CN109457299A - 一种植物降解组文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物降解组文库构建方法，5’RNA接头中含有Ecop15I酶的识别位点，由Ecop15I酶切，文库插入片段长度为27个碱基，5’RNA接头序列为GUUCAGAGUUCUA CAGUCCGACGAUCAGCAG，其中下划线部分是EcoP15I酶的识别序列，双链DNA接头序列的上链：5’NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 3’，下链：5’CCTTGGCACCCGAGAATTCCA 3’，由于5’RNA接头序列及双链DNA接头序列的改变，所构建的植物降解组文库能够采用Illumina TruSeq小RNA文库测序方法进行测序，因此测序简便易行。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种植物降解组文库构建方法。
背景技术
MicroRNA(miRNA)是真核生物中具有重要调控机能的一种小分子RNA(Yu Y等，The'how'and'where'of plant microRNAs.The New Phytologist,2017,216(4):1002-1017)。植物miRNA与植物的生长、发育、代谢以及生物和非生物胁迫存在着密切的联系(Sunkar R等，Functions of microRNAs in plant stress responses.Trends in PlantScience 2012,17(4):196-203)。miRNA需通过调控其靶基因发挥作用，植物miRNA与其调控的靶基因mRNA有着完美或近似完美的互补配对关系，并主要以介导靶基因mRNA在miRNA对应的第10-11位碱基之间被剪切的方式对靶基因进行调控(Xie M等，microRNAbiogenesis,degradation and activity in plants.Cellular and molecular lifescience,2015,72(1):87-99)。因此，对植物miRNA靶基因的分析和验证是研究miRNA功能必不可少的一部分。靶基因可通过生物信息学方法(Ding J等，Finding MicroRNA Targetsin Plants:Current Status and Perspectives.Genomics Proteomics Bioinformatics,2012,10(5):264-275)进行预测，然而，理论上预测的靶基因尚需通过实验验证才能确认。RLM-5'RACE(RNA ligase-mediated 5'rapid amplification of cDNA ends)(Llave C等，Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class of ArabidopsismiRNA.Science,2002,297(5589):2053–2056)是验证miRNA靶基因的经典方法。其原理是miRNA介导的靶基因mRNA被降解时会产生2个片段(5'剪切片段和3'剪切片段)，其中3'剪切片段比较稳定，有一个暴露的5'单磷酸基团和polyA尾巴。用RNA连接酶在5'磷酸基团处连接一个RNA接头，经反转录、PCR、克隆和测序，则可确定待测基因是否为miRNA的靶基因(Llave C等，Cleavage of Scarecrow-like mRNA targets directed by a class ofArabidopsis miRNA.Science,2002,297(5589):2053–2056)。RLM-5'RACE对于验证少数靶基因时非常实用，然而其缺点是每次只能验证一个靶基因，当要验证大量靶基因时则费时费力。而降解组测序(degradome sequencing)则结合了RLM-5'RACE、高通量测序和生物信息学分析的优势，可以在整个转录组水平对细胞或者组织中miRNA介导的mRNA的3'剪切片段进行深度分析，因此是研究miRNA靶基因的最实用、最高效的技术手段。
2008年，两个实验室(Addo-Quaye C等，Endogenous siRNA and miRNA targetsidentified by sequencing of the Arabidopsis degradome.Current biology,2008,18(10):758-762；German MA等，Global identification of microRNA-target RNA pairsby parallel analysis of RNA ends.Nat Biotechnol，2008，26:941–946)几乎同时采用了相似的方法对拟南芥的降解组文库进行了构建、测序和分析。其原理是用RNA连接酶在3'剪切片段的5'磷酸基团处连接一个RNA接头，该RNA接头的3'端有限制性内切酶MmeI的识别位点。经反转录得到cDNA并进行PCR简单扩增，然后用MmeI对PCR产物进行酶切，得到含有5'接头和下游20个碱基的双链片段，再将此片段与3'双链DNA接头连接并进行PCR扩增，经纯化即得到降解组文库(German MA等，Construction of Parallel Analysis of RNA Ends(PARE)libraries for the study of cleaved miRNA targets and the RNAdegradome.Natture protocols,2008,4(8):356-362)(图1A)。该文库采用Illumina公司的高通量测序方法进行测序，每次只能测一个文库。用Illumina升级仪器HiSeq测序时虽然得到的序列片段数目多，但成本也随之提高。Zhai等(Zhai J等，Rapid construction ofparallel analysis of RNA end(PARE)libraries for Illumina sequencing.Methods,2014,67(1):84-90)将该技术进一步改进，将index序列引入到不同文库中(图1B)，因此可将多个降解组文库混合后测序。这是迄今降解组文库采用的普遍方法。2009年，Addo-Quaye等设计了一种方法采用Ecop15I构建降解组文库，采用Applied Biosystems SOLiD高通量测序技术研究小立碗藓miRNA的靶基因(Addo-Quaye等，Sliced microRNA targets andprecise loop-first processing of MIR319hairpins revealed by analysis of thePhyscomitrella patens degradome.RNA 2009，15:2112-2121)。该方法的优势在于：构建的文库插入片段为27个碱基，比采用MmeI方法要长7个碱基，因此对于测序片段的比对定位会更准确。但Applied Biosystems SOLiD测序方法远不及illumina公司Hi-seq测序方法普遍，因此，该方法并没有得到广泛应用。
