CN105886608B - ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及DNA检测技术领域,提供了一种ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法,其中包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组;检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO:1‑4中的任一种序列,检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO:5‑8中的任一种序列;检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO:9‑12中的任一种序列,检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQ ID NO:13‑16中的任一种序列。本发明的引物组、试剂盒及方法能够提高ApoE基因检测过程中正确信号的比例。
Description
技术领域
本发明涉及DNA检测技术领域,更具体地说,涉及一种APOE基因引物组、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
ApoE基因与多种心脑血管疾病密切相关,其编码的载脂蛋白E(ApolipoproteinE,ApoE)参与高血脂症、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病的整个发生发展过程,ApoE基因多态性是这些疾病早期及发展过程中个体差异的主要原因。
根据ApoE表型提出ApoE基因模型,认为ApoE的合成是由位于一个基因位点上的三个等位基因所控制,即E2、E3和E4,每一个等位基因对应于一个主要异构体产生三种纯合子(E2/2,E3/3,E4/4)和三种杂合子(E2/3,E2/4,E3/4)共六种常见表型。ApoE3/3型又称野生型。ApoE是一个多态性蛋白,有三个常见的异构体,即E2、E3和E4。ApoE的氨基酸序列的112位(Cys112Arg,rs429358,以下简称358)和158位(Arg158Cys,rs7412,以下简称412)两种氨基酸残基即精氨酸(Arg)和半胱氨酸(Cys)的交换决定了异构体的种类。ApoE4在这两个位置上都是Arg;E2都是Cys;112位为Cys和158位是Arg者为ApoE3异构体。自然人群中,基因频率E3分布最高,ApoE3/3表型分布约70%。
另外国内外多项研究发现,ApoE基因是目前已知的阿尔茨海默病最密切的遗传标志物,ApoE4携带者阿尔茨海默病的易感性增加。ApoE突变后,其与LDL-R的亲和力发生改变。携带一个E4等位基因的个体其发展为AD的可能性高于无E4等位基因的个体约3-4倍。E4等位基因在普通人群中比例大约为15%,而在AD患者中的比例可达40%。ApoE4是AD的重要危险因素。通过检测ApoE的基因型,可了解是否为AD易感人群,继而从病因学延缓AD的发生、发展;并定期检查,以便早诊断、早治疗、最大程度的降低疾病造成的损害。
目前对基因突变和基因多态性的检测,常见有直接测序法、基因芯片杂交法、Taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法(Amplification Refractory MutationSystem Real Time PCR,ARMS-RT PCR)、等位基因特异性扩增法(AmplificationRefractory Mutation System Real Time PCR,ARMS-RT PCR)等。
其中,直接测序法准是突变分析的金标准,能发现已知突变和未知突变,其包括以Sanger技术为基础的第一代测序技术,和具有高通量、低成本特点的第二代高通量测序技术。第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中,所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的,以待测序核酸片段为模板,锚定引物(又称测序引物,其与待测序核酸片段所在链互补)和寡核苷酸探针(该探针的特定位置上带有荧光标记)进行连接反应,通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的,以待测序核酸片段为模板,锚定引物互补结合至待测序核酸片段上,通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。
因为在高通量基因测序过程中,某一位点的基因序列的测定,是通过观察成千上万甚至更多个待测模板在进行该位点检测时的信号,经统计分析后得出的,因此如何提高这些信号中正确信号的比例,对于降低分析的难度,解决假阳性或假阴性的问题是至关重要的。
因此需要一种新的ApoE基因检测引物、检测试剂盒和检测方法,以提高ApoE基因检测过程中正确信号的比例。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ApoE基因检测引物、检测试剂盒和检测方法,旨在解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。
为了实现发明目的,本发明提供了一种ApoE基因引物组,包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组;
所述检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列,所述检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8序列;
所述检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12序列,所述检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16序列。
优选的,所述检测rs429358位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述检测rs7412位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。
优选的,所述检测rs429358位点的引物组有两对,分别为358外引物对和358内引物对;所述检测rs7412位点的引物组有两对,分别为412外引物对和412内引物对;所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。
为了更好的实现本发明的目的,本发明还提供了一种ApoE基因检测试剂盒,所述试剂盒含有上述的任一种ApoE基因引物组。
优选的,所述试剂盒还包括无荧光标记的寡核苷酸探针。
优选的,所述试剂盒还包括连接缓冲液,所述连接缓冲液中含有PEG。
优选的,所述试剂盒还包括接头,所述接头用于直接与所述检测rs429358位点的引物组的扩增产物连接,也用于直接与所述检测rs7412位点的引物组的扩增产物连接。
更优选的,所述接头上含有标签序列。所述标签序列用于识别待测样本来源和所检测的SNP位点。
优选的,所述试剂盒还包括检测rs429358位点的锚定引物和检测rs7412位点的锚定引物。
更优选的,所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间,更优选在1至5bp之间。
