CN114250224B - 一种用于提取或检测样本中小分子rna的核酸组合物及其试剂盒和方法 - Google Patents

一种用于提取或检测样本中小分子rna的核酸组合物及其试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法,涉及核酸检测技术领域,该核酸组合物包括固相载体、捕获探针和封闭探针,所述固相载体上固定有单链寡核苷酸;所述捕获探针包括有与所述单链寡核苷酸反向互补的序列以及与靶基因反向互补的序列;所述封闭探针能够与所述捕获探针或其部分反向互补。该核酸组合物在无需提取总RNA的情况下,能够对样本中微量的目标小分子RNA进行捕获分离并进行测序文库构建,其产物可直接应用于高通量测序检测,具有快速、灵敏、高效的优点,可高通量地实现多种小分子RNA的精准检测。

Description

一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试 剂盒和方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域,具体而言,涉及一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法。
背景技术
大量研究表明,健康人与癌症患者血液中的循环游离核酸(cfNA),作为一种新型无创诊断生物标志物,具有临床应用价值。
小分子RNA(Small RNA)是一类高度保守的长度小于50nt的RNA分子,是一大类功能各异的调控分子,主要包括:微小RNA(microRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi蛋白相互作用RNA(piRNA)、重复相关siRNA(rasiRNA)等。它们分别在转录水平、转录后水平及表观遗传水平等方面控制基因的表达,通过多种多样的作用途径,包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除,广泛参与调控生物体的生长发育和疾病发生。
MicroRNAs(miRNAs)是小分子RNA中研究较多的一个类型,由19~22个核苷酸组成,通过靶向结合的信使RNA(mRNA)来调控基因表达,具有高度保守性、时序性和组织特异性。研究发现,miRNA不仅存在于细胞内,也存在于细胞外,以细胞外游离形式存在于血液(血浆或血清)和其他类型的生物液体中,如乳汁、尿液或房水等。miRNA通过形成蛋白质复合物或包裹于微囊泡内的形式,免受RNA酶的降解,从而在体液中稳定存在,并发挥细胞间通信及调节受体生物学过程的功能。越来越多的研究发现miRNA与癌症发展有关,癌症组织的miRNA表达谱发生显著改变。而血清和血浆中,含有大量来自各种组织或器官的稳定的miRNA,检测癌症或其他疾病患者的循环游离miRNA,有望成为新型无创诊断方式。
目前,小分子RNA的检测方法主要有Northern印迹分析,微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)。
Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法,其缺点在于:不适用于大规模的筛选实验,不能有效区分具有细微序列差异的小分子RNA,且检测过程耗时、样本量消耗大,一次检测需要3个工作日,需要5-10μg的总RNA才能成功检出,不适用于血浆等来源的微量小分子RNA的检测;微点阵分析采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交,通过荧光扫描获得表达图。
微点阵可以实现高通量的RNA分析,但仍需要较大RNA初始样本量,并且同样无法清楚区分近似小分子RNA。
实时定量PCR技术,是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测,实现目标小分子RNA的定性定量分析。实时定量PCR检测灵敏度高、成本低,常用于RNA表达谱的结果鉴定,其缺点在于无法实现对多种RNA的高通量检测。
因此,需要发展一种小分子RNA检测技术,能够兼顾检测灵敏度、检测通量与检测特异性。
此外,由于生物样本组成的复杂性,现有的RNA检测方法,大多需要先进行总RNA提取,大大增加了检测周期与人力成本,并且在RNA的提纯过程中,也存在RNA降解与靶基因损失风险。
因此,开发一种稳定快捷,可以直接从生物样本中提取小分子RNA,并能够高通量检测的技术,对小分子RNA的临床应用具有重要意义。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法。
本发明是这样实现的:
第一方面,本发明实施例提供了一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物,其包括:固相载体、捕获探针与封闭探针;
所述固相载体上固定有单链寡核苷酸;
