CN104164488B - 一种单引物引发的核酸恒温扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种单引物引发的核酸恒温扩增方法。本发明所要解决的技术问题是提供一种单引物引发的核酸恒温扩增方法，避免了现有技术的传统恒温检测方法中引物设计复杂，检测成本高等缺点。本发明提供的技术方案为一种单引物引发的核酸恒温扩增方法，通过对引物序列的设计使得引物在与目标核酸配对后自身互补配对，形成茎环结构继而从目标核酸上脱离，在切刻酶和聚合酶共同作用下不断产生核苷酸片段。本发明技术方案可在等温条件下完成，仅仅利用可保持恒定温度的设备就可得以施行，操作方便；扩增过程中只需一条引物，从而使检测方案更加简便易行，提高了核酸扩增及检测的效率。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种单引物引发的核酸恒温扩增方法。
背景技术
核酸检测已经广泛应用于临床诊断，环境监测以及传染疾病的预防与控制等许多方面，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)能对微量核酸模板进行指数性扩增，其高灵敏度使其成为目前使用最广泛的核酸扩增方法，然而，传统PCR需要使用热变性的方法制备单链核酸模板，使引物与模板退火，此过程需要具有精确调控温的仪器。此外，PCR反应的特异性取决于引物退火的特异性，为了得到特异性的扩增，常常需要对退火温度进行优化，工作较繁琐。此外，PCR的产物也可以作为模板进行扩增，大量的产物极大的增加了污染的可能性，因此，对产物的处理要非常谨慎。为了克服上述传统PCR费时、费力、工作繁琐等的缺点，自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术。美国New England Biolabs的研究人员模拟生物体内DNA的复制机制发明了一种新的体外恒温基因扩增技术--依赖于解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification,HDA)，此方法使用解旋酶将双链核酸变成单链核酸，代替了传统PCR的热变性方法，使得整个反应可以在恒温下进行，是一种恒温条件下进行的PCR反应，不需要温度的反复调控，省时、省力。但是此过程需要加入打开双链核酸的解旋酶、使核酸保持单链状态的单链DNA结合蛋白(SSB)和聚合酶，导致检测费用增加。1992年美国BectonDickinson研究中心的Walker等首次报道链置换扩增技术(Strand DisplacementAmplification,SDA)，其首先使用热变性方法将双链DNA转变为单链，带有限制性内切酶识别序列的引物与单链模板退火，聚合酶延伸形成模板的互补链，加入的外引物链置换下形成的模板互补链，另一个带有限制性酶识别序列的引物与形成的模板互补链退火，延伸，实验中使用硫代dNTP作为合成底物，使得内切酶只能裂解其中一条链，形成切口，聚合酶和内切酶共同作用进行指数扩增。此方法需要预先的热变性过程，需要额外的加入硫代dNTP合成底物，增加了设计的复杂性和实验费用。虽然后来切刻酶的发明解决了使用硫代dNTP合成底物来使内切酶裂解其中一条链的问题，节约了硫代dNTP合成的成本，但是需要设计四条引物和预先高温变性的问题仍没有解决。环介导等温扩增技术(LoopMediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等于2000年建立的一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，该技术是用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现DNA的快速等温扩增。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其特别之处在于引物的设计，它包括2条内引物FIP、BIP及2条外引物F3、B3，其中两条内引物在模板上延伸之后会自身形成茎环结构，两条外引物在聚合酶延伸作用下，链置换下延伸的内引物。该方法反应迅速，一小时内可有效的扩增检测1-10个拷贝的目的基因，特异性强，恒温检测，不需要特殊的仪器。但是此方法四条引物设计比较困难，对设计人员要求高，此过程双链的解离需要依靠加入解链温度调节剂，并且扩增的含有重复结构的大量产物易形成气溶胶，造成假阳性结果。
发明内容
本发明为解决现有技术中所存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种单引物引发的核酸恒温扩增方法，避免了现有的传统恒温检测方法中需要预先通过变温手段打开双链核酸再进行扩增及引物设计复杂，检测成本高等缺点。