更优选的,针对rs429358,所述锚定引物为SEQ ID NO:21,针对rs7412,所述锚定引物为SEQ ID NO:22。
更优选的,所述试剂盒还包括检测标签序列的锚定引物。
更优选的,针对标签序列,所述锚定引物为SEQ ID NO:23。
为了更好的实现本发明的目的,本发明还提供了一种基于上述任一种ApoE基因引物组的ApoE基因检测方法,包括以下步骤:
A、利用检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组分别对待测样本进行PCR扩增,得含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物;
B、将含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与接头连接,形成rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子,并将rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子分别通过微球可寻址的固定在固相载体上;
C、利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针,对固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子进行一次连接测序反应;
D、连接测序获得rs429358位点和rs7412位点的序列信息。
优选的,所述步骤C包括以下步骤:
C1、将检测rs429358位点的锚定引物和检测rs7412位点的锚定引物锚定在固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子上;
C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应;
C3、变性去除连接产物。
优选的,所述检测rs429358位点的引物组有两对,分别为358外引物对和358内引物对;所述检测rs7412位点的引物组有两对,分别为412外引物对和412内引物对;所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物含有可断裂位点;所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物含有可断裂位点
所述步骤A包括以下步骤:
A1、利用358外引物对和412外引物对分别对对待测样本进行PCR扩增,得358第一次扩增产物和412第一次扩增产物;
A2、以358第一次扩增产物和412第一次扩增产物为模板,分别利用358内引物对和412内引物对进行PCR扩增,得358第二次扩增产物和412第二次扩增产物。
更优选的,所述步骤B包括以下步骤:
B1、将358第二次扩增产物和412第二次扩增产物分别直接与固定在微球上的接头连接,得固定在微球上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子;
B2、将步骤B1所得微球可寻址的固定在固相载体上。
更优选的,所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的,所述切割-连接反应体系包括:连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液;
所述断裂剂,用于对核酸片段中的可断裂位点进行特异性切割,形成第一粘性末端;
所述第一接头为核酸分子,含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
更优选的,步骤B1中所述连接缓冲液中含有PEG。
由上可知,本发明的ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法能够提高ApoE基因检测过程中正确信号的比例,避免假阳性或假阴性问题的出现,提高检测准确率。
附图说明
图1是本发明一个具体实施例中第一接头的结构示意图。
图2是本发明一个具体实施例中第一接头的标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系图。
图3是本发明一个具体实施例中实验组测序流程图。
图4是本发明一个具体实施例中对照组测序流程图。
图5是本发明一个具体实施例中部分初步实验结果对照图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。
在本发明的第一典型实施例中,一种ApoE基因引物组,包括分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组;
所述检测rs429358位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列,所述检测rs429358位点的引物组中的下游引物具有SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8序列;
所述检测rs7412位点的引物组中的上游引物具有SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12序列,所述检测rs7412位点的引物组中的下游引物具有SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16序列。
需要说明的是,所述检测rs429358位点的引物组和所述检测rs7412位点的引物组均至少包括一对引物。
优选的,所述检测rs429358位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述检测rs7412位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。
本方案中,所述可断裂位点为核糖核苷酸,优选为U。本方案引物中的可断裂位点可通过扩增反应带入至扩增产物中的目标分子中,而这些目标分子可被特异性识别可断裂位点的断裂剂切割,从而形成第一粘性末端,从而可进一步的与相应的接头连接,提高连接效率。
所述断裂剂,用于对核酸片段中的可断裂位点进行特异性切割,形成第一粘性末端。所述核酸片段为双链核酸分子。
优选的,所述断裂剂为USER酶或RNase H。
优选的,上述方案中引物上的可断裂位点的3’端与其所在链5’末端的距离为1至8个碱基。更优选在2至4个碱基,本方案中的可断裂位点断裂后形成的粘性末端既能保证有较好的连接效率,在保证粘性末端自身之间的不相互配对的前提下,设计难度较小。
优选的,所述检测rs429358位点的引物组有两对,分别为358外引物对和358内引物对;所述检测rs7412位点的引物组有两对,分别为412外引物对和412内引物对;所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。
本方案中,两个SNP位点均有两套引物,可利用它们进行巢式PCR,进而提高所得扩增产物中目标片段的纯度。
在本发明的第二典型实施例中,一种ApoE基因检测试剂盒,含有上述的任一种ApoE基因引物组。
优选的,所述试剂盒还包括无荧光标记的寡核苷酸探针。
需要说明的是,所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的有荧光标记的寡核苷酸探针相比,序列完全相同,差别仅在于有无荧光标记;即,所述无荧光标记的寡核苷酸探针序列为(N-N-N……-N)n,所述N为A、G、C或T,n为正整数。