所述捕获探针为单链核酸序列,包括有相互连接的第一序列和第二序列;所述第一序列包括有与所述单链寡核苷酸反向互补的序列,所述第二序列能与靶基因或靶基因的部分序列反向互补;
所述封闭探针为单链核酸序列,包括相互连接的第三序列和第四序列;所述第三序列能与所述第一序列或第一序列的部分序列反向互补,所述第四序列能与所述第二序列或第二序列的部分序列反向互补。
第二方面,本发明实施例提供了一种用于提取或检测样本中小分子RNA的试剂盒,其包括:如前述实施例所述的用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物。
第三方面,本发明实施例提供了一种目标核酸的提取方法,其包括采用如前述实施例所述的用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物或如前述实施例所述的用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物对样本中的目标RNA进行提取。
第四方面,本发明实施例提供了一种测序文库的构建方法,其包括采用如前述实施例所述的小分子RNA的提取方法对样本中的目标RNA进行提取,并对提取产物连接接头后扩增,获得测序文库。
第五方面,本发明实施例提供了一种小分子RNA的检测方法,其包括:对如前述实施例所述的测序文库的构建方法构建的测序文库进行测序。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种核酸组合物,包括捕获探针、固相载体和封闭探针,该核酸组合物,无需提取总RNA,可以一步从生物样本完成小分子RNA的提取并直接进行文库构建。采用本发明提供的核酸组合物用于小分子RNA的提取具有快速、灵敏、高效的优点,并可高通量地实现多种小分子RNA的精准检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的核酸组合物以及捕获建库流程示意图;
图2为验证例1中本发明的方法捕获cel-miR-39-3p并构建二代测序文库结构;
图3为验证例1中本发明的方法构建得文库片段分布;
图4为验证例1中本发明方法所得文库的一代测序结果;
图5为验证例2中两种结构捕获探针捕获建库的片段分布;
图6为验证例3中是否加入封闭探针的建库结果;
图7为验证例4中探针是否封闭修饰对文库构建的影响;
图8为验证例5中不同长度的第一序列,对提取效率的影响;
图9为验证例6中验证捕获探针和封闭探针的检测特异性的结果;
图10为验证例7中验证共同捕获mRNA与小分子RNA并建库的可行性的检测结果;
图11为验证例8中不同长度的第二序列对提取效率的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先,本发明实施例提供了一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物,可参照图1,包括固相载体、捕获探针与封闭探针。
所述固相载体上固定有单链寡核苷酸;所述捕获探针为单链核酸序列,包括有相互连接的第一序列和第二序列;所述第一序列包括有与所述单链寡核苷酸反向互补的序列,所述第二序列能与靶基因或靶基因的部分序列反向互补;所述封闭探针为单链核酸序列,包括相互连接的第三序列和第四序列;所述第三序列能与所述第一序列或第一序列的部分序列反向互补,所述第四序列能与所述第二序列或第二序列的部分序列反向互补。
本发明实施例提供的封闭探针通过与所述捕获探针或其部分反向互补结合,能够封闭捕获探针上结合目标小分子RNA的位点,置换捕获探针上捕获的目标RNA,使得被释放的目标RNA能够用于后续的测序文库的构建。
优选地,所述小分子DNA为长度<50nt的RNA。本发明不对小分子RNA的具体种类进行限定,只要是长度满足<50nt的RNA均可采用本发明的核酸组合物进行有效检测。
在无需提取总RNA的情况下,采用上述核酸组合物可以一步从生物样本中完成目标小分子RNA的提取并直接进行测序文库的构建。具有快速、灵敏、高效的优点,可以高通量地实现多种小分子RNA的检测。
本文中的“单链寡核苷酸”可以选自oligo dA、oligo dT、oligo dC和oligo dG中的任意一种,优选为oligo dT。当单链寡核苷酸为oligo dT时,第一序列中,与所述单链寡核苷酸反向互补的序列为Poly A。单链寡核苷酸固定在固相载体的表面,与固相载体共价偶联。
在小分子RNA的捕获过程中,所述捕获探针能够通过第二序列,特异性识别并结合目标小分子RNA;在固相分离过程中,捕获探针通过互补配对,结合固相载体上共价偶联的单链核苷酸,吸附于固相载体表面,固相载体优选为磁珠,经过磁珠吸附作用,连同目标小分子RNA从样本中分离。
