CN113025690A

CN113025690A - 一种核酸探针组及其应用

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Publication number: CN113025690A
Application number: CN202110581853.9A
Authority: CN
Inventors: 张�浩
Original assignee: Guangdong Pinbo Yishi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Pinbo Yishi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-05-27
Filing date: 2021-05-27
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2041-05-27
Also published as: CN113025690B

Abstract

本发明公开了一种核酸探针组及其应用；核酸探针组包括第一探针和第二探针；第一探针包括第一5’端碱基序列、第一互补序列和第一3’端碱基序列；第一5’端碱基序列与通用核酸配对，第一3’端碱基序列与待测核酸配对；第二探针包括第二5’端碱基序列、第二互补序列和第二3’端碱基序列；第二5’端碱基序列与待测核酸配对，第二3’端碱基序列与通用核酸配对；第一互补序列和第二互补序列配对；核酸探针组的应用为将核酸探针组用于核酸原位检测；该核酸探针组可以用于特定核酸片段的定量、定性或定位检测，提高了传统核酸探针的特异性、灵敏度和稳定性。

Description

一种核酸探针组及其应用

技术领域

本发明涉及一种核酸探针组及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

随着全球各物种全基因组测序的快速发展，在各公共数据库和非公共数据库中已经累积了海量的基因序列，这其中既包括编码功能蛋白的核酸序列，也包括各种非编码核酸片段，继而涌现了针对各种目的而对这些核酸片段进行检测的需求：比如要检测某些序列是否存在、存在的数目或存在的空间位置等等。为满足这些检测目的，多年来形成了几种主要的检测方法。1）通过特定核酸序列可以结合的蛋白/抗体来直接检测这些核酸序列，用于转录因子检测的EMSA或一些利用免疫共沉淀原理的核酸序列检测；2）利用各种扩增方法（如聚合酶链扩增法PCR、荧光定量PCR、等温扩增）来扩增待测核酸序列进行检测的方法；3）通过将待测核酸序列全长或片段特异或非特异地固定于某种基质上，再通过设计和目标序列互补的核酸序列与其杂交结合，进而进行各种标记检测等（比如Southern杂交，Northern杂交，点杂交，膜杂交，原位杂交，芯片杂交等）。

以上三类主要检测各有各的优缺点与应用领域。通过抗原抗体结合检测的方法只适合检测很少一部分特定核酸，实际应用范围非常有限。基于PCR扩增的检测有非常广泛的应用，也有很好的灵敏度，但常局限于样本的取材方法和核酸的分离与降解程度。而基于核酸杂交的检测方法，虽然在一定程度上可以弥补PCR方法的局限性，但其高度受限于检测的特异性和灵敏性。并且实际应用中，该种方法，尤其是原位杂交（ISH）和核酸捕获杂交检测有其他方法无可替代的应用价值，它可以提供核酸空间表达模式及表达水平的信息。因此，在传统核酸检测方法基础上进一步的研究和改进，是一项非常有意义的工作。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种核酸探针组，该核酸探针组可以用于特定核酸片段的定量、定性或定位检测，提高了传统核酸探针的特异性、灵敏度和稳定性。

本发明的第二个目的在于提供一种上述核酸探针组的设计方法的应用。

实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种核酸探针组，包括第一探针和第二探针；第一探针包括第一5’端碱基序列、第一互补序列和第一3’端碱基序列；第一5’端碱基序列与通用核酸配对，第一3’端碱基序列与待测核酸配对；

第二探针包括第二5’端碱基序列、第二互补序列和第二3’端碱基序列；第二5’端碱基序列与待测核酸配对，第二3’端碱基序列与通用核酸配对；

第一互补序列和第二互补序列配对。

进一步地，第一5’端碱基序列为10-16个碱基；第一3’端碱基序列为15-30个碱基；第二5’端碱基序列为15-30个碱基；第二3’端碱基序列为10-16个碱基；第一5’端碱基序列及其互补序列、第二3’端碱基序列及其互补序列与待测核酸的物种基因组无相同或高度同源。

