CN104419751A

CN104419751A - miRNA检测探针、试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104419751A
Application number: CN201310377483.2A
Authority: CN
Inventors: 陈昌华; 陈菲; 许昌有
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2013-08-26
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2033-08-26
Also published as: CN104419751B

Abstract

本发明提供了一种miRNA检测探针、包括检测探针的试剂盒及miRNA检测方法。所述miRNA检测探针，包括：杂交探针：其5'端为tag标签序列，3'端为结合序列，tag标签序列和结合序列之间还设有待检测靶标miRNA反向互补序列；信号探针：其5'端为信号序列，3'端为polyT或oligoTGG。所述检测方法包括如下步骤：使用杂交探针和信号探针形成信号标记复合体后与含有miRNA的样本杂交，与包被有anti-tag序列的微珠结合后经RNase酶切消化，再经SA-PE孵育后即可检测。本发明制备的miRNA检测探针、试剂盒可用于目标miRNA的高灵敏高选择性检测。

Description

miRNA检测探针、试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学、医学和生物技术领域，尤其涉及一种miRNA检测探针、试剂盒及其检测方法。

背景技术

microRNA（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，一个miRNA可有很多靶基因，而每个基因受多个miRNA调控。研究发现，编码调控miRNA的基因发生突变、缺失以及转录后调控失衡、启动子区DNA甲基化修饰及结合蛋白异常等引起miRNA的异常表达。miRNA表达异常会严重影响细胞信号转导途径的功效，导致细胞增殖和分化失去控制。针对miRNA的检测对于分子水平的基因表达的监控有重要意义，也可以为miRNA功能研究提供重要依据。

目前miRNA的检测方法主要有Northern Blot、原位杂交、基因芯片、荧光定量探针法；但NorthernBlot方法敏感度低、耗时长且RNA的用量较大，不适合高通量分析；原位杂交技术在一次实验过程只能检测有限的miRNA，仍然难以满足高通量要求；基因芯片技术能实现miRNA的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个miRNA，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵。荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获miRNA序列，因此提高了准确性，但是由于miRNA同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。

发明内容

本发明的目的之一提供了一种用于miRNA检测的探针。

实现上述目的的具体技术方案如下：

一种miRNA检测探针，包括：

（1）杂交探针：其5'端为tag标签序列，3'端为结合序列，所述tag标签序列和所述结合序列之间还设有待检测靶标miRNA反向互补序列；所述结合序列为polyA序列或为oligoCCA序列，其长度为8-20个碱基；

（2）信号探针：其5'端为信号序列，3'端为polyT或oligoTGG；所述polyT或oligoTGG是杂交探针中结合序列的反向互补序列；所述信号序列为Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列，其长度为60-90个碱基。

在其中一些实施例中，所述结合序列的长度为9-11个碱基。最优选为10个碱基。

在其中一些实施例中，所述信号序列的长度为为89-90个碱基。最优选为90个碱基。

本发明的另一目的是提供一种miRNA检测试剂盒。该检测试剂盒能够高灵敏高选择性检测靶标序列。

一种miRNA检测试剂盒，包括以下组份：

A、上述检测探针；

B、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列与杂交探针5’端的tag序

列互补配对。

在其中一个实施例中，miRNA检测试剂盒还包括有生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP。

在其中一些实施例中，所述tag序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5中的一条或多条。

在其中一些实施例中，步骤（2）所述anti-tag序列与微珠之间连接有间隔臂序列，优选地，所述间隔臂序列为5～10个T的间隔臂序列。

本发明的另一个目的是提供一种检测miRNA的方法，该方法能实现目标miRNA的准确检测。

实现上述目的的技术方案如下。

一种检测miRNA的方法，包括以下步骤：

1）使用本发明上述检测探针中的杂交探针和信号探针，与生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP进行延伸反应，形成信号标记复合体；