磁珠包括但不限于表面偶联有Oligo d(T)的磁珠(如:NEB S1419S、Thermo61005)、表面偶联有链霉亲和素的磁珠(如NEB S1420S,Thermo60210,Thermo 65001)、表面无偶联基团但是可以经过加工后偶联基团的磁珠(如:NH3偶联或者COOH偶联,Thermo65011),或者上述磁珠经制备加工后的产物,磁珠要求为大小均一、单分散的超顺磁性微粒,由SiO2、聚苯乙烯、琼脂糖中一种高分子层包裹磁性材料形成,表面共价偶联靶向性生物分子或有表面活化基团,平均粒径分布在1-3μm范围之间。
本文中的“目标小分子RNA”同“靶标小分子RNA”和“靶基因”,其可以为来源于生物体内存在的小分子RNA,或基因数据库中的小分子RNA,或人工合成的小分子RNA。
本发明不对捕获探针以及封闭探针的条数进行限制,可根据具体需要检测的靶标进行设置,不同靶标分别对应不同的捕获探针和封闭探针,多种捕获探针和封闭探针在实际操作的时候可以制成探针池,以同时实现对多个靶标小分子RNA进行建库检测。
优选地,所述样本可以为生物样本也可以为环境样本,生物样本包括但不限于:血清、血浆、富血小板血浆、尿液、肺泡灌洗液等无细胞体液样本,组织样本以及细胞样本。
优选地,所述第一序列还包括有连接序列,所述与单链寡核苷酸反向互补的序列通过所述连接序列与所述第二序列相连。需要说明的是,在一些实施例中,第一序列也可以不包含连接序列,当不包含连接序列时,与单链寡核苷酸反向互补的序列直接与所述第二序列相连。
本文中的连接序列可以选自现有已知的用于连接的linker,连接序列的长度优选为0~30nt。
优选地,与所述单链寡核苷酸反向互补的序列的长度为10-100nt。具体地,单链寡核苷酸的长度可以为10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt和100nt中的任意长度。在该范围内,捕获建库效率较好,若是与所述单链寡核苷酸反向互补的序列过长,会导致非特异性捕获。
优选地,10nt≤所述第二序列的长度≤靶基因序列的长度。在该范围内,捕获探针更有效地发挥其技术效果。
更优选地,所述第二序列的长度为15~21nt。在此范围内,捕获建库效率更佳。
优选地,所述捕获探针和/或所述封闭探针的3’末端有封闭修饰。封闭修饰用于阻止捕获探针或封闭探针进行延申和/或连接反应。
优选地,所述封闭修饰包括:磷酸化修饰、C3或C6 Spacer修饰、双脱氧胞嘧啶核苷和氨基修饰中的至少一种。
此外,本发明实施例还提供了一种用于提取或检测样本中小分子RNA的试剂盒,其包括:如前述任意实施例所述的用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物。
优选地,所述试剂盒还包括:RNA提取液、RNA酶抑制剂、缓冲液、稀释液、洗杂液和洗脱液中的至少一种试剂。
优选地,提取液中含有RNA酶抑制剂,该抑制剂可以是盐酸胍、尿素、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物、8-羟基喹啉中的一种或几种,其浓度范围可以在0.05-8mol/L之间。
优选地,提取液中还可以含有0.05-20%的表面活性剂,该表面活性剂可以是PEG200、Triton X-100、Tween 20、SDS、LDS、SLS、NP-40中的一种或几种。
优选地,提取液中还可以含有巯基试剂,该巯基试剂可以是二硫苏糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、2-巯基乙醇、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐中的一种或几种。
优选地,配制提取液所用的缓冲液,由商品化的Tris-HCl、NaCl、PBS、NaOH中一种或几种盐溶液配制而成,其浓度范围可以在0.01-10mol/L之间,其酸碱度范围在pH 6.0-9.0之间。
可选地,稀释液可以由商品化的Tris-HCl、NaCl、LiCl、KCl、EDTA二钠、PBS、NaOH中一种或几种盐溶液配制而成,其浓度范围可以在0.001-5.0mol/L之间,其酸碱度范围在pH6.0-9.0之间。
洗杂液可包括洗杂液I-IV:
洗杂液I由商品化的Tris-HCl、LiCl、EDTA二钠、NaCl、NaOH、LDS、SDS、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇中一种或几种试剂配制而成,其浓度范围可以在0.001-2mol/L之间,其酸碱度范围在pH 7.0-8.5之间;
洗杂液II由商品化的Tris-HCl、LiCl、EDTA二钠、NaCl、NaOH、LDS、SDS中一种或几种盐溶液配制而成,其浓度范围可以在0.001-1mol/L之间,其酸碱度范围在pH 7.0-8.5之间;
洗杂液III由商品化的Tris-HCl、LiCl、EDTA二钠、NaCl、NaOH中一种或几种盐溶液配制而成,其浓度范围可以在0.001-1mol/L之间,其酸碱度范围在pH 7.0-8.5之间;
