CN107058287B - 一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种有助于恒温扩增体系中生成单链产物的方法；所述单链产物生成方法如下：所述恒温扩增体系包含有两对引物，F1、R1和BF、BR，在某些条件下，F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶区域。本发明反应速率快、成本低、操作简便，能够通过恒温扩增方法生成单链DNA扩增产物，克服背景技术中存在的技术缺陷。
Description
技术领域
本发明属于核酸分析与检测领域，具体涉及一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法。
背景技术
核酸扩增技术在当今的分析检测领域具有十分重要的意义。食品安全检测、环境监控、医疗诊断、法医鉴定等领域无不依赖于核酸扩增技术。最早也是最经典的核酸扩增技术是在耐热性聚合酶的帮助下，依靠温度的不断循环交替而实现模板变性、引物退火及延伸从而实现目标产物的大量积累，这种技术被称作聚合酶链式反应（PCR）。然而，PCR最大的缺陷也就在于，其不断的温度变化过程对仪器（PCR仪）提出了相对高的要求，并进而限制了其扩增速率。恒温扩增的出现彻底摆脱了对精密温控设备的依赖，仅仅一个热块、一台水浴锅甚至一只保温效果良好的保温瓶、热水瓶等即可满足反应需求。常见的恒温扩增技术包括：环介导等温扩增（LAMP）、重组聚合酶扩增（RPA）、链置换扩增（SDA）、依赖解旋酶的扩增（HDA）等等。然而，这些扩增方法反应时间相对较长，或需要多种酶同时工作而造成检测成本高，或需要特定的核苷酸参与而造成高成本、低反应速率等问题。因此，十分需要一种反应速率快、成本低、操作简便的恒温扩增方法。
核酸扩增的另外一个问题在于产物的快速特异性检测。基于凝胶电泳的方法虽然能够根据目标产物的分子量大小而对扩增产物进行较为直观的分析。但是其对专用凝胶成像设备的依赖及操作的费时费力使其不利于现场快速检测。基于可视化显色的钙黄绿素法、浊度法虽然操作简便，但无法鉴别非特异性扩增。而实时荧光定量的方法要求反应仪器具有相对精密的光学设备。试纸条检测方法具有操作简便、结果易于读取、特异性强等优点而广受青睐。但是试纸条检测的缺点是针对某个特殊的分析目标必须对引物实现抗原-抗体修饰或者对目标核酸分子进行探针捕获。对于某些反应过程中引物会被切断的反应，针对引物进行抗原抗体修饰显然并不可取，因此更好的方法是实现探针捕获。但是探针捕获的核酸分子往往是单链，对于双链核酸分子，探针捕获显然并不方便。因此，本发明的目的是针对恒温扩增体系提供一种单链DNA产物的生成方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有助于恒温扩增体系中生成单链产物的方法。
所述单链产物生成方法如下：
1）所述恒温扩增体系包含有两对引物，F1、R1和BF、BR，在某些条件下，F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶区域。
2）所述恒温扩增体系需要至少两种酶的参与：其一为具有链取代活性的聚合酶，能够在引物与模板结合之后在引物的3’端加成核苷酸，使得引物的3’不断延伸，并取代原来模板链的互补链。其二为具有能够特异性识别某些特定核苷酸序列位点，并在具有此特异性核苷酸序列位点的双链DNA中的其中一条单链上产生切口的切口酶。
3）所述恒温扩增体系至少包含一条核酸阻遏物，能够与所述恒温扩增体系的其中一条产物进行很强的互补配对，防止在核酸阻遏物的上游的带有切口酶位点的引物与所述产物结合后被聚合酶延伸为长的产物链。
4）所述单链产物的生成方法其具体原理（图1）为：
（ⅰ）在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游。
（ⅱ）在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸。
（ⅲ）在相同的反应温度下，引物BF的3’末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1。
（ⅳ）引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游。
（ⅴ）在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸。
（ⅵ）在相同的反应温度下，引物BR的3’末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1。
（ⅶ）在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物F1的3’末端，形成双链产物。
（ⅷ）切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口。
（ⅸ）在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3’末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链。当切口酶浓度较低时，生成产物A1。当切口酶浓度相对过量时，生成产物E1。
（ⅹ）引物R1的识别区域与产物A1或产物E1结合，并在引物R1的3’末端沿着产物A1或E1进行延伸。同时，核酸阻遏物与A1或E1结合。
（xi）当延伸至核酸阻遏物的位置时，聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止。
（xii）切口酶特异性切割出短的延伸产物，单链扩增产物生成。
14）所述生成的单链DNA产物优选为30-60nt。
15）所述恒温核酸扩增的温度可以为35-65°C。
16）所述核酸阻遏物的3’端与所述反应的中间产物A1或者E1的5’端的距离优选为15-22nt。
17）所述核酸阻遏物的浓度优选为0.05-0.2uM。
18）所述核酸阻遏物的长度优选为14-18nt。
19）所述核酸阻遏物的组成可以为不带修饰的核苷酸，也可以为带有修饰的核苷酸；可以为肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）或其特殊核苷酸。
20）所述核酸阻遏物的GC含量优选为30%-60%。
21）所述的核酸阻遏物的3’羟基末端可以进行某些脱羟基修饰，以避免所述核酸阻遏物本身作为引物被延伸，如生物素化、C3-spacer等。
本发明的有益效果是：本发明反应速率快、成本低、操作简便，能够通过恒温扩增方法生成单链DNA扩增产物，克服背景技术中存在的技术缺陷。
附图说明
图1是恒温扩增体系中利用核酸阻遏物生成单链DNA扩增产物的方法。
具体实施例
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但具体实施例并不对本发明作任何限定。
实施例1：以转基因水稻KMD1的CaMV 35S为模板56°C生成60nt单链产物的步骤。
CaMV 35S模板序列：
CACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTC。
CaMV 35S模板的互补序列：
GAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACTGGTGATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTG。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.BstNBI，6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，500nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。56°C温浴10min。