本专利发明人课题组采用了最初的和改进的降解组文库构建方法对水稻(Li YF等，Transcriptome-wide identification of microRNA targets in rice.The Plantjournal,2010,62(5):742–759)、小麦(Li YF等，Characterization of small RNAs andtheir target genes in wheat seedlings using sequencing-based approaches.PlantSci 203-204:17-24)的miRNA靶基因进行了研究，发现了大量靶基因。但是我们认为该方法尚存在下列不足，有待于进一步改进，具体原因如下：a、降解组测序困难。改进后的降解组文库虽然可将多个文库混合后测序，由于降解组文库5'RNA接头比小RNA文库的5'RNA接头要少5个碱基，因此必需采用降解组文库特用引物进行测序(Zhai J等，Rapidconstruction of parallel analysis of RNA end(PARE)libraries for Illuminasequencing.Methods,2014,67(1):84-90)。这种文库系用户自建文库，Illumina公司没有针对该种文库测序的试剂盒，因此大多数生物技术测序公司对该文库测序方法不了解，因此，降解组文库测序面临诸多问题。b、测序片段准确定位难。有些片段可定位到多个靶基因上，因此无法确定miRNA对这些靶基因的调控程度；此外，降解组文库可用于鉴别miRNA的产生方式并用于miRNA的鉴定(Li YF等，Transcriptome-wide identification of microRNAtargets in rice.The Plant journal,2010,62(5):742–759)。我们发现大量测序片段可定位于miRNA或miRNA*的起始位点，由于插入片段长度只有20个碱基，而多数miRNA或miRNA*长度为21-22个碱基，仅差1-2个碱基，无法确定这些测序片段起源于miRNA/miRNA*的3'末端腺苷化还是源于miRNA产生过程中的DCL1酶切的中间产物，只有经过繁琐的实验验证才能确定这些序列的来源。如果插入片段比miRNA/miRNA*长度多几个碱基，将大大有助于miRNA产生机理的研究。因此，如能构建出一种降解组文库既能解决插入片段短的问题，又能采用Illumina现有的测序试剂盒对降解组文库进行测序，不仅对研究者精准定位miRNA的靶基因和靶位点，探讨miRNA调控机理和miRNA的产生方式有所帮助，而且也能使生物技术公司测序变得更加简便易行。目前国内外尚未见能满足上述要求的降解组构建方法。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种植物降解组文库构建方法，其技术要点包括设计新的5'RNA接头、设计新的3’双链DNA接头及最终文库PCR扩增引物改变。采用新方法构建的降解组文库大小为150bp，插入片段长度为27个碱基，解决了目前文库短的问题。此外该方法构建的植物降解组文库可直接采用Illumina TruSeq小RNA文库测序试剂盒进行测序。应用这种新方法已经成功构建了拟南芥、水稻和小麦的降解组文库(见图2)，并对水稻和小麦的降解组文库进行了测序分析，证明该技术是可行的。
本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种植物降解组文库构建方法，其特征在于：5’RNA接头中含有Ecop15I酶的识别位点，由Ecop15I酶切，文库插入片段长度为27个碱基，5’RNA接头序列为GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGCAG，其中下划线部分是EcoP15I酶的识别序列，双链DNA接头序列的上链：5’NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 3’，下链：5’CCTTGGCACCCGAGAATTCCA 3’，由于5’RNA接头序列及双链DNA接头序列的改变，所构建的植物降解组文库能够采用Illumina TruSeq小RNA文库测序方法进行测序。
相比于现有的降解组文库构建技术，本发明的技术优势如下：
(1)测序方法简便易行。该方法构建的降解组文库可采用小RNA文库测序方法进行测序。既可以将不同降解组文库混合后测序，也可与小RNA文库混合后测序。而原来的降解组文库无法与小RNA文库混合后测序，需要特用引物单独测序。即使遇到降解组文库的index与小RNA文库的index相同，测序后可以根据降解组序列5'端特有的AGCAG序列将两者区分开。
(2)文库中插入片段的长度由原来的20个碱基变为27个碱基，因此reads定位更准确。该技术不仅能对miRNA的靶基因进行分析，同时还能分析miRNA形成过程中的中间产物，因此有助于对miRNA的形成机理进行研究。
附图说明
图1是现有技术中植物降解组文库构建示意图；
图2是本发明植物降解组文库构建示意图；
图3是cDNA扩增后1wt％琼脂糖凝胶电泳图(10μL PCR扩增15循环)；
图4是EcoP15I酶切后与双链DNA接头连接产物12wt％聚丙烯酰胺凝胶图，方块代表切胶区域，该图为SYBRTMGold nucleic acid gel stain染色结果；
图5是降解组文库富集后8wt％聚丙烯酰胺凝胶图，箭头代表文库片段；
图6是AgilentBioanalyzer检测降解组文库大小和质量，150bp的峰即为降解组文库；
图7是降解组文库各位点碱基含量分析，前5个碱基AGCAG源于5’RNA接头序列，生物信息学分析时需要切除；
图8是原来的方法和我们的方法序列定位比较，原来方法(上图)无法确定接头所指位置20个碱基(中图中阴影部分)来源于水稻MIR160a还是MIR160b，而文库长度变为27个碱基后(中图下划线部分)可区分来源于MIR160a和MIR160b的序列(下图箭头所指)；
图9是EcoP15I酶切后与双链DNA接头连接产物12wt％聚丙烯酰胺凝胶图，方块代表切胶区域，该图为SYBRTMGold nucleic acid gel stain染色结果；
图10是降解组文库富集后8wt％聚丙烯酰胺凝胶图，箭头代表文库片段；
图11、12是AgilentBioanalyzer检测降解组文库大小和质量，150bp的峰即为降解组文库。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
主要试剂及酶：
Reagent(Invitrogen,Catalog no.15596-026).