进一步地，第一3’端碱基序列的Tm值和第二5’端碱基序列的Tm值均为60-70℃，且第一3’端碱基序列的Tm值和第二5’端碱基序列的Tm值相差≤1℃；第一5’端碱基序列与第二3’端碱基序列的总长核酸的Tm值，和第一3’端碱基序列或第二5’端碱基序列的Tm值之间的差值≤2℃；第一5’端碱基序列的Tm值低于第一3’端碱基序列的Tm值至少10℃；第二3’端碱基序列的Tm值低于第二5’端碱基序列的Tm值至少10℃。

进一步地，第一互补序列和第二互补序列均为5-14个碱基；第一互补序列和第二互补序列的互补部分Tm值低于第一3’端碱基序列或第二5’端碱基序列的Tm值至少25℃。

进一步地，通用核酸不存在于待测样本中或与待测样本中所有的核酸序列均无同源性。

进一步地，通用核酸包括荧光标记、抗体标记、生物素标记、地高辛标记和特定蛋白标记中的至少一种。

进一步地，第一探针与待测核酸的结合位置和第二探针与待测核酸的结合位置之间的距离≤2个碱基。

进一步地，待测核酸包括ssDNA，dsDNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA或LncRNA，待测核酸的长度≥100个碱基。

实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种核酸探针组的应用，将核酸探针组用于核酸原位检测。

进一步地，使用至少三个核酸探针组进行核酸原位检测。

或，一种核酸探针组的应用，将核酸探针组用于制备试剂盒；试剂盒包括上述的核酸探针组和通用核酸；核酸探针组为至少三个。

或，一种核酸探针组的应用，将核酸探针组用于将待测核酸稳定捕获于基质上。

或，一种核酸探针组的应用，将核酸探针组用于同时检测至少两种待测核酸。

或，一种核酸探针组的应用，将核酸探针组用于在双链DNA和其转录产物的混合物中检测待测核酸；第一3’端碱基序列结合于dsDNA的反义链，第二5’端碱基序列结合于紧邻正义链来实现对dsDNA的特异检测。

本发明的配方设计原理如下：在核酸原位杂交检测和核酸捕获检测上，长期以来通常使用较长的单链核酸（DNA或RNA）作为探针，在一定温度和反应条件下，该单链探针杂交于待测核酸，而探针通常会被做一定修饰，以利于后期的检测。但长链探针的制备比较繁琐且成本高，尤其引起的非特异杂交通常会导致很高的背景信号，因而大大限制了实际应用。尤其当应用于RNA被显著降解的福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中的RNA/DNA检测时，其信号将很难清晰获取。如果是以短探针（20-40碱基）作为检测探针的商业化检测试剂盒，但以标记的单一短探针设计进行检测时，由于序列较短，其容易杂交于非目标序列而产生假阳性信号。而另一些以两个一组的探针设计进行的检测，其紧邻的双探针设计要求此双探针同时结合于待测核酸才能产生信号，很好地解决了特异性问题，但由于双探针结合区在反应液中的空间动力学阻隔，形成理想杂交复合物的杂交效率被降低，导致了检测的时间性和灵敏性无法满足需求，杂交复合物的不稳定则影响实验一致性，因此很多情况下该种双探针设计还达不到众所期望的检测要求。

本发明基于长链、短链、混合探针等的缺点，设计了一种核酸探针组，其中的第一探针和第二探针通过第一互补序列和第二互补序列进行配对连接，形成“工”字形探针组合结构，第一探针和第二探针形成整体的稳定结构，也分别与待测核酸配对，确保了检测的特异性结构稳定，明显可以改善了检测的灵敏性。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明的核酸探针组可以用于特定核酸片段的定量、定性或定位检测，提高了传统核酸探针的特异性以降低背景信号、灵敏度和稳定性；增强了检测信号，以得到更高的信噪比；

2、本发明的核酸探针组中的第一探针和第二探针通过第一互补序列和第二互补序列进行配对连接，形成“工”字形探针组合结构，而为能检测到通用核酸，又必须第一探针和第二探针均就位杂交于指定待测核酸，因此确保了检测的特异性结构稳定，明显可以改善了检测的灵敏性。