2）与待检测的样本杂交；

3）加入上述包被有anti-tag序列的微珠进行捕获反应；

4）RNase酶切消化；

5）用SA-PE进行孵育，检测。

本发明的主要优点在于：

1）本发明的miRNA检测探针构建方法，能够适用于不同的目标检测miRNA，灵敏度高，特异性好，适用性强。

2）本发明采用的三明治结构嵌合杂交探针（tag—靶标miRNA反向互补序列—polyA或oligoCCA），与现有技术相比，该设计更为简单，更具有实用性。而且本技术方案所设计的检测探针能够实现特异性强、灵敏度高、高通量检测RNA的目的。

3）本发明使用信号探针“信号序列+polyT”或“信号序列+oligoTGG”，分别与polyA或oligoCCA结构结合，并通过使用biotin-dCTP、biotin-dATP、biotin-dTTP或biotin-dGTP的随机插入进行信号的放大，对比现有技术中仅使用生物素标记探针，其检测的荧光信号值大大提高，从而使得灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。

4）本发明所提供的检测方法不需要对miRNA样本进行任何修饰，比如：生物素化、去磷酸化、逆转录和PCR扩增等步骤，可将所设计的检测探针直接与目标检测miRNA进行杂交，操作简单，节省时间的同时，大大减低操作过程或多步骤误差积累对结果的影响。

5）本发明将所提供的检测方法反应时间短，整个过程只需4小时，可以一次反应中，并行检测多达100个指标，具有明显的技术优势和应用能力。

6）本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

实施例1miRNA检测探针

一种miRNA检测探针，具体包括杂交探针和信号探针：

1）杂交探针包括三部分，5’端为tag标签序列，中间是待检测的成熟标靶miRNA完整序列的反向互补序列，3'端为结合序列，所述结合序列为polyA序列或oligoCCA序列，polyA序列或oligoCCA序列长度为8-20个碱基。

2）信号探针包括两部分，5'端为信号序列，3'端为polyT或oligoTGG，是杂交探针3'端结合序列的反向互补序列，其中信号序列为Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列，所述Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列长度为60-90个碱基。

本实施例例举了针对目标检测的内标一、内标二、hsa-miR-199b、hsa-miR-122、hsa-miR-145*等5种成熟的miRNA序列的反向互补序列的检测探针，其中，内标一、内标二为内参miRNA，hsa-miR-199b、hsa-miR-122、hsa-miR-145*为目标检测的3种miRNA，依据本发明的构建方法，分别设计miRNA杂交探针，杂交探针的结构为“tag—靶标miRNA反向互补序列—结合序列”，杂交探针序列如下：

表1miRNA杂交探针

所对应的信号探针的3'端为polyT或oligoTGG，是上述杂交探针3'端结合序列（见下划线部分）的反向互补序列，其中5'端信号序列为Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列，所述Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列长度为60-90个碱基，使用的时候可具体选择。

实施例2.试剂盒的组成

1、miRNA检测试剂盒，主要包括有：

A、实施例1中针对目标检测内标一、内标二、hsa-miR-199b、hsa-miR-122、hsa-miR-145*等5种miRNA构建的检测探针；

B、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列与目标miRNA检测探针5’端的相应的tag序列互补配对，具体如表2所示；本实施例中，anti-tag序列与微球之间还连接有10个T的间隔臂序列；

C、生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP（使用的时候选择具体的一种）。

根据所设计的探针片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与探针片段可能形成的二级结构，选择的5种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

类型	微球号	Anti-tag序列
			内标一	23	AAGAAGTATAGTTTATTG（SEQ ID NO.46）
内标二	31	TTAAAGTGAAGTAATTGA（SEQ ID NO.47）
			sa-miR-199	b25	AATTGAGTAAAAAGGATT（SEQ ID NO.48）
hsa-miR-12	232	AGTGTAGATTTTGAGTAA（SEQ ID NO.49）
			sa-miR-145	*45	GAGTATTGATTTGAAAAG（SEQ ID NO.50）

所述微珠的直径介于10纳米-100微米，可以为磁性或非磁性，例如具体可以含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上的成分。当微珠含有聚苯乙烯和四氧化三铁时，该微珠即为磁珠，使用磁力分离，如磁力架或离心方法均能取得很好的分离效果，当使用非磁性微球时，使用离心方法也能实现相应的技术效果，本实施例中所述微珠为磁珠。