RNaseOutTM(Invitrogen，Cat.No.10777-019).
SuperScriptTMII Reverse Transcriptase(Invitrogen，Cat No.18064).
Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen，CatNo.11304011).
EcoP15I(New England Biolabs,Cat No.R0646S).
phenol/chloroform/iso-amyl alcohol(25:24:1).
T4DNA ligase(Invitrogen,Cat No.15224-017).
T4RNA ligase(New England biolabs，Cat No.M0204S).
Glycogen(Invitrogen,Cat No.10814-010).
PCR purification kit(QIAGEN,Cat No.28004).
接头及引物信息：
5’RNA接头：5’GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGCAG 3’.
Oligo(dT)反转录引物：5’CGAGCACAGAATTAATACGAC(T)18V 3’.
5’接头引物：5’GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC 3’.
3’接头引物：5’CGAGCACAGAATTAATACGACT 3’.
双链DNA接头：上链：5’NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 3’；下链：5’CCTTGGCACCCGAGAATTCCA3’.
文库扩增引物1(RP1)：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA.
文库扩增引物2：TruSeq小RNA文库3’PCR primers,Index 1–24.
技术步骤：
降解组文库构建过程包括植物mRNA的纯化，5'RNA接头连接，反转录，第一次PCR扩增，EcoP15I酶切，双链DNA接头的连接，第一次聚丙烯酰胺凝胶分离纯化连接产物，降解组文库富集(第二次PCR扩增)，第二次聚丙烯酰胺凝胶分离纯化降解组文库，文库的质检和测序分析(图2)。其详细构建流程如下：
1.植物mRNA的纯化
1.1植物总RNA的提取：
采用Reagent(invitrogen，Catalog no.15596-026)提取总RNA，其它方法也可，要求提取高质量总RNA，RNA不存在降解问题。
1.2植物mRNA的纯化：
利用Poly(A)PuristTMMAG Kit(Invitrogen，catalog No.AM1922)从总RNA中纯化mRNA。将100-500μg总RNA用水稀释至600μg/mL，按照试剂盒内的方法进行mRNA纯化，将mRNA溶于11.5μL DEPC水中。
2.5'RNA接头连接
将1.5μL5'RNA adaptor(100μM)与11.5μL mRNA混合均匀，将试管置于65℃水浴5分钟后，迅速将试管置于冰上2分钟，低速离心收集液体至管底。在冰上与下列成分混合，将试管置于37℃连接1小时。
连接反应结束后，加80μL DEPC水，加100μL苯酚:氯仿:异戊醇，振荡混匀，14000rpm离心2分钟，将试管上层溶液(水相)约100μL转移至一个新的1.5毫升离心管内，加10μL 3M醋酸钠,pH 5.2，1μL 10mg/mL glycogen，然后加220μL体积分数95％酒精并混匀，将试管置于-80℃冰箱30分钟后于4℃离心30分钟(14000rpm)，丢弃上清液，加入500μL体积分数70％酒精洗涤沉淀，震荡混匀，于4℃离心10分钟(14000rpm)。将上清液小心丢弃，将试管于室温干燥1-2分钟，用20μL DEPC水溶解RNA沉淀。
3.mRNA反转录
在上述连接过5’RNA接头的试管中加入2μL dNTPs(10mM)和2μL oligo(dT)反转录引物(50μM)，将上述试管置于65℃水浴5分钟，置于冰上2分钟并低速离心。然后加入8μL 5×First Strand Buffer，4μL 0.1M DTT，1μL RNaseOutTM(40U/μL)，混匀，低速离心，置于42℃保温2分钟后，加入3μL SuperScriptTMII RTase(200U/μL),混匀，低速离心，置于42℃保温50分钟。然后70℃15分钟终止反转录。
4.PCR扩增及纯化
4.1PCR扩增：用Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增，反应如下：
将上述PCR混合液分装到2个PCR管中，每管50μL。PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，5分钟；7个循环。
4.2PCR产物纯化：按照MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)的纯化程序对上述100μL PCR样品进行纯化，最后用水洗脱两次，每次10μL，合并洗脱液。
5.EcoP15I酶切、双链DNA接头的连接和产物纯化
5.1EcoP15I酶切
采用New England Biolabs的EcoP15I对上述纯化的PCR产物进行酶切。
将上述各成分混合均匀，低速离心后于37℃酶切反应1小时。然后将试管置于65℃20分钟，于室温冷却。
5.2连接双链DNA 接头
1)接头制备：将双链DNA接头的上链与下链(100μM)各10μL混合，100℃保温5min后，室温冷却。
2)连接反应：按下表混合各个成分，于室温连接1小时。
6.聚丙烯酰胺凝胶分离连接产物