本发明提供的技术方案为：
一种引发核酸恒温扩增反应的单引物，引物至少含有a、b’、x、c四个区，其中b’区和a区的5’侧相连，x区和b’区的5’侧相连，c区和x的5’侧相连；a区是和靶标核酸互补配对的核苷酸序列，b’区是与使用该引物延伸合成反应产物的3’末端区域互补的核苷酸序列，x区包含切刻酶的识别位点和切刻位点核苷酸序列，c区是利用其合成的互补核酸进行信号检测的核苷酸序列；引物a区聚合延伸形成b区，形成的a+b区可在反应温度下与模板核酸动态解离；引物延伸形成的b区与引物原有序列自身折叠互补配对，形成自身茎环结构；形成的茎环结构3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位点。
本文所述一种引发核酸恒温扩增反应的的单引物，其至少含有a、b’、x、c四个区，也就是说此单引物不仅仅局限于这四个区，也可含有多个切刻酶位点，在此设计下，单个引物即可引发该扩增反应，方法简便，易于操作。
本文所述的靶标模板a+b区可由5-200个碱基组成，更优选10-50个碱基对。
本文所述的引物延伸形成的b区自身折叠形成茎环结构，不仅仅局限于与引物自身的b’区互补，特征在于形成的茎环结构在聚合延伸后能形成新的切刻酶位点。
一种单引物引发的核酸恒温扩增方法，(1)引物的3’端a区与核酸模板近5’端的区域a’区退火；(2)聚合酶以退火后的引物的a区3’末端为合成起点，以核酸模板未发生互补配对的b’区为模板，进行合成反应；(3)步骤(2)产生的引物延伸产物可以在反应温度下自身退火并和核酸模板发生解离，形成含有a区的环，而核酸模板又可重复参与步骤(1)中与引物的反应过程；(4)步骤(3)中形成了茎环结构的延伸产物以自身为模板，以与b’区退火的b区的3’末端为合成起点，合成其自身的互补链；(5)切刻酶在步骤(4)形成的延伸产物的X’区进行单核酸链的切刻，形成切口，聚合酶以切口5’侧的X’区的3’末端为合成起点，以自身为模板，进行链置换合成反应，置换步骤(4)所合成的互补链c’；其中聚合酶在切刻形成的切口处进行聚合反应形成的产物和步骤(4)形成的产物一样，可进行步骤(5)的反应，不断循环置换产生互补链c’。
所述地，反应产生的大量的c’不会和引物再引发扩增反应，避免了传统扩增反应中产物再扩增从而产生的产物污染问题。
优化地，所述的单引物引发的核酸恒温扩增方法，处理双链核酸，得到核酸模板。包括：含有切刻酶切刻位点的双链核酸在聚合酶和切刻酶的共同作用下不断产生含有特定区域的单链核酸模板分子，与后续级联扩增反应相结合(如图1)，使得信号扩增更强，此反应只需要切刻酶聚合酶共同作用在等温条件下进行解链过程，不需要传统扩增方法所必须的变温过程。
处理双链核酸的方法可采用酶或超声等手段，得到的核酸结构含有能与引物a区退火互补配对的a’单链区域，所得到的核酸模板的b’区是单链或者双链结构对本实验无影响。如果b’区为双链结构，在引物延伸过程中由于聚合酶的链置换特性也会将原与模板链配对的部分区域打开变为单链，进行合成延伸。
优化地，所述的单引物引发的核酸恒温扩增方法，所述核酸模板为DNA或RNA。
优化地，所述的单引物引发的核酸恒温扩增方法，可在步骤(3)中加入解链温度调节剂促使引物延伸产物从模板解离。
本文所用术语“解链温度调节剂”是指降低解核酸链温度的调控物，如甜菜碱、三甲胺N氧化物、脯氨酸、二甲基亚砜和甲酰胺等。
一种检测目的核苷酸序列的方法，包括上述任一种扩增方法，还包括基于信号变化测定是否已产生步骤(5)中产生的扩增反应产物。
优化地，所述的检测目的核苷酸序列的方法，所述信号变化是基于加入核酸检测试剂，包括荧光检测试剂、电化学检测试剂、比色检测试剂、化学发光检测试剂。
所述的荧光检测试剂一般包括能嵌插入DNA发光的试剂，如溴化乙锭、SYBR Green I、GoodView等，也包括标记有荧光基团的分子信标等。
所述的荧光检测可以利用能保持恒定温度和荧光扫描的仪器进行检测，也可以利用现有的PCR仪在恒定温度下进行反应，如实施例所示的伯乐CFX96荧光定量PCR仪器。
所述的电化学检测试剂包括利用电化学手段进行寡核苷酸的检测，如辣根过氧化物酶电化学体系，三联吡啶钌电化学体系等。
所述的比色检测试剂包括纳米金比色、钙黄绿素比色、ABTS比色等能发生颜色变化的试剂。
所述的化学反光检测试剂包括鲁米诺及其衍生物-过氧化氢体系、吖啶脂类-过氧化氢体系、钌联吡啶+TPA体系等。
基于检测目的核苷酸序列的方法进行突变检测的方法，其中要被扩增的核苷酸序列中的野生型或突变至少一个在3’末端防止互补链的合成，其3’末端是构成扩增方法的互补链合成的起点，其中所述的3’端选自：引物a区的3’末端或上述步骤(2)中合成的互补链b的3’末端。