选择的5种微珠购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH₂O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly（dT），寡聚四聚乙二醇以及（CH₂）_n间隔臂（n≥3），如（CH₂）₁₂、（CH₂）₁₈等。另外，如果存在poly（dA）干扰，还可以用poly（TTG）作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球（购自Luminex公司）悬浮于5μl0.1mol/L的MES溶液中（pH4.5），加入10μl合成的anti-tag分子（100nmol/mL）。配制10ng/mL的EDC（N-（3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide）（购自Pierce Chemical公司）工作液。往微球悬液中加入2.5μl的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5μl的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100μl的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris（pH8.0）]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

实施例3一种检测miRNA的方法

使用本发明实施例2中的试剂盒，对目标检测内标一、内标二、hsa-miR-199b、hsa-miR-122、hsa-miR-145*等5种miRNA进行检测。

1、检测方法

1）形成信号标记复合体：

针对目标检测内标一、内标二、hsa-miR-199b、hsa-miR-122、hsa-miR-145*等5种miRNA，分别取PCR管，按照下表配置预结合液，95℃变性3min，4℃预结合反应1min，得到预延伸产物；

其中，根据实施例1中杂交探针中3’端选用polyA或OligoCCA的实际情况，当对应的杂交探针3’端选用polyA时，miRNA信号探针为“信号序列+polyT”，当对应的杂交探针3’端选用oligoCCA时，miRNA信号探针为“信号序列+oligoTGG”。

往上述的预延伸产物中添加延伸标记液，并根据延伸反应条件，得到相应的信号标记复合体。

A、当对应的杂交探针3’端选用polyA时，miRNA信号探针为“信号序列+polyT”，延伸标记液使用biotin-dCTP、biotin-dATP、biotin-dTTP或biotin-dGTP，具体为：

B、当对应的杂交探针3’端选用oligoCCA时，miRNA信号探针为“信号序列+oligoTGG”，延伸标记液使用biotin-dCTP、biotin-dATP、biotin-dTTP或biotin-dGTP，具体为：

根据检测探针的实际情况，选用A或B的反应体系，延伸反应条件如下表；

2）与含有miRNA的样本杂交；

每组加入1x杂交液21uL、预延伸产物4uL、含有miRNA的样本2ul，其中1x杂交液配方如下：

试剂名称	配置250ml用量
		2M Nacl	25ml
1M Tris pH8.0	25ml
		TrironX-100	0.2ml
DEPC水	定容至250ml

反应程序如下表：

3）微珠捕获反应：

PCR仪温度60℃，3min时暂停，加入相应的25uL包被anti-tag序列的磁珠混合液，37℃震荡过夜。

4）RNase酶切反应，用杂交缓冲液稀释RNaseA/T1，稀释比例为1:250，每组加入5ul RNaseA/T1稀释液（0.4%）,反应30min。

5）杂交液洗脱，用枪吹打杂交液3次，转移杂交液至96孔U型板中，固定于磁力板上静置2min，倒扣去除杂交液，吸水纸上印干；加入100μL1X杂交液，静置15s，倒扣去除洗涤液，吸水纸上印干；卸下磁力板。

6）SA-PE孵育与洗板，1×杂交液（RNase free）70ul和SA-PE（5X）5ul配置成SA-PE工作液，混匀后每孔中加入75ul重悬磁珠，封膜，盖上盖子，将U型板置于恒温培养箱内（无光照）微量振荡器上37℃，震荡孵育10min。固定于磁力板上静置2min，倒扣去除杂交液，吸水纸上印干；加入100μL1X杂交液，静置15s，倒扣去除洗涤液，吸水纸上印干；卸下磁力板，加入75μL1X杂交液。

7）用液相芯片检测仪对步骤六中的反应产物进行检测，得到检测结果。

2、检测结果与数据分析：

在5个目标检测miRNA中，其中，3个为需要定量的目标miRNA，分别是：hsa-miR-199b、hsa-miR-122、hsa-miR-145*；2个为内参miRNA，分别是：内标一、内标二