采用12wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离。在连接反应液中加入12μL 6×DNAloading buffer，混匀，加入2-3个加样孔中；同时在连接样品两侧的加样孔中，加入0.5μg20bp DNA ladder。电泳槽中添加0.5×TBE，160V电泳60min。小心将胶取出置于干净塑料盒中，加入0.5×TBE(刚好淹没胶为宜)和2μL ethidium bromide(若采用SYBRTMGold nucleicacid gel stain,Invitrogen,S11494，效果更佳)，染色5分钟后观察并切胶。
染色期间，用注射器针头从0.5mL试管口向管底部扎孔，然后将该0.5mL试管置于2mL试管内备用。用凝胶成像系统成像，用干净刀片将大小介于70-90bp之间的胶切下，放入准备好的0.5mL试管内。将上述套管于室温14000rpm离心2分钟，确保所有胶都已通过管底后，丢弃0.5mL试管。在2mL试管内加入300μL 无菌水，室温振荡至少2小时或4℃振荡过夜。14000rpm离心2分钟，将水相转移至1.5mL 试管内，加入1μL Glycogen,30μL 3M醋酸钠,660μL体积分数100％乙醇，混匀，置于-80℃冰箱30分钟。低温(4℃)离心30分钟(14000rpm)后小心丢弃上清液。用500μL体积分数80％酒精洗涤DNA沉淀，14000rpm离心5分钟，小心丢弃上清液，将试管于室温干燥1-5分钟，用37.8μL 水溶解沉淀DNA。
7.降解组文库富集及纯化
用文库扩增引物和Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增富集。
PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒；10-15个循环。
8.降解组文库纯化
采用8wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离。在PCR管中加入10μL 6×DNA loadingbuffer，混匀，加入2个加样孔中；同时在样品两侧加样孔中各加入0.5μg 50bp DNAladder。120V电泳50min。后续的染色(ethidium bromide即可)、切胶、洗脱和沉淀同步骤6。用15μL水溶解沉淀DNA，即为降解组文库。
9.文库质检和测序分析
采用Agilent Bioanalyzer检测文库质量。降解组文库测序方法与ILLUMINA小RNA文库测序方法相同。可将不同降解组文库混合后测序，也可与小RNA文库混合后测序。所得序列在生物信息学分析之前需将起始的5个碱基AGCAG去除。
实施例1：以日本晴水稻叶子为材料构建降解组文库
1.植物mRNA的纯化
1.1植物总RNA的提取：
采用Reagent(invitrogen，Catalog no.15596-026)提取总RNA
1)在标记好的EP管中加入1mL TRIzol,将所取材料放到研钵中，在液氮中快速充分研磨。将0.1g的研磨好的材料加入到上述EP管中，振荡混合均匀，室温静置5分钟。
2)加入0.2mL氯仿(三氯甲烷)，振荡15秒，室温静置2-3分钟。
3)4℃，12000rpm，离心15分钟，将上层水相(450-500μL)转移到一个新的RNase-Free EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，与冰上静置10分钟。
4)4℃，12000rpm，离心10分钟，弃上清，加入1mL体积分数75％的乙醇洗涤沉淀。
5)4℃，12000rpm，离心3分钟，弃上清，室温静置2-3分钟，晾干，加入30μL DEPC水，充分溶解RNA。
6)使用Nanodrop测量提取的RNA样品浓度；用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品质量。
1.2植物mRNA的纯化：
利用Poly(A)PuristTMMAG Kit(Invitrogen，catalog No.AM1922)从总RNA中纯化mRNA。
1)将500μg总RNA用水稀释至600μg/mL，加入与总RNA等体积的2×BindingSolution，即830μl。
2)准备Oligo(dT)MagBeads：每100μg RNA需要10μl Beads；每10μl Beads需要加入50μl的Wash Solution 1洗涤，取50μl Beads，加入250μl的Wash Solution 1放在磁架上沉淀Beads,弃上清，再重复一次。
3)将1)中溶液加入到步骤2)的beads中，65℃水浴加热5分钟。室温振荡60分钟，放在磁架上沉淀，将上清转移回原管并置于冰上保存。
4)分别加入830μl Wash Solution 1和Wash Solution 2洗涤两次，方法同上。
5)加入65℃预热的RNA Storage Solution 200μl，混匀洗脱后置磁力架上，将上清转移到干净的EP管中，再重复洗脱一次，合并上清液。
6)于上清液中加入40μl 5M醋酸铵，1μl Glycogen，1mL体积分数100％乙醇，于-80℃过夜沉淀。
7)14000×g，4℃，离心30分钟，吸弃上清；加入1mL体积分数75％乙醇洗涤，涡旋振荡，14000×g，4℃，离心30分钟，吸弃上清。
8)将上述沉淀溶于11.5μL DEPC水中。
2.5'RNA接头连接
将1.5μL5'RNA adaptor(100μM)，与11.5μL mRNA 混合均匀。将试管置于65℃水浴5分钟后，迅速将试管置于冰上2分钟，低速离心收集液体至管底。在冰上与下列成分混合，将试管置于37℃连接1小时。
