIx操作说明上机。可替换地,可以进行双端测序,也可以进行单端测序,在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果:经上机测序验证后表明,根据本发明实施例3构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验,发现其与传统方法构建得到的DNA文库具有类似的条带(参见附图3a,泳道4)。
实施例4
实施例4的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1,不同之处在于,在实施例4中,末端补平、和末端悬A、以及测序接头的连接,三者在一个反应体系中进行,末端补平和末端悬A之间、以及末端悬A和测序接头连接之间不进行清洁纯化步骤,其中末端悬A采用普通Taq酶代替常用的klenowex-酶,以使三种反应的缓冲体系得以兼容。
以下示出利用根据本发明实施例4的方法进行血浆DNA样品测序的一个具体实例。
步骤1:抽提血浆DNA约5ng。
步骤2:制备如表11所示的反应混合液,在37°C温浴20分钟(末端补平),72°C温浴20分钟(末端悬A),以完成末端补平和末端悬A,此时不进行纯化步骤。
表11
步骤3:向上步反应溶液中加入另外的反应试剂,制备如表12所示的反应混合液,在20°C温浴15分钟,以为DNA片段连接双链测序接头;在Qiagen柱上纯化回收DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表12
步骤4:制备表13所示的PCR反应混合液,通过PCR富集接头修饰的DNA片段;在Qiagen柱上提取DNA样品并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表13
PCR反应方案为:a.98℃30秒→b.18个如下的循环:98℃10秒,65℃30秒,72℃30秒→c.72℃5分钟→d.保持在4℃。
步骤5:文库定量及混合:取1μL文库Qubit定量;根据通道安排,将同一通道内不同接头的样品文库等量混合;再次取1μL混合样品Qubit定量。
步骤6:上机测序:将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM;按照IllminaGAIIx操作说明上机。可替换地,可以进行双端测序,也可以进行单端测序,在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果:经上机测序验证后表明,根据本发明实施例3构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验,发现其与传统方法构建得到的DNA文库具有类似的条带(参见附图3a,泳道5)。
实施例5
实施例5的血浆DNA测序文库的构建方法基本上类似于实施例1,不同之处在于,在实施例5中,省却了末端补平、和末端悬A步骤,将抽提得到的血浆DNA直接进行与测序接头的连接,且采用单链测序接头代替实施例1中的双链测序接头。本发明人发现,通过采用单链测序接头代替双链测序接头,能够无需进行末端补平和末端悬A步骤,同样可获得符合高通量测序要求的血浆DNA文库。
以下示出利用根据本发明实施例5的方法进行血浆DNA样品测序的具体例1-5。
步骤1:抽提血浆DNA约5ng。
步骤2:分别制备如表14所示的反应混合液,在20°C温浴60分钟,从而为DNA片段连接接头;在Qiagen柱上纯化回收DNA样品,并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。可替换地,T4DNA连接酶和T4RNA酶可具有不同于各具体实例的比例关系。
表14
步骤3:制备如表15所示的PCR反应混合液,通过PCR富集接头修饰的DNA片段;在Qiagen柱上提取DNA样品并在25μl的无菌dH2O或洗脱缓冲液中洗脱。
表15
由于采用单链测序接头,将PCR反应方案调整为:72℃5分钟→98℃30秒→4个如下的循环:98℃10秒,30℃30秒,72℃30秒→d.98℃30秒→e.16个如下的循环:98℃10秒,65℃30秒,72℃30秒→f.72℃5分钟→g.保持在4℃。
步骤4:文库定量及混合:取1μL文库Qubit定量;根据通道安排,将同一通道内不同接头的样品文库等量混合;再次取1μL混合样品Qubit定量。
步骤5:上机测序:将第一端测序引物、标签引物、第二端测序引物稀释成100μM;按照IllminaGAIIx操作说明上机。可替换地,可以进行双端测序,也可以进行单端测序,在进行单端测序时不需要第二端测序引物。
结果:经上机测序验证后表明,根据本发明实施例5构建的血浆DNA测序文库符合第二代高通量测序的设计要求。对构建得到的测序文库进行电泳实验(如图3b),发现其与传统方法构建得到的DNA文库具有类似的条带,且采用不同比例的T4DNA连接酶和T4RNA酶均能得到类似的电泳条带。
