CN113041967B - 一种超长链核酸合成生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种超长链核酸合成生产工艺，包括以下步骤：第一步、微量合成柱的制备；第二步、超长链核酸合成；第三步、超长链氨解处理；本发明提供一种超长链核酸合成生产工艺，合成开始先使用盖帽反应一至两次，便于引物充分固定在固相载体上，提高引物得率，降低小分子残留含量，载体体积小，利于试剂充分接触反应，其次2000A的CPG粉增加了粉尘间的间隙，不易造成载体内部空隙的堵塞，利于反应的持续充分发应，针对企业而言合成超长链工艺的完善，能够降低全基因生产难度及引物使用成本，缩短的生产周期及交付周期。提高企业在行业中的竞争力。

Description

一种超长链核酸合成生产工艺
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体的，涉及一种超长链核酸合成生产工艺。
背景技术
超长链核酸合成工艺能有效改善引物合成质量。超长链引物合成能降低引物设计难度，减少后续PCR扩增次数，从而降低PCR扩增及检测中出现问题发生的概率，降低引物使用成本，提高引物质量，缩短产品的交付周期，换言之，用更低的成本合出更优的产品，现在市场上引物合成技术相对而言较为成熟，但合成的引物序列长度有限，一般高于120bp，合成出的引物质量明显较差。换言之，如果有引物合成公司能够提高碱基序列长度，必然能提高企业在行业中的地位。其次，微量合成超长链工艺的完善，能够降低全基因生产难度及引物使用成本，缩短的生产周期及交付周期。提高企业在行业中的竞争力。但现有的超长链核酸合成生产工艺繁琐，操作不变，产物纯度低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超长链核酸合成生产工艺。
本发明需要解决的技术问题为：
现有技术中，超长链核酸合成生产工艺繁琐，操作不变，合成出的引物质量明显较差，产物纯度低。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种超长链核酸合成生产工艺，包括以下步骤：
第一步、微量合成柱的制备
1）称取购买30-40umol/g的2000A通用CPG粉，以CPG：聚乙烯=1：28.8的比例称取，混匀，得到S1粉并用密封干燥容器装好备用；
2）取制作好的模具，模具布有孔直径为4mm，高为2mm上下贯通的圆柱形空孔；将制好的S1粉填充严实到模具孔中，孔上下用平面玻璃密封卡紧，做好备用S2；
3）将烘箱打开，温度设置到200℃，当烘箱加热到200℃，打开烘箱将S2放进烘箱，打开烘箱此时注意使温度降到170℃左右，关闭烘箱加热至196℃时将模具取出，烧制时间控制在25min左右，如果温度提前到达196℃，可适当将烘箱门打开，低温烧制时间稍长点不影响，保证烧制出的载体切开有颗粒状即可，模具取出冷却后，用直径3.8mm的圆柱形工具将载体捅出，将边缘及表面完整的载体挑出，用密封干燥容器装好备用S3。
4）取定做的上内直径为4.5mm，下内直径为3.2mm的合成空柱，将S3用工具捅至适当位置，保证载体与空柱接触无间隙，制成微量合成柱S4,用密封干燥容器装好备用。
第二步、超长链核酸合成
1）单体用无水乙腈按1:40比例溶解，加入分子筛除水备用；
2）调节仪器参数，清洁仪器，检测仪器试剂喷打及仪器密封；
3）设定试剂参数，仪器单次反应试剂量设定；
4）程序设置：通过压力调节试剂渗透使试剂充分反应，开始合成前用乙腈清洗微量合成柱，并优先进行一次盖帽反应，去除游离羟基。因合成链过长，可采用分段合成，在合成到60以上碱基时，可适当增加单体反应遍数，并适当加长试剂反应时长。以便充分反应。
5）合成结束，通过对收集的DMT颜色，来大概判断此次合成效果。
第三步、超长链氨解处理
RPC或者PAGE纯化均可，若对引物纯度有一定要求，建议采用PAGE纯化，RPC纯化后目的引物占比明显，但依旧会存在部分小片段合成失败引物。
本发明的有益效果：
本发明提供一种超长链核酸合成生产工艺，合成开始先使用盖帽反应一至两次，便于引物充分固定在固相载体上，提高引物得率，降低小分子残留含量，载体体积小，利于试剂充分接触反应，其次2000A的CPG粉增加了粉尘间的间隙，不易造成载体内部空隙的堵塞，利于反应的持续充分发应，针对企业而言合成超长链工艺的完善，能够降低全基因生产难度及引物使用成本，缩短的生产周期及交付周期。提高企业在行业中的竞争力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明分析板检测图；