连接反应结束后，加80μL DEPC水，加100μL 苯酚:氯仿:异戊醇，振荡混匀，14000rpm离心2分钟，将试管上层溶液(水相)约100μL 转移至一个新的1.5毫升离心管内，加10μL 3M醋酸钠,pH 5.2，1μL 10mg/mL glycogen，然后加220μL体积分数95％酒精并混匀。将试管置于-80℃冰箱30分钟；于4℃离心30分钟(14000rpm)，丢弃上清液，加入500μL体积分数70％酒精洗涤沉淀，震荡混匀，于4℃离心10分钟(14000rpm)。将上清液小心丢弃，将试管于室温干燥1-2分钟，用20μL DEPC水溶解RNA沉淀
3.mRNA反转录
在上述连接过RNA adaptor的试管中加入2μL dNTPs(10mM)和2μL oligodTadaptor引物(50μM)，将上述试管置于65℃水浴5分钟，置于冰上2分钟并低速离心，将下列成分加入上述试管中，混匀，低速离心，置于42℃保温2分钟。
再加入3μL SuperScriptTMII RTase(200U/μL),混匀，低速离心，置于42℃保温50分钟。然后70℃ 15分钟终止反转录。
4.PCR扩增及纯化
4.1PCR扩增：
用Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增，反应如下：
将上述PCR混合液分装到2个PCR管中，每管50μL。PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，5分钟；7个循环。
4.2PCR产物纯化：
按照MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)的纯化程序对上述100μL PCR样品进行纯化，最后用水洗脱两次，每次10μL，合并洗脱液。
5.EcoP15I酶切、双链DNA接头的连接和产物纯化
5.1EcoP15I酶切
采用New England Biolabs的EcoP15I对上述纯化的PCR产物进行酶切。
将上述各成分混合均匀，低速离心后于37℃酶切反应1小时。然后将试管置于65℃20分钟，于室温冷却。
5.2连接双链DNA接头
1)接头制备：
将双链DNA接头的上链与下链(100μM)各10μL混合，100℃保温5min后，室温冷却。
2)连接反应：按下表混合个成分，于室温连接1小时。
6.聚丙烯酰胺凝胶分离连接产物
采用12wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离。在连接反应液中加入12μL6×DNAloading buffer，混匀，加入2个加样孔中；同时，将0.5μg 20bp DNA ladder加入到连接样品两边的加样孔中。电泳槽中添加0.5×TBE，160V电泳60min。小心将胶取出置于干净塑料盒中，加入0.5×TBE(刚好淹没胶为宜)和2μL ethidium bromide(若采用SYBRTMGoldnucleic acid gel stain,Invitrogen,S11494，效果更佳)，染色5分钟。
在染色期间，用注射器针头从0.5mL试管口向管底部扎孔，然后将该0.5mL试管置于2mL试管内。用凝胶成像系统成像，用干净刀片将大小介于70-90bp之间的胶切下，放入准备好的0.5mL试管内。将上述套管于室温14000rpm离心2分钟，确保所有胶都已通过管底后，丢弃0.5mL试管。在2mL试管内加入300μL无菌水，室温振荡至少2小时或4℃振荡过夜。14000rpm离心2分钟，将滤液转移至1.5mL试管内，加入1μL Glycogen,30μL 3M醋酸钠,660μL体积分数100％乙醇，混匀，置于-80℃冰箱30分钟。低温(4℃)离心30分钟(14000rpm)后小心丢弃上清液。用500μL体积分数80％酒精洗涤DNA沉淀，14000rpm室温离心5分钟，小心丢弃上清液，将试管于室温干燥1-5分钟，用37.8μL水溶解沉淀DNA。
7.降解组文库富集及纯化
用文库扩增引物和Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增富集。
PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒；15个循环。
8.降解组文库纯化
采用8wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离。在PCR管中加入10μL 6×DNA loadingbuffer，混匀，加入2个加样孔中；同时，将0.5μg 50bp DNA ladder加入到样品两侧。120V电泳50min。后续的染色(ethidium bromide即可)、切胶(切取150bp左右的片段)、洗脱和沉淀同上。用15μL水溶解沉淀DNA，即为降解组文库。
9.文库质检和测序分析
采用Agilent Bioanalyzer检测文库质量。降解组文库测序方法与Illumina小RNA文库测序方法相同。
10.实验结果
实验结果见图3-8。
实施例2：以小麦叶子和顶端分生组织为材料构建降解组文库
1.植物mRNA的纯化
1.1植物总RNA的提取：
采用Reagent(invitrogen，Catalog no.15596-026)提取总RNA
1)在标记好的EP管中加入1mL TRIzol,将所取材料放到研钵中，在液氮中快速充分研磨。将0.1g的研磨好的材料加入到上述EP管中，振荡混合均匀，室温静置5分钟。
2)加入0.2mL氯仿(三氯甲烷)，振荡15秒，室温静置2-3分钟。
3)4℃，12000rpm，离心15分钟，将上层水相(450-500μL)转移到一个新的RNase-Free EP管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，与冰上静置10分钟。