将读取的荧光值按照以下方法进行均一化处理：

步骤1：获得原始数据（MFI值）

步骤2：样品的MFI减去空白孔N的MFI=net MFI

步骤3：每个样品的2个内参miRNA的net MFI值分别取几何平均值，得到相应的G1、G2、G3……Gn

步骤4：每个样品目标miRNA的net MFI除以对应的Gn得到相应的Nn。Nn即为已排除上样量差异，可在样品间进行相对表达量比较的数值。

实施例4使用实施例1中的检测探针和实施例2中的试剂盒对样本的检测

使用实施例1中的miRNA杂交探针和实施例2中的试剂盒（采用生物素标记的dCTP），以及通过实施例3中的检测方法（采用生物素标记的dCTP），信号序列采用90个碱基的oligoGT为例，将实施例1的杂交探针分为八组，如表3所示：

表3试剂盒的组成

采用上述八组探针组成，对10例样本进行检测，并与荧光定量检测方法进行比较，结果如下：

表4Group1原始数据与相对表达量

表5Group2原始数据与相对表达量

表6Group3原始数据与相对表达量

表7Group4原始数据与相对表达量

表8Group5原始数据与相对表达量

表9Group6原始数据与相对表达量

表10Group7原始数据与相对表达量

表11Group8原始数据与相对表达量

表12荧光定量PCR检测结果

由表4-12检测数据可见，对相同样本的检测，其miRNA的相对表达量一致，即杂交探针的3’端分别采用8-20个碱基的polyA与oligoCCA结构效果相同，相对表达量与荧光定量PCR的结果接近。

当试剂盒及检测方法采用生物素标记的dATP、dTTP或dGTP，能取得与实施例4一致的检测效果，具体实验数据省略。

实施例5关于信号序列的使用

依据本发明所构建的miRNA杂交探针，结构为“tag—待测靶标互补序列—结合序列”，结合序列碱基长度为10个碱基，与结构为“信号序列+polyT”或“信号序列+oligoTGG”的信号探针进行杂交反应，与biotin-dCTP进行聚合反应，从而使目标检测miRNA带上生物素标记，信号序列分别采用60、70、80或90个碱基的Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT，本实施例采用生物素标记的dCTP。试验设计具体如表13所示：

表13试剂盒的组成

采用上述探针组成，根据实施例3所述的方法，对10例样本进行检测，并与荧光定量检测方法进行比较，结果如下：

表14Group9原始数据与相对表达量

表15Group10原始数据与相对表达量

表16Group11原始数据与相对表达量

表17Group12原始数据与相对表达量

表18Group13原始数据与相对表达量

表19Group14原始数据与相对表达量

表20Group15原始数据与相对表达量

表21Group16原始数据与相对表达量

表22荧光定量PCR检测结果

由表14-22检测数据可见，对相同样本的检测，其miRNA的相对表达量一致，即采用60、70、80或90个碱基的Oligo GT信号序列检测效果一致，相对表达量与荧光定量PCR的结果接近。

当信号序列采用Oligo TG或Oligo GTT时，能取得与实施例5相同的检测效果，具体实验数据省略。

实施例6关于信号探针的使用

依据本发明所构建的miRNA杂交探针，一方面杂交探针3’端直接用生物素标记，另一方面杂交探针分别与信号探针“Oligo GT+polyT”或“OligoGT+oligoTGG”进行杂交反应，分别与biotin-dCTP进行聚合反应，从而使目标检测miRNA带上生物素标记，其中杂交探针3’端结合序列碱基长度采用10个碱基，信号序列Oligo GT长度采用90个碱基。