本文所述的突变检测方法可以对野生型或者突变型任一一个进行设计相对应引物，进行检测，具体的，可以设计野生型对应的引物进行检测，此情况下突变型不会有信号变化；也可以设计突变型对应的引物进行检测，此情况下野生型不会有信号变化。
单引物引发的核酸恒温扩增试剂盒，包括以下组分：寡核苷酸引物，其至少包括前述引物的a、b'、x、c区；催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶；能够特异的切刻双链核酸其中一条核酸链的切刻酶；核苷酸，其作为聚合酶的底物。
本文所用术语“试剂盒”是指本发明扩增检测所需的各种试剂可被预先包装，并以试剂盒的形成提供，具体地，本发明所提供的试剂盒包含作为合成互补链合成的引物，用于互补链合成的底物dNTPs，用于实现链置换型互补链合成的DNA聚合酶，用于切刻双链DNA特定一条链的切刻酶，为酶反应提供合适条件的缓冲液，和用于检测合成反应产物的所必须的介质。具体地，本发明优选的模式中，反应期间无需加入试剂，并由此对于移入反应容器后一个反应所必须供给的试剂，其中仅通过加入样品就可以启动该反应，通过利用发光信号、电信号或荧光信号可在反应容器内检测反应产物的系统。反应后不必打开或关闭容器，这对于预防污染是非常可取的。
在同一反应体系检测多个靶标核酸的方法，基于单引物引发的核酸恒温扩增方法，在同一反应体系中至少含有两条引物，通过至少一个检测信号实现多个靶标核酸的同时分别检测或多个靶标核酸的兼并性检测。
本文所用术语“同时分别检测”是指同时检测不同的靶标核酸时用不同的信号分别指示，即针对同一体系中不同的靶标核酸设计相应的引物，扩增反应产生不同的信号。
本文所用术语“兼并性检测”是指同时检测不同的靶标核酸时用同一种信号指示，即针对同一体系中不同的靶标核酸设计相应的引物，扩增反应产生同一种信号。
本文中所用术语“切口”指对双链核酸的两条链中的一条进行内部切割。
本文中所用术语“切刻酶”指切刻内切酶，它可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA中一条DNA链的一类内切酶。如Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII或者其他类似的具有切刻功能的酶。
本文中所用术语“聚合酶”为具有链置换活性的聚合酶，即该酶具有链置换的活性，说的更确切些，该聚合酶可在作为模板的核酸序列基础上进行DNA复制并置换DNA链以释放退火到模板链上的互补链。如9°NmTmDNA聚合酶、Bst DNA聚合酶，大片段、Bsu DNA聚合酶，大片段、Deep VentRTm DNA聚合酶、Deep VentRTm(exo-)DNA聚合酶、Klenow片段3’-5’exo-、DNA聚合酶I，(Klenow)大片段、M-MuLV反转录酶、phi29DNA聚合酶、DNA聚合酶、VentR(exo-)DNA聚合酶或其他类似功能的聚合酶中的一种。
本文中所用术语“解离”是双链核苷酸变成单链核苷酸的过程。
本文中所用术语“退火”指的是通过根据沃森-克里克定律的碱基配对，形成双链结构的核酸。
本文中所用术语“自身折叠互补配对”是指寡核苷酸自身含有互补配对的核苷酸序列，自身发生碱基互补配对。
本文中所用术语“核酸”，本发明核酸通常既包括DNA又包括RNA。然而，功能为合成互补链的模板的，来自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替代的核酸或修饰核苷酸也包括在本发明的核酸范围内，通常本发明的核酸被包括于生物样品中，生物样品包括动物，植物或微生物的组织，细胞，培养物和分泌物，或它们的提取物。本发明的生物样品包括细胞内寄生物基因组DNA或RNA例如病毒或支原体，本发明的核酸一般由包含在所述生物样品的核酸衍生而来。例如由mRNA合成cDNA，基于生物样品衍生来的核酸而扩增的核酸，是本发明的核酸的典型实例。
本文中所用术语“核酸”、“DNA”以及类似术语还包括核酸类似物，即具有磷酸二酯主链以外的类似物。举例来说，本领域已知并且在主链上具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”，被认为在本发明的范围内。
本文所用术语“目的核苷酸序列”是指将对其进行扩增或者检测或者既扩增又检测的一段目标(靶)区域。目的核苷酸序列作为扩增和检测的对象可以是任何核酸。目的核苷酸序列可以是RNA、cDNA、基因组DNA，或者来自如一种致病的微生物或病毒的DNA或RNA。目的核苷酸序列还可以是经化学试剂、各种酶类以及物理暴露处理过的DNA。一份样品中的目的核苷酸序列可以以单链DNA或RNA如cDNA、mRNA、其他RNA，或以分离的互补链的形式存在。可以通过物理的、化学的或酶学的方法实现目标的核酸互补链的分离。