附图说明

图1为具体实施方式核酸探针组的示意图；

图2为具体实施方式常规单链核酸探针的示意图；

图3为具体实施方式常规双探针的示意图；

图4为实施例1使用第一个核酸探针组的信噪比图示；

图5为实施例1使用第二个核酸探针组的信噪比图示；

图6为实施例1使用第三个核酸探针组的信噪比图示；

图7为实施例1使用第一、第二、第三个核酸探针组混合的信噪比图示；

图8为实施例1使用连续20组不包含A1A2区序列的探针进行原位杂交检测的实验结果；

图9为实施例1使用连续20组包含A1A2区序列的探针进行原位杂交检测的实验结果；

图10为实施例2使用第1个核酸探针组的原位杂交的检测结果；

图11为实施例2使用10个核酸探针组的原位杂交的检测结果；

图中，L1、第一5’端碱基序列；A1、第一互补序列；C1、第一3’端碱基序列；C2、第二5’端碱基序列；A2、第二互补序列；L2、第二3’端碱基序列；D、通用核酸；T、待测核酸；T1、待测核酸T（T1区域）；T2、待测核酸T（T2区域）。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

待测核酸可以单链或双链形式被固定在某一基质上，比如石蜡切片，冰冻切片，细胞涂片、硝酸纤维素膜，或者以一定方法已经捕获/结合了待测核酸的96孔板或微球等。使用三组或以上核酸探针组对待测核酸的结合则促使检测时形成的探针杂交混合物更快速更稳定，最多则可设计若干核酸探针组覆盖全部待测核酸序列。待测核酸包括ssDNA，dsDNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA或LncRNA，待测核酸的长度≥100个碱基。

如图1所示，核酸探针组，包括第一探针和第二探针；第一探针包括第一5’端碱基序列L1、第一互补序列A1和第一3’端碱基序列C1；第一5’端碱基序列L1与通用核酸D配对，第一3’端碱基序列C1与待测核酸T（T1区域）配对；第一5’端碱基序列L1为10-16个碱基；第一3’端碱基序列C1为15-30个碱基；

第二探针包括第二5’端碱基序列C2、第二互补序列A2和第二3’端碱基序列L2；第二5’端碱基序列C2与待测核酸T（T2区域）配对，第二3’端碱基序列L2与通用核酸D配对；第二5’端碱基序列C2为15-30个碱基；第二3’端碱基序列L2为10-16个碱基；

第一5’端碱基序列L1及其互补序列、第二3’端碱基序列L2及其互补序列与待测核酸T的物种基因组无相同或高度同源（高度同源为≥70%同源）。

第一3’端碱基序列C1的Tm值和第二5’端碱基序列C2的Tm值均为60-70℃，Tm值由第一3’端碱基序列C1和第二5’端碱基序列C2为15-30个碱基可以限定，经已知的生物信息学对退火温度的计算并配合实际研发中的经验而得到；且第一3’端碱基序列C1的Tm值和第二5’端碱基序列C2的Tm值相差≤1℃；第一5’端碱基序列L1与第二3’端碱基序列L2的总长核酸的Tm值，和第一3’端碱基序列C1或第二5’端碱基序列C2的Tm值之间的差值≤2℃；第一5’端碱基序列L1的Tm值低于第一3’端碱基序列C1的Tm值至少10℃；第二3’端碱基序列L2的Tm值低于第二5’端碱基序列C2的Tm值至少10℃；

第一互补序列A1和第二互补序列A2配对（配对即互补，第一互补序列A1和第二互补序列A2应至少有部分互补），第一互补序列A1和第二互补序列A2均为5-14个碱基；第一互补序列A1和第二互补序列A2的互补部分Tm值低于第一3’端碱基序列C1或第二5’端碱基序列C2的Tm值至少25℃。第一互补序列A1和第二互补序列A2当长度小于5碱基时，每少一个碱基，杂交检测信号约减少10%；长度大于14碱基时，信号也有明显下降。如果完全没有A1和A2区，像传统的一些原位杂交探针设计方案那样进行检测时，检测信号值只有本发明的30-50%。

