CN107099606A - 一种快速检测her‑2基因扩增的探针组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用荧光原位杂交技术快速检测HER‑2基因扩增的方法,每个靶位点的检测需要三种探针,分别为:接触探针、扩增探针和荧光探针。其中接触探针的5’端特异性地与HER‑2基因结合,3’端有20组20碱基的重复序列,可以特异性地与扩增探针相结合;扩增探针的5’端特异性地与接触探针的3’端结合,3’端有20组20碱基的重复序列,可以特异性地与荧光探针结合;荧光探针的5’末端带有CY3或FITC标记,通过这三种探针的协同作用,将荧光信号放大400倍,实现HER‑2基因扩增快速、灵敏的检测。本发明还公开了一种快速检测HER‑2基因扩增的试剂盒及探针组。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,特别涉及一种探针组和试剂盒,通过使用荧光原位杂交的手段,快速检测样品中的HER-2基因扩增。
背景技术
HER-2/neu基因(Her-2基因)在20-30%的浸润性乳腺癌中存在扩增,常见的扩增有单纯的Her-2基因扩增,也存在17号染色体非整倍性导致的Her-2基因拷贝数增加。Her-2基因所编码的蛋白为表皮生长因子受体蛋白2,其家族中共有4位成员,分别位Her1、Her2、Her3和Her4,属于酪氨酸激酶受体家族。基础研究显示,这些受体通过同源二聚或异源二聚的方式发生偶联,使受体胞内部分的酪氨酸激酶激活,导致下游的蛋白发生磷酸化,从而发挥调控细胞增殖以及血管生成等作用。正确的判断Her-2基因状态,可以准确的判断患者预后,并能指导临床合理选择治疗药物。HER-2基因扩增的患者能明显受益于靶向治疗药物赫赛汀。在该药物的临床应用过程中,HER-2基因的检测是至关重要的,因为该药物对具有HER-2基因扩增的患者具有良好的治疗效果,而对于低度扩增或者是不扩增的患者疗效不理想。
由于上述原因,HER-2基因扩增被列入乳腺癌临床必检项目,目前临床上检测HER-2扩增的常见方法有免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH),其中FISH是检测HER-2扩增的金标准。但传统FISH使用的是基因组探针,探针总长度达100Kb以上,由于探针长度极长,覆盖范围极大,使得部分序列不可避免地出现非特异性杂交,导致背景偏高;同时,过长的探针也经常导致荧光信号点发散,不利于信号的确认和统计。由于传统FISH探针单位长度的荧光强度有限,用减少探针长度的方法来解决上述问题,会使得荧光信号强度降低,不利于检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种探针组,通过荧光原位杂交的手段,建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中HER-2基因扩增的方法。
本发明的快速检测HER-2基因扩增的方法与传统FISH方法相比,具有背景低,信号点集中,特异性强,速度快等优点,能快速、高效地检测HER-2基因扩增。
本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明提供了一种快速检测HER-2基因扩增的探针组,所述探针组由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成,所述接触探针包括接触探针1和接触探针2,所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2,所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2,其中,接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为:
接触探针1:
5’-GTGGCGCTTAAGAAAATCCGCCTGGACACT(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)-3’;
扩增探针1:
5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)-3’;
荧光探针1:5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’;
接触探针2:
5’-CCTCGGAGAGGACAGAGGCCTAGGCCCACG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)-3’;
扩增探针2:
5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)-3’;
荧光探针2:5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’。
优选地,所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。
优选地,所述荧光基团为CY3或FITC。
进一步地,所述接触探针1、所述扩增探针1和所述荧光探针1用于检测HER-2基因,所述荧光探针1将HER-2基因标记为红色荧光,所述接触探针2、所述扩增探针2和所述荧光探针2用于检测17号染色体的着丝粒,所述荧光探针2将17号染色体的着丝粒标记为绿色荧光,所述接触探针、所述扩增探针和所述荧光探针的碱基序列中的F表示甲基化的C,J表示甲基化的G,引入F/J两种天然基因组DNA中不存在的碱基,可以有效地减少非特异性杂交,提高检测的特异性。