4)4℃，12000rpm，离心10分钟，弃上清，加入1mL体积分数75％的乙醇洗涤沉淀。
5)4℃，12000rpm，离心3分钟，弃上清，室温静置2-3分钟，晾干，加入30μL DEPC水，充分溶解RNA。
6)使用Nanodrop测量提取的RNA样品浓度；用1wt％琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品质量。
1.2植物mRNA的纯化：
利用Poly(A)PuristTMMAG Kit(Invitrogen，catalog No.AM1922)从总RNA中纯化mRNA。
1)将500μg总RNA用水稀释至600μg/mL，加入与总RNA等体积的2×BindingSolution，即830μl。
2)准备Oligo(dT)MagBeads：每100μg RNA需要10μl Beads；每10μl Beads需要加入50μl的Wash Solution 1洗涤，取50μl Beads，加入250μl的Wash Solution 1放在磁架上沉淀Beads,弃上清，再重复一次。
3)将1)中溶液加入到步骤2)的beads中，65℃水浴加热5分钟。室温振荡60分钟，放在磁架上沉淀，将上清转移回原管并置于冰上保存。
4)分别加入830μl Wash Solution 1和Wash Solution 2洗涤两次，方法同上。
5)加入65℃预热的RNA Storage Solution 200μl，混匀洗脱后置磁力架上，将上清转移到干净的EP管中，再重复洗脱一次，合并上清液。
6)于上清液中加入40μl 5M醋酸铵，1μl Glycogen，1mL体积分数100％乙醇，于-80℃过夜沉淀。
7)14000×g，4℃，离心30分钟，吸弃上清；加入1mL体积分数75％乙醇洗涤，涡旋振荡，14000×g，4℃，离心30分钟，吸弃上清。
8)将上述沉淀溶于11.5μL DEPC水中。
2.5'RNA接头连接
将1.5μL 5'RNA adaptor(100μM)，与11.5μL mRNA混合均匀。将试管置于65℃水浴5分钟后，迅速将试管置于冰上2分钟，低速离心收集液体至管底。在冰上与下列成分混合，将试管置于37℃连接1小时。
连接反应结束后，加80μL DEPC水，加100μL苯酚:氯仿:异戊醇，振荡混匀，14000rpm离心2分钟，将试管上层溶液(水相)约100μL转移至一个新的1.5毫升离心管内，加10μL 3M醋酸钠,pH 5.2，1μL 10mg/mL glycogen，然后加220μL体积分数95％酒精并混匀。将试管置于-80℃冰箱30分钟；于4℃离心30分钟(14000rpm)，丢弃上清液，加入500μL体积分数70％酒精洗涤沉淀，震荡混匀，于4℃离心10分钟(14000rpm)。将上清液小心丢弃，将试管于室温干燥1-2分钟，用20μL DEPC水溶解RNA沉淀
3.mRNA反转录
在上述连接过RNA adaptor的试管中加入2μL dNTPs(10mM)和2μL oligodTadaptor引物(50μM)，将上述试管置于65℃水浴5分钟，置于冰上2分钟并低速离心，将下列成分加入上述试管中，混匀，低速离心，置于42℃保温2分钟。
再加入3μL SuperScriptTMII RTase(200U/μL),混匀，低速离心，置于42℃保温50分钟。然后70℃ 15分钟终止反转录。
4.PCR扩增及纯化
4.1PCR扩增：
用Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增，反应如下：
将上述PCR混合液分装到2个PCR管中，每管50μL。PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，5分钟；7个循环。
4.2PCR产物纯化：
按照MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)的纯化程序对上述100μL PCR样品进行纯化，最后用水洗脱两次，每次10μL，合并洗脱液。
5.EcoP15I酶切、双链DNA接头的连接和产物纯化
5.1EcoP15I酶切
采用New England Biolabs的EcoP15I对上述纯化的PCR产物进行酶切。
将上述各成分混合均匀，低速离心后于37℃酶切反应1小时。然后将试管置于65℃20分钟，于室温冷却。
5.2连接双链DNA接头
3)接头制备：
将双链DNA接头的上链与下链(100μM)各10μL混合，100℃保温5min后，室温冷却。
4)连接反应：按下表混合个成分，于室温连接1小时。
6.聚丙烯酰胺凝胶分离连接产物
采用12wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离。在连接反应液中加入12μL 6×DNAloading buffer，混匀，加入2个加样孔中；同时，将0.5μg 20bp DNA ladder加入到连接样品两边的加样孔中。电泳槽中添加0.5×TBE，160V电泳60min。小心将胶取出置于干净塑料盒中，加入0.5×TBE(刚好淹没胶为宜)和2μL ethidium bromide(若采用SYBRTMGoldnucleic acid gel stain,Invitrogen,S11494，效果更佳)，染色5分钟。
在染色期间，用注射器针头从0.5mL试管口向管底部扎孔，然后将该0.5mL试管置于2mL试管内。用凝胶成像系统成像，用干净刀片将大小介于70-90bp之间的胶切下，放入准备好的0.5mL试管内。将上述套管于室温14000rpm离心2分钟，确保所有胶都已通过管底后，丢弃0.5mL试管。在2mL试管内加入300μL无菌水，室温振荡至少2小时或4℃振荡过夜。14000rpm离心2分钟，将滤液转移至1.5mL试管内，加入1μL Glycogen,30μL 3M醋酸钠,660μL体积分数100％乙醇，混匀，置于-80℃冰箱30分钟。低温(4℃)离心30分钟(14000rpm)后小心丢弃上清液。用500μL体积分数80％酒精洗涤DNA沉淀，14000rpm室温离心5分钟，小心丢弃上清液，将试管于室温干燥1-5分钟，用37.8μL水溶解沉淀DNA。