图2为本发明200nmol PAGE纯化质谱检测结果；
图3为本发明微量合成RPC纯化质谱检测结果；
图4为本发明微量合成PAGE纯化质谱检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-4所示，本发明为一种超长链核酸合成生产工艺，具体包括以下步骤：
第一步、微量合成柱的制备
1）称取购买30umol/g的2000A通用CPG粉，以CPG：聚乙烯=1：28.8的比例称取，混匀，得到S1粉并用密封干燥容器装好备用；
2）取制作好的模具，模具布有孔直径为4mm，高为2mm上下贯通的圆柱形空孔；将制好的S1粉填充严实到模具孔中，孔上下用平面玻璃密封卡紧，做好备用S2；
3）将烘箱打开，温度设置到200℃，当烘箱加热到200℃，打开烘箱将S2放进烘箱，打开烘箱此时注意使温度降到170℃左右，关闭烘箱加热至196℃时将模具取出，烧制时间控制在25min左右，如果温度提前到达196℃，可适当将烘箱门打开，低温烧制时间稍长点不影响，保证烧制出的载体切开有颗粒状即可，模具取出冷却后，用直径3.8mm的圆柱形工具将载体捅出，将边缘及表面完整载体挑出，用密封干燥容器装好备用S3。
4）取定做上内直径为4.5mm，下内直径为3.2mm的合成空柱，将S3用工具捅至适当位置，保证载体与空柱接触无间隙，制成微量合成柱S4,用密封干燥容器装好备用。
第二步、超长链核酸合成
1）单体用无水乙腈按1:40比例溶解，加入分子筛除水备用；
2）按下表调节仪器仪器参数，清洁仪器，检测仪器试剂喷打及仪器密封；
3）设定试剂参数，仪器单次反应试剂量设定；
4）程序设置：通过压力调节试剂渗透使试剂充分反应，开始合成前用乙腈清洗微量合成柱，并优先进行一次盖帽反应，去除游离羟基。因合成链过长，可采用分段合成，在合成到60以上碱基时，可适当增加单体反应遍数，并适当加长试剂反应时长。以便充分反应。
5）合成结束，通过对收集的DMT颜色，来大概判断此次合成效果。
第三步、超长链氨解处理
RPC或者PAGE纯化均可，若对引物纯度有一定要求，建议采用PAGE纯化，RPC纯化后目的引物占比明显，但依旧会存在部分小片段合成失败引物。
实施例2
本发明为一种超长链核酸合成生产工艺，具体包括以下步骤：
第一步、微量合成柱的制备
1）称取购买35umol/g的2000A通用CPG粉，以CPG：聚乙烯=1：28.8的比例称取，混匀，得到S1粉并用密封干燥容器装好备用；
2）取制作好的模具，模具布有孔直径为4mm，高为2mm上下贯通的圆柱形空孔；将制好的S1粉填充严实到模具孔中，孔上下用平面玻璃密封卡紧，做好备用S2；
3）将烘箱打开，温度设置到200℃，当烘箱加热到200℃，打开烘箱将S2放进烘箱，打开烘箱此时注意使温度降到170℃左右，关闭烘箱加热至196℃时将模具取出，烧制时间控制在25min左右，如果温度提前到达196℃，可适当将烘箱门打开，低温烧制时间稍长点不影响，保证烧制出的载体切开有颗粒状即可，模具取出冷却后，用直径3.8mm的圆柱形工具将载体捅出，将边缘及表面完整载体挑出，用密封干燥容器装好备用S3。
4）取定做上内直径为4.5mm，下内直径为3.2mm的合成空柱，将S3用工具捅至适当位置，保证载体与空柱接触无间隙，制成微量合成柱S4,用密封干燥容器装好备用。
第二步、超长链核酸合成
1）单体用无水乙腈按1:40比例溶解，加入分子筛除水备用；
2）按下表调节仪器仪器参数，清洁仪器，检测仪器试剂喷打及仪器密封；
3）设定试剂参数，仪器单次反应试剂量设定；
4）程序设置：通过压力调节试剂渗透使试剂充分反应，开始合成前用乙腈清洗微量合成柱，并优先进行一次盖帽反应，去除游离羟基。因合成链过长，可采用分段合成，在合成到60以上碱基时，可适当增加单体反应遍数，并适当加长试剂反应时长。以便充分反应。
5）合成结束，通过对收集的DMT颜色，来大概判断此次合成效果。
第三步、超长链氨解处理
RPC或者PAGE纯化均可，若对引物纯度有一定要求，建议采用PAGE纯化，RPC纯化后目的引物占比明显，但依旧会存在部分小片段合成失败引物。
实施例3
本发明为一种超长链核酸合成生产工艺，具体包括以下步骤：
第一步、微量合成柱的制备