本发明的试剂盒能够有效的用于本发明的ApoE基因检测方法中,有效的减少连接测序中出现的错误信号,从而减少由测序初始结果到最终的序列信息的分析过程中的干扰信号,提高待测SNP位点的准确性。
优选的,所述n在6-10之间;更优选在7-9之间。
优选的,所述试剂盒还包括变性缓冲液,所述变性缓冲液为0.05M-0.15M 的NaOH溶液。
优选的,所述试剂盒还包括连接酶。
更优选的,所述连接酶为T4连接酶。
优选的,所述试剂盒还包括连接缓冲液。
更优选的,所述连接缓冲液中含有PEG。本方案中所述PEG能够提高连接效率。
优选的,所述试剂盒还包括接头,所述接头用于直接与所述检测rs429358位点的引物组的扩增产物连接,也用于直接与所述检测rs7412位点的引物组的扩增产物连接。
更优选的,所述接头上含有修饰标记,用于使其固定在微球上。
所述修饰标记可为生物素、亲和素、链霉亲和素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组氨酸、纳米金、碘乙酰、巯基、氨基、醛基、羧基、异硫氰基、硅烷基或丙烯酰胺,它们均能特异性的与相对应的基团或分子结合。
需要说明的是,所述接头可采用多种形式,包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。
所述平末端接头是指双链之间完全互补配对的双链核酸接头。优选的,所述平末端接头的两条链的5’末端均不含磷酸基团,其可避免连接过程中接头自连现象的出现,减少对后续测序实验的干扰,提高ApoE基因检测的准确率。
所述突出末端接头,是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列,而其余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端,也可以是含有两个突出末端的双突出末端,这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所述突出末端接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现,减少对后续测序实验的干扰,提高ApoE基因检测的准确率。
在一具体实施方式中,所述接头优选为单突出末端接头,且该突出末端为其所在链的3’末端,碱基为T;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接,提高连接效率。
所述分叉型接头包括互补区和分叉区,互补区双链的核苷酸互补配对,配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现,减少对后续测序实验的干扰,提高ApoE基因检测的准确率。
在本实施例的另一具体实施方式中,所述接头优选为互补区的3’末端为突出末端,且突出末端最后一个碱基为T的T末端分叉接头;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接,提高连接效率。
所述带茎环结构的接头,有多种实施方案。在一实施例中,该接头为单链核酸分子,该单链核酸分子依次包括第一互补配对区、茎环区和第二互补配对区,第一互补配对区能够与第二互补配对区完全互补配对。在另一实施例中,带茎环结构的接头还可带有突出末端,该突出末端可位于单链核酸分子的3’端。突出末端4的存在能够防止接头自连现象的发生,减少对后续测序实验的干扰,提高SNP分型检测的准确率。该突出末端优选为T;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接,提高连接效率。
更优选的,所述接头上含有标签序列。所述标签序列用于识别待测样本来源和所检测的SNP位点。
更优选的,所述接头为由SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20组成的双链核酸分子,所述接头中的NNNN为标签序列。
优选的,所述试剂盒还包括锚定引物。
优选的,所述试剂盒还包括检测rs429358位点的锚定引物和检测rs7412位点的锚定引物。
更优选的,所述锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间,更优选在1至5bp之间。
更优选的,针对rs429358,所述锚定引物为SEQ ID NO:21,针对rs7412,所述锚定引物为SEQ ID NO:22。
更优选的,所述试剂盒还包括检测标签序列的锚定引物。
更优选的,针对标签序列,所述锚定引物为SEQ ID NO:23。
在本发明的第三典型实施例,一种基于上述任一种ApoE基因引物组的ApoE基因检测方法,包括以下步骤:
A、利用检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组分别对待测样本进行PCR扩增,得含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物;
B、将含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与接头连接,形成rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子,并将rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子分别通过微球可寻址的固定在固相载体上;
C、利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针,对固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子进行一次连接测序反应;
D、连接测序获得rs429358位点和rs7412位点的序列信息。
需要说明的是,所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的有荧光标记的寡核苷酸探针相比,序列完全相同,差别仅在于有无荧光标记;即,所述无荧光标记的寡核苷酸探针序列为(N-N-N……-N)n,所述N为A、G、C或T,n为正整数。
所述可寻址的固定,是指能够确定位置信息的固定。即,固定载体上每一具体位置上所固定的待测序文库分子与其它具体位置上所固定的待测序文库分子是能够明确区分的。
每一次连接测序反应均包括以下步骤:锚定引物锚定,冲洗(除去多余的未锚定引物),探针连接,冲洗(除去多余探针、连接酶等),采图(获得探针上荧光标记所对应位置的序列信息),变性洗脱连接产物(以便下一次连接测序反应中锚定引物的锚定)。步骤C中的连接测序反应,因为使用的是无荧光标记的寡核苷酸探针,因此可不进行采图步骤,以减少实验步骤,提高实验效率。当然,如果进行采图步骤,可验证该次使用的荧光探针是否是无荧光标记的,起到一个再次确认的效果。
虽然,从理论上来说,步骤C中锚定引物与无荧光标记的寡核苷酸案子会被洗脱去除,无法起到封闭的作用,但是,本申请发明人在具体实验中对比发现,在连接测序前,增加一个使用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的探针进行一次连接测序反应的步骤,有效的减少在后续的连接测序中出现的错误信号,从而减少由测序初始结果到最终的序列信息的分析过程中的干扰信号,提高待测SNP位点检测的准确性。具体原因可能是非锚定引物的目标结合位点和/或非探针的目标结合位点,经过步骤C后被封闭,使得在后续的连接测序实验中,锚定引物和/或探针能够更多更准确的结合在目标结合位点上,从而减少了错误信号的产生。
优选的,所述n在6-10之间;更优选在7-9之间。