本文所用术语“引物”是指一种自然产生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸当被置于诱发与一条核酸链互补的一种引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成的起始点，其中所述条件即有核苷酸和一种聚合反应试剂如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和缓冲条件。本文中的引物是经过选择从而与待扩增的各特异性序列的不同链充分互补的。也就是说引物与它们各自的对应链必须充分互补以能与之杂交。一段非互补的核苷酸片段可以与引物的5’端相联，而该引物序列的其余部分与目标碱基序列的诊断区互补。除了当非互补的核苷酸如上文所述存在于预先确定的引物末端时以外，引物通常是互补的。
本文所用术语“与……互补”是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸碱基配对。即腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况下胸苷与鸟苷可以碱基配对，亦不应将它们视为互补的。
本文所用术语“双链”是指一条寡-多聚核苷酸与互补的寡-多聚核苷酸杂交。
本文所用术语“扩增”是指在核酸序列的混合物中令一种特定核酸序列的浓度升高的任何扩增过程。
本文所用术语“发卡(Hairpin)”结构也被称作“茎环”结构，是指一种寡核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该寡核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。发卡结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的寡核苷酸序列后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成发卡结构。
本发明的有益效果主要体现在以下方面：
1)本发明技术方案可在等温条件下完成，等温是指技术方案中全过程的每个步骤的反应温度是不变的，每步都是在基本恒定的温度下进行，本发明在核酸合成乃至检测全过程无需对温度进行上下调节，因此本发明提供了等温合成核酸及检测的方法，多种传统的核酸扩增方法要求对温度进行上下调节以使目的核酸从合成的链中解离出来，这些方法要求特殊的反应设备，如热循环仪来达到其目的，然而本发明的方法仅仅利用可保持恒定温度的设备就可得以施行，操作方便。
2)本发明技术方案实施扩增过程中只需一条引物，无需现有技术中LAMP法所述的四条引物，实验设计简单，投入成本较低，从而使检测方案更加简便易行，进一步提高了核酸扩增及检测的效率。
3)本发明技术方案可以针对多条靶标核酸模板设计相应的引物实现同一体系的多重靶标核酸的同时检测，也可以利用不同的信号指示实现多重靶标核酸同时进行区别性检测。
4)本发明技术方案主要利用产生的大量的寡聚核苷酸进行信号的检测，并且扩增期间产生的核酸都不能被引物利用作为模板进行扩增，这就减少了产物污染导致的假阳性结果问题。
附图说明
图1为双链核酸模板检测实验原理图；
图2为本发明涉及的实施例1检测结果的荧光信号图；
图3为本发明涉及的实施例1检测结果的电泳结果图；
图4为本发明涉及的实施例2检测结果的荧光信号图；
图5为本发明涉及的实施例2检测结果的线性关系图；
图6为本发明涉及的实施例3检测结果的荧光信号图；
图7为本发明涉及的实施例4检测的纳米金检测原理图；
图8为本发明涉及的实施例4检测结果比色结果图；
图9为本发明涉及的实施例5检测结果的荧光信号图；
图10为本发明涉及的实施例6检测结果的荧光信号图；
图11为本发明涉及的实施例7检测结果的荧光信号图；
图12为本发明实验原理图。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图作进一步说明。
序列表独立文本：
SEQ ID NO.1(5’-3’)：分子信标MB1；
SEQ ID NO.2(5’-3’)：primer；
SEQ ID NO.3(5’-3’)：PBS质粒；
SEQ ID NO.4(5’-3’)：巯基修饰的纳米金DNA1；
SEQ ID NO.5(5’-3’)：巯基修饰的纳米金DNA2；
SEQ ID NO.6(5’-3’)：鸡的序列；
SEQ ID NO.7(5’-3’)：牛的序列；
SEQ ID NO.8(5’-3’)：鱼的序列；
SEQ ID NO.9(5’-3’)：primer鸡1；
SEQ ID NO.10(5’-3’)：primer牛；
SEQ ID NO.11(5’-3’)：primer鱼；
SEQ ID NO.12(5’-3’)：分子信标MB2；