1）称取购买40umol/g的2000A通用CPG粉，以CPG：聚乙烯=1：28.8的比例称取，混匀，得到S1粉并用密封干燥容器装好备用；
2）取制作好的模具，模具布有孔直径为4mm，高为2mm上下贯通的圆柱形空孔；将制好的S1粉填充严实到模具孔中，孔上下用平面玻璃密封卡紧，做好备用S2；
3）将烘箱打开，温度设置到200℃，当烘箱加热到200℃，打开烘箱将S2放进烘箱，打开烘箱此时注意使温度降到170℃左右，关闭烘箱加热至196℃时将模具取出，烧制时间控制在25min左右，如果温度提前到达196℃，可适当将烘箱门打开，低温烧制时间稍长点不影响，保证烧制出的载体切开有颗粒状即可，模具取出冷却后，用直径3.8mm的圆柱形工具将载体捅出，将边缘及表面完整载体挑出，用密封干燥容器装好备用S3。
4）取定做上内直径为4.5mm，下内直径为3.2mm的合成空柱，将S3用工具捅至适当位置，保证载体与空柱接触无间隙，制成微量合成柱S4,用密封干燥容器装好备用。
第二步、超长链核酸合成
1）单体用无水乙腈按1:40比例溶解，加入分子筛除水备用；
2）按下表调节仪器仪器参数，清洁仪器，检测仪器试剂喷打及仪器密封；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
3）设定试剂参数，仪器单次反应试剂量设定(除OX外每种试剂分两次喷打发应）；
试剂种类 ACT 单体 CAPA CAPB OX WASH TCA
单次喷打量（ul） 6 4 15 15 20 40 40
4）程序设置：通过压力调节试剂渗透使试剂充分反应，开始合成前用乙腈清洗微量合成柱，并优先进行一次盖帽反应，去除游离羟基。因合成链过长，可采用分段合成，在合成到60以上碱基时，可适当增加单体反应遍数，并适当加长试剂反应时长。以便充分反应。
5）合成结束，通过对收集的DMT颜色，来大概判断此次合成效果。
第三步、超长链氨解处理
RPC或者PAGE纯化均可，若对引物纯度有一定要求，建议采用PAGE纯化，RPC纯化后目的引物占比明显，但依旧会存在部分小片段合成失败引物。
实施例4
1）对比合成分别采用不同规模合成144bp超长链，并采用不同纯化方式进行合成效果对比。（PAGE纯化：200nmol、2000ACPG微量合成；RPC纯化合成：2000ACPG微量）
三种合成引物检测结果如图1-4所示。
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种超长链核酸合成生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
第一步、微量合成柱的制备；
第二步、超长链核酸合成；
第三步、超长链氨解处理；
微量合成柱的制备具体包括以下步骤：
1）称取购买30-40umol/g的2000A通用CPG粉，以CPG：聚乙烯=1：28.8的比例称取，混匀，得到S1粉并用密封干燥容器装好备用；
2）取制作好的模具，模具布有孔直径为4mm，高为2mm上下贯通的圆柱形空孔；将制好的S1粉填充严实到模具孔中，孔上下用平面玻璃密封卡紧，做好备用S2；
3）将烘箱打开，温度设置到200℃，当烘箱加热到200℃，打开烘箱将S2放进烘箱，打开烘箱使温度降到170℃，关闭烘箱加热至196℃时将模具取出，烧制时间控制在25min，如果温度提前到达196℃，适当将烘箱门打开，低温烧制时间稍长点不影响，保证烧制出的载体切开有颗粒状即可，模具取出冷却后，用直径3.8mm的圆柱形工具将载体捅出，将边缘及表面完整的载体挑出，用密封干燥容器装好备用S3；
4）取上内直径为4.5mm，下内直径为3.2mm的合成空柱，将S3用工具捅至适当位置，保证载体与空柱接触无间隙；制成微量合成柱S4，用密封干燥容器装好备用；
超长链核酸合成具体步骤如下：
1）单体用无水乙腈按1:40比例溶解，加入分子筛除水备用；
2）调节仪器参数，清洁仪器，检测仪器试剂喷打及仪器密封；
3）设定试剂参数，仪器单次反应试剂量设定；
4）程序设置：通过压力调节试剂渗透使试剂充分反应，开始合成前用乙腈清洗微量合成柱，并优先进行一次盖帽反应，去除游离羟基；因合成链过长，采用分段合成，在合成到60以上碱基时，适当增加单体反应遍数，并适当加长试剂反应时长。
2.根 据权利要求1所述的一种超长链核酸合成生产工艺，其特征在于，超长链氨解处理步骤如下：
RPC或者PAGE纯化均可。
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