更优选的,所述无荧光标记的寡核苷酸探针与步骤D中的有荧光标记的寡核苷酸探针序列完全相同,差别仅在于有无荧光标记。本方案可有效降低无荧光标记的寡核苷酸探针的设计难度。
优选的,所述步骤C包括以下步骤:
C1、将检测rs429358位点的锚定引物和检测rs7412位点的锚定引物锚定在固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子上;
C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应;
C3、变性去除连接产物。
对于步骤C3中变性去除连接产物需要说明的是,步骤C3所述连接产物为锚定引物与无荧光标记的寡核苷酸探针的连接产物,为单链核酸分子,可与待测序文库分子互补配对。所述变性既可以通过物理的方法实现,例如提高双链核酸分子(待测序文库分子与连接产物)所处的温度,也可以通过化学的方法实现,例如改变双链核酸分子(待测序文库分子与连接产物)所处的pH值。其中,采用化学方法,只需加入酸性或碱性的试剂即可,无需额外的加热部件,能够更简单有效的实现自动化。
优选的,所述步骤C3为:用0.05M-0.15M NaOH冲洗。
对于所述步骤B,需要说明的是,其可有多种实施方案,以下将通过多个实施例来进行说明。
在本发明的一个实施例中,所述步骤B包括以下步骤:
B1、将含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与接头连接,形成rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子,然后将rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子分别固定在微球上,得固定在微球上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子;
B2、将步骤B1所得微球可寻址的固定在固相载体上。
在本发明的另一个实施例中,所述步骤B包括以下步骤:
B1、将含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与固定在微球上的接头连接,得固定在微球上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子;
B2、将步骤B1所得微球可寻址的固定在固相载体上。
需要说明的是,在上述两个实施例中,所述接头上含有修饰标记,用于使其固定在微球上;与前一实施例相比,后面的实施例中的接头被预先固定在微球上,减少了连接产物与微球连接的步骤,实验效率更高。
另外,所述修饰标记可为生物素、亲和素、链霉亲和素、抗原、抗体、受体、配体、多聚组氨酸、纳米金、碘乙酰、巯基、氨基、醛基、羧基、异硫氰基、硅烷基或丙烯酰胺,它们均能特异性的与相对应的基团或分子结合。
需要说明的是,所述接头可采用多种形式,包括但不限于平末端接头、突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。
所述平末端接头是指双链之间完全互补配对的双链核酸接头。优选的,所述平末端接头的两条链的5’末端均不含磷酸基团,其可避免连接过程中接头自连现象的出现,减少对后续测序实验的干扰,提高ApoE基因检测的准确率。
所述突出末端接头,是指双链核酸分子中的至少一端带有突出核苷酸序列,而其余核苷酸则完全互补的双链核酸接头。突出末端接头可为单突出末端,也可以是含有两个突出末端的双突出末端,这两个突出末端可在一条核苷酸链上或在不同的核苷酸链上。所述突出末端接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现,减少对后续测序实验的干扰,提高ApoE基因检测的准确率。
在一具体实施方式中,所述接头优选为单突出末端接头,且该突出末端为其所在链的3’末端,碱基为T;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接,提高连接效率。
所述分叉型接头包括互补区和分叉区,互补区双链的核苷酸互补配对,配对的核苷酸对数不限。互补区末端可为平末端或突出末端。所述分叉型接头能够避免连接过程中接头自连现象的出现,减少对后续测序实验的干扰,提高ApoE基因检测的准确率。
在本实施例的另一具体实施方式中,所述接头优选为互补区的3’末端为突出末端,且突出末端最后一个碱基为T的T末端分叉接头;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接,提高连接效率。
所述带茎环结构的接头,有多种实施方案。在一实施例中,该接头为单链核酸分子,该单链核酸分子依次包括第一互补配对区、茎环区和第二互补配对区,第一互补配对区能够与第二互补配对区完全互补配对。在另一实施例中,带茎环结构的接头还可带有突出末端,该突出末端可位于单链核酸分子的3’端。突出末端4的存在能够防止接头自连现象的发生,减少对后续测序实验的干扰,提高SNP分型检测的准确率。该突出末端优选为T;该接头能够与通过Taq酶扩增的含A尾的PCR扩增产物直接连接,提高连接效率。
更优选的,所述接头上含有标签序列。所述标签序列用于识别待测样本来源和所检测的SNP位点。
因为步骤B中固定有接头的微球的密度可能会与步骤B反应体系中的其他成分的密度不同,所以,在连接过程中,使整个反应体系周期性震荡,可有效提高固定在微球上的接头与步骤A所得扩增产物的连接效率,避免反应体系中各成分分层而引起的连接效率低现象的出现。
当然,在本发明的另外一个实施例中,为了解决上述问题,在步骤B中的连接反应体系中加入PEG。
因为步骤B中,含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与接头连接;即不经纯化,直接进行连接反应,这使得反应体系较大,DNA分子浓度较低,而PEG既能够提高反应体系中发生反应的分子的有效密度,提高接头与相应的扩增产物之间接触的概率;又能提高反应体系的密度,防止固定有接头的微球沉降;本方案从两个方面有效提高了固定在微球上的接头与含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物的连接效率。本方案中,PEG的具体浓度可根据所述步骤B中微球的密度和原反应体系的密度来计算,以使微球的密度与加入PEG后的反应体系的密度基本相同为宜。
在本发明的一个具体实施例中,步骤B1中所述连接缓冲液中含有2%-15% PEG4000或2%-15% PEG6000或2%-15% PEG8000。
在本发明的另一个具体实施例中,步骤B1中所述连接缓冲液中含有5%-10%PEG4000或5%-10% PEG6000或5%-10% PEG8000。
在本发明的一个实施例中,所述检测rs429358位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述检测rs7412位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。
本方案中,所述可断裂位点为核糖核苷酸,优选为U。本方案引物中的可断裂位点可通过扩增反应带入至扩增产物中的目标分子中,而这些目标分子在步骤B中可被特异性识别可断裂位点的断裂剂切割,从而形成第一粘性末端,从而可进一步的与相应的接头连接,提高连接效率。
所述断裂剂,用于对核酸片段中的可断裂位点进行特异性切割,形成第一粘性末端。所述核酸片段为双链核酸分子,可为步骤A所得含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物。