SEQ ID NO.13(5’-3’)：primer鸡2；
SEQ ID NO.14(5’-3’)：突变DNA链B；
SEQ ID NO.15(5’-3’)：突变DNA链C。
实施例1：验证方法的可行性及其原理的正确性。
本实施例是利用PBS质粒作为靶标核酸，利用单引物进行扩增的恒温检测，通过荧光信号验证方法的可行性和原理的正确性。向该恒温扩增系统加入1μL(5×10-6M)的分子信标MB1(序列为5’-FAM-CGCTTGGTAGGCTCCGGTTCCCAACGATCAGATCCTGCTACCAAGCG-DABCYL-3’即SEQ ID NO.1)，1×NEBuffer3.1(100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,100μg/mL BSA pH7.9@25℃)，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL Nt.BstNBI切刻酶，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer(序列为5’-GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCAACTATGCTATTTCGTTCATC-3’即SEQ ID NO.2)，1μL(1×10-12M)靶目标PBS质粒(序列为5’-CTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTC-3’即SEQ ID NO.3)，体系最后加水至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应60分钟。结果如图2所示，图中A为上述反应体系荧光信号变化，B、C和D分别为上述体系不含Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶、不含切刻酶Nt.BstNBI和不含primer(即SEQ ID NO.2)的荧光信号变化。实验表明没有聚合酶、切刻酶和primer任意一种物质，实验都不能进行反应，从而验证了实验的原理。
本实施例是利用PBS质粒作为靶标核酸，利用单引物进行扩增的恒温检测，通过电泳结果验证方法的可行性和原理的正确性，向该恒温扩增系统加入1μL(5×10-6M)的分子信标MB1(即SEQ ID NO.1)，1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL Nt.BstNBI切刻酶，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer(即SEQ ID NO.2)，再分别加入1μL1×10-8M，1×10-9M，1×10-10M，1×10-11M靶目标PBS质粒，体系最后加水至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应30分钟。非变性聚丙烯酰胺电泳胶浓度17.5％，电压135V，电泳70分钟，EB染色；检测结果如图3所示，图中泳道1代表含有模板浓度为1×10-9M PBS质粒反应体系的产物，泳道2代表含有模板浓度为1×10-10M PBS质粒反应体系的产物，泳道3代表含有模板浓度为1×10-11M PBS质粒反应体系的产物，泳道4代表含有模板浓度为1×10-12M PBS质粒反应体系的产物，泳道5代表浓度为2×10-7M Primer(即SEQ ID NO.2)的引物条带，泳道6代表分子信标浓度为5×10-7M MB1的条带，泳道M代表20bp DNA Marker条带。由电泳图中可以看出，一定时间内不同浓度模板间产物的生成量变化，验证了实验的原理的正确性和可行性。
实施例2：利用单引物引发的核酸恒温扩增检测方法检测PBS质粒。
本实施例检测不同浓度的PBS质粒，检验该核酸检测方法的灵敏度。向该恒温扩增系统加入1μL(5×10-6M)的分子信标MB1(即SEQ ID NO.1)，1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL Nt.BstNBI切刻酶，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer(即SEQ ID NO.2)，再向该体系分别加入1μL1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M、1×10-15M、1×10-16M及0M的靶目标PBS质粒(即SEQ ID NO.3)，体系加水至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应70分钟；结果如图4所示，浓度梯度从左到右依次递减。图4的结果表明，本方法有较宽的检测范围(从1×10-9M到1×10-17M)，较低的检测限，能够检测到浓度为1×10-17M的PBS质粒。并由图5可以得出其线性方程为POI＝-114.5-9lg C(mol)(R＝0.9988)和POI＝-33.14-4.27lg C(mol)(R＝0.9945)(POI即point ofinflection，表示扩增曲线斜率最大值对应的时间点)，说明本方法有较好的线性检测范围。