针对CaMV 35S双链模板序列设计引物及核酸阻遏物序列如下：
F1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGA。
R1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AGAGACTGGTGATTTC。
核酸阻遏物序列：CCAAATGAAATGAACTT-Biotin。
单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
针对CaMV 35S双链模板进行扩增生成单链产物的具体步骤：
（ⅰ）56°C时，引物F1和BF同时与模板链的互补序列结合。
（ⅱ）在Bst聚合酶的作用下，引物F1和BF的3’末端被延伸。
（ⅲ）引物BF的延伸产物将引物F1的延伸产物取代，得到取代产物链S1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTC。
（ⅳ）引物R1和BR与产物链S1结合，引物BR在上游。
（ⅴ）在Bst聚合酶的作用下，引物R1和BR的3’末端被延伸。
（ⅵ）引物BR的延伸链将引物R1的延伸产物取代，并得到产物P1：
CTTATTGTCCGAGTCTTATTTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAATAAGACTCGGACAATAAG。
（ⅶ）引物F1与产物P1结合，并在Bst聚合酶的作用下3’末端被延伸成为双链产物，此双链产物的一条链为P1，另一条链为P1的互补链：
CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATAAGACTCGGACAATAAG。
（ⅷ）切口酶Nt.BstNBI特异性识别F1和P1双链复合物上的切口酶识别位点GAGTCNNNN^NN，并在此切口位点处产生缺口。由于此双链复合物的两端各有一个切口酶位点，且切口酶位点分别在两条链上。当切口酶Nt.BstNBI浓度高时，双链复合物的两端都产生缺口，即P1与其互补链上同时产生缺口；当切口酶Nt.BstNBI浓度低时，仅P1上产生缺口。
（ⅸ）Bst聚合酶在切口位点处继续加成DNA并取代原来的延伸链。在切口酶Nt.BstNBI浓度低的条件下，取代产物为A1：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAAATAAGACTCGGACAATAAG。
在切口酶Nt.BstNBI浓度较高的条件下，取代产物为E1：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGAA。
（ⅹ）引物R1与产物A1或者产物E1结合，在Bst聚合酶的作用下3’端以A1或者E1为模板进行延伸。同时，核酸阻遏物结合在产物A1或者产物E1上。
（xi）当R1被延伸至核酸阻遏物的位置时，Bst聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止。
（xii）切口酶Nt.BstNBI特异性切割出短的延伸产物，生成单链扩增产物L1：TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
实施例2：以转基因大豆GTS 40-3-2的CP4 epsps为模板65°C生成43nt单链产物的步骤。
CP4 epsps模板序列：
TGGGGTTTATGGAAATTGGAATTGGGATTAAGGGTTTGTATCCCTTGTGCCATGTTGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCTAGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCT。
CP4 epsps模板的互补序列：
AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAACAACATGGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCCCAATTCCAATTTCCATAAACCCCA。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nb.BsrDI，9.6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，200nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。65°C温浴10min。
针对CP4 epsps双链模板序列设计引物及核酸阻遏物序列如下：
F1：CTTGTTCTTGTTCATTGCTGTCAGCGTGTCCT。
R1：TTTACTTACCTTCATTGCCCCACTATCCTTCG。
BF：CCATTCTTGAAAGATCT。
BR：GCAAGTGGATTGATGTG。
核酸阻遏物序列：AAGTTCATTTCATTTG-Biotin，下划线碱基修饰LNA。
单链扩增产物：
CATTGCCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
针对CP4 epsps双链模板进行扩增生成单链产物的具体步骤：
（ⅰ）65°C时，引物F1和BF同时与模板链的互补序列结合。
（ⅱ）在Bst聚合酶的作用下，引物F1和BF的3’末端被延伸。
（ⅲ）引物BF的延伸产物将引物F1的延伸产物取代，得到取代产物链S1：CTTGTTCTTGTTCATTGCTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCT。
（ⅳ）引物R1和BR与产物链S1结合，引物BR在上游。
（ⅴ）在Bst聚合酶的作用下，引物R1和BR的3’末端被延伸。
（ⅵ）引物BR的延伸将引物R1的延伸产物取代，并得到产物P1：
TTTACTTACCTTCATTGCCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTGACAGCAATGAACAAGAACAAG。
（ⅶ）引物F1与产物P1结合，并在Bst聚合酶的作用下3’末端被延伸成为双链产物，此双链产物的一条链为P1，另一条链为P1的互补链：
CTTGTTCTTGTTCATTGCTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGGCAATGAAGGTAAGTAAA。
（ⅷ）切口酶Nb.BsrDI特异性识别F1和P1双链复合物上的切口酶识别位点NN^CATTGC，并在含此切口位点处产生缺口。由于此双链复合物的两端各有一个切口酶位点，且切口酶位点分别在两条链上。当切口酶Nb.BsrDI浓度高时，双链复合物的两端都产生缺口，即P1与其互补链上同时产生缺口；当切口酶Nb.BsrDI浓度低时，仅P1上产生缺口。
（ⅸ）Bst聚合酶在切口位点处继续加成DNA并取代原来的延伸链。在切口酶Nb.BsrDI浓度低的条件下，取代产物为A1：
CATTGCTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGGCAATGAAGGTAAGTAAA。
在切口酶Nb.BsrDI浓度较高的条件下，取代产物为E1：
CATTGCTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGGCAATG。
