CN109750031A - 可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可利用高通量测序技术检测真核生物poly(A)RNA转录起始位点的文库构建方法。该方法用于真核生物中同时含有poly(A)尾、又具有帽子结构的RNA，具体包括：纯化获得poly(A)RNA、去磷酸化、去除帽结构、连接RNA接头、反转录、PCR扩增、酶切、连接双链DNA接头、PCR富集转录起始位点文库、文库的纯化和分析等步骤。本申请具有脱帽效率高、可高效构建转录起始位点文库、便于准确定位转录起始位点、测序方法简便易行，有助于提高转录起始位点分析结果的准确性等优点，该技术稍加改进即可用于所有具有帽子结构的RNA转录起始位点的研究。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可利用高通量测序技术检测真核生物poly(A) RNA转录起始位点的文库构建方法。
背景技术
帽子结构是指真核生物mRNA及一些非编码RNA经转录后修饰在5' 端形成的一个特殊结构，即N7-甲基化的鸟苷与RNA的第一核苷酸通过反向5'-5'三磷酸键连接形成的m7GPPPN结构，又称为甲基鸟苷帽子。所有真核生物mRNA均有一个帽结构，帽结构对mRNA成熟具有重要作用，可作为特定的标识物来招募mRNA前体剪切、合成poly(A)尾以及进行细胞核转运所需的蛋白因子。帽结构还具有重要的生物学意义，mRNA 是蛋白质合成的模板，帽结构是mRNA翻译起始的必要结构，是核糖体识别mRNA的信号，同时还可以增加mRNA的稳定性，保护mRNA免遭5'→3'核酸外切酶的降解。有文献报道无帽结构的mRNA没有模板作用，去掉帽子之后的mRNA便失去模板活性。蛋白合成细胞体系研究表明帽子的存在能增强mRNA的编码能力，有帽子的mRNA与核糖体结合得快，结合的核糖体也多。正是核糖体准确无误地辨认mRNA 5'端的帽子，才得以使mRNA与核糖体结合并从5'端起始向3'端移动合成多肽。因此，研究具有帽结构的mRNA比仅仅研究具poly(A) 尾巴的mRNA更具有生物学意义。
已有研究表明，帽结构后的第一个碱基即是转录起始位点（Transcriptionstarting site，TSS），因此确定转录起始位点的技术方法均与帽结构有关，而转录起始位点研究又有助于确定位于基因上游的启动子序列。核心启动子（core promoter）区域指TSS上游的35个碱基到启动子下游的35个碱基之间的序列（Stamatoyannopoulos JA,Illuminating eukaryotic transcription start sites. 2010, Nature Methods 7:501-503），该区域是基因转录的主要调控区，因此对TSS进行研究不仅有助于研究基因的启动子而且有助于转录水平调控机理的研究。
真核生物中酵母、人、鼠的转录起始位点研究较为详细，而其它物种的转录起始位点尚缺乏研究。已有研究方法中，转录起始位点可通过5'RACE 技术进行研究，然而这种方法每次只能确定一个基因的转录起始位点，费时费力。因此，早期主要是通过构建全长cDNA文库研究TSS，概括而言可通过三种技术进行：
1）帽捕获技术（Cap-trapper）：首先RNA经反转录，形成RNA/DNA复合物，帽子结构经化学处理后与生物素结合，再用RNase I 处理，反转录未进行到帽结构的RNA则被剪切，而反转录到帽结构的RNA/DNA复合物可免受RNase I的降解，被结合有链霉亲和素的磁珠纯化，然后再用RNA酶将RNA降解，剩下的cDNA用于构建全长 cDNA 文库；
2）脱帽-RNA接头法：先用碱性磷酸酶处理mRNA，不具帽结构、5'端有一个磷酸基团的RNA会发生脱磷酸，而具帽结构的RNA则不受影响，再用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）除帽，具帽结构的RNA 5'端此时含有一个磷酸基团，因此可以与RNA接头连接，经反转录后即可得到全长cDNA；
3）反转录酶的模板转换（template-switching）：反转录酶合成cDNA到帽结构时会添加额外的胞嘧啶碱基CCC，此时遇到3'端为GGG的核酸片段时即会以核酸片段为模板合成互补序列，进而构建全长文库。