需要说明的是,上述方案中引物上的可断裂位点的3’端与其所在链5’末端的距离优选为1至8个碱基。更优选在2至4个碱基,本方案中的可断裂位点断裂后形成的粘性末端既能保证有较好的连接效率,在保证粘性末端自身之间的不相互配对的前提下,设计难度较小。
基于上述实施例,本发明提出另一实施例,所述检测rs429358位点的引物组有两对,分别为358外引物对和358内引物对;所述检测rs7412位点的引物组有两对,分别为412外引物对和412内引物对;所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点。
在本发明的一个实施例中,所述步骤A包括以下步骤:
A1、利用358外引物对和412外引物对分别对对待测样本进行PCR扩增,得358第一次扩增产物和412第一次扩增产物;
A2、以358第一次扩增产物和412第一次扩增产物为模板,分别利用358内引物对和412内引物对进行PCR扩增,得358第二次扩增产物和412第二次扩增产物。
需要说明的是,所述358第二次扩增产物和412第二次扩增产物分别为上述任一实施例中的含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物。
本方案采用两步式巢式PCR,可有效降低内外引物的设计难度,并减少第二次扩增产物中非目标产物的比例,从而有效提高ApoE基因检测结果中有效信号的比例。
在本发明的另一个实施例中,所述步骤A包括以下步骤:
分别将358外引物对和358内引物对、412外引物对和412内引物对,加入至适宜的缓冲液中,然后加入待测样本,分别进行PCR反应,所述PCR反应包括两个扩增阶段,第一个阶段的扩增反应的退火温度较第二个阶段的扩增反应的退火温度低。
在本实施例中,所述358外引物对中引物的Tm值,比358内引物对中引物的Tm值低;所述412外引物对中引物的Tm值,比412内引物对中引物的Tm值低;。本方案采用一步式巢式PCR,通过改变PCR反应过程中的退火温度来控制引物与模板的结合,在第一阶段,在低退火温度条件下,外引物对能够较好的与待测序样本结合,进行扩增,而在第二阶段,在高退火温度条件下,与外引物对引物相比,内引物对引物能够更好的与相应的模板进行结合进而扩增。本方案利用外引物对与内引物对之间的Tm值差异,通过控制退火温度来实现了巢式PCR,简化了实验步骤,所得扩增产物即为含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物。
另外,基于上述实施例,本发明提出另一实施例,所述反应体系中,358外引物对的量是358内引物对的量的五分之一至二十分之一;412外引物对的量是412内引物对的量的五分之一至二十分之一。本方案通过对引物量的控制,提高了扩增产物中目标分子的比例。
对应上述两步式巢式PCR的方案,针对步骤B,本发明提出另一实施例,所述步骤B包括以下步骤:
B1、将358第二次扩增产物和412第二次扩增产物分别直接与固定在微球上的接头连接,得固定在微球上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子;
B2、将步骤B1所得微球可寻址的固定在固相载体上。
基于上述实施例,本发明提出另一实施例,所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的,所述切割-连接反应体系包括:连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液;
所述断裂剂,用于对核酸片段中的可断裂位点进行特异性切割,形成第一粘性末端;
所述第一接头为核酸分子,含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
需要说明的是,所述切割-连接反应体系为使连接酶和断裂剂同时具有活性的反应体系。所述第一接头可为突出末端接头、分叉接头或含茎环结构的接头。
通过上述对PCR扩增引物和切割-连接反应体系的特殊设计,使得在建库过程中,PCR扩增后的切割和连接反应能在同一反应体系中进行;一旦断裂剂完成对可断裂位点或可切除序列进行特异性切割,形成第一粘性末端,第一接头即可在连接酶的作用下,与被切割后的扩增产物连接,省去了切割反应和连接反应中的纯化步骤,切割、连接反应在同一反应体系中进行;即,减少了建库的步骤,提高了建库效率。
另外,本方案中,358内引物对和412内引物对中均只有一种PCR引物(上游引物或下游引物)上含有可断裂位点,所述第一接头仅与步骤A所得扩增产物中的目标分子的一端连接。本方案减少了试剂种类,库结构简单,可降低成本。
当然,所述358内引物对和412内引物对中的两种PCR引物(上游引物和下游引物)上均含有可断裂位点。本方案中,所述358第二次扩增产物和412第二次扩增产物在步骤B中均会被切出两个粘性末端,所述第一接头和第二接头分别用于与这两个粘性末端连接。需要说明的,仅有第一接头上含有修饰标记,用于使其固定在微球上。优选的,所述两个粘性末端之间不互补配对。本方案既可避免被切割产物之间的互相连接,又可避免接头与被切割产物的非目标链接。
基于上述任一实施例,本发明提出另一实施例,步骤B所述接头上含有标签序列,用于识别不同的SNP位点和/或样本来源。本方案中,所述标签序列为由若干个脱氧核糖核苷酸分子顺序连接而成的序列;本方案能够实现多个不同SNP位点的同时检测,更能够实现多样本多SNP位点的同时检测,可大大提高本发明的SNP分型方法的检测通量,提高检测效率。
基于上述任一实施例,本发明提出另一实施例,步骤D的连接测序过程中所使用锚定引物上用于连接寡核苷酸探针的一端距待测SNP位点1至9bp之间,更优选在1至5bp之间。因为最为常见的连接酶——T4连接酶最大限度能保证6个碱基正确互补配对,所以,本方案使得所述步骤D中的测序反应仅需进行一轮连接反应即可实现待测SNP位点的检测,能有效提高检测效率,降低检测成本。
针对上述各技术方案,为进一步说明本发明所记载技术方案的技术效果及优越性,本发明给出下述具体实施例。
在一具体实施例中,以25个人的血液基因组DNA为模板,同时检测ApoE基因的358和412位点。
其中,针对上述SNP位点,均分别设计了一对内引物和一对外引物。具体如下所述:358内引物对为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:7,358外引物对为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5,358内引物对为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:15,358外引物对为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:13。
一、含待测SNP位点的扩增产物的获得。
1、第一次PCR扩增
以25个人的血液基因组DNA为模板,利用上述的外引物对,分别对各SNP位点所在序列进行扩增,反应体系为:F引物(10μM),2μL;R引物(10μM),2μL;dNTP(各2.5mM),4μL;血液基因组DNA,50ng;Ex Taq(5U/μL),0.25μL;10×Ex Taq Buffer,5μL;ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下:94℃ 3min;94℃ 15s,57℃ 20s,72℃ 45s;重复20个循环;72℃ 3min。
所得产物即为第一次PCR扩增产物。
2、第二次PCR扩增