本实施例将分别使用上述所述情况的试剂盒，对10个样本进行检测，比较其检测效果，具体如表23所示，检测步骤参照实施例3的检测方法。

表23试剂盒的组成

表24Group17原始数据与相对表达量

表25Group18原始数据与相对表达量

表26Group19原始数据与相对表达量

表27Group20原始数据与相对表达量

表28荧光定量PCR检测结果

由上述检测结果可见，一方面，直接用生物素标记的Group17和Group19，与Oligo GT+polyT或OligoGT+oligTGG进行杂交反应，并与biotin-dCTP进行聚合反应的Group18和Group20，四组试验检测结果一致，另一方面，Group18和Group20的相对表达量与荧光定量PCR的结果更为接近，由此可见，先使用信号探针Oligo GT+polyT或Oligo TG+GTGGTGGTGG作信号放大，检测效果更佳。

实施例7Tag序列及Anti-Tag序列的选择

以hsa-miR-199b为例，按照实施例1的方法设计检测探针，采用实施例3的检测方法，其中杂交探针3’端结合序列碱基长度采用10个碱基，信号序列Oligo GT长度采用90个碱基，杂交探针分别与信号探针“Oligo GT+polyT”或“Oligo GT+oligoTGG”进行杂交反应，分别与biotin-dCTP进行聚合反应，从而使目标检测miRNA带上生物素标记，而杂交探针5’端的Tag序列则选自SEQID NO.1-SEQ ID NO.5，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.46-SEQ ID NO.50。具体设计如下表（表29）所示。

表29Tag序列及Anti-Tag序列组合

本实施例将分别使用上述所述情况的试剂盒，对10个样本进行检测，比较其检测效果，具体如表30所示，检测步骤参照实施例3的检测方法。

表30检测结果与相对表达量（一）

表31检测结果与相对表达量（二）

表32检测结果与相对表达量（三）

从上述实施例可见，杂交探针5’端选用不同的tag序列时，试验检测结果一致，并且与荧光定量PCR检测结果吻合。可见选用不同的miRNA，杂交探针5’端运用不同的tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种miRNA检测探针，其特征是，包括：

2.根据权利要求1所述的miRNA检测探针，其特征是，所述结合序列的长度为9-11个碱基。

3.根据权利要求1所述的miRNA检测探针，其特征是，所述信号序列的长度为89-90个碱基。

4.一种miRNA检测试剂盒，其特征是，包括以下组份：

A、权利要求1-3任一项所述的检测探针；

B、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列与杂交探针5’端的tag序列互补配对。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征是，还包括有生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP。

6.根据权利要求4或5所述的miRNA检测试剂盒，其特征是，所述anti-tag序列与微珠之间连接有间隔臂序列。

7.根据权利要求6所述的miRNA检测试剂盒，其特征是，所述间隔臂为序列为5～10个T。

8.根据权利要求4或5所述的miRNA检测试剂盒，其特征是，所述tag序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5中的一条或多条。

9.一种检测miRNA的方法，其特征是，包括以下步骤：

1）将杂交探针和信号探针，与生物素标记的dCTP、dATP、dTTP或dGTP进行延伸反应，形成信号标记复合体；

所述杂交探针的5'端为tag标签序列，3'端为结合序列，所述tag标签序列和所述结合序列之间还设有待检测靶标miRNA反向互补序列；所述结合序列为polyA序列或为oligoCCA序列，其长度为8-20个碱基；

所述信号探针的5'端为信号序列，3'端为polyT或oligoTGG；所述polyT或oligoTGG是杂交探针中的结合序列的反向互补序列；所述信号序列为Oligo GT、Oligo TG或Oligo GTT序列，其长度为60-90个碱基；

2）与待检测的样本杂交；

3）加入包被有anti-tag序列的微珠进行捕获反应，所述anti-tag序列与杂交探针5’端的tag序列互补配对；

4）RNase酶切消化；

5）用SA-PE进行孵育，检测。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征是，所述结合序列的长度为9-11个碱基；所述信号序列的长度为89-90个碱基。

11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征是，所述anti-tag序列与微珠之间连接有间隔臂序列。

12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征是，所述间隔臂为序列为5～10个T。

13.根据权利要求9-12任一项所述的检测方法，其特征是，所述tag序列选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.5中的一条或多条。