CN104789667B - 一种基于无偏识别与恒温扩增的小rna检测试剂盒及定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法，通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3‑WJ引物、3‑WJ模板并形成稳定的三元杂交结构，3‑WJ引物沿着硫代修饰的3‑WJ模板起始链置换扩增反应并产生大量带有酶切位点的单链SDA产物。该单链DNA打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复。分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被切口酶识别，被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，被释放后的SDA产物可与新的分子信标形成杂交双链，产生更多的荧光信号。该定量方法及试剂盒灵敏度高，通过硫代修饰模板，巧妙的实现了链置换扩增反应的级联放大。

Description

一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量 方法

技术领域

本发明属于小RNA检测技术领域，具体涉及一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法。

背景技术

小RNA是一类广泛存在于真核生物中的细胞内源性非蛋白编码RNA分子，其长度约为20-30个碱基，主要包括小干扰RNAs(siRNAs)，微RNA(miRNA)和与piwi相互作用的RNA(piRNA)。小RNA通过与特定的Argonaute家族蛋白(AGO蛋白)结合，指导AGO接近其标靶分子(DNA或RNA)，通过RNA诱导的沉默复合物特异性的降低目标基因的表达。小RNA参与调节细胞生长、发育、分化、增殖和凋亡等生命过程，影响着几乎所有的信号通路，参与各种生理病理过程，发挥着重要的调节作用，其表达水平与人类疾病特别是肿瘤的发生和发展密切相关，可以作为标志物用于一些癌症的早期诊断。因此，对定量检测组织、血液或细胞样本中小RNA方法及试剂盒的深入研究将有助于人们进一步了解小RNA与肿瘤发生、发展的生物学机制，对肿瘤的早期诊断以及治疗具有重要的意义。

Northern blotting技术是小RNA检测的经典方法及试剂盒，一直被用于小RNA的鉴定和发现等方面。该方法及试剂盒通过聚丙烯酰胺变性凝胶电泳对小RNA样品按大小与分子量进行分离，然后将小RNA转移并固定至硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，再与标记好的寡核苷酸探针杂交，洗膜后将非特异性结合的探针洗掉，最后经过显影获得信号。虽然该技术被认为是小RNA检测的标准方法及试剂盒，但其灵敏度、特异性不高，操作步骤多且复杂，耗时长(数天)，对环境要求很高。

相较于Northern blotting技术，微阵列芯片技术(Microarray)可以同时对多种目标物进行分析，实现了小RNA的高通量检测。Microarray是利用分子杂交原理，通过仪器把已知序列的DNA探针固定在玻璃片或者尼龙膜上形成阵列，然后加入多种待测的小RNA与DNA探针进行杂交固定，通过检测杂交信号的强度，经数据处理后获得不同小RNA的分析谱。然而，微阵列芯片技术制作成本高昂，灵敏度和重复性较差，选择性远不能让人满意。

为了提高灵敏度和特异性，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)已被应用于小RNA的分析。然而，由于成熟小RNA分子长度较短，仅相当于PCR引物的长度，无法直接用PCR技术实现扩增。另外，虽然RT-PCR具有较好的分析灵敏度和特异性，但是其依赖于热循环扩增反应，需要大型反应仪器(PCR仪)，同时要设计复杂的多种引物，极大地限制了它们的广泛应用。

为了简化反应条件和设计，同时又保持高灵敏度和选择性，研究者们相继发展了多种基于核酸恒温信号放大的小RNA检测方法及试剂盒。但是，近年来的研究表明，多种小RNA都存在3’末端甲基化，以使其免受细胞中多种核酸外切酶、连接酶、末端转移酶、聚合酶等可作用于核酸3’末端羟基的酶攻击，从而保护小RNA的稳定。这些小RNA的3’末端甲基化尽管没有改变核苷酸序列，却给现有的基于酶外切、酶聚合以及酶连接的检测技术带来了极大的挑战，这些酶反应都需要与小分子RNA的3’末端发生作用，而3’末端的甲基化会影响酶的识别能力，抑制酶反应的效率，最终导致检测结果不准确。因此，发展一种简单、通用、快速、高灵敏、高选择性的小RNA检测方法及试剂盒依旧是一个挑战。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒及定量方法，该试剂盒体系简单，使用方便，可实现高效、快速的酶协同级联恒温扩增反应，灵敏度高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，包括：