基于上述技术，将Serial analysis gene expression （SAGE）改进后的CapAnalysis of Gene Expression（CAGE）技术被用于构建TSS短片段文库，用于研究启动子或帽结构RNA的表达（Shiraki T等，Cap analysis gene expression for high-throughputanalysis of transcriptional starting point and identification of promoterusage. PNAS, 2003, 100 (26): 15776-15781; Kodzius R等，CAGE: cap analysis ofgene expression. 2006, Nat. Methods, 3:211-222）；Zhang Z和Dietrich F. S使用SAGE技术对酿酒酵母的mRNA的转录起始位点进行了研究(Mapping of transcriptionstart sites in Saccharomyces cerevisiae using 5′ SAGE. 2005, Nucleic AcidsResearch, 33: 2838-2851)；Carninci P等使用CAGE技术研究了哺乳动物人和鼠启动子的结构和进化（Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture andevolution. 2006, Nat. Genet, 38: 626-635)。
近年来，随着新技术应用和改进，针对转录起始位点测定也进行了较多研究工作，部分典型研究工作介绍如下：
高通量测序技术在转录起始位点研究中得到了应用，例如：Gu W等采用CalfIntestinal Phosphatase (CIP)-TAP处理线虫的总RNA，然后在RNA 5’端连接RNA接头，再用接头-随机引物进行反转录，最终用Illumina 公司的文库扩增引物进行扩增、测序，揭示了具帽结构的小RNA是piRNA的前体(CapSeq and CIP-TAP identify Pol II start sitesand reveal capped small RNAs as C. elegans piRNA precursors. 2012, Cell, 151(7):1488-500)。
将cDNA全长文库构建和CAGE技术结合改进成能用于高通量测序的TSS短片段序列文库，如基于Cap-Trapper 的CAGE和高通量测序技术结合的deepCAGE (Valen E等，Genomewide detection and analysis of hippocampus core promoters using DeepCAGE.2009, Genome Research, 19(2): 255-265；Kurosawa J等，Deep cap analysis of geneexpression. 2011, Methods in Molecular Biology, 687: 147-163）。
Ni. T 等发表了PEAT（paired-end analysis of TSSs )技术，该技术的特点是在连接mRNA 5'端的RNA接头和反转录随机引物上添加了MmeI的识别位点（Ni. T 等，Apaired-end sequencing strategy to map the complex landscape of transcriptioninitiation. 2010, Nature Methods, 7: 521-527）。具体而言：脱帽mRNA经接头连接、反转录后，再经5个循环PCR和桥式连接成环状DNA，再经滚环扩增（rolling circleamplification）和MmeI 酶切，得到一对标签，一个对应转录起始位点，一个源于基因内部序列，再经连接Illumina 测序接头，即获得PEAT文库。
Plessy C等使用了nanoCAGE和CAGEscan方法(Linking promoters tofunctional transcripts in small samples with nanoCAGE and CAGEscan, 2010,Nature Methods, 7(7):528-537)。具体而言：nanoCAGE利用了反转录进行到RNA 5' 帽子时模板转换的特性，在1st strand cDNA的3'端添加了一段外源片段，该片段靠近帽结构的地方有一个EcoP15I 的识别位点，因此利用EcoP15I的酶切特性在酶切后连接一个双链DNA接头，再经桥式PCR扩增，即可利用高通量测序技术进行测序。CAGEscan是对nanoCAGE的改进，最终文库既包括RNA的5' TSS短序列，又有一个下游随机位点，经两端测序可对基因的TSS位点进行定位。
总体上，上述测定技术在人、鼠、线虫和酵母的TSS研究中发挥了重要作用，但是，每种技术均有其不足。例如：基于Cap-Trapper的方法RNA需求量大，且操作步骤繁琐；Template Switching技术的缺点是DNA-RNA 复合物也会发生template switching，因此，并非所有检测到的序列都是真正的TSS位点。因此，开发新的TSS位点检测技术、检测方法仍然具有十分重要的技术意义。
发明内容