以第一次PCR扩增产物为模板,利用上述的内引物对,分别对各SNP位点所在序列进行扩增,反应体系为:F引物(10μM),2μL;R引物(10μM),2μL;dNTP(各2.5mM),4μL;第一次PCR扩增产物,100ng;Ex Taq(5U/μL),0.25μL;10×Ex Taq Buffer,5μL;ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下:95℃ 3min;94℃ 15s,57℃ 20s,72℃ 30s;重复30个循环;72℃ 3min。
所得产物即为第二次扩增产物。
第二次扩增完成后,经琼脂糖凝胶电泳检测,所有样本的第二次扩增产物中均含有目标分子,且凝胶电泳图显示无杂带,条带单一;说明第二次PCR扩增成功获得了所需的PCR扩增产物。
二、待测序文库分子的构建。
1、将第一接头固定在微球上。
为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源,本具体实施例在第一接头上设计了标签序列,第一接头的基本结构如图1所示(SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20),该接头中的NNNN为标签序列,标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系如图2所示。
将上述各第一接头分别与带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠(Invitrogen)结合,使得上述各第一接头被分别固定在磁珠表面,反应体系及反应过程为:将200ng第一接头与4μL(约4×107个磁珠)Myone磁珠螺旋振荡混匀,反应30min,以适量TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0;1mM EDTA)清洗两次,离心分离,将得到的磁珠以4μL结合缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5;1mM EDTA;1M NaCl;0.01% Triton X-100)重悬保存,得固定有第一接头的磁珠。
2、第二次PCR扩增产物与固定在磁珠上的第一接头的连接。
按按表2中的对应关系分别配置下述反应体系:步骤一所得扩增产物20μL;USER酶(1U/μL,NEB,Cat#M5505S),10μL;缓冲液,8μL;T4 DNA连接酶,2μL;固定有第一接头的磁珠,0.4μL;加ddH2O至40μL。
其中,所述缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP、25% PEG6000,pH值7.8的溶液。
25℃反应20分钟,得连接产物,即待测序文库分子。
反应结束后,将50管连接产物合并成1管,2500g 离心3min,磁铁吸附磁珠,去上清,用50μL TE洗涤二次,并最终悬浮于50μL TE中,从而将待测序文库分子固定在磁珠上。
3、固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
将步骤2所得产物点样至异硫氰基修饰的载样片(玻片),于37℃固定1h,即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
三、测序。
对步骤二所得的固定在固相载体上的待测序文库分子进行测序。
在本具体实施例中采用深圳华因康基因科技有限公司的高通量基因测序仪PstarII A测序仪,并采用连接测序法进行测序。测序过程中,针对358位点,所使用的锚定引物为SEQ ID NO:21,针对412位点,所使用的锚定引物为SEQ ID NO:22。另外,为了区分不同的样本来源,还需对第一接头上的标签序列进行检测,用于检测标签序列的锚定引物为SEQ IDNO:23。需要说明的是,SEQ ID NO:21-23的的5’端均被磷酸化修饰。
整体的测序顺序如图3所示。其中,待测SNP位点anchor混合物为SEQ ID NO:21、22这2种锚定引物按相同摩尔数混合所得的混合物。其中,Base1用于封闭锚定引物或探针与待测序文库分子上的非特异性结合位点,Base2用于检测待测SNP位点,Base3-6用于检测标签序列。
另外,本实施例同样步骤二所得产物,以图4中的测序顺序作为对比。即,未进行图3中的Base1。
图5示出了上述具体实施例中部分样本的待测SNP位点——358\412在实验组和对照组中的初步实验结果。其中,R=A/G,Y=C/T,M=A/C,K=G/T,S=C/G,W=A/T,H=A/C/T,B=C/G/T,V=A/C/G,D=A/G/T,N=A/C/G/T;n表示信号太弱,无法判断是A、C、G和T中的哪一个。
由实验结果可知,相同样本在实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列类型均相同,但是它们的占比有明显区别;实验组中占比最高的SNP位点序列类型检出数均在93%以上,而对照组中占比最高的SNP位点序列类型检出数基本在75-85%之间。
另外,本发明人还将第二次扩增产物通过Sanger测序进行验证,结果显示,上述实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列类型均与Sanger测序结果完全一致。
以上,本发明的方法能够高效的同时对多个样品的多个SNP位点同时进行检测,并得到准确可信的结果,并且能够有效的降低连接测序所得结果中的错误信号,从而提高了ApoE基因中的SNP位点检测的准确性。
在本发明的另一个具体实施例中,直接用上述实施例中的358内引物对和412内引物对,对上述样本1-25进行PCR扩增,然后进行后续的步骤二、三,所得实验结果和上述具体实施例结果基本一致,实验组中占比最高的SNP位点序列类型检出数均在90%以上,而对照组中占比最高的SNP位点序列类型检出数基本在70-80%之间。整体来说,实验组和对照组的检出数和检出总数均较上一实施例低,且无论是在实验组还是在对照组中,占比最高的SNP位点序列类型检出数所占比例有所降低。
在本发明的另一个具体实施例中,358内引物对为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:8,358外引物对为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:6,358内引物对为SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:16,358外引物对为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14。一、含待测SNP位点的扩增产物的获得。
1、第一次PCR扩增
以25个人的血液基因组DNA为模板,利用上述的外引物对,分别对各SNP位点所在序列进行扩增,反应体系为:F引物(10μM),2μL;R引物(10μM),2μL;dNTP(各2.5mM),4μL;血液基因组DNA,50ng;Ex Taq(5U/μL),0.25μL;10×Ex Taq Buffer,5μL;ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下:94℃ 3min;94℃ 15s,57℃ 20s,72℃ 45s;重复20个循环;72℃ 3min。
所得产物即为第一次PCR扩增产物。
2、第二次PCR扩增
以第一次PCR扩增产物为模板,利用上述的内引物对,分别对各SNP位点所在序列进行扩增,反应体系为:F引物(10μM),2μL;R引物(10μM),2μL;dNTP(各2.5mM),4μL;第一次PCR扩增产物,100ng;Ex Taq(5U/μL),0.25μL;10×Ex Taq Buffer,5μL;ddH2O加至50μL。