通用核酸D不存在于待测样本中或与待测样本中所有的核酸序列均无同源性；通用核酸D可以无标记也可以有标记，标记包括荧光标记、抗体标记、生物素标记、地高辛标记和特定蛋白标记（比如碱性磷酸酶标记、辣根过氧化物酶标记）中的至少一种，之后通过常规显色或检测方法进行检测该通用核酸D，即可知道待测核酸T的定位与相对数量。

第一探针与待测核酸T的结合位置（T1区域）和第二探针与待测核酸T的结合位置（T2区域）之间的距离≤2个碱基；待测核酸T上为连续序列时，杂交检测信号值最强，间隔1-2碱基时，信号没有明显衰减，而后随着距离增大，信号开始衰减。当超过5个碱基时，大部分A1A2区的设计都无法稳定复合物，检测信号极不稳定。

与常规单链核酸探针（如图2所示）比较，常规单链核酸探针没有第二探针。本核酸探针组形成“工”字形的特点在于：C1和C2区同时结合于待测核酸T时，带标记的通用核酸D才能被杂交整合进整个复合物。这是因为，单独L1区的Tm值远低于L1和L2区组合的Tm值，如果任一探针（C1）非特异结合于某一非目的核酸时，带标记通用核酸D只能结合于单独的L1区，这将使得这个杂交非常不稳定，以至于通用核酸D会被洗涤除去而不能得到任何检测信号。而由基本的生物信息学可知，两条探针（C1和C2）同时非特异且紧邻结合于另一非待测区域的概率小于百万分之一，因此此种双探针设计也大大提高了检测的特异性。区别于传统双探针（如图3所示），传统双探针没有互补序列，本核酸探针组设计的部份为增加的互补序列A1A2，实际上当他们形成杂交复合物后，可以在空间上拉近L1和L2的距离，大有利于通用核酸D的杂交，因此比传统的检测方案更加有效率及增加了复合物的稳定性，保证实验的一致可重复性。

如果根据以上原则设计第二个核酸探针组，可增强检测的灵敏性。以第一个核酸探针组的待测核酸T的T2区域序列邻接的序列作为第二个核酸探针组待测核酸T1区域，以此设计第二核酸探针组的第一3’端碱基序列C1，以此按照上述方法得到第二个核酸探针组。

根据以上原则设计第三个核酸探针组，第二个核酸探针组的待测核酸T的T2区域序列邻接的序列作为第三个核酸探针组待测核酸T1区域，以此设计第三核酸探针组的第一3’端碱基序列C1，以此按照上述方法得到第三个核酸探针组。

每一个核酸探针组可与一个通用核酸D配对，因此每一个核酸探针组的第一5’端碱基序列L1与第二3’端碱基序列L2相同，每一个核酸探针组的第一互补序列A1和第二互补序列A2可以相同也可以不同。

一种核酸探针组的应用，将核酸探针组用于制备试剂盒；试剂盒包括上述的核酸探针组、通用核酸和杂交液；核酸探针组为三个。

杂交液一价阳离子浓度通常为700-800mM，并含有40-50wt%的甲酰胺，依此杂交条件，选定C1和C2区的Tm值60-70℃，这是因为根据如下已知寡核苷酸退火温度计算公式：

Tm=81.5+16.6LogM+0.41（G+C）%-500/L-0.62F（M为一价阳离子浓度，L为退火长度，F为甲酰胺百分比浓度），以25碱基退火长度计算，可知平均退火温度为65℃，而通常杂交最适温度会比Tm值小15-25℃，因此以此方案设计的探针可以40℃的温度进行杂交检测，此杂交温度既通常地高于室温，避免了非特异杂交，又可以显著降低长时间杂交时杂交液挥发导致的浓度变化。

传统方法中此步骤杂交时间较长且杂交复合物在之后的低温洗涤时极不稳定，影响了检测效率。本发明中的C1和C2区均为短链核酸，可以非常迅速地结合于待测核酸，其长度大于15碱基，也足以保证真核生物引物杂交的特异性，因此2-3h的杂交时间可以满足检测需求，比传统的选择长链探针过夜杂交更有效率。更特别的，A1和A2区的设计则极好地改善了杂交体系的稳定问题。在实验体系从杂交温度降温到洗涤温度的过程中，A1和A2区发生了互补杂交结合，该结合很好地稳定了整个杂交复合物，提高了检测效率并保证一致性。