本申请目的在于提供一种能够利用高通量测序技术来检测真核生物转录起始位点的文库构建方法，该方法主要适用于同时含有poly(A)尾、又具有帽子结构的完整RNA，从而在转录组水平为基因转录起始位点的定位分析奠定一定技术基础。
本申请所采用的技术方案详述如下。
一种可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，该方法主要用于真核生物中同时含有poly(A)尾、又具有帽子结构的完整 RNA；所述真核生物具体例如为水稻；具体包括如下步骤：
（1）纯化
提取真核生物总RNA后，纯化获得具poly(A)的 RNA；
所述poly(A) RNA不仅包括mRNA，也包括一些具有重要调控功能、有poly (A)尾的非编码RNA；这些poly(A) RNA的 5'端，有的有帽结构，是完整的RNA，有的无帽结构；无帽结构的RNA中，有的5'端有单磷酸基团，有的无单磷酸基团；
需要强调的是，该技术使用的RNA应是不存在降解问题的高质量总RNA，具体操作时可采取商品化的TRIzol® Reagent进行提取操作；
在纯化获得具有poly(A)的 RNA过程中，可采用Poly(A)Purist™ MAG Kit或其它Poly(A)纯化试剂盒进行操作；
（2）去磷酸化
用碱性磷酸酶（CIAP酶）将步骤（1）中纯化后5'端有磷酸基团的RNA去磷酸化；去磷酸化过程中，含有5'单磷酸基团的RNA由于CIAP的脱磷酸化变为不含5'单磷酸基团的RNA从而完成去磷酸化，而具有帽子结构的完整RNA则不受影响；
（3）去除帽结构
用CCAP酶对步骤（2）的RNA进行处理，具有帽结构的RNA的帽结构被去除，使RNA 5'端的单磷酸基团暴露；此时5'端有单磷酸基团的RNA理论上均是原来具有帽结构的Poly(A)RNA；
（4）连接接头，并反转录
对步骤（3）中去除帽结构后的RNA在其5'端的单磷酸基团处连接5’RNA接头，并反转录成cDNA；
用于水稻基因转录起始位点分析时，所述5’RNA连接接头具体序列为：
5’RNA接头：5' –GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGCAGC-3'；
（5）PCR扩增
对步骤（4）中反转录的cDNA进行PCR 扩增，并进行回收、纯化；
用于水稻基因转录起始位点分析时，具体PCR扩增引物序列参考如下：
5'接头引物：5' –GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3'，
3'接头引物：5' –CGAGCACAGAATTAATACGACT-3'；
（6）酶切、连接，分离后，对起始点文库进行富集、纯化和分析
利用EcoP15I酶对步骤（5）中回收纯化的扩增产物进行酶切，对酶切产物进行双链DNA接头的连接，并对连接产物进行分离、纯化；
最后对转录起始位点文库进行PCR富集及纯化后，对转录起始位点文库进行质控检测、测序分析；
对连接产物分离时，可采用12wt%的聚丙烯酰胺凝胶对连接产物进行分离；
对转录起始位点文库进行纯化时，可采用8wt%的聚丙烯酰胺凝胶进行操作；
对转录起始位点文库进行质控检测时，可采用Agilent Bioanalyzer 检测文库质量；
测序分析时，可采用ILLUMINA 小RNA文库测序方法，可将不同转录起始位点文库混合后测序，也可与小RNA文库或其他文库混合后测序；需要注意的是，所得序列在生物信息学分析之前需将起始的6个碱基AGCAGC去除。
本申请主要技术原理为：真核生物RNA加工后5’ 端有一个甲基鸟苷帽子，采用碱性磷酸酶处理时帽子RNA不受影响，而5’ 端有单磷酸基团的RNA则会脱磷酸；进一步采用Cap-Clip™ Acid Pyrophosphatase (CCAP) 脱帽，原来有帽RNA的5’ 端则有一个单磷酸基团得以暴露，利用该特点，在5’端连接特定序列RNA接头，经反转录、PCR扩增、酶切、3’ 端连接双链DNA接头，PCR 扩增，即可构建出25-27个碱基的转录起始位点文库。利用该技术构建的转录起始位点文库可采用Illumina TruSeq小RNA文库测序方法进行高通量测序。因此该技术不仅能在转录组水平确定基因的转录起始位点，而且也有助于基因的启动子及转录水平调控机理的研究。
需要说明的是，本申请所提供的技术方案虽然主要用于研究具poly (A)尾 RNA的TSS，但若省略poly(A) RNA纯化步骤、反转录时采用随机引物-接头反转录引物进行反转录，则可用于研究所有具有帽结构RNA的TSS位点，因此也可为其他类型核酸序列分析提供较好技术借鉴和参考。
总体上，相较于现有其他转录起始位点检测技术，本发明的主要技术优势体现在如下几个方面：
（1）利用Cap-Clip™ Acid Pyrophosphatase（CCAP）进行脱帽处理，具有较好脱帽效率；
（2）将Ecop15I酶识别序列加入到5’RNA接头中，可高效构建转录起始位点文库；文库长度均一，为25-27个碱基，便于准确定位转录起始位点；