PCR反应条件如下:95℃ 3min;94℃ 15s,57℃ 20s,72℃ 30s;重复30个循环;72℃ 3min。
所得产物即为第二次扩增产物。
第二次扩增完成后,经琼脂糖凝胶电泳检测,所有样本的第二次扩增产物中均含有目标分子,且凝胶电泳图显示无杂带,条带单一;说明第二次PCR扩增成功获得了所需的PCR扩增产物。
二、待测序文库分子的构建。
1、第二次PCR扩增产物与第一接头的连接。
为了在同时检测过程中能够区分不同的样本来源,本具体实施例在第一接头上设计了标签序列,第一接头的基本结构如图1所示(SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20),该接头中的NNNN为标签序列,标签序列与样本来源和SNP位点的对应关系如图2所示。
按图2中的对应关系分别配置下述反应体系:步骤一所得第二扩增产物20μL;USER酶(1U/μL,NEB,Cat#M5505S),10μL;缓冲液,8μL;T4 DNA连接酶,2μL;第一接头(10μM),2μL;加ddH2O至40μL。
其中,所述缓冲液为含400mM Tris、100mM MgCl2、100mM DTT、5mM ATP,pH值7.8的溶液。
25℃反应20分钟,得连接产物,即待测序文库分子。
2、将待测序文库分子固定在微球上。
将上述各待测序文库分子分别与带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠(Invitrogen)结合,使得上述各待测序文库分子被分别固定在磁珠表面,反应体系及反应过程为:将步骤1产物直接与0.4μL(约4×106个磁珠)Myone磁珠螺旋振荡混匀,反应30min,以适量TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH8.0;1mM EDTA)清洗两次,离心分离,将得到的磁珠以2μL结合缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.5;1mM EDTA;1M NaCl;0.01% Triton X-100)重悬保存,得固定在磁珠上的待测序文库分子。
反应结束后,将50管固定在磁珠上的待测序文库分子合并成1管,2500g 离心3min,磁铁吸附磁珠,去上清,用50μL TE洗涤二次,并最终悬浮于50μL TE中,从而将待测序文库分子固定在磁珠上。
3、固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
将步骤2所得产物点样至异硫氰基修饰的载样片(玻片),于37℃固定1h,即完成固定在磁珠上的待测序文库分子的可寻址固定。
三、测序。
对步骤二所得的固定在固相载体上的待测序文库分子进行测序。本步骤中的测序具体步骤同上述具体实施例。
所得实验结果与第一个具体实施例一致,相同样本在实验组和对照组中占比最高的SNP位点序列类型均相同,但是它们的占比有明显区别;实验组中占比最高的SNP位点序列类型检出数均在93%以上,而对照组中占比最高的SNP位点序列类型检出数基本在75-85%之间,且与Sanger测序结果完全一致。
需要说明的是,上述具体实施例中,所述使用的引物中,可断裂位点均为U,且均设计在上游引物上,断裂序列(与第一粘性末端对应)为CGGU。当然,也可将可断裂位点设计在下游引物上。所述断裂序列可根据需要进行设计,只要能满足后续的连接实验的要求即可,例如:GCCU、AAAU、CGCU、GCCCU、CGGCU、TTTTU等。随着所述断裂序列的改变,所述第一接头的相关序列需进行相关调整。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉康昕瑞基因健康科技有限公司
<120> ApoE基因引物组、检测试剂盒和检测方法
<130>
<160> 25
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggaactggag gaacaactga 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtccaagga gctgcagg 18
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggacttgga ggtcgtg 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggacatgga ggacgtg 17
<210> 5
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aggagccgct tacgca 16
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctccttcac ctcgtcca 18
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgtacttcac caggcgg 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tctgcaggtc atcggcat 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagagcaccg aggagctg 18
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cctacaaatc ggaactgga 19
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccgatgaccc gcagaa 16
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agagcaccga ggagctg 17
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctgcccatct cctccatc 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctcgaaccag ctcttgagg 19
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggtacacag ccaggc 16
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccagggagcc cacagtg 17
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cggucggact tggaggtcgt g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgguccgatg acccgcagaa 20
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(26)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 19
cctccctgca gtctctatgg gcnnnnctgc tagtcgctga agtagtcggt 50
<210> 20
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(23)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 20