洗杂液IV由商品化的Tris-HCl、NaCl、MgCl2、KCl、二硫苏糖醇、2-巯基乙醇中一种或几种盐溶液配制而成,其浓度范围可以在0.001-0.1mol/L之间,其酸碱度范围在pH 7.0-8.5之间;
优选地,洗脱液可以是无核酶水,也可以是含有低浓度盐离子的水。
提取RNA后的生物样本,可再加入0.05-20%的表面活性剂,配合商品化DNA提取试剂盒,继续提取DNA,该表面活性剂可以是PEG200、Triton X-100、Tween 20、SDS、LDS、SLS和NP-40中的一种或几种。
本发明实施例还提供了一种目标核酸的提取方法,其包括采用如前述任意实施例所述的用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物或如前述任意实施例所述的用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物对样本中的目标小分子RNA进行提取。
优选地,当所述目标核酸包括小分子RNA和具有Poly A结构的RNA时,所述提取方法包括:先采用所述核酸组合物中的固相载体对具有Poly A结构的RNA进行提取,再采用所述核酸组合物对样本中的小分子RNA进行提取。所述具有Poly A结构的RNA包括mRNA和lncRNA中的至少一种。
对小分子RNA的提取步骤包括:将核酸组合物中的捕获探针与样本混合,使得捕获探针对样本中的目标小分子RNA进行捕获,形成捕获探针-小分子RNA复合物;
将捕获探针与样本混合后的产物与固相载体混合,使得固相载体能够对所述捕获探针-小分子RNA复合物进行富集;
将富集产物与核酸组合物中的封闭探针混合,以释放捕获探针捕获的目标小分子RNA。
优选地,所述捕获探针与所述样本的混合条件为:温度为50~70℃,时间为1~30min;
优选地,所述封闭探针与所述富集产物的混合条件为:温度为60~80℃,时间为0.1~10min。
优选地,将所述捕获探针与样本混合前,所述提取方法还包括对捕获探针进行变性,变性的条件:温度为70~100℃,时间为0.1~5min。探针自身或相互间可能形成二级结构,使用前需变性打开探针的二级结构。
本发明实施例还提供了一种核酸测序文库的构建方法,其包括:采用前述任意实施例所述的小分子RNA的提取方法对样本中的目标小分子RNA进行提取,对提取产物连接两端接头并扩增,获得测序文库。
此外,本发明实施例还提供了一种小分子RNA的检测方法,其包括:对如前述任意实施例所述的测序文库的构建方法构建的测序文库进行检测或测序。
对提取产物小分子RNA或其测序文库进行检测的方式可以为qRT-PCR,测序的方法可以选用现有测序的方法,不再赘述。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种用于提取或检测样本中小分子RNA的试剂盒,包括核酸组合物,核酸组合物包括硅基磁珠(固相载体)、捕获探针和封闭探针。
(1)捕获探针和磁珠
磁珠上固定有单链寡核苷酸(SEQ ID No.1:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)。
所述捕获探针为单链DNA序列,具体包括相互连接的第一序列和第二序列。第一序列包括有与所述单链寡核苷酸反向互补的序列,第二序列能与所述靶基因或其部分反向互补。需要说明的是,第一序列还可以包括连接序列,当包括有连接序列时,与单链寡核苷酸反向互补的序列通过所述连接序列与所述第二序列相连。
本实施例以cel-miR-39-3p及hsa-miR-16-5p为靶基因,所述捕获探针序列如下表所示。
表1捕获探针
备注:1、表1中下画直线的部分为与所述靶基因反向互补的序列;下画虚线的部分为与单链寡核苷酸反向互补的序列;2、所有捕获探针序列的3’末端均进行封闭修饰,本实施例中使用磷酸化修饰(-P)。
需要说明的是,在其他实施例中,可以针对多个靶标基因,设计不同的捕获探针。
(2)封闭探针
封闭探针为单链核酸序列,包括相互相连的第三序列和第四序列。所述第三序列能与所述第一序列或第一序列的部分序列反向互补,所述第四序列能与所述第二序列或第二序列的部分序列反向互补。本实施例以cel-miR-39-3p及hsa-miR-16-5p为靶基因,所述封闭探针序列如表2所示。
表2封闭探针
备注:1、下划直线部分第四序列;2、双下划线部分为第三序列;3、每条封闭探针序列3’末端都进行封闭修饰,该示例中使用磷酸化修饰(-P)。
(3)所述试剂盒还包括:提取液、稀释液、洗杂液I、洗杂液II、洗杂液III、洗杂液IV以及洗脱液。
提取液:1.00M异硫氰酸胍,61.54mM Tris-HCl pH 8.0,1.00%SLS,5.00mM DTT;
提取液也可为:4.14M异硫氰酸胍,255mM Tris-HCl pH 8.0,4.14%SLS,20.7mMDTT;
稀释液:35mM Tris-HCl pH 8.0,1.28M LiCl,12.8mM EDTA;