（ⅹ）引物R1与产物A1或者产物E1结合，在Bst聚合酶的作用下3’端以A1或者E1为模板进行延伸。同时，核酸阻遏物结合在产物A1或者产物E1上。
（xi）当R1被延伸至核酸阻遏物的位置时，聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止。
（xii）切口酶特异性切割出短的延伸产物，生成单链扩增产物L1：CATTGCCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
实施例3：以柑橘黄龙病HLB的16S rDNA为模板35°C生成30nt单链产物的步骤。
16S rDNA模板序列：
GGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCTTGGTAGGCTCTTACCCTACCAACTAGCTAATCCAACGCAGG。
16S rDNA模板的互补序列：
CCTGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAGAGCCTACCAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAACCC。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.AlwI，5U phi29 DNA Polymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol ReactionBuffer，300uM dNTP，200nM引物F1，1uM引物R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。35°C温浴10min。
针对HLB的16SrDNA双链模板序列设计引物及核酸阻遏物序列如下：
F1：TTAGTTTCGTGGATCTTTGCCGTGTCTCAGTC。
R1：AGGGTAAACAGGATCAATAAGGCTACGATCT。
BF：ATTGTCCAATATTCC。
BR：AGCTAGTTGGTAGGGTA。
核酸阻遏物序列：CAGTGTGGCTGATCG-Biotin，下划线碱基修饰LNA。
单链扩增产物：AGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGA。
针对CP4 epsps双链模板进行扩增生成单链产物的具体步骤：
（ⅰ）35°C时，引物F1和BF同时与模板链的互补序列结合。
（ⅱ）在Bst聚合酶的作用下，引物F1和BF的3’末端被延伸。
（ⅲ）引物BF的延伸产物将引物F1的延伸产物取代，得到取代产物链S1：TTAGTTTCGTGGATCTTTGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCTTGGTAGGCTCTTACCCTACCAACTAGCTAATCCAACGCAGG。
（ⅳ）引物R1和BR与产物链S1结合，引物BR在上游。
（ⅴ）在phi29 DNA Polymerase的作用下，引物R1和BR的3’末端被延伸。
（ⅵ）引物BR的延伸将引物R1的延伸产物取代，并得到产物P1：
AGGGTAAACAGGATCAATAAGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCAAAGATCCACGAAACTAA。
（ⅶ）引物F1与产物P1结合，并在phi29 DNA Polymerase的作用下3’末端被延伸成为双链产物，此双链产物的一条链为P1，另一条链为P1的互补链：
TTAGTTTCGTGGATCTTTGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCTTATTGATCCTGTTTACCCT。
（ⅷ）切口酶Nt.AlwI特异性识别F1和P1双链复合物上的切口酶识别位点GGATCNNNN^NN，并在含此切口位点处产生缺口。由于此双链复合物的两端各有一个切口酶位点，且切口酶位点分别在两条链上。当切口酶Nt.AlwI浓度高时，双链复合物的两端都有产生缺口，即P1与其互补链上同时产生缺口；当切口酶Nt.AlwI浓度低时，仅P1上产生缺口。
（ⅸ）phi29 DNA Polymerase在切口位点处继续加成DNA并取代原来的延伸链。在切口酶Nt.AlwI浓度低的条件下，取代产物为A1：
CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCTTATTGATCCTGTTTACCCT。
在切口酶Nt.AlwI浓度较高的条件下，取代产物为E1：
CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCT。
（ⅹ）引物R1与产物A1或者产物E1结合，在phi29 DNA Polymerase的作用下3’端以A1或者E1为模板进行延伸。同时，核酸阻遏物结合在产物A1或者产物E1上。
（xi）当R1被延伸至核酸阻遏物的位置时，phi29 DNA Polymerase的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止。
（xii）切口酶Nt.AlwI特异性切割出短的延伸产物，单链扩增产物L1生成：
AGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGA。
实施例4：以转基因水稻KMD1的CaMV 35S为模板65°C生成30nt单链产物。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nb.BsrDI，9.6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，500nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，200nM核酸阻遏物。65°C温浴10min。
引物序列：
F1：CTGTTCTGTCCATTGCGATGCCTCTGCC。
R1：CTGTTCTGTCCATTGCTTTCCACGATGC。
BF：CTCCTCGGATTCCATTGCC。
BR：GGATTGTGCGTCATCCCTTA。
核酸阻遏物：CTCGTGGGTGGGGGTCC-C3 spacer。
单链核酸产物的生成步骤同实施例1，但所述的中间产物及扩增产物的序列根据具体实施例发生变化。
单链DNA产物序列：GATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGAT。
实施例5：以转基因水稻KMD1的CaMV 35S为模板35°C生成60nt单链产物。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10UNt.AlwI，5U phi29 DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，200nM引物F1，1uM引物R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。35°C温浴10min。
引物序列：
F1：GGTTTAGTGCGGATCTGAGTGACGTAAGGGA。
R1：TTGTCGTCTTGGATCCCTGTTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AGAGACTGGTGATTTC。
核酸阻遏物序列：CCAAATGAAATGAACTT-Biotin，下划线碱基修饰LNA。
单链核酸产物的生成步骤同实施例3，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化。