与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板；

其中，3-WJ引物由两部分序列组成，其5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3'端部分与3-WJ模板的中间段互补；3-WJ模板由三部分序列组成：其3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与3-WJ引物3'端部分互补，其5'端部分为含两个核酸切口酶识别位点的链置换扩增(SDA)模板区域，其中一个酶切位点经过硫代修饰；

扩增底物，包括dNTPs混合物；

工具酶，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶，用于三元杂交结构形成所触发SDA反应的引物聚合延伸以及酶切级联放大，产生带有内切酶位点的SDA产物；

带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；

以及扩增反应缓冲液。

小RNA检测试剂盒中包括：10nM 3-WJ引物，10nM 3-WJ模板，250uM dNTPs，250nM分子信标探针，0.5U DNA聚合酶(Klenow Fragment exo^-，KF^-)，2.5U核酸切口酶(Nt.BbvCI)，50mM KAc，10mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT；

与SDA产物互补的分子信标探针序列中含有核酸切口酶Nt.BbvCI的酶切位点。

3-WJ引物与3-WJ模板的摩尔比为1:1；且3-WJ引物与3-WJ模板有6个碱基的互补。

3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；含有酶切位点的硫代修饰的3-WJ模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。

本发明公开了一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，包括以下步骤：

1)提取获得待测目标小RNA；

2)通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的三元杂交结构；

3)将三元杂交结构与扩增底物、工具酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合，三元杂交结构中的三元引物沿着硫代修饰的三元模板起始链置换扩增反应并产生大量带有酶切位点的单链SDA产物；

4)扩增获得的SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，恢复荧光；分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，SDA产物与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；

5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析，得到待测溶液中小RNA的含量。

在3-WJ模板的SDA模板区域中含有两个Nt.BbvCI的识别位点，包括硫代修饰不被切割的单链序列5’-CCTCAGC-3’和可被切口酶识别并切割的5’-GCTGAGG-3’；

靠近模板3’端的位点在SDA生成双链的过程中被Nt.BbvCI识别，在聚合产物位点处切割实现SDA；

靠近模板5’端的位点被硫代修饰，阻断第二次Nt.BbvCI酶切，在产生大量带有酶切位点的SDA产物的同时模板不被酶切。

步骤3)所述的扩增反应中温度为37℃，反应时间为45分钟。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明提供的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，设计简单，一步操作即可完成，无需增加体系复杂性即可实现高效、快速的酶协同级联恒温扩增反应，反应快速，只需要30分钟，可以提高灵敏度到600fM；

2.本发明提供的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，具有很好的通用性，巧妙的回避了核酸外切酶、连接酶、聚合酶等工具酶对核酸3’末端羟基的偏好性导致检测结果不准确。可适用于各种修饰的小RNA序列，如3’末端2-O-甲基化修饰。并且只需改变三元探针的序列而无需改变发卡探针及分子信标即可检测其他序列的小RNA，方便、价廉。尤其是还能检测到植物样本中小RNA的表达水平，结果与商品化小RNA试剂盒相一致。

3.与传统的Northern印迹分析方法及试剂盒相比，本发明提供的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，样品需求量很少，可以实现微量操作，尤其有利于检测物中小RNA含量很少的情况；与实时定量PCR相比，本发明采用的恒温反应，无需使用昂贵的热循环仪，体系设计更为简单，应用范围更广泛。

4.本发明巧妙的利用小分子RNA作为三元杂交结构的参与链，稳定了三元杂交结构的形成。由于小RNA不参与SDA聚合反应，其3’末端的修饰不会对依赖3’羟基的工具酶的识别和作用产生影响，进一步确保了本发明应用的通用性和普适性。同时，本发明所设计的级联放大方法无需茎环介导，避免了对茎环结构的设计与优化，简化了实验体系，在不增加体系复杂性的条件下，实现了高效、快速的信号放大。