实施例3：检测在复杂体系环境下，本方法的抗背景干扰检测靶核酸的能力。
本实施例检测在含有大肠杆菌基因组复杂体系下，本方案的抗背景干扰能力。向恒温扩增系统加入1μL(5×10-6M)的分子信标MB1(即SEQ ID NO.1)，1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL切刻酶Nt.BstNBI，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer(即SEQ ID NO.2)，1μL1×10-12M PBS质粒，再向该体系分别加入1μL1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、0M的大肠杆菌基因组，体系最后加水至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应50分钟。本实施例的检测结果如图6所示，图6中曲线结果A、B、C、D、E分别表示为含有大肠杆菌基因组浓度分别为1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M、0M的反应体系荧光信号。如图6所示，检测结果表明，加入不同浓度的大肠杆菌基因组对实验几乎没有影响，说明本实验复杂体系下的抗干扰能力较强，同时也说明了本方法特异性很好。
实施例4：纳米金比色法对恒温扩增产物进行检测。
向恒温扩增系统加入1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL Nt.BstNBI切刻酶，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer(即SEQ ID NO.2)，再向该体系分别加入1μL1×10-11M、1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M及0M的靶目标PBS质粒(即SEQ ID NO.3)，体系最后加水至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪55℃保温25分钟；将反应产物加入纳米金体系(图7)，即20μL巯基修饰的纳米金DNA1(5’-SH-GGTTCCCAACGT-3’即SEQ IDNO.4)和20μL巯基修饰的纳米DNA2(5’-ATCAGATCCTG-SH-3’即SEQ IDNO.5)，其中纳米金的缓冲体系为10mM PBS、0.3M NaCl和8mM MgCl2。结果如图8所示，其中体系浓度含有1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M的靶目标核苷酸均变蓝色，1×10-15M的靶目标核苷酸变色不明显，0M的阴性对照体系没有变色，这是由于反应25分钟后，1×10-12M、1×10-13M、1×10-14M的靶标核苷酸体系扩增产生了大量的产物与纳米金反应，使其聚集变色；而1×10-15M的靶目标核苷酸此段时间内扩增的产物量太少，使得纳米金变色不明显；没加靶目标核苷酸的的阴性体系没有引发扩增反应，没有产物产生使得纳米金变色。因此实验结果表明，本实验可以利用纳米金比色法进行检测，不需要特殊的荧光仪器和标记昂贵的荧光分子信标，并且可以进一步利用纳米金试纸条来进行检测，便宜、方便、应用范围广，更可进一步用于现场的快速检测。
实施例5：对本实验单一体系的多重检测能力进行验证。
本实验利用鸡(序列为5’-AGACTTCAAGGACCTCTCATTTGACTC-3’即SEQ ID NO.6)、牛(序列为5’-GAGTCCATATCGACAATAGGGTTTACGA-3’即SEQ ID NO.7)、鱼(序列为5’-GAGTCCATATCGACGAGGGGGTTTAC-3’即SEQID NO.8)的基因组DNA作为目标链，及相应的引物primer鸡1(序列为5’-GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCGAGAGGTAGACTTCAAGGAC-3’即SEQ ID NO.9)，primer牛(序列为5’-GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCTCGACATCGTAAACCCTA-3’即SEQ ID NO.10)，primer鱼(序列为5’-GGTTCCCAACGATCAGATCCTGGTGAGACTCTCGACGGTAAACCCCCTC-3’即SEQ ID NO.11)检验本方法同一体系检测多重靶标的能力。