（3）测序方法简便易行；配合现有较为成熟的高通量测序技术，便于高效分析相关位点特性，例如采用小RNA文库测序方法进行测序分析时，既可以将使用不同index的转录起始位点文库混合后测序，也可与小RNA文库、其他文库混合后测序；而测序过程中即使遇到转录起始位点文库的index与小RNA文库的index相同，测序后也可以根据转录起始位点文库序列5'端特有的AGCAGC序列将两者分开。
附图说明
图1为本发明转录起始位点文库构建流程示意图；
图2为利用该技术构建的水稻幼苗叶子转录起始位点文库聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3为水稻幼苗叶子转录起始位点文库Agilent Bioanalyzer 2100分析结果图；
图4为水稻幼苗叶子转录起始位点文库测序后原始序列的长度分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
主要试剂及酶：
TRIzol® Reagent (Cat No.15596-026)、RNaseOut™ (Cat. No. 10777-019)、CalfIntestinal Alkaline Phosphatase (CIAP)（Cat No.18009027)、SuperScript™ IIReverse Transcriptase(Cat No. 18064)、Glycogen (Cat No. 10814-010)、Poly(A)Purist™ MAG Kit（Cat No. AM1922），Invitrogen公司产品；
Cap-Clip™ Acid Pyrophosphatase (CCAP）（Cat.No.C-CC15011H），CELLSCRIPTTM公司产品；
KOD Plus Neo High Fidelity & efficient & fast DNA polymerase（Code No.KOD-401），TOYOBO公司产品；
EcoP15I (Cat No. R0646S)、T4 DNA ligase (Cat No. M0202S)、T4 RNA ligase(Cat No. M0204S)，New England Biolabs公司产品；
MinElute ® PCR purification kit (Cat No. 28004)，QIAGEN司产品；
phenol/chloroform/iso-amyl alcohol（苯酚：三氯甲烷：异戊醇）=25:24:1，常规配制；
部分引物序列：
5'RNA 接头（如SEQ ID NO.1所示）：5' –GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGCAGC-3'；
反转录引物：
Oligo (dT)-接头反转录引物：5' -CGAGCACAGAATTAATACGAC(T)18V-3'，
随机引物-接头反转录引物：5' -CGAGCACAGAATTAATACGAC(N)6-3'；
PCR扩增引物（如SEQ ID NO.2~3所示）：
5'接头引物：5' –GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3'，
3'接头引物：5' –CGAGCACAGAATTAATACGACT-3'；
双链DNA接头：
上链：5'- NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG-3'，
下链：5-' CCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'；
文库扩增引物1(RP1)：5-' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'；
文库扩增引物2：TruSeq小RNA文库3'PCR primers（Index 1–24）；
除文库扩增引物1和2外，其它引物均由Invitrogen公司合成提供。
实施例
如图1所示，本申请所提供的转录起始位点文库构建过程包括：poly(A) RNA的纯化→5'端单磷酸基团的去磷酸化→去除poly(A)RNA帽结构→5'RNA接头连接→反转录→第一次PCR扩增→EcoP15I 酶切→双链DNA接头的连接→第一次聚丙烯酰胺凝胶分离纯化连接产物→转录起始位点文库富集（第二次PCR扩增）→第二次聚丙烯酰胺凝胶分离纯化转录起始位点文库→文库的质检和测序分析等过程。本实施例以日本晴水稻幼苗叶子（发芽后生长一个月）作为生物材料，就相关转录起始位点文库构建过程详细介绍如下。
（一）纯化获得具poly(A)的 RNA
首先， 参考说明书，利用TRIzol® Reagent提取水稻幼苗叶子总RNA，-80℃保存备用；