附图说明

图1为本发明的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法流程示意图；

图2-1为在聚合反应体系下切口酶能够循环酶切分子信标产生信号放大的可行性验证结果图；

图2-2为硫代修饰可以有效阻断切口酶对模板切割作用的熔解曲线分析图；

图2-3为本发明所建立的级联放大方法与传统SDA方法的放大效果对比图，以荧光强度表征；

图2-4为本发明所建立的级联放大方法与传统SDA方法的放大效果对比图，以信号/背景比值表征；

图3-1为优化不同KF^-聚合酶浓度对检测效果的影响结果；

图3-2为优化不同Nt.BbvCI切口酶浓度对检测效果的影响结果；

图4为根据荧光信号的检测结果与目标小RNA的浓度的标准曲线；

图5为本发明与商品化的实时荧光定量PCR检测试剂盒的比对结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，包括：

与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括10nM 3-WJ引物和10nM3-WJ模板：

3-WJ引物由两部分序列组成，5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3'端部分与3-WJ模板的中间段互补；

3-WJ模板由三部分序列组成，3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与3-WJ引物3'端部分互补，5'端部分为含两个核酸切口酶识别位点的SDA模板区域；其中一个酶切位点经过硫代修饰；

3-WJ引物的核苷酸序列为(5’to 3’)：

GTG CTC ACT CAT CCA AAA(SEQ.ID.NO.1)

含有酶切位点的硫代修饰3-WJ模板的核苷酸序列(5’to 3’)，*表示硫代修饰：

TATTGTGTC*C*T*C*A*GC GCTGAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA(SEQ.ID.NO.2)

扩增底物，包括250uM dNTPs混合物；

工具酶，包括具有链置换扩增活性的0.5U DNA聚合酶和2.5U核酸切口酶，用于触发SDA产生带有内切酶位点的SDA产物；

250nM带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；

序列如下(SEQ.ID.NO.3)：

FAM-CCA CGA GTC AGT GTC CTC AGC GTG G-DABCYL

以及扩增反应缓冲液(50mM KAc，10mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)2及1mM DTT)。

即，该小RNA检测试剂盒中包括：10nM 3-WJ引物，10nM 3-WJ模板，250uM dNTPs，250nM分子信标探针，0.5U DNA聚合酶(Klenow Fragment exo^-，KF^-)，2.5U核酸切口酶(Nt.BbvCI)，50mM KAc，10mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT。

本发明公开的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，具体流程参见图1：

将从植物或动物样本中提取的目标小RNA与三元杂交结构的组合物混合，小RNA通过碱基互补配对与3-WJ模板，3-WJ引物形成并形成稳定的三元杂交结构；

将三元杂交结构与扩增底物、工具酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合；在三元杂交结构存在的情况下，DNA聚合酶识别3-WJ引物与3-WJ模板的SDA模板区域形成的扩增起始位置，并进行扩增，待扩增至一定长度后，扩增产物中的第一个核酸切口酶识别位点被识别并在扩增链的相应位点发生切割，由于靠近5’端的第二个酶切位点经硫代修饰，阻断了第二次酶切，即可产生大量带有酶切位点的SDA产物，而三元杂交结构中的SDA模板区域继续被扩增；

扩增所获得的SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复；同时分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；

被切割的分子信标在反应温度下不稳定，从双链结构上脱落产生荧光信号，而SDA产物可与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析得到待测溶液中小RNA的含量，在一定范围内，小RNA浓度越高，则荧光信号越强。

1、本发明建立了基于硫代修饰3-WJ模板的级联放大策略，通过对模板进行硫代修饰可以抵抗核酸切口酶的作用，实现SDA体系的级联放大。

参见图2-1所示，以互补链作为对照验证了本方法的放大能力，通过酶切放大可以显著提高荧光信号。再将这种放大的方法应用于基于硫代修饰3-WJ模板的级联放大策略，通过对模板进行硫代修饰可以抵抗核酸切口酶的作用，实现SDA体系的级联放大。

设计传统的3-WJ SDA模板(SDA组)，无硫代修饰的3-WJ模板(对照组)，硫代修饰的3-WJ模板(本方法组)进行对照，验证了本发明级联放大的可行性。

对照组：含有酶切位点的无硫代修饰3-WJ模板的核苷酸序列(5’to 3’)：

TAT TGT GTC CTC AGC GCT GAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA

本方法组：含有酶切位点的硫代修饰3-WJ模板的核苷酸序列(5’to 3’)，*表示硫代修饰：

TAT TGT GTC*C*T*C*A*GC GCT GAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA

SDA组：不含酶切位点的常规3-WJ SDA模板的核苷酸序列(5’to 3’)：

AGT CAG TGT CCT CAG GCT GAG GTT GTT TTG GTC TTC TGT CA。

参见图2-2，为不同模板酶切反应后的溶解曲线分析结果。其中，a为硫代修饰的3-WJ模板的无切口酶体系；b为硫代修饰的3-WJ模板的切口酶体系；c为无硫代修饰的3-WJ模板的无切口酶体系；d为无硫代修饰的3-WJ模板的切口酶体系的溶解曲线分析，该组图证明了硫代修饰可以有效的保护SDA模板，不会被内切酶作用，体系内有无内切酶计划无差异，但是不被硫代修饰的3-WJ模板则在内切酶体系内被切断，溶解曲线表现出明显的差异。

参见图2-3和图2-4，为不同模板扩增体系SDA信号响应：对照组代表具有酶切位点的无硫代修饰模板，由于体系内存在切口酶，模板被切断，荧光信号较低；SDA组代表无酶切位点的常规SDA模板，表现出正常的荧光信号；发明提出的带有酶切位点的硫代修饰模板，通过硫代修饰模板抵抗酶切，实现体系内的级联放大，具有显著的信号增强效果。

2、本发明对KF^-聚合酶以及Nt.BbvCI切口酶的浓度进行了优化，对比了体系内加入不同浓度聚合酶(0.375u，0.5u，0.75u，1u)和Nt.BbvCI切口酶(1.875u，2.5u，3.125u)时，级联放大所产生的背景和信号的荧光强度，最终选定0.5u KF^-聚合酶和2.5u Nt.BbvCI切口酶作为本发明检测的最佳工具酶浓度。参见图3-1和3-2，由图中可以看出，KF^-聚合酶与Nt.BbvCI切口酶的最优浓度为0.5个单位和2.5个单位时，信号与背景的比值最大。

3、利用荧光分光光度计检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与目标小RNA的浓度来绘制标准曲线，结果参见图4，其中，横坐标为小RNA的浓度，纵坐标为为荧光强度。检测限可达600fM。图4中的插入图显示在4pM-500pM范围内，荧光强度与小RNA浓度图3不同浓度小RNA的定量检测检测的对数呈现线性相关。

4、检测植物样本小RNA的表达：

采用商品化试剂盒(RNAiso for small RNA，Takara)提取小RNA的步骤如下：从超低温冻结的拟南芥叶片称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研钵研磨组织，期间不断加入液氮直至研磨成粉末状。向研钵中加入适量的RNAiso for small RNA，将研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液透明。将匀浆液置于离心管中室温静置5min后12000g，4度离心5min。小心吸取上清液移至新的离心管中，加入氯仿(RNAiso for small RNA用量的1/5体积)，紧盖离心管盖，用手剧烈震荡15s，待溶液充分乳化后室温静置5min。12000g，4度离心15min，吸取上清液转移至新的离心管内，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后在15-30度静置10min，12000g，4度离心10min。小心弃去上清，缓慢盐离心管壁加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管壁，12000g，4度离心5min后小心弃去乙醇，室温干燥沉淀2-5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。将根据目标小RNA所设计的RT-PCR引物与小RNA样品混合，逆转录完成后采用实时定量PCR试剂盒进行小RNA样品检测(miRNA荧光定量PCR试剂盒，吉玛基因)。结果参见图5，说明本发明方法及试剂盒与商品化的实时荧光定量PCR检测试剂盒检测到植物样本中小RNA的表达水平结果一致。