单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
实施例6：核酸阻遏物长为18nt。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.BstNBI，6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，200nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，80nM核酸阻遏物。56°C温浴10min。
引物序列：
F1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGA。
R1：TTTGTCGTTTGAGTCTAGTTGTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AATTTGTGCCATTCTTGAAAGA。
核酸阻遏物序列：AGGAAGTTCATTTCATTT-C3 spacer。
单链核酸产物的生成步骤同实施例1，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化。
单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATA。
实施例7：核酸阻遏物长为14nt。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.BstNBI，6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，200nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，80nM核酸阻遏物。56°C温浴10min。
F1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGA。
R1：TTTGTCGTTTGAGTCTAGTTGTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AATTTGTGCCATTCTTGAAAGA。
核酸阻遏物序列：AGGAAGTTCATTTC-C3 spacer。
单链核酸产物的生成步骤同实施例1，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化。
单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATA。
实施例8：核酸阻遏物的GC含量为30%
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.BstNBI，6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ulThermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，500nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。56°C温浴10min。
F1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGA。
R1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AATTTGTGCCATTCTTGAAAGA。
核酸阻遏物序列：AAGTTCATTTCATTTGGA-C3spacer。
单链核酸产物的生成步骤同实施例1，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
实施例9：核酸阻遏物的GC含量为60%
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nb.BsrDI，9.6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，500nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，200nM核酸阻遏物。65°C温浴10min。
引物序列：
F1：CTGTTCTGTCCATTGCGATGCCTCTGCC。
R1：CTGTTCTGTCCATTGCTTTCCACGATGC。
BF：CTCCTCGGATTCCATTGCC。
BR：GGATTGTGCGTCATCCCTTA。
核酸阻遏物：CGGTCCCAAAGATGG-Biotin。
单链核酸产物的生成步骤同实施例2，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化。
单链DNA产物序列：TTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGT。
实施例10：核酸阻遏物采用肽核酸PNA修饰
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.BstNBI，6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ulThermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，500nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。56°C温浴10min。
F1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGACGTAAGGGA。
R1：CTTATTGTCCGAGTCTTATTGTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AATTTGTGCCATTCTTGAAAGA。
核酸阻遏物序列：AAGTTCATTTCATTTGGA-C3spacer，下划线碱基修饰PNA。
单链核酸产物的生成步骤同实施例1，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
实施例11：核酸阻遏物采用锁核酸LNA修饰
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10UNt.AlwI，5U phi29 DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，200nM引物F1，1uM引物R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。35°C温浴10min。
引物序列：
F1：GGTTTAGTGCGGATCTGAGTGACGTAAGGGA。
R1：TTGTCGTCTTGGATCCCTGTTCAGCGTGTCCT。
BF：TCAAAGCAAGTGGATTGATGTG。
BR：AGAGACTGGTGATTTC。
核酸阻遏物序列：CCAAATGAAATGAACTT-Biotin，下划线碱基修饰LNA。
单链核酸产物的生成步骤同实施例3，但所述的中间产物及扩增终产物的序列根据具体实施例发生变化。
单链扩增产物：
TGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