实施例1：

现以检测人源的PPIB（NM_00942）基因为例，说明如何设计核酸探针组。第一探针中，可选取该基因第131-145碱基ggcctcagctgtccg（SEQ ID NO.1）为T1区域（Tm值为66℃），选取第146-161碱基ggctgctttcgcctcc（SEQ ID NO.2）为T2区域（Tm值为67℃）。则对应的第一探针的C1区序列应为5’cggacagctgaggcc3’（SEQ ID NO.3），对应的第二探针的C2区序列应为5’ggaggcgaaagcagcc3’（SEQ ID NO.4）。人工设计A1区序列为5’gtgtgtgtg3’（SEQ IDNO.5）（Tm值为35℃），设计A2区序列为5’cacacacac3’（SEQ ID NO.6）（Tm值为35℃）。人工设计L1区序列为5’acgattatcttcgg3’（SEQ ID NO.7）（Tm值为49℃），设计L2区序列为5’agaatatacactcg3’（SEQ ID NO.8）（Tm值为44℃）。则用于检测的通用核酸序列为与L1连结L2后的互补序列5’cgagtgtatattctccgaagataatcgt3’（SEQ ID NO.9）（Tm值为65℃）。

第一探针序列（L1+A1+C1）：5’acgattatcttcgggtgtgtgtgcggacagctgaggcc3’（SEQID NO.10）；

第二探针序列（C2+A2+L2）：5’ggaggcgaaagcagcccacacacacagaatatacactcg3’（SEQ ID NO.11）。

在杂交反应下，该核酸探针组可稳定结合于PPIB基因的转录子mRNA，在高温杂交中，C1C2区和待测核酸结合，在冷却至常温洗涤过程，A1和A2互补结合稳定了杂交体系，之后的第二步高温杂交，通用核酸可以杂交至L1和L2区。比如，在50wt%甲酰胺存在时，可以使用40℃的杂交条件用于两步杂交，中间的洗涤过程可以在常温下进行。

更进一步，我们可以依此设计第二个核酸探针组。第二个核酸探针组的T1和T2区的Tm值应和第一个核酸探针组接近，才能保证杂交反应可在相同温度下进行。选取第162-177碱基gcctgtggatgctgcg（SEQ ID NO.12）为T1区（Tm值为67.5℃），选取第178-197碱基cctctccgaacgcaacatga（SEQ ID NO.13）为T2区（Tm值为67.5℃），与第一个核酸探针组共享A1A2L1L2序列。则此第二个核酸探针组的第一探针和第二探针分别为：

第一探针（L1+A1+C1）：5’acgattatcttcgggtgtgtgtgcgcagcatccacaggc3’（SEQ IDNO.14）；

第二探针（C2+A2+L2）：5’tcatgttgcgttcggagaggcacacacacagaatatacactcg3’（SEQ ID NO.15）。

依次可设计第三个核酸探针组：选取第198-215碱基aggtgctccttgccgccg（SEQ IDNO.16）为T1区（Tm值为67.5℃），选取第216-232碱基ccctcatcgcggggtcc（SEQ ID NO.17）为T2区，此第三个核酸探针组的第一探针和第二探针分别为：

第一探针（L1+A1+C1）：5’acgattatcttcgggtgtgtgtgcggcggcaaggagcacct3’（SEQID NO.18）；

第二探针（C2+A2+L2）：5’ggaccccgcgatgagggcacacacacagaatatacactcg3’（SEQID NO.19）。

分别使用第一个核酸探针组、第二个核酸探针组、第三个核酸探针组和第一、第二、第三个核酸探针组混合对PPIB的转录子进行检测，检测步骤如下：1）依常规方法制作5微米厚石蜡切片；2）将切片用二甲苯脱蜡；3）将切片在10mM柠檬酸溶液中煮沸10分钟；4）用蛋白酶消化切片10分钟；5）将各核酸探针组以终浓度3uM在杂交液（50wt%甲酰胺、5×SSC、50mg/uL肝素、1mg/mL tRNA）40℃杂交2h；6）在40℃的条件下使用生物素标记的通用核酸杂交30分钟；7）以碱性磷酸酶标记的亲和素结合；8）碱性磷酸酶底物显色。