洗杂液I:100mM Tris-HCl pH 7.5,500mM LiCl,10mM EDTA,0.1%LDS,5mM DTT;
洗杂液II:10mM Tris-HCl pH 7.5,150mM LiCl,1mM EDTA,0.1%LDS;
洗杂液III:10mM Tris-HCl pH 7.5,150mM LiCl,1mM EDTA;
洗杂液IV:50mM Tris-HCl pH 8.3,3mM MgCl2,75mM KCl,10mM DTT;
洗脱液:10mM Tris-HCl pH 7.5。
需要说明的是,上述各组分的浓度均为其在各自溶液中的终浓度。
实施例2
一种提取样本中的靶标小分子RNA并构建测序文库的方法,具体包括以下步骤。
(1)样本提取
以血浆样本为例,提取生物样本中的小分子RNA:取-20℃或-80℃冷冻保存或新鲜分离的血浆,依次向低吸附离心管中加入提取液与蛋白酶K,具体试剂体积可参照表3,充分混匀后,65℃孵育20min。
表3提取液以及蛋白酶K的体积
(2)捕获探针池变性:靶基因捕获探针池为多条探针混合液,探针自身或相互间可能形成二级结构,使用前需变性打开二级结构。取探针池适量,95℃2min变性,立即置于冰上冷却2min。
(3)依次加入稀释液和变性后的靶基因捕获探针池,体系可参照表4,充分混匀后,65℃孵育10min。向混合液中,加入Oligo dT磁珠,室温颠倒孵育30min,将孵育后的样品置于磁力架上磁吸分离,依次使用洗杂液I、II、III、IV清洗磁珠,弃上清。
表4稀释液以及磁珠溶液体积
(4)测序文库构建:向捕获产物中加入50pmol的封闭探针池,以及3’端单链接头,置于提前预热至70℃的金属浴中反应2min,反应结束后立即取出置于冰上2min。
通过磁吸分离磁珠,转移上清至新的干净的离心管中,加入连接酶及反应液,进行3’端接头连接。使用小分子RNA建库试剂盒(VAHTS Small RNA Library Prep Kit forIllumina),进行5’端接头连接、cDNA合成、文库扩增及纯化操作,最后获得二代测序文库。
实施例3
以血浆样本为例,本实施例提供一种共提取Poly A结构的RNA(mRNA)与小分子RNA并构建测序文库的方法,采用实施例1提供的试剂盒,先通过Oligo dT磁珠上的dT序列,特异性捕获裂解血浆样本中的polyA结构RNA(主要为mRNA与lncRNA),通过第一次磁吸分离出polyA结构RNA,而后再加入本专利所述的捕获探针与Oligo dT磁珠,参见实施例2方法,通过第二次磁吸作用,捕获小分子RNA,具体步骤如下。
(1)取-20℃或-80℃冷冻保存或新鲜分离的血浆,依次向低吸附离心管中加入提取液与蛋白酶K,具体试剂体积可参照表3,充分混匀后,65℃孵育20min。
(2)依次加入稀释液,体系可参照表4,充分混匀后,向上述混合液中,加入OligodT磁珠,室温颠倒孵育30min,将孵育后的样品置于磁力架上磁吸分离。转移上清至干净低吸附离心管中,进入本实施例中步骤(5)的目标小分子RNA提取;磁珠依次使用洗杂液I、II、III、IV清洗磁珠,后续进行本实施例中步骤(3)的PCR检测或测序文库构建。
(3)Poly A结构RNA的PCR检测或转录组文库构建:直接用III RTSuperMix for qPCR(Vazyme,R323-01)试剂盒,对上述洗杂后磁珠-RNA逆转录,而后使用SYBR FAST Master Mix kits(KAPA,K4601)试剂盒进行qPCR,检测基因的表达水平;或直接使用RNA文库构建试剂盒(VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina),进行二代测序文库构建。
(4)捕获探针池变性:靶基因捕获探针池为多条探针混合液,探针自身或相互间可能形成二级结构,使用前需变性打开二级结构。取探针池适量,95℃2min变性,立即置于冰上冷却2min。
(5)向步骤(2)上清溶液中加入变性后的捕获探针池,体系可参照表5,充分混匀后,65℃孵育10min。向上述混合液中,加入Oligo dT磁珠,室温颠倒孵育30min,将孵育后的样品置于磁力架上磁吸分离,依次使用洗杂液I、II、III、IV清洗磁珠,弃上清。
表5体系
(6)文库构建:向捕获产物中加入50pmol的封闭探针池,以及3’端单链接头(建库试剂盒提供),置于提前预热至70℃的金属浴仪中反应2min,反应结束后立即取出置于冰上2min。通过磁吸作用分离磁珠,转移上清至新的干净的离心管中,加入连接酶及反应液,进行3’端接头连接。使用小分子RNA建库试剂盒(VAHTS Small RNA Library Prep Kit forIllumina),进行5’端接头连接、cDNA合成、文库扩增及纯化操作,最后获得二代测序文库。
验证例1:验证实施例2提供的测序文库的构建方法的有效性。
基于实施例2所述的方法,提取单一小分子RNA并建库。本实施例以cel-miR-39-3p为靶基因,靶基因序列、靶基因捕获探针及封闭探针序列如表6所示,“-P”表示序列3’末端存在磷酸化修饰。