该体系含有1μL(5×10-6M)的分子信标MB1(即SEQ ID NO.1)，1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL Nt.BstNBI切刻酶，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)不同物种对应的引物，然后分别向该体系中加入鸡、牛、鱼的混合目标链(即SEQ ID NO.6、NO.7、NO.8)和其对应的引物(即SEQ ID NO.9、NO.10、NO.11)、鸡的目标链(即SEQ ID NO.6)和其对应的引物(即SEQ ID NO.9)、鱼的目标链(即SEQ ID NO.8)和其对应的引物(即SEQ ID NO.11)、牛的目标链(即SEQ IDNO.7)和其对应的引物(即SEQ ID NO.10)以及水和鸡、牛、鱼的引物(即SEQ IDNO.9、NO.10、NO.11)，各体系加水补充至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应60分钟。
本实施例的检测结果如图9所示，其中A为鸡、鱼、牛混合目标链和其对应引物的体系的荧光信号，B、C、D、E分别为鸡目标链和其对应的引物体系的荧光信号、鱼目标链和其对应的引物体系的荧光信号、牛目标链和其对应的引物体系的荧光信号、水和鸡、鱼、牛的引物体系的荧光信号。由实验结果可以得出：同时含有鸡、鱼、牛目标链体系的荧光信号较单独含有其中任意一个目标链体系的荧光信号出现的早，此结果表明本实验可以实现对多个目标核酸的同一体系的同时检测，减少了检测多个靶标核酸的工作量。
实施例6：利用多重荧光标记的分子信标进行多重目标的同时区别性检测。
本实验利用鸡(即SEQ ID NO.6)和鱼(即SEQ ID NO.8)的目标链作为检测模板，利用标记不同荧光物质的分子信标进行同时检测。该体系含有1μL(2×10-6M)的分子信标MB1(即SEQ ID NO.1，可以特异的显示鱼的扩增信号)，1μL(2×10-6M)的分子信标MB2(序列为5’-HEX-CCGATCGAACGCTCCCGTGTGTGCAGCCTACAACCAAGTTCGATCGG-DABCYL-3’即SEQ ID NO.12，可以特异的显示鸡的扩增信号)，1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL Nt.BstNBI切刻酶，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer鸡2(序列为5’-CGTGTGTGCAGCCTACAACCAAGTGAGACTCGAGAGGTAGACTTCAAGGAC-3’即SEQ ID NO.13)，0.2μL(10μM)primer鱼(即SEQ ID NO.11)，分别向该体系中加入鸡和鱼的混合目标链(即SEQ ID NO.6、NO.8)、鸡的目标链(即SEQID NO.6)、鱼的目标链(即SEQ ID NO.8)和水，体系加水补充至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应60分钟。本实施例的检测结果如图10所示，图中A表示只有鸡的目标链体系中HEX的信号，E表示该体系中FAM的信号；C表示只有鱼的目标链体系中FAM信号，F表示该体系中HEX信号；图中B表示含有鸡和鱼的混合目标链的体系中HEX信号，D表示该体系中FAM信号；图中G、H分别表示阴性水的体系中的HEX信号和FAM信号。结果显示，混合体系中不同模板产生的特异性信号与其单独体系时产生的特异性信号相一致，由此表明，本实验可以利用多重荧光信标对多重目标同时但区别性的特异的检测。
实施例7：本实验对突变碱基的检测。