检测结果分别如图4、5、6、7所示，图7与图4-6对比，图7的信噪比最高，即第一、第二、第三个核酸探针组混合使用效果最好。

对于A1A2区效果的验证：

如图8-9所示，图8为使用连续20组不包含A1A2区序列的探针进行原位杂交检测的实验结果。图9为使用连续20组包含A1A2区序列的探针进行原位杂交检测的实验结果。可见，在探针中使用全互补或部分互补的A1A2区可以显著增强检测信号。

在本实施方案中，A1和A2序列可以有很多设计方案，但应遵守通用引物探针的最基础设计限制，即不可以在探针内部或探针间形成强烈的二级结构，满足此条件下，只要选取上述合适的Tm值即可。经我们验证也可以取用的A1和A2序列为部份互补的序列5’TAttatgagaaAG3’（SEQ ID NO.20）与5’GAttctcataaAT3’（SEQ ID NO.21）。也可以得到很好的原位杂交效果。另外有关L1和L2序列也可以选用5’ATGAAAGTTTTTAGAG3’（SEQ ID NO.22）和5’AATAGATTGTGTTTGG3’（SEQ ID NO.23）。

实施例2：

以检测大鼠ARBP（NM_022402）基因为例。根据表格1，以具体实施方式设计10个核酸探针组。图10为以第1个核酸探针组做原位杂交的检测结果，图11为以全部10个核酸探针组做原位杂交的检测结果。可见使用10个核酸探针组信号会大大增强。

表格1 大鼠ARBP待测核酸序列

实施例3：

以检测人源PDL1基因为例，根据表格2，以具体实施方式设计核酸探针组。

表格2人PDL1待测核酸序列

使用10个核酸探针组检测人源石蜡肺切片可得到高信噪比效果，结果如表格3所示。

表格3人源PDL1在肺切片的表达

实施例4：

该核酸探针组可用于从呈液态的混合样本中特异地捕捉待测核酸。实施步骤如下。首先将通用核酸序列用常规的共价结合办法固定于某一基质，比如微孔板、基因芯片、聚乙烯微球，而后将设计合成的核酸探针组和液态样本在一定的核酸杂交液环境中在某一温度孵育（由C1或C2区的Tm温度决定，通常40-65℃）2-3h或过夜，则待测核酸、核酸探针组和通用核酸就会形成稳定的复合物。在无甲酰胺存在下，以通用的生物学核酸southernblot杂交液，杂交温度可设定于55℃。接着洗涤去掉所有未能形成复合物的成分，待测核酸就可以以很高纯度的形式被保留在基质表面，后续可以通过别的生物学方法对此核酸进行检测（比如PCR，测序等等）。

只要待测核酸足够长＞200个碱基（可以设计出至少六个核酸探针组，也即可找出六组T1和T2区），通过至少三个核酸探针组和某一特定L1与L2通用核酸将待测核酸从一种液态样本中捕获至某基质表面，而后通过设计另外至少三个核酸探针组及又一组L1与L2通用核酸对其做放大检测。

同样以大鼠ARPB为例，以下步骤显示了如何从大鼠肾脏石蜡切片中捕获ARBP基因的mRNA。1）将通用核酸SEQ ID NO.9用常规方法共价结合于96孔板的孔中；2）将石蜡切片以石蜡裂解液在60℃消化1h；3）将根据实施例2表格1中第1-5组待测核酸序列设计第1-5个核酸探针组，以1uM终浓度，连同50uL石蜡消化液，选用100uL通用核酸杂交液在55℃孵育过夜；4）2×SSC洗液洗涤除去杂质，则微孔中只留下目标mRNA；5）再以根据表格1中第6-10组待测核酸序列设计第6-10个核酸探针组（配以SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23作为L1L2区）以1uM终浓度在55℃孵育1h；6）以SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23设计通用核酸（生物素标记）在55℃孵育1h；7）以PE荧光标记的亲和素结合于通用核酸；8）通过检测荧光强度对捕获的ARBP mRNA进行定量。