表6 cel-miR-39-3p的捕获探针及封闭探针的序列
根据靶基因序列,以及文库构建过程中,测序接头及文库标签序列推测,测序文库理论结构如图2所示。
捕获靶基因为cel-miR-39-3p,其序列为插入片段,在附图中,以单下划线标注。该二代测序文库标签为Index 3#,其序列以斜体加单下划线标注。该文库理论序列长度为141bp。
对建库产物进行片段分布检测,见图3,产物片段为142bp,考虑仪器检测信号偏移等因素影响,其片段分布与理论一致。
由于仅提取单一的miRNA并进行建库,其文库序列单一,进行一代测序验证其序列。一代测序结果见图4。
一代测序结果显示,文库的插入片段与靶标miRNA,即cel-miR-39-3p的序列一致;且其上的文库标签,与所使用的Index序列一致,说明建库产物为理论文库;一代测序背景干净,说明文库产物片段单一,未含有的捕获探针与封闭探针形成的非特异片段。以上结果说明,该提取建库方法可行。
验证例2:不同探针结构捕获建库的效果。
验证不同结构捕获探针,即是否存在连接序列,对捕获建库效率的影响。使用实施例2所述的方法,提取小分子RNA并建库。
本实施例提取的靶标小分子RNA的靶基因序列、捕获探针及封闭探针序列如表7所示。提取时,混合相同结构探针为一个探针池。建库时,混合所有封闭探针为一个探针池。
表7捕获探针和封闭探针
通过不同的捕获探针池与封闭探针池组合,比较不同探针结构对小分子RNA提取及建库的效率差别。建库产物进行Qsep片段分布检测,根据特征信号峰(140-142bp)浓度大小,比较提取及建库效率。
结果参照图5。Qsep片段分布结果显示,两种结构的捕获探针,都可以成功捕获建库。两者的特征信号峰浓度相当,其中,有连接序列的捕获探针结构,效率略高。无连接序列的文库背景更干净,探针合成成本更低。
验证例3:封闭探针对测序文库构建的影响。
参见实施例2所述方法,使用不同捕获探针池提取靶基因并建库(参照验证例2),并设置在建库前未使用封闭探针池封闭捕获探针(Panel+BLK-)的对照例。然后对建库产物进行片段分布检测,根据是否出现特征信号峰(140-142bp),判断建库是否成功。
结果如图6所示。片段分布结果显示,未加封闭探针的两个对照组(图6中C、D),均未有特征信号峰出现,说明二代测序文库构建失败。上述结果说明,该小分子RNA的捕获提取方法,必须要加入封闭探针(图6中A、B),才能成功构建二代测序文库。
本验证例还通过二代测序方法,验证封闭探针的必要性。选用商品化总RNA提取试剂盒ZYMO Quick-cfRNATM Serum&Plasma Kit(货号:R1059)作为本方法对照,二者均添加等量的外源miRNA参考品cel-lin-4-5p与cel-miR-39-3p。本方法参见实施例3所述进行操作。区别在于:捕获探针池中,添加cel-lin-4-5p与cel-miR-39-3p的捕获探针;封闭探针池中,不添加cel-lin-4-5p的封闭探针。测序及分析结果如表8所示。
表8两种方法提取小分子RNA以及测序分析结果
二代测序结果显示,在未添加cel-lin-4-5p的封闭探针的情况下,该miRNA的Reads数显著减少,无法被建库测序,说明加入封闭探针的必要性。
验证例4:探针3’末端封闭修饰对测序文库构建的影响。
参照实施例2所述的方法,使用表9所示的两种不同的捕获与封闭探针池组合1与组合3,提取小分子RNA并建库。两种探针序列完全一致,区别在于组合3的捕获与封闭探针3’末端封闭修饰,组合1的探针3’末端有封闭修饰,本验证例中使用磷酸化修饰(-P)。
表9捕获探针以及封闭探针的序列
捕获建库产物进行片段分布检测,根据信号峰分布情况,判断捕获建库效果。结果如图7所示。
由结果可知,发现无磷酸化修饰的组别的Qsep背景杂乱,有弥散的非特异产物。说明封闭修饰可以阻止捕获或封闭探针在建库过程中进行延申或/和连接反应,而未修饰的捕获与封闭探针,会干扰靶标小分子RNA建库,影响目的产物建库效率,同时还会诱发体系内发生非特异的连接扩增。上述结果说明,捕获或封闭探针都必须进行封闭修饰。
验证例5:不同长度的与单链寡核苷酸反向互补的序列,对提取效率的影响。
参见实施例2所述方法,使用Poly A(与单链寡核苷酸反向互补的序列)长度分别为50、30、15和10的捕获探针,提取小分子RNA并建库。建库产物进行Qsep片段分布检测,根据特征信号峰(140-142bp)浓度大小,比较提取及建库效率。结果见图8。
片段分布结果显示,Poly A长度为30nt的捕获探针,其峰浓度最高,捕获建库效率最佳。Qsep结果显示,Poly A长度越长,文库背景的杂峰越多,说明过长的Poly A会导致非特异捕获,或者干扰建库过程,导致非特异产物产生。上述结果说明,选用Poly A长度为30nt的捕获探针最佳。
验证例6:验证实施例2提供的方法捕获小分子RNA并建库的特异性。