7.降解组文库富集及纯化
用文库扩增引物和Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增富集。
PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒；15个循环。
8.降解组文库纯化
采用8wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离。在PCR管中加入10μL6×DNA loadingbuffer，混匀，加入2个加样孔中；同时，将0.5μg 50bp DNA ladder加入到样品两侧。120V电泳50min。后续的染色(ethidium bromide即可)、切胶(切取150bp左右的片段)、洗脱和沉淀同上。用15μL水溶解沉淀DNA，即为降解组文库。
9.文库质检和测序分析
采用Agilent Bioanalyzer检测文库质量。降解组文库测序方法与Illumina小RNA文库测序方法相同。
10.实验结果
实验结果见图9-12。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110>河南师范大学
<120>一种植物降解组文库构建方法
<130>2018
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>RNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
guucagaguucuacaguccgacgaucagcag 31
<210>2
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
cgagcacagaattaatacgactttttttttttttttttta/c/g 40
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
gttcagagttctacagtccgac 22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
cgagcacagaattaatacgact 22
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
(a/t/c/g)(a/t/c/g)tggaattctcgggtgccaagg 23
<210>6
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<212>RNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
ccttggcacccgagaattcca 21
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<212>DNA
<213>人工序列(artificial chromosome)
<400>1
aatgatacggcgaccaccgagatctacacgttcagagttctacagtccga 50
序列表
<110> 河南师范大学
<120> 一种植物降解组文库构建方法
<141> 2018-06-27
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 1
guucagaguu cuacaguccg acgaucagca g 31
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 2
cgagcacaga aaaacgaca 19
<210> 3
<211> 16
<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 3
gcagagcaca gccgac 16
<210> 4
<211> 18
<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 4
cgagcacaga aaaacgac 18
<210> 5
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<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 5
acgacgggaa ccggggccaa gg 22
<210> 6
<211> 17
<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 6
ccggcacccg agaacca 17
<210> 7
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial chromosome
<400> 7
aagaacggcg accaccgaga cacacgcaga gcacagccga 40
Claims (2)