实施例12：核酸阻遏物的3’端与中间产物A1或者E1的5’端的距离为15nt。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nt.AlwI，5U phi29 DNA Polymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol ReactionBuffer，300uM dNTP，200nM引物F1，1uM引物R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。35°C温浴10min。
引物序列：
F1：TTAGTTTCGTGGATCTTTGCCGTGTCTCAGTC。
R1：AGGGTAAACAGGATCAATAAGGCTACGATCT。
BF：ATTGTCCAATATTCC。
BR：AGCTAGTTGGTAGGGTA。
核酸阻遏物序列：CGATCAGCCACACT-Biotin，下划线为LNA修饰。
取代产物为A1：
CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCTTATTGATCCTGTTTACCCT。
取代产物为E1：
CCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTATAGATCGTAGCCT。
单链扩增产物：
AGGCTACGATCTATAGCTGGTCTGAGAGGA。
实施例13：核酸阻遏物的3’端与中间产物A1或者E1的5’端的距离为22nt。
反应前试剂的准备：在PCR管中加入50ul反应试剂：10U Nb.BsrDI，9.6U Bst DNAPolymerase，2.5ul NEBuffer 3，5ul Thermopol Reaction Buffer，300uM dNTP，200nM引物F1和R1，50nM引物BF和BR，2.5ul模板，50nM核酸阻遏物。65°C温浴10min。
针对CP4 epsps双链模板序列设计引物及核酸阻遏物序列如下：
F1：CTTGTTCTTGTTCATTGCTGTCAGCGTGTCCT。
R1：TTTACTTACCTTCATTGCCCCACTATCCTTCG。
BF：CCATTCTTGAAAGATCT。
BR：GCAAGTGGATTGATGTG。
核酸阻遏物序列：AAGTTCATTTCATTTGG-Biotin。
取代产物为A1：
CATTGCTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGGCAATGAAGGTAAGTAAA。
取代产物为E1：
CATTGCTGTCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGGCAATG。
单链扩增产物：
CATTGCCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种有助于恒温扩增体系中生成单链产物的方法
<130>
<160> 106
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 60
atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 120
gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctc 165
<210> 2
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagagagata gatttgtaga gagagactgg tgatttcagc gtgtcctctc caaatgaaat 60
gaacttcctt atatagagga agggtcttgc gaaggatagt gggattgtgc gtcatccctt 120
acgtcagtgg agatatcaca tcaatccact tgctttgaag acgtg 165
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg a 31
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cttattgtcc gagtcttatt tcagcgtgtc ct 32
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agagactggt gatttc 16
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccaaatgaaa tgaactt 17
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
<210> 9
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 60
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 120
ctctctctac aaatctatct ctctc 145
<210> 10
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cttattgtcc gagtcttatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 60
gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc aataagactc 120
ggacaataag 130
<210> 11
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 60
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aataagactc 120
ggacaataag 130
<210> 12
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
aagttcattt catttggaga ggacacgctg aaataagact cggacaataa g 111
<210> 13
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
aagttcattt catttggaga ggacacgctg aa 92
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
<210> 15
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tggggtttat ggaaattgga attgggatta agggtttgta tcccttgtgc catgttgtta 60
atttgtgcca ttcttgaaag atctgctaga gtcagcttgt cagcgtgtcc tctccaaatg 120
aaatgaactt ccttatatag aggaagggtc ttgcgaagga tagtgggatt gtgcgtcatc 180
ccttacgtca gtggagatat cacatcaatc cacttgcttt gaagacgtgg ttggaacgtc 240
ttctttttcc acgatgctcc t 261
<210> 16
<211> 261
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt 60
gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca agacccttcc 120
tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacacgct gacaagctga ctctagcaga 180
tctttcaaga atggcacaaa ttaacaacat ggcacaaggg atacaaaccc ttaatcccaa 240
ttccaatttc cataaacccc a 261
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cttgttcttg ttcattgctg tcagcgtgtc ct 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tttacttacc ttcattgccc cactatcctt cg 32
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ccattcttga aagatct 17
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gcaagtggat tgatgtg 17
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aagttcattt catttg 16
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cattgcccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata agg 43
<210> 23
<211> 182
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
cttgttcttg ttcattgctg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 60
gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata 120
tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc 180
ct 182
<210> 24
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tttacttacc ttcattgccc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt 60
catttcattt ggagaggaca cgctgacagc aatgaacaag aacaag 106
<210> 25
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cttgttcttg ttcattgctg tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata 60
gaggaagggt cttgcgaagg atagtggggc aatgaaggta agtaaa 106
<210> 26
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
cattgctgtc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct 60
tgcgaaggat agtggggcaa tgaaggtaag taaa 94
<210> 27
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
cattgctgtc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct 60
tgcgaaggat agtggggcaa tg 82
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cattgcccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata agg 43
<210> 29
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gggttgcccc cattgtccaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt 60
ctcagtccca gtgtggctga tcgtcctctc agaccagcta tagatcgtag ccttggtagg 120
ctcttaccct accaactagc taatccaacg cagg 154
<210> 30
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
cctgcgttgg attagctagt tggtagggta agagcctacc aaggctacga tctatagctg 60
gtctgagagg acgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 120
agcagtgggg aatattggac aatgggggca accc 154
<210> 31
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ttagtttcgt ggatctttgc cgtgtctcag tc 32
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
agggtaaaca ggatcaataa ggctacgatc t 31
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
attgtccaat attcc 15
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
agctagttgg tagggta 17
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
cagtgtggct gatcg 15
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aggctacgat ctatagctgg tctgagagga 30
<210> 37
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ttagtttcgt ggatctttgc cgtgtctcag tcccagtgtg gctgatcgtc ctctcagacc 60
agctatagat cgtagccttg gtaggctctt accctaccaa ctagctaatc caacgcagg 119
<210> 38
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
agggtaaaca ggatcaataa ggctacgatc tatagctggt ctgagaggac gatcagccac 60
actgggactg agacacggca aagatccacg aaactaa 97
<210> 39
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
ttagtttcgt ggatctttgc cgtgtctcag tcccagtgtg gctgatcgtc ctctcagacc 60
agctatagat cgtagcctta ttgatcctgt ttaccct 97