基于实施例2的方法,设置A、B、C三个组别,其中,A组只加外参,但不加入捕获或封闭探针;B组加入外参与捕获探针,但不加入封闭探针;C组加入外参与封闭探针,但不加入捕获探针。
结果参照图9。如图所示,A组在122bp位置出现非特征信号峰,为引物二聚体峰,在140~142bp位置,均未出现特征信号峰。上述结果表明,在该捕获建库检测体系中,捕获探针与封闭探针缺一不可。
验证例7:验证实施例3提供的方法共捕获mRNA与小分子RNA并建库的可行性。
设置A、B两个组别,其中,A组直接提取血浆中的miRNA(步骤同实施例2);B组在先提取血浆中的mRNA后再提取miRNA(步骤同实施例3)。
结果参照图10。如图所示,A组共提取的mRNA,其qPCR扩增产物片段在理论值271bp位置出现特征信号峰,其共提取miRNA文库在140~142bp位置,出现特征信号峰,且与B组直接提取miRNA的文库相比,其特征信号峰浓度相当。上述结果表明,该方法可以共提取mRNA与小分子RNA。
验证例8:不同长度的第二序列,对提取效率的影响。
参见实施例2所述的方法,使用第二序列(与靶基因小分子RNA反向互补的序列)长度分别为22nt、19nt和16nt的捕获探针,提取miRNA并建库。建库产物进行Qsep片段分布检测,根据特征信号峰(140-142bp)浓度大小,比较提取及建库效率。结果见图11。
片段分布结果显示,第二序列长度为19nt的捕获探针,其峰浓度最高,捕获建库效率最佳。Qsep结果显示,当第二序列与靶基因miRNA完全互补时(22nt),特征信号峰消失,说明完全互补的第二序列,会干扰建库过程。上述结果说明,选用第二序列长度为19nt的捕获探针最佳。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 福建和瑞基因科技有限公司
北京和瑞精湛医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttttttt tttttttttt ttttt 25
<210> 2
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctgatttac acccggtgac tgcgacgaag gacaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 83
<210> 3
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatttacacc cggtgactgc gacgaaggac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 80
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gatttacacc cggtgactgc gacgaaggac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatttacacc cggtgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaa 66
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gccaatattt acgtgctgct actgcgacga aggacaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 85
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tatttacgtg ctgctactgc gacgaaggac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 80
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
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tatttacgtg ctgctactgc gacgaaggac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tatttacgtg ctgctaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaa 66
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtccttcgtc gcagtcaccg ggtgtaaatc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tttttttttt tttttcaccg ggtgtaaatc 30