然后，参考说明书，利用Poly(A)Purist™ MAG Kit对稀释至600 μg/mL的总RNA进行纯化，从总RNA中纯化Poly(A) RNA，然后将纯化后Poly(A) RNA溶于35 μL DEPC水中。
（二）去磷酸化
用碱性磷酸酶（CIAP酶）对步骤（1）中纯化后5'端有磷酸基团的Poly(A) RNA进行处理，含有5'单磷酸基团的RNA由于CIAP的脱磷酸化变为不含5'单磷酸基团的RNA从而完成去磷酸化，而具有帽子结构的完整Poly(A) RNA则不受影响，具体操作参考如下。
（1）将步骤（一）中所得35 μL 的Poly(A) RNA与4 μL 10× DephosphorylationBuffer、1 μL CIAP混合均匀，37℃反应1小时；
（2）补充DEPC水至100μL，再加100μL 苯酚:氯仿:异戊醇，振荡混匀；
（3）14000rpm离心2分钟，将试管上层溶液转移至一个新的1.5 毫升离心管内，加100 μL氯仿:异戊醇，振荡混匀；
（4）14000rpm离心2分钟，将试管上层水相溶液约100 μL 转移至一个新的1.5 毫升离心管内；
加10μL 3 M 醋酸钠（pH 5.2），1μL 10 mg/mL glycogen，220 μL 体积分数95% 酒精并混匀；
将试管于-80℃静置30分钟后于4℃、14000rpm离心30分钟，丢弃上清液；
（5）加入500 μL 体积分数70%酒精洗涤沉淀，震荡混匀，于4℃、14000rpm离心10分钟，将上清液小心丢弃，将试管于室温干燥1~2分钟，用20 μL DEPC 水溶解RNA 沉淀。
（三）去除帽结构（脱帽处理）
用CCAP酶（Cap-Clip 酶）去除步骤（二）中具有帽子结构的poly(A) RNA的帽子，其 5'端变为单磷酸基团；具体操作过程参考如下：
（1）在步骤（二）中去磷酸化处理后的20 μL poly(A) RNA中，加入5 μL 10×Cap-Clip™ Acid Pyrophosphatase Reaction Buffer，3 μL Cap-Clip™Acid Pyrophosphatase，补充DEPC水至50μL，混合均匀，37℃反应2小时；
（2）补充DEPC水至100μL，加苯酚:氯仿:异戊醇去除Cap-Clip™ AcidPyrophosphatase（去除过程参考步骤（二）中（2）-（5）相关操作），并纯化沉淀去帽后的poly(A) RNA，最终溶于12 μL DEPC水中。
（四）连接接头，并反转录
对步骤（3）中去除帽结构后的poly(A) RNA 连接5' RNA接头（脱帽后poly(A) RNA与一个3'端具EcoP15I识别位点的RNA接头（序列如前述“5'RNA 接头”所示）相连），并反转录成cDNA；具体操作介绍如下。
（1）接头连接
在步骤（三）所得12 μL poly(A) RNA中加入1 μL 5' RNA 接头 (100 μM），混合均匀，65℃水浴5分钟后，迅速置于冰上2分钟，低速离心收集液体；
在冰上配置20 μL反应体系，然后37℃连接1小时；20 μL反应体系具体设计如下：
RNA+RNA adaptor，13 μL；
10×T4 RNA Ligase Buffer，2 μL；
10 mM ATP，2 μL；
RNaseOut™ (40 U/μL)，1 μL；
T4 RNA ligase (5 U/μL)，2 μL；
连接反应结束后，加80μL DEPC水，加100μL 苯酚:氯仿:异戊醇，振荡混匀，14000rpm离心2分钟，将试管上层溶液（水相）约100 μL 转移至一个新的1.5 毫升离心管内沉淀RNA（具体操作参考前述步骤（二）中（2）-（5）相关操作）；最终用20 μL DEPC 水溶解连接接头后的poly(A)RNA。
（2）反转录
在上述连接过5'RNA 接头的试管中加入2 μL dNTPs (10 mM) 和2 μL oligo（dT）-接头反转录引物（或随机引物-接头反转录引物），65℃水浴5 分钟，然后置于冰上2分钟并低速离心；
加入8μL 5× First Strand Buffer，4 μL 0.1 M DTT，1μL RNaseOut™ (40 U/μL)，混匀，低速离心，42℃保温2分钟（若使用随机引物-接头引物反转录时，于室温放置10分钟）；
再加入3 μL SuperScript™ II RTase (200 U/μL)，混匀，低速离心，42℃保温60分钟，然后于70℃、15分钟终止反转录。
（五）PCR扩增
利用KOD Plus Neo High Fidelity & efficient & fast DNA polymerase对步骤（四）中反转录的cDNA进行PCR 扩增，并进行回收、纯化。
PCR扩增过程中，100μL体系设计如下：
cDNA，40 μL；
10×Buffer，10 μL；
25 mM MgSO4，6μL；