以DNA链A(即SEQ ID NO.3)、突变DNA链B(5’-CTATTTCGTTCATGCATAGTTGCCTGACTC-3’即SEQ ID NO.14)、突变DNA链C(5’-CTATTTCGTTCATCCATAGTAGCCTGACTC-3’即SEQ ID NO.15)为目标链进行突变基因的检测，其中链B、C含有一个突变碱基。该体系含有1μL(5×10-6M)的分子信标MB1(即SEQ ID NO.1)，1×NEBuffer3.1，0.05μL Bst2.0WarmStartTM DNA聚合酶，0.4μL切刻酶Nt.BstNBI，1μL(2.5mM)dNTPs，0.2μL(10μM)primer(即SEQ ID NO.2)，向该体系分别加入1μL1×10-12M模板DNA链A(即SEQ ID NO.3)、突变DNA链B(即SEQ ID NO.14)及突变DNA链C(即SEQ ID NO.15)，体系加水补充至10μL。利用伯乐CFX96TM实时荧光定量PCR仪每分钟检测一次荧光信号，55℃反应50分钟。实验结果如图11所示，图中A表示正常的模板DNA链A扩增体系的荧光信号，B、C分别表示含有单个碱基突变的DNA链B、C扩增体系的荧光信号，可以看出即使只有一个碱基的突变，本实验也可以很好地区分出来，说明本实验可以特异的对碱基突变进行检测。
需要指出的是，以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化相替换，都应涵盖在本发明的保护范围内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种引发核酸恒温扩增的单引物，其特征在于：
(1)引物至少含有a、b’、x、c四个区，其中b’区和a区的5’侧相连，x区和b’区的5’侧相连，c区和x的5’侧相连；
(2)a区是和靶标核酸互补配对的核苷酸序列，b’区是与该引物延伸合成反应产物的3’末端区域互补的核苷酸序列，x区包含切刻酶的识别位点和切刻位点核苷酸序列，c区是利用其合成的互补核酸进行信号检测的核苷酸序列；
(3)引物a区聚合延伸形成b区，形成的a+b区在反应温度下与模板核酸动态解离；
(4)引物延伸形成的b区与引物原有序列发生折叠互补配对，形成自身茎环结构；
(5)形成的茎环结构3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位点。
2.一种基于如权利要求1所述的单引物引发的非疾病诊断用途的双链核酸恒温扩增方法，其特征在于，步骤如下：
(1)引物的3’端a区与核酸模板近5’端的区域a’区退火；
(2)聚合酶以退火后的引物的a区3’末端为合成起点，以核酸模板未发生互补配对的b’区为模板，进行合成反应；
(3)步骤(2)产生的引物延伸产物可以在反应温度下自身退火并和核酸模板发生解离，形成含有a区的环，而核酸模板又可重复参与步骤(1)中与引物的反应过程；
(4)步骤(3)中形成了茎环结构的延伸产物以自身为模板，以与b’区退火的b区的3’末端为合成起点，合成其自身的互补链；
(5)切刻酶在步骤(4)形成的延伸产物的X’区进行单核酸链的切刻，形成切口，聚合酶以切口5’侧的X’区的3’末端为合成起点，以自身为模板，进行链置换合成反应，置换步骤(4)所合成的互补链c’；
其中聚合酶在切刻形成的切口处进行聚合反应形成的产物和步骤(4)形成的产物一样，可进行步骤(5)的反应，不断循环置换产生互补链c’。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：处理双链核酸，得到权利要求2所述的核酸模板，包括：含有切刻酶切刻位点的双链核酸,在聚合酶和切刻酶的共同作用下不断产生含有特定区域的单链核酸模板分子。
4.如权利要求2或3所述的任一方法，其特征在于：权利要求2所述核酸模板为DNA或RNA。
5.如权利要求2或3所述的任一方法，其特征在于：可在权利要求2所述的步骤(3)加入解链温度调节剂促使引物延伸产物从模板解离。
6.一种非疾病诊断用途的检测目的核苷酸序列的方法，
其特征在于：所述方法包括权利要求2或3所述的任一种扩增方法，还包括基于信号变化测定是否已产生权利要求2步骤(5)中产生的扩增反应产物。
7.如权利要求6所述的一种非疾病诊断用途的检测目的核苷酸序列的方法，其特征在于：所述信号变化是基于加入核酸检测试剂，包括荧光检测试剂、电化学检测试剂、比色检测试剂、化学发光检测试剂。
8.通过权利要求7所述的一种非疾病诊断用途的检测方法检测突变的方法，其特征在于：其中要被扩增的核苷酸序列中的野生型或突变至少一个在3’末端防止互补链的合成，其3’末端是构成扩增方法的互补链合成的起点，其中所述的3’端选自：引物a区的3’末端或权利要求2步骤(2)中合成的互补链b的3’末端。
9.一种单引物引发的核酸恒温扩增试剂盒，其特征在于：试剂盒包括以下组分：权利要求1所述的单引物；催化链置换型互补链合成反应的DNA聚合酶；能够特异的切刻双链核酸其中一条核酸链的切刻酶；核苷酸，其作为聚合酶的底物。
10.一种非疾病诊断用途的在同一反应体系检测多个靶标核酸的方法，其特征在于：通过权利要求2所述的方法，在同一反应体系中至少含有两条引物，通过至少一个检测信号实现多个靶标核酸的同时分别检测或多个靶标核酸的兼并性检测。
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