<210> 40
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcgt cctctcagac cagctataga tcgtagcctt 60
attgatcctg tttaccct 78
<210> 41
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcgt cctctcagac cagctataga tcgtagcct 59
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aggctacgat ctatagctgg tctgagagga 30
<210> 43
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ctgttctgtc cattgcgatg cctctgcc 28
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ctgttctgtc cattgctttc cacgatgc 28
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ctcctcggat tccattgcc 19
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ggattgtgcg tcatccctta 20
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
ctcgtgggtg ggggtcc 17
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 30
<210> 49
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
ggtttagtgc ggatctgagt gacgtaaggg a 31
<210> 50
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ttgtcgtctt ggatccctgt tcagcgtgtc ct 32
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
agagactggt gatttc 16
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ccaaatgaaa tgaactt 17
<210> 54
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
<210> 55
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg a 31
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
tttgtcgttt gagtctagtt gtcagcgtgt cct 33
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
aatttgtgcc attcttgaaa ga 22
<210> 59
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
aggaagttca tttcattt 18
<210> 60
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatata 57
<210> 61
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg a 31
<210> 62
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
tttgtcgttt gagtctagtt gtcagcgtgt cct 33
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
aatttgtgcc attcttgaaa ga 22
<210> 65
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
aggaagttca tttc 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatata 57
<210> 67
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg a 31
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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cttattgtcc gagtcttatt gtcagcgtgt cct 33
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
aatttgtgcc attcttgaaa ga 22
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<213> 人工序列
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aagttcattt catttgga 18
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<213> 人工序列
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tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
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ctgttctgtc cattgcgatg cctctgcc 28
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ctcctcggat tccattgcc 19
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ggattgtgcg tcatccctta 20
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cggtcccaaa gatgg 15
<210> 78
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg t 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
cttattgtcc gagtcttatt gacgtaaggg a 31
<210> 80
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
cttattgtcc gagtcttatt gtcagcgtgt cct 33
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
aatttgtgcc attcttgaaa ga 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
aagttcattt catttgga 18