2 mM dNTPs，10μL；
5'接头引物（10 μM），3μL；
3'接头引物（10 μM），3μL；
KOD-Plus (1.0U/μL)，2μL；
DMSO，2μL；
H2O，24μL；
将100μL体系分装到两个PCR管中，每管50μL；PCR扩增条件：94℃，2.5分钟；98℃，20秒，58℃，45秒，68℃，5分钟；7个循环。
参考说明书，按照MinElute PCR Purification Kit （QIAGEN）的纯化程序，对PCR扩增产物进行回收、纯化，最后用水洗脱两次，每次10 μL，合并洗脱液备用。
（六）酶切、连接，分离连接产物后，对起始位点文库进行富集、纯化和分析
利用EcoP15I酶对步骤（五）中回收纯化的扩增产物进行酶切，对酶切产物进行双链DNA接头的连接和纯化；最后对转录起始位点文库进行富集及纯化后，对转录起始位点文库进行质控检测、测序分析。具体过程介绍如下。
（1）EcoP15I 酶切、双链DNA接头的连接
酶切过程中，采用 New England Biolabs 的EcoP15I对步骤（五）中扩增、纯化后PCR产物37℃酶切反应1小时，然后65℃处理20分钟、室温冷却；酶切过程中，30μL酶切体系设计如下：
纯化PCR 产物，20 μL；
10× NEB buffer 3.1，3 μL；
10 mM ATP，3 μL；
EcoP15I（10 U/ μL），2 μL；
H2O，2 μL。
双链 DNA 接头连接过程中，首先将双链DNA接头的上链与下链（均为100μM）各10μL混合均匀后，100℃保温处理5 min，然后室温冷却得到双链DNA接头；然后配制连接体系于室温条件下连接1小时；60μL连接体系设计如下：
EcoP15I酶切反应，30 μL；
10× Ligase Buffer，6 μL；
双链 DNA 接头，3 μL；
T4 DNA Ligase，3 μL；
H2O，18 μL。
（2）分离连接产物
采用12wt%的聚丙烯酰胺凝胶对连接产物进行分离，具体操作参考如下：
在连接反应液中加入12 μL 6 × DNA 上样缓冲液，混匀，加入2-3个加样孔中；同时在连接样品两侧的加样孔中，加入0.5µg 20 bp DNA ladder；
电泳槽中添加0.5×TBE，160 V电泳 60 min；
小心将胶取出置于干净塑料盒中，加入0.5× TBE（刚好淹没胶为宜）和 2 μLethidium bromide，染色5分钟后用凝胶成像系统成像观察并切胶。
染色期间，用注射器针头从0.5 mL 试管口向管底部扎孔，然后将该0.5 mL 试管置于2 mL试管内备用。连接产物切胶及回收，具体操作参考如下：
用干净刀片将大小介于70-90 bp 之间的胶切下，放入准备好的0.5 mL 试管内；
将上述套管于室温14000 rpm 离心 2 分钟，确保所有胶都已通过管底后，丢弃0.5 mL试管；在2 mL试管内加入300 μL 无菌水，室温振荡至少2小时或4℃振荡过夜；
14000 rpm 离心 2 分钟，将水相转移至1.5 mL 试管内，加入1 μL Glycogen，30 μL3M 醋酸钠，660 μL 体积分数100% 乙醇，混匀，置于-80°C 冰箱30分钟；
4℃、14000rpm离心30分钟后，小心丢弃上清液；
用500 μL体积分数 80% 酒精洗涤DNA沉淀，14000 rpm离心 5分钟，小心丢弃上清液，将试管于室温干燥1~5分钟，用15μL 水溶解沉淀DNA。
（3）转录起始位点文库富集及纯化
富集过程中，利用文库扩增引物和KOD Plus Neo High Fidelity & efficient &fast DNA polymerase进行PCR扩增富集，50μL扩增体系设计如下：
连接产物（步骤（2）所分离连接产物），15 μL；
10×Buffer，5 μL；
25mM MgSO4，3μL；
2 mM dNTPs，5 μL；
10 μM RP1，2 μL；
3' index 引物（10 μM），2 μL；
KOD-Plus，1μL；
H2O，17μL；
PCR扩增条件：94℃，2分钟；98℃，20秒，60℃，30秒，68℃，30秒；10-15个循环。
纯化过程中，采用8wt%的聚丙烯酰胺凝胶进行分离纯化，具体而言：在PCR管中加入10 μL 6 × DNA 上样缓冲液，混匀，加入2个加样孔中；同时在样品两侧加样孔中各加入0.5µg 50 bp、1000bp DNA ladder；
120 V电泳 50 min；ethidium bromide染色。图2即为最终所得日本晴水稻幼苗叶子转录起始位点文库聚丙烯酰胺凝胶电泳图。后续的切胶、洗脱和沉淀步骤参考前述操作即可。
最后用15 μL 水溶解沉淀DNA，即为转录起始位点文库。
（4）文库质检和测序分析