ctacttcagc gactagcagn nnngcccata gagactgcag gg 42
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cacgacctcc aagtcc 16
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cttctgcggg tcatc 15
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcccatagag actgcag 17
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cggucggaca tggaggacgt g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cgguagagca ccgaggagct g 21
Claims (10)
1.一种ApoE基因检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒含有分别检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组;所述检测rs429358位点的引物组中的上游引物为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4序列,所述检测rs429358位点的引物组中的下游引物为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8序列;
所述检测rs7412位点的引物组中的上游引物为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:12序列,所述检测rs7412位点的引物组中的下游引物为SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16序列;
所述检测rs429358位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述检测rs7412位点的引物组中的一种上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;
所述检测rs429358位点的引物组有两对,分别为358外引物对和358内引物对;所述检测rs7412位点的引物组有两对,分别为412外引物对和412内引物对;所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物上含有可断裂位点;
所述试剂盒还包括无荧光标记的寡核苷酸探针。
2.根据权利要求1所述的ApoE基因检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括连接缓冲液,所述连接缓冲液中含有PEG。
3.根据权利要求1所述的ApoE基因检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括接头,所述接头用于直接与所述检测rs429358位点的引物组的扩增产物连接,也用于直接与所述检测rs7412位点的引物组的扩增产物连接,所述接头上含有标签序列。
4.根据权利要求1所述的ApoE基因检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括检测rs429358位点的锚定引物、检测rs7412位点的锚定引物和检测标签序列的锚定引物。
5.一种基于权利要求1-4任一项所述的ApoE基因检测试剂盒的以非疾病诊断为目的的ApoE基因检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、利用检测rs429358位点的引物组和rs7412位点的引物组分别对待测样本进行PCR扩增,得含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物;
B、将含rs429358位点的扩增产物和含rs7412位点的扩增产物分别直接与接头连接,形成rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子,并将rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子分别通过微球可寻址的固定在固相载体上;
C、利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针,对固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子进行一次连接测序反应;
D、连接测序获得rs429358位点和rs7412位点的序列信息;
所述无荧光标记的寡核苷酸探针与连接测序技术中所使用的有荧光标记的寡核苷酸探针的序列完全相同,所述无荧光标记的寡核苷酸探针序列为(N-N-N……-N)n,所述N为A、G、C或T,n为正整数。
6.根据权利要求5所述的ApoE基因检测方法,其特征在于,所述步骤C包括以下步骤:
C1、将检测rs429358位点的锚定引物和检测rs7412位点的锚定引物锚定在固定在固相载体上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子上;
C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液,进行连接反应;
C3、变性去除连接产物。
7.根据权利要求5所述的ApoE基因检测方法,其特征在于,所述检测rs429358位点的引物组有两对,分别为358外引物对和358内引物对;所述检测rs7412位点的引物组有两对,分别为412外引物对和412内引物对;所述358内引物对中的上游引物和/或下游引物含有可断裂位点;所述412内引物对中的上游引物和/或下游引物含有可断裂位点;所述步骤A包括以下步骤:
A1、利用358外引物对和412外引物对分别对对待测样本进行PCR扩增,得358第一次扩增产物和412第一次扩增产物;
A2、以358第一次扩增产物和412第一次扩增产物为模板,分别利用358内引物对和412内引物对进行PCR扩增,得358第二次扩增产物和412第二次扩增产物。
8.根据权利要求5所述的ApoE基因检测方法,其特征在于,所述步骤B包括以下步骤:
B1、将358第二次扩增产物和412第二次扩增产物分别直接与固定在微球上的接头连接,得固定在微球上的rs429358待测序文库分子和rs7412待测序文库分子;
B2、将步骤B1所得微球可寻址的固定在固相载体上。
9.根据权利要求8所述的ApoE基因检测方法,其特征在于,所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的,所述切割-连接反应体系包括:连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液;
所述断裂剂,用于对核酸片段中的可断裂位点进行特异性切割,形成第一粘性末端;
所述第一接头为核酸分子,含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。
10.根据权利要求8所述的ApoE基因检测方法,其特征在于,步骤B1中所述连接缓冲液中含有PEG。
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Citations (5)
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