本发明还提供了一种用于快速检测HER-2基因扩增的的试剂盒,所述试剂盒包括杂交液和上述由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成的探针组。
进一步地,所述杂交液包括:1~10%(w/v)硫酸葡聚糖,100~1000mMNaCl,10~40%(v/v)去离子甲酰胺,5mM Na2EDTA,0.01~1%(v/v)TritonX-100,5~200mM Tris-HCl(pH 7.5),0.1~1%的吐温80,0.1~1%的三甲铵乙内酯。
本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测HER-2基因扩增的方法,包括如下步骤:
(1)吸取10μL样本滴在载玻片上,在56℃下烘干,使样本固定在载玻片上;
(2)在室温下将载玻片浸入二甲苯中脱蜡2次,每次10min,随后在100%乙醇中浸泡5min,接着依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各2min复水,在90℃下浸入纯化水中煮20-30min,每5min将样本玻片取出观察一次,防止样本脱落,取出载玻片,在室温下将其依次浸入70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2min脱水,自然晾干;
(3)分别吸取0.5μL的接触探针1、接触探针2、扩增探针1、扩增探针2、荧光探针1和荧光探针2,加入到17μL杂交缓冲液中,混匀,离心,得到探针混合物;
(4)将20μL探针混合物滴于载玻片的杂交区域,盖片,胶水封边,置于杂交仪中杂交30min;
(5)去除载玻片上的封片胶和盖玻片,在67±1℃下干燥2h,然后将其浸入含0.3%(v/v)NP-40的0.4×SSC溶液中漂洗2min,其间晃动1~2次,在暗处自然晾干;
(6)将10μL DAPI复染剂滴于载玻片的杂交区域,加盖盖玻片,静置10min,用荧光显微镜镜检。
本发明的技术要点或原理:荧光原位杂交(Flourescence insituHybridization,FISH)是一种应用标记有荧光物质的探针,通过杂交的方法来检测细胞或组织内特异性DNA或RNA的方法;传统的荧光原位杂交由于单条探针的荧光强度有限,只能通过用多条探针共同作用的方法来提高荧光信号强度,这些探针单条长度约200~500bp,覆盖总计高达100Kb以上的基因组区域。由于探针数量多,覆盖范围广,不可避免的有部分探针会产生非特异性杂交,从而导致背景上升。同时,由于探针的覆盖范围过大,很多时候荧光信号不能精确地聚成一个点,而是会发散开来,影响检测和结果判读,此外,传统FISH检测需经历长达16小时的杂交,检测时间长,检测效率低。
本发明通过引入接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针,并通过这三种探针与靶基因(HER-2)的相互作用,将荧光信号放大400倍,且杂交时间仅需要30分钟;本发明通过在三种探针中引入F(甲基化的C)和J(甲基化的G)两种天然DNA中不存在的碱基,来提高三种探针相互作用的精度,有效地避免非特异性杂交。
本发明通过大量实验,确定荧光原位杂交的最佳温度为42-58℃,甲酰胺最佳浓度为10-40%,分子信标的最佳浓度为10ng/L。
本发明荧光探针5’端的荧光基团,包括但不限于FITC或Cy3,可以根据现有技术进行添加。
与传统荧光原位杂交方法相比,本发明提供的方法具有以下优点:
1、本发明的探针组特异性地识别HER-2基因上30bp的序列,只有传统方法的千分之一,由于探针覆盖区域小,产生非特异性扩增的概率大大降低,从而背景更干净;
2、本发明的探针组特异性地识别HER-2基因上30bp的序列,只有传统FISH方法的千分之一,由于探针覆盖区域小,产生的荧光信号更加集中,同时,由于荧光信号被放大了400倍,荧光信号比传统方法更易识别和检测;
3、本发明的探针组的相互作用DNA区段均在30bp以下,只需要30分钟就能完成杂交,比传统FISH方法(16小时)的杂交时间大为缩短。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它附图。
图1为使用探针检测HER-2基因扩增的荧光图,其中a为使用传统FISH探针检测HER-2基因扩增的阴性结果,b为使用本发明的探针组检测HER-2基因扩增的阴性结果,c为使用传统FISH探针检测HER-2基因扩增的阳性结果,d为使用本发明的探针组检测HER-2基因扩增的阳性结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针的设计和合成
(1)通过序列比对和高级结构分析,选取BCR基因和ABL基因上各30bp的序列分别作为检测靶位点1和检测靶位点2,其碱基序列分别为:
靶位点1:5’-AGTGTCCAGGCGGATTTTCTTAAGCGCCAC-3’
靶位点2:5’-CGTGGGCCTAGGCCTCTGTCCTCTCCGAGG-3’
(2)根据靶位点序列,设计互补的探针序列,并在其3’端添加20组20碱基的重复序列,构成接触探针1和接触探针2,其碱基序列分别为:
接触探针1:
5’-GTGGCGCTTAAGAAAATCCGCCTGGACACT(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)20-3’