采用Agilent Bioanalyzer 检测文库质量，结果表明文库质量较高（图3），满足使用要求。高通量测序采用Illimina 测序平台进行，具体测序时采用ILLUMINA 小RNA文库测序方法即可，测序时，可将不同index的转录起始位点文库混合后测序，也可与小RNA文库或其他文库混合后测序；图4 为水稻幼苗叶子转录起始位点文库测序后原始序列的长度分布图，主要是长度为32个碱基的片段，其次为长度为31、33个碱基的序列；需要说明的是，所得序列在进行生物信息学分析之前需将起始的6个碱基AGCAGC去除，因此获得的TSS序列的长度为25-27 碱基。
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法
<130> none
<141> 2019-02-22
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工设计(（artificial sequence）)
<400> 4
guucagaguu cuacaguccg acgaucagca gc 32
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计(（artificial sequence）)
<400> 5
gttcagagtt ctacagtccg ac 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计(（artificial sequence）)
<400> 6
cgagcacaga attaatacga ct 22
Claims (6)
1.一种可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
（1）纯化
提取真核生物总RNA后，纯化获得具poly A的 RNA；
（2）去磷酸化
用碱性磷酸酶将步骤（1）中纯化后5'端有磷酸基团的poly A RNA去磷酸化；去磷酸化过程中，含有5'单磷酸基团的RNA由于碱性磷酸酶CIAP的脱磷酸化变为不含5'单磷酸基团的RNA从而完成去磷酸化；而具有帽子结构的完整poly A RNA则不受影响；
（3）去除帽结构
用CCAP酶去除步骤（2）中具有帽子结构的RNA的帽结构，使poly(A) RNA 5'端的单磷酸基团暴露；
（4）连接接头，并反转录
对步骤（3）中去除帽结构后的RNA，在其5' 端单磷酸基团处连接RNA接头，并反转录成cDNA；
（5）PCR扩增
对步骤（4）中反转录的cDNA进行PCR 扩增，并进行纯化、回收；
（6）酶切、连接，分离后，对起始位点文库进行富集、纯化和分析
利用EcoP15I酶对步骤（5）中纯化回收的扩增产物进行酶切，对酶切产物进行双链DNA接头的连接，并对连接产物进行分离、纯化；
最后对转录起始位点文库进行富集及纯化后，对转录起始位点文库进行质控检测、测序分析。
2.如权利要求1所述可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，其特征在于，所述真核生物为水稻。
3.如权利要求2所述可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，其特征在于，步骤（6）中，对连接产物分离时，采用12wt%的聚丙烯酰胺凝胶对连接产物进行分离；对转录起始位点文库进行纯化时，采用8wt%的聚丙烯酰胺凝胶进行操作。
4.如权利要求2所述可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，其特征在于，步骤（6）中，对转录起始位点文库进行质控检测时，采用Agilent Bioanalyzer2100 检测文库质量；测序分析时，采用ILLUMINA 小RNA文库测序方法。
5.如权利要求2所述可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，其特征在于，步骤（4）中，所述连接接头具体序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
5'RNA 接头：5' –GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGCAGC-3'。
6.如权利要求2所述可利用高通量测序技术检测转录起始位点的文库构建方法，其特征在于，步骤（5）中，具体PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.2~3所示，具体为：
5'接头引物：5' –GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC-3'，
3'接头引物：5' –CGAGCACAGAATTAATACGACT-3'。
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