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gtccttcgtc gcagtagcag cacgtaaata 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tttttttttt tttttagcag cacgtaaata 30

Claims (16)

1.一种用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物,其特征在于,其包括:固相载体、捕获探针与封闭探针;
所述固相载体上固定有单链寡核苷酸;
所述捕获探针为单链核酸序列,包括有相互连接的第一序列和第二序列;所述第一序列包括有与所述单链寡核苷酸反向互补的序列,所述第二序列能与靶基因或靶基因的部分序列反向互补;
所述封闭探针为单链核酸序列,包括相互连接的第三序列和第四序列;所述第三序列能与所述第一序列或第一序列的部分序列反向互补,所述第四序列能与所述第二序列或第二序列的部分序列反向互补;
在所述第一序列中,所述与所述单链寡核苷酸反向互补的序列为polyA,其长度为30nt;
所述第二序列的长度为16~19nt;
所述捕获探针和所述封闭探针的3’末端有封闭修饰。
2.根据权利要求1所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物,其特征在于,所述第一序列还包括有连接序列,与单链寡核苷酸反向互补的序列通过所述连接序列与所述第二序列相连。
3.根据权利要求1所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物,其特征在于,所述小分子RNA为长度<50nt的RNA。
4.根据权利要求1~3任一项所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物,其特征在于,所述固相载体选自有磁珠、硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物,其特征在于,当所述固相载体为磁珠时,所述磁珠为oligo dT磁珠。
6.根据权利要求1所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物,其特征在于,所述封闭修饰包括:磷酸化修饰、C3或C6 Spacer修饰、双脱氧胞嘧啶核苷和氨基修饰中的至少一种。
7.一种用于提取样本中小分子RNA的试剂盒,其特征在于,其包括:如权利要求1~6任一项所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物。
8.根据权利要求7所述的用于提取样本中小分子RNA的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括:RNA提取液、RNA酶抑制剂、缓冲液、稀释液、洗杂液和洗脱液中的至少一种试剂。
9.一种目标核酸的提取方法,其特征在于,其包括采用如权利要求1~6任一项所述的用于提取样本中小分子RNA的核酸组合物或如权利要求7或8所述的用于提取样本中小分子RNA的试剂盒对样本中的目标小分子RNA进行提取。
10.根据权利要求9所述的目标核酸的提取方法,其特征在于,当所述目标核酸包括小分子RNA和具有Poly A结构的RNA时,所述提取方法包括:先采用所述核酸组合物中的固相载体对具有Poly A结构的RNA进行提取,再采用所述核酸组合物对样本中的小分子RNA进行提取。
11.根据权利要求9或10所述的小分子RNA的提取方法,其特征在于,对小分子RNA的提取步骤包括:将核酸组合物中的捕获探针与样本混合,使得捕获探针对样本中的目标小分子RNA进行捕获,形成捕获探针-RNA复合物;
在捕获探针与样本混合后的产物与固相载体混合,使得固相载体能够对所述捕获探针-RNA复合物进行富集;
将富集产物与核酸组合物中的封闭探针混合,以释放捕获探针捕获的目标小分子RNA。
12.根据权利要求11所述的小分子RNA的提取方法,其特征在于,所述捕获探针与所述样本的混合条件为:温度为50~70℃,时间为1~30min。
13.根据权利要求11所述的小分子RNA的提取方法,其特征在于,所述封闭探针与所述富集产物的混合条件为:温度为60~80℃,时间为0.1~10min。
14.根据权利要求11所述的小分子RNA的提取方法,其特征在于,将所述捕获探针与样本混合前,所述提取方法还包括对捕获探针进行变性,变性的条件:温度为90~100℃,时间为0.1~5min。
15.一种测序文库的构建方法,其特征在于,其包括采用权利要求9~14任一项所述的小分子RNA的提取方法对样本中的目标小分子RNA进行提取,对提取的产物连接接头后扩增,获得测序文库。
16.一种小分子RNA的检测方法,其特征在于,其包括:对如权利要求15所述的测序文库的构建方法构建的测序文库进行检测或测序。
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