表格4显示了对石蜡切片做梯度稀释后捕获的ARBP mRNA荧光强度，可见荧光强度和预期的mRNA数量线性吻合（R²=0.9998）。

表格4 ARBP mRNA荧光强度

实施例5：

在对样本进行核酸检测时，经常需要区别检测到的信号是来源于双链基因组DNA还是转录产物单链RNA。第一探针和第二探针必须两条探针同时结合于目标位置，A1A2区杂交结合后方能显出信号。如果将T1T2区分别选在DNA的一条正链和负链上，则检测信号只可能产生于双链DNA；实验时只需将样本在95℃变性解开DNA双链，则检测到的信号只可能产生于解链的DNA；如果将T1T2区全部选在DNA的正链（也即与mRNA链相同序列），样本DNA不变性解链，则检测信号只可能产生于mRNA链，因为双链DNA在不变性条件下并没有空间让探针结合；如果将T1T2区全部选在DNA的负链（也即mRNA的互补链），样本DNA变性解开双链，则检测信号可能产生于RNA或DNA。按以上条件调整探针组合，即可验证信号是否来源于RNA还是DNA。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 广东品博易视生物科技有限公司

<120> 一种核酸探针组及其应用

<130> 2021

<160> 63

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> PPIB

<400> 1

ggcctcagct gtccg 15

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> PPIB

<400> 2

ggctgctttc gcctcc 16

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

cggacagctg aggcc 15

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

ggaggcgaaa gcagcc 16

<210> 5

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtgtgtg 9

<210> 6

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 6

cacacacac 9

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 7

acgattatct tcgg 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 8

agaatataca ctcg 14

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 9

cgagtgtata ttctccgaag ataatcgt 28

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 10

acgattatct tcgggtgtgt gtgcggacag ctgaggcc 38

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaggcgaaa gcagcccaca cacacagaat atacactcg 39