1.一种植物降解组文库构建方法，其特征在于：5’RNA接头中含有Ecop15I酶的识别位点，由Ecop15I酶切，文库插入片段长度为27个碱基，5’RNA接头序列为GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCAGCAG，其中下划线部分是EcoP15I酶的识别序列，双链DNA接头序列的上链：5’NNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG 3’，下链：5’CCTTGGCACCCGAGAATTCCA3’，由于5’RNA接头序列及双链DNA接头序列的改变，所构建的植物降解组文库能够采用IlluminaTruSeq小RNA文库测序方法进行测序。
2.根据权利要求1所述的植物降解组文库构建方法，其特征在于具体步骤为：
1.植物mRNA的纯化
1.1植物总RNA的提取：
采用Reagent提取总RNA；
1.2植物mRNA的纯化：
利用Poly(A)PuristTM MAG Kit从总RNA中纯化mRNA，将100-500μg总RNA用水稀释至600μg/mL，按照试剂盒内的方法进行mRNA纯化，将mRNA溶于11.5μL DEPC水中；
2.5'RNA接头连接
将1.5μL摩尔浓度为100μM的5'RNA adaptor与11.5μL mRNA混合均匀，将试管置于65℃水浴5分钟后，迅速将试管置于冰上2分钟，低速离心收集液体至管底，在冰上与下列成分混合，将试管置于37℃连接1小时；
连接反应结束后，加80μL DEPC水，加100μL苯酚:氯仿:异戊醇，振荡混匀，14000rpm离心2分钟，将试管上层溶液100μL转移至一个新的1.5mL离心管内，加10μL摩尔浓度为3M的醋酸钠溶液，pH 5.2，1μL 10mg/mL glycogen，然后加220μL体积分数为95％酒精并混匀，将试管置于-80℃冰箱30分钟后于4℃离心30分钟，弃上清液，加入500μL体积分数为70％的酒精洗涤沉淀，震荡混匀，于4℃离心10分钟，将上清液丢弃，将试管于室温干燥1-2分钟，用20μLDEPC水溶解RNA沉淀；
3.mRNA反转录
在上述连接过5’RNA接头的试管中加入2μL摩尔浓度为10mM的dNTPs和2μL摩尔浓度为50μM的oligo(dT)反转录引物，将上述试管置于65℃水浴5分钟，置于冰上2分钟并低速离心，然后加入8μL 5×First Strand Buffer、4μL 0.1M DTT、1μL 40U/μL RNaseOutTM，混匀，低速离心，置于42℃保温2分钟后，加入3μL 200U/μL SuperScriptTM II RTase，混匀，低速离心，置于42℃保温50分钟，然后70℃15分钟终止反转录；
4.PCR扩增及纯化
4.1 PCR扩增：用Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增，反应如下：
将上述PCR混合液分装到2个PCR管中，每管50μL，PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，5分钟；7个循环；
4.2 PCR产物纯化：按照MinElute PCR Purification Kit的纯化程序对上述100μLPCR样品进行纯化，最后用水洗脱两次，每次10μL，合并洗脱液；
5.EcoP15I酶切、双链DNA接头的连接和产物纯化
5.1 EcoP15I酶切
采用New England Biolabs的EcoP15I对上述纯化的PCR产物进行酶切；
将上述各成分混合均匀，低速离心后于37℃酶切反应1小时，然后将试管置于65℃20分钟，于室温冷却；
5.2连接双链DNA接头
1)接头制备：将双链DNA接头的上链与下链100μM各10μL混合，100℃保温5min后，室温冷却；
2)连接反应：按下表混合各个成分，于室温连接1小时；
6.聚丙烯酰胺凝胶分离连接产物
采用12wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，在连接反应液中加入12μL 6×DNA loadingbuffer，混匀，加入2-3个加样孔中；同时在连接样品两侧的加样孔中，加入0.5μg 20bp DNAladder，电泳槽中添加0.5×TBE，160V电泳60min，将胶取出置于干净塑料盒中，加入0.5×TBE和2μL ethidium bromide，染色5分钟后观察并切胶；
染色期间，用注射器针头从0.5mL试管口向管底部扎孔，然后将该0.5mL试管置于2mL试管内备用，用凝胶成像系统成像，用干净刀片将大小介于70-90bp之间的胶切下，放入准备好的0.5mL试管内，将上述套管于室温14000rpm离心2分钟，确保所有胶都已通过管底后，丢弃0.5mL试管，在2mL试管内加入300μL无菌水，室温振荡至少2小时或4℃振荡过夜，14000rpm离心2分钟，将水相转移至1.5mL试管内，加入1μL Glycogen、30μL 3M的醋酸钠溶液、660μL体积分数为100％的乙醇，混匀，置于-80℃冰箱30分钟，低温4℃离心30分钟后丢弃上清液，用500μL体积分数为80％的酒精洗涤DNA沉淀，14000rpm离心5分钟，丢弃上清液，将试管于室温干燥1-5分钟，用37.8μL水溶解沉淀DNA；
7.降解组文库富集及纯化
用文库扩增引物和Taq DNA Polymerase High Fidelity进行PCR扩增富集；
PCR扩增条件：94℃，2分钟；94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒；10-15个循环；
8.降解组文库纯化
采用8wt％的聚丙烯酰胺凝胶进行分离，在PCR管中加入10μL 6×DNA loadingbuffer，混匀，加入2个加样孔中；同时在样品两侧加样孔中各加入0.5μg 50bp DNAladder，120V电泳50min，后续的染色、切胶、洗脱和沉淀同步骤6，用15μL水溶解沉淀DNA即为植物降解组文库。
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