综上所述，本发明公开的试剂盒在定量检测目标小RNA含量时，通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的三元杂交结构。三元杂交结构中的3-WJ引物沿着硫代修饰的3-WJ模板起始链置换扩增反应并产生大量带有酶切位点的单链SDA产物。该单链DNA可以打开分子信标的茎环结构，其荧光恢复。同时分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中还含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后该位点被切口酶识别，被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，而被释放后的SDA产物可与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号。该方法及试剂盒通用性强，有效解决了由于许多物种小RNA 3’末端2-O-甲基化修饰而引起的聚合抑制问题，可在30min内实现小RNA的无偏扩增恒温定量，检测限低至600fM。此外，只需改变三元探针的序列而无需改变分子信标即可检测其他序列的小RNA，方便、价廉。该定量方法及试剂盒灵敏度高，通过硫代修饰模板，巧妙的实现了链置换扩增反应的级联放大，能检测到植物样本中小RNA的表达水平，结果与商品化小RNA试剂盒相一致。

Claims (6)

1.基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，包括：

与目标小RNA形成三元杂交结构的组合物，包括3-WJ引物和3-WJ模板：

3-WJ引物由两部分序列组成，5'端部分与目标小RNA 3'端部分互补，3'端部分与3-WJ模板的中间段互补；

3-WJ模板由三部分序列组成，3'端部分与目标小RNA 5'端部分互补，中间段与3-WJ引物3'端部分互补，5'端部分为含两个核酸切口酶识别位点的链置换扩增SDA模板区域，其中一个切口酶识别位点经过硫代修饰；

扩增底物，包括dNTPs混合物；

工具酶，包括具有链置换扩增活性的DNA聚合酶和核酸切口酶，用于触发SDA产生带有内切酶位点的SDA产物；

带有茎环结构的分子信标探针，其两端分别标记有荧光基团和猝灭基团，分子信标探针具有能够与SDA产物相互补的序列；与SDA产物互补的分子信标探针序列中含有核酸切口酶Nt.BbvCI的酶切位点；

以及扩增反应缓冲液；缓冲液包括：KAc、Tris-HAc、Mg(Ac)₂及DTT；

3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；含有酶切位点的硫代修饰的3-WJ模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；其两端分别标记有荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL。

2.根据权利要求1所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，小RNA检测试剂盒中包括：10nM 3-WJ引物，10nM 3-WJ模板，250uM dNTPs，250nM分子信标探针，0.5U DNA聚合酶，2.5U核酸切口酶，50mM KAc，10mM Tris-HAc，10mM Mg(Ac)₂及1mMDTT。

3.根据权利要求1所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA检测试剂盒，其特征在于，3-WJ引物与3-WJ模板的摩尔比为1:1；且3-WJ引物与3-WJ模板有6个碱基的互补。

4.一种基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取获得待测目标小RNA；

2)通过核酸互补杂交，目标小RNA特异性识别3-WJ引物、3-WJ模板并形成稳定的三元杂交结构；

其中，3-WJ引物的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

3-WJ模板的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

3)将三元杂交结构与扩增底物、工具酶、分子信标探针以及扩增反应缓冲液混合，三元杂交结构中的三元引物沿着硫代修饰的三元模板起始链置换扩增反应，产生大量带有酶切位点的单链SDA产物；

4)扩增获得的单链SDA产物触发打开分子信标的茎环结构，恢复荧光；分子信标与SDA产物形成的双链互补结构中含有核酸切口酶识别位点，在形成双链结构后，该核酸切口酶识别位点被识别，并在分子信标序列上进行切割；被切割的分子信标从双链结构上脱落产生荧光信号，SDA产物与新的分子信标形成杂交双链，以产生更多的荧光信号；

5)待达到规定的反应时间后，检测荧光信号，对荧光信号分析，得到待测溶液中小RNA的含量。

5.根据权利要求4所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，其特征在于，在3-WJ模板的SDA模板区域中含有两个Nt.BbvCI的识别位点，包括硫代修饰不被切割的序列5’-CCTCAGC-3’和能够被切口酶识别并切割的5’-GCTGAGG-3’；

靠近模板3’端的位点在SDA生成双链的过程中被Nt.BbvCI识别，在聚合产物位点处切割实现SDA；

靠近模板5’端的位点被硫代修饰，阻断第二次Nt.BbvCI酶切，在产生大量带有酶切位点的SDA产物的同时模板不被酶切。

6.根据权利要求4所述的基于无偏识别与恒温扩增的小RNA定量方法，其特征在于，步骤3)所述的扩增反应中温度为37℃，反应时间为45分钟。