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> PPIB

<400> 12

gcctgtggat gctgcg 16

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> PPIB

<400> 13

cctctccgaa cgcaacatga 20

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 14

acgattatct tcgggtgtgt gtgcgcagca tccacaggc 39

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 15

tcatgttgcg ttcggagagg cacacacaca gaatatacac tcg 43

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> PPIB

<400> 16

aggtgctcct tgccgccg 18

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> PPIB

<400> 17

ccctcatcgc ggggtcc 17

<210> 18

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 18

acgattatct tcgggtgtgt gtgcggcggc aaggagcacc t 41

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 19

ggaccccgcg atgagggcac acacacagaa tatacactcg 40

<210> 20

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 20

tattatgaga aag 13

<210> 21

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 21

gattctcata aat 13

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 22

atgaaagttt ttagag 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 23

aatagattgt gtttgg 16

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 24

attagagtga catcgtcttt aaacccc 27

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 25

gcgtggcaat ccctgacgca 20

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 26

ccgccgtgat gcccaggg 18

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 27

aagacagggc gacctggaag t 21

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 28

ccaactactt ccttaagatc atccaact 28

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 29

tttggatgac tacccaaaat gcttc 25

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 30

attgtgggag cagacaatgt g 21

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 31

ggctccaagc agatgcagca 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 32

gatccgcatg tccctccgcg 20

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 33

ggaaggctgt ggtgctgatg g 21

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 34

gcaagaacac catgatgcgc 20

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 35

aaggccatcc ggggcca 17

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 36

cctggagaac aaccccgctc t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 37

ggagaagctg ctgcctcaca 20

<210> 38

<211> 18

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 38

tccgggggaa cgtgggct 18

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 39

ttgtgttcac caaggaggac ctca 24

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 40

ccgagattag ggacatgctg ct 22

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 41

ggccaataag gtgccagctg ct 22

<210> 42

<211> 17

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 42

gcccgagccg gtgccat 17

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> ARBP

<400> 43

cgccccgtgt gaggtcaca 19

<210> 44

<211> 18

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 44

gcggccccag ttctgcgc 18

<210> 45

<211> 19

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 45

agcttcccga ggctccgca 19

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 46

ccagccgcgc ttctgtccg 19

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 47

cctgcagggc attccagaa 19

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 48

agatgaggat atttgctgtc tttatattca 30

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 49

tgacctactg gcatttgctg aacg 24

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 50

catttactgt cacggttccc aa 22

<210> 51

<211> 28

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 51

ggacctatat gtggtagagt atggtagc 28

<210> 52

<211> 27

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 52

aatatgacaa ttgaatgcaa attccca 27

<210> 53

<211> 27

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 53

gtagaaaaac aattagacct ggctgca 27

<210> 54

<211> 26

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 54

ctaattgtct attgggaaat ggagga 26

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 55

taagaacatt attcaatttg tgcatgga 28

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 56

gaggaagacc tgaaggttca gca 23

<210> 57

<211> 24

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 57

tagtagctac agacagaggg cccg 24

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 58

gctgttgaag gaccagctct cc 22

<210> 59

<211> 23

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 59

ctgggaaatg ctgcacttca gat 23

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 60

cacagatgtg aaattgcagg atgc 24

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 61

aggggtgtac cgctgcatga t 21

<210> 62

<211> 23

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 62

cagctatggt ggtgccgact aca 23

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> PDL1

<400> 63

agcgaattac tgtgaaagtc aatgc 25

Claims

1.一种核酸探针组，其特征在于包括第一探针和第二探针；所述第一探针包括第一5’端碱基序列、第一互补序列和第一3’端碱基序列；所述第一5’端碱基序列与通用核酸配对，所述第一3’端碱基序列与待测核酸配对；

所述第二探针包括第二5’端碱基序列、第二互补序列和第二3’端碱基序列；所述第二5’端碱基序列与待测核酸配对，所述第二3’端碱基序列与通用核酸配对；

所述第一互补序列和第二互补序列配对。

2.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述第一5’端碱基序列为10-16个碱基；所述第一3’端碱基序列为15-30个碱基；所述第二5’端碱基序列为15-30个碱基；所述第二3’端碱基序列为10-16个碱基；所述第一5’端碱基序列及其互补序列、第二3’端碱基序列及其互补序列与待测核酸的物种基因组无相同或高度同源。

3.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述第一3’端碱基序列的Tm值和第二5’端碱基序列的Tm值均为60-70℃，且第一3’端碱基序列的Tm值和第二5’端碱基序列的Tm值相差≤1℃；所述第一5’端碱基序列与第二3’端碱基序列的总长核酸的Tm值，和第一3’端碱基序列或第二5’端碱基序列的Tm值之间的差值≤2℃；所述第一5’端碱基序列的Tm值低于第一3’端碱基序列的Tm值至少10℃；所述第二3’端碱基序列的Tm值低于第二5’端碱基序列的Tm值至少10℃。

4.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述第一互补序列和第二互补序列均为5-14个碱基；所述第一互补序列和第二互补序列的互补部分Tm值低于第一3’端碱基序列或第二5’端碱基序列的Tm值至少25℃。

5.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述通用核酸不存在于待测样本中或与待测样本中所有的核酸序列均无同源性。

6.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述通用核酸包括荧光标记、抗体标记、生物素标记、地高辛标记和特定蛋白标记中的至少一种。

7.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述第一探针与待测核酸的结合位置和第二探针与待测核酸的结合位置之间的距离≤2个碱基。

8.如权利要求1所述的核酸探针组，其特征在于，所述待测核酸包括ssDNA， dsDNA、cDNA或RNA，待测核酸的长度≥100个碱基。

9.一种核酸探针组的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的核酸探针组用于核酸原位检测。

10.一种核酸探针组的应用，其特征在于，将核酸探针组用于制备试剂盒；所述试剂盒包括如权利要求1所述的核酸探针组和通用核酸；所述核酸探针组为至少三个。