接触探针2:
5’-CCTCGGAGAGGACAGAGGCCTAGGCCCACG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)20-3’
重复序列经DNA序列比对,和人类基因组上任何区段不匹配,不会产生非特异性杂交,并且通过引入非天然的碱基F和J,进一步降低非特异性信号产生的可能性;
(3)根据各自接触探针的重复序列,设计相应的扩增探针1和扩增探针2,其碱基序列分别为:
扩增探针1:
5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)20-3’
扩增探针2:
5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)20-3’
扩增探针的3’端也带有20组20碱基的重复序列,经经DNA序列比对,和人类基因组上任何区段不匹配,不会产生非特异性杂交,并且通过引入非天然的碱基F和J,进一步降低非特异性信号产生的可能性;
(4)根据各自扩增探针的重复序列,设计相应的荧光探针1和荧光探针2,其碱基序列分别为:
荧光探针1:5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’
荧光探针2:5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’
在本实施例中,所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。所述荧光基团包括但不限于FITC、FAM或Cy3等,可以根据现有技术进行添加。
(5)人工设计合成相应的分子信标
在本实施例中,通过对分子信标做热变性曲线实验,确定荧光原位杂交的最佳温度为42-58℃,甲酰胺最佳浓度为10-40%,分子信标最佳浓度为10ng/L。
实施例2:传统FISH探针和本发明的探针组检测HER-2基因扩增
A、传统FISH探针检测
使用传统FISH探针检测HER-2基因扩增的方法,包括以下步骤:
(1)吸取10μL样本滴在载玻片上,在56℃下烘干,使样本固定在载玻片上;
(2)在室温下将载玻片浸入二甲苯中脱蜡2次,每次10min,随后在100%乙醇中浸泡5min,接着依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各2min复水,在90℃下浸入纯化水中煮20-30min,每5min将载玻片取出观察一次,防止样本脱落,取出载玻片,在室温下将其依次浸入70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2min脱水,自然晾干;
(3)吸取3μL探针加入到7μL杂交缓冲液中,轻弹离心管底部混匀后短暂离心,得到探针混合物;
(4)将10μL探针混合物滴于载玻片的杂交区域,立即加盖玻片,封片胶封住盖玻片边缘,避免盖玻片与玻片之间产生气泡;
(5)将载玻片置于杂交仪中,在变性温度为83℃,变性时间为5min,杂交温度为42℃的条件下杂交16h;
(6)去除载玻片上的封片胶和盖玻片,在67±1℃下干燥2h,然后将其浸入含0.3%(v/v)NP-40的0.4×SSC溶液中漂洗2min,其间晃动载玻片1~2次;
(7)在室温下将载玻片浸入含0.1%(v/v)NP-40的2×SSC溶液中漂洗30s,其间晃动载玻片1~2次;
(8)在室温下将载玻片依次浸入70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2min脱水,并在暗处自然晾干;
(9)在载玻片的杂交区域中滴加10μL DAPI复染剂,加盖盖玻片,避免盖玻片与载玻片之间产生气泡。静置10分钟,用荧光显微镜镜检。
B、本发明的探针检测
使用本发明的探针组检测HER-2基因扩增的方法,包括以下步骤:
(1)吸取10μL样本滴在载玻片上,在56℃下烘干,使样本固定在载玻片上;
(2)在室温下将载玻片浸入二甲苯中脱蜡2次,每次10min,随后在100%乙醇中浸泡5min,接着依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各2min复水,在90℃下浸入纯化水中煮20-30min,每5min将样本玻片取出观察一次,防止样本脱落,取出载玻片,在室温下将其依次浸入70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2min脱水,自然晾干;
(3)分别吸取0.5μL的接触探针1、接触探针2、扩增探针1、扩增探针2、荧光探针1和荧光探针2,加入到17μL杂交缓冲液中,混匀,离心,得到探针混合物;
(4)将20μL探针混合物滴于载玻片的杂交区域,立即加盖玻片,封片胶封住盖玻片边缘,避免盖玻片与玻片之间产生气泡;
(5)将载玻片置于杂交仪中,在变性温度为83℃,变性时间为5min,杂交温度为42℃的条件下杂交30min;
(6)去除载玻片上的封片胶和盖玻片,在67±1℃下干燥2h,然后将其浸入含0.3%(v/v)NP-40的0.4×SSC溶液中漂洗2min,其间晃动1~2次,并在暗处自然晾干;
(7)在载玻片的杂交区域中滴加10μL DAPI复染剂,加盖盖玻片,避免盖玻片与载玻片之间产生气泡,静置10分钟,用荧光显微镜镜检。
(8)计算每个基因红、绿色荧光强度比值(Ratio值):随机选取荧光显微镜内观察的30个细胞,统计30个细胞的细胞核中的红信号总数和绿信号总数,按照下列公式计算:
Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数。
(9)根据计算的Ratio值判断检测结果:
若Ratio值<2,则该样本为阴性结果,说明该样本无HER-2基因扩增;若Ratio值>2或有成簇红色信号,则该样本为阳性结果,说明该样本存在HER-2基因扩增。
C、两种方法的结果分析
经检验,本发明提供的FISH方法与传统FISH相比,对样本阴阳性判断的一致性超过99.9%,但传统FISH方法需要杂交16小时,本发明的FISH方法只需杂交30分钟。且本发明的FISH方法背景更干净,荧光信号更清晰,如图1所示。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种快速检测HER-2基因扩增的探针组,其特征在于,由接触探针、扩增探针和荧光探针三种探针组成,所述接触探针包括接触探针1和接触探针2,所述扩增探针包括扩增探针1和扩增探针2,所述荧光探针包括荧光探针1和荧光探针2,其中,接触探针1、扩增探针1、荧光探针1、接触探针2、扩增探针2和荧光探针2的碱基序列分别为:
接触探针1:
5’-GTGGCGCTTAAGAAAATCCGCCTGGACACT(GTATJCGCJCTGFTATJCCG)-3’;
扩增探针1:
5’-CGGFATAJCAGFGCGFATAC(TCFACGJCFCTAJGGAFAAFG)-3’;
荧光探针1:5’-CY3-JTTJTCCFTAGJGFCGTJGA-3’;
接触探针2:
5’-CCTCGGAGAGGACAGAGGCCTAGGCCCACG(AGTFAJCGCFGTAFCAAJTJ)-3’;
扩增探针2:
5’-FAFTTGJTACJGCGFTJACT(GCAFJTTACCGFAJJTACFT)-3’;
荧光探针2:5’-FITC-AJGTAFFTJCGGTAAFJTGC-3’。
2.根据权利要求1所述的探针组,其特征在于,所述荧光探针1和所述荧光探针2的5’端用荧光基团标记。
3.根据权利要求2所述的探针组,其特征在于,所述荧光基团为CY3或FITC。
4.根据权利要求1所述的探针组,其特征在于,所述接触探针1、所述扩增探针1和所述荧光探针1用于检测HER-2基因,所述荧光探针1将HER-2基因标记为红色荧光,所述接触探针2、所述扩增探针2和所述荧光探针2用于检测17号染色体的着丝粒,所述荧光探针2将17号染色体的着丝粒标记为绿色荧光。
5.根据权利要求4所述的探针组,其特征在于,所述接触探针、所述扩增探针和所述荧光探针的碱基序列中的F和J为两种天然基因组DNA中不存在的碱基,其中,F表示甲基化的C,J表示甲基化的G。
6.一种含有权利要求1-5任一所述探针组的用于快速检测HER-2基因扩增的试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还包括包括杂交液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述杂交液包括:1~10%(w/v)硫酸葡聚糖,100~1000mM NaCl,10~40%(v/v)去离子甲酰胺,5mM Na2EDTA,0.01~1%(v/v)TritonX-100,5~200mM Tris-HCl(pH 7.5),0.1~1%的吐温80,0.1~1%的三甲铵乙内酯。
9.一种利用权利要求6所述试剂盒快速检测HER-2基因扩增的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)吸取10μL样本滴在载玻片上,在56℃下烘干,使样本固定在载玻片上;
(2)在室温下将载玻片浸入二甲苯中脱蜡2次,每次10min,随后在100%乙醇中浸泡5min,接着依次浸入100%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中各2min复水,在90℃下浸入纯化水中煮20-30min,每5min将样本玻片取出观察一次,防止样本脱落,取出载玻片,在室温下将其依次浸入70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2min脱水,自然晾干;
(3)分别吸取0.5μL的接触探针1、接触探针2、扩增探针1、扩增探针2、荧光探针1和荧光探针2,加入到17μL杂交缓冲液中,混匀,离心,得到探针混合物;
(4)将20μL探针混合物滴于载玻片的杂交区域,盖片,胶水封边,置于杂交仪中杂交30min;
(5)去除载玻片上的封片胶和盖玻片,在67±1℃下干燥2h,然后将其浸入含0.3%(v/v)NP-40的0.4×SSC溶液中漂洗2min,其间晃动1~2次,在暗处自然晾干;
(6)将10μL DAPI复染剂滴于载玻片的杂交区域,加盖盖玻片,静置10min,用荧光显微镜镜检。
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Cited By (2)
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CN110172511A (zh) * | 2019-05-10 | 2019-08-27 | 广州安必平医药科技股份有限公司 | 用于检测her-2基因扩增水平的探针组、试剂盒及其应用 |
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