此外,本发明还提供用于根据本发明的实施例1-5构建DNA血浆测序文库的试剂盒。根据不同的实施例,该试剂盒可包含用于对血浆DNA末端进行补平修复的酶;用于为DNA的3’端加上腺嘌呤的酶,包括T4DNA聚合酶、Klenow酶、DNA聚合酶、Taq酶和klenowex-(3’-5’外切活性缺失);用于接头连接的酶,包括T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、T7DNA连接酶、或它们的组合;用于进行PCR扩增所需的聚合酶,包括PhusionDNA聚合酶等;和各种酶所需要的缓冲液;以及末端补平和PCR扩增所需的dNTP、末端悬A所需的dATP、接头连接所需的双链测序接头或单链测序接头、PCR扩增所需的引物等等。
由于本发明发现在血浆DNA测序文库的构建中可以不进行5’末端磷酸化步骤,因而,本发明试剂盒的一个重要特征是,可以不包含对血浆DNA进行5’末端磷酸化的试剂。
此外,由于本发明发现在不进行5’末端磷酸化的情况下,通过采用Taq酶进行末端悬A,可以实现末端补平和末端悬A在一个反应体系中进行,或者末端补平和末端悬A、连同测序接头连接三步反应在一个反应体系中进行,因而,本发明的试剂盒可以不包含末端补平后纯化的试剂和器械和/或不包含末端悬A后纯化的试剂和器械,从而可降低文库构建成本,简化了文库构建流程。
本发明的试剂盒在必要情况下,还包含用于纯化末端补平产物的试剂和器械;用于纯化末端悬A产物的试剂和器械;用于纯化测序接头连接产物的试剂和器械;用于纯化PCR产物的试剂和器械等。纯化试剂可包括无菌dH2O或洗脱缓冲液;纯化器械可包括纯化柱或Qiagen柱。所使用的纯化试剂和器械不局限本文中所列出的具体的试剂和器械,本领域中常用的各种纯化试剂和器械均可根据技术人员的判断而应用于本发明中。
需要说明的是,以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。例如,上述末端悬A步骤和连接测序接头的步骤也可以两反应一体系进行,即,可以对提取的血浆DNA进行末端悬A步骤,在其后无需进行纯化步骤,可直接进行连接接头的步骤。另外,虽然示出的用于连接测序接头的酶为T4DNA聚合酶和/或T4RNA聚合酶,但还可以单独使用T7DNA聚合酶或其与T4DNA聚合酶和/或T4RNA聚合酶的组合。而血浆DNA测序文库构建中所涉及的反应缓冲液、PCR反应流程等当然可以根据具体的需要进行相应的调整和改变。本领域技术人员理解的是,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (11)

1.用于构建血浆DNA测序文库的方法,其特征在于,包括:
抽提血浆DNA;
将血浆DNA与测序接头连接,并对连接产物进行纯化;
对纯化的连接产物进行PCR扩增,并对PCR扩增产物进行纯化,以获得所述血浆DNA测序文库,
其中,所述方法不包括对血浆DNA进行5’末端磷酸化的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述将血浆DNA与测序接头连接,是采用选自以下中的一种或多种而进行的:T4DNA连接酶、T4RNA连接酶、以及T7DNA连接酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述测序接头为单链的测序接头。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述测序接头为双链的测序接头。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前,对抽提得到的血浆DNA进行末端悬A并对经末端悬A的血浆DNA进行纯化。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述末端悬A采用klenowex-酶、或Taq酶、或klenowex-酶与Taq酶的组合。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在所述抽提血浆DNA之后、但在所述将血浆DNA与测序接头连接之前,对抽提得到的血浆DNA进行末端补平和末端悬A。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述末端补平和所述末端悬A在一个反应体系中进行,并在末端补平和末端悬A之后对血浆DNA进行纯化。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述末端补平采用T4DNA聚合酶;所述末端悬A采用Taq酶。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述末端补平和所述末端悬A、以及所述将血浆DNA与测序接头连接在一个反应体系中进行。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,所述末端补平采用T4DNA聚合酶;所述末端悬A采用Taq酶。
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