<210> 84
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtttagtgc ggatctgagt gacgtaaggg a 31
<210> 86
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
ttgtcgtctt ggatccctgt tcagcgtgtc ct 32
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
tcaaagcaag tggattgatg tg 22
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
agagactggt gatttc 16
<210> 89
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
ccaaatgaaa tgaactt 17
<210> 90
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg 60
<210> 91
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
ttagtttcgt ggatctttgc cgtgtctcag tc 32
<210> 92
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
agggtaaaca ggatcaataa ggctacgatc t 31
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<211> 15
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<213> 人工序列
<400> 93
attgtccaat attcc 15
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<211> 17
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<400> 94
agctagttgg tagggta 17
<210> 95
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
cgatcagcca cact 14
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<211> 78
<212> DNA
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<400> 96
ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcgt cctctcagac cagctataga tcgtagcctt 60
attgatcctg tttaccct 78
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<213> 人工序列
<400> 97
ccgtgtctca gtcccagtgt ggctgatcgt cctctcagac cagctataga tcgtagcct 59
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<213> 人工序列
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cttgttcttg ttcattgctg tcagcgtgtc ct 32
<210> 100
<211> 32
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<213> 人工序列
<400> 100
tttacttacc ttcattgccc cactatcctt cg 32
<210> 101
<211> 17
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<400> 101
ccattcttga aagatct 17
<210> 102
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
gcaagtggat tgatgtg 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
aagttcattt catttgg 17
<210> 104
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
cattgctgtc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct 60
tgcgaaggat agtggggcaa tgaaggtaag taaa 94
<210> 105
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
cattgctgtc agcgtgtcct ctccaaatga aatgaacttc cttatataga ggaagggtct 60
tgcgaaggat agtggggcaa tg 82
<210> 106
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
cattgcccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata agg 43
Claims (1)
1.一种恒温扩增体系中生成单链产物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设计两对引物，F1、R1和BF、BR，其中F1、R1包含三个部分：靠近引物5’端的固定区，靠近3’端的能够与模板进行特异性结合的识别区及固定区和识别区中间的切口酶作用区域；
(2)选取反应酶，包括具有链取代活性的聚合酶和切口酶，所述聚合酶能够在引物与模板结合之后在引物的3'端加成核苷酸，使得引物的3'不断延伸，并取代原来模板链的互补链；所述切口酶能够识别特异性的核苷酸序列，并在含有此序列的上游、中间、或者下游的双链DNA的其中一条链上产生缺口；
(3)选取核酸阻遏物，该核酸阻遏物能够与所述恒温扩增体系的一条产物进行互补配对，防止引物与所述产物结合后被聚合酶被过度延伸；
(4)所述单链产物的生成方法具体包括以下步骤：
(ⅰ)在某些反应温度下，引物F1和BF与同一条模板链结合，引物BF在引物F1的上游，
(ⅱ)在聚合酶的作用下，引物F1的3’末端被聚合酶延伸，
(ⅲ)在相同的反应温度下，引物BF的3'末端被延伸，并取代F1延伸所得的产物S1，
(ⅳ)引物R1和BR与产物S1结合，引物BR在引物R1的上游，
(ⅴ)在聚合酶的作用下，引物R1的3’末端被聚合酶延伸，
(ⅵ)在相同的反应温度下，引物BR的3'末端被延伸，并取代R1延伸所得的产物P1，
(ⅶ)在相同的反应条件下，引物F1与产物P1结合，并在聚合酶的作用下延伸引物的3’末端，
(ⅷ)切口酶特异性识别双链DNA产物的切口位点，并在双链区的特异性位点的其中一条DNA链上产生一缺口，
(ⅸ)在聚合酶的帮助下，具有缺口的DNA链3'末端继续被延伸，并取代原来的切口位点下游的DNA链，
当切口酶浓度较低时，生成产物A1，
当切口相对过量时，生成产物E1，
(ⅹ)引物R1的识别区域与产物A1或产物E1结合，并在引物R1的3'末端沿着产物A1或E1进行延伸，
同时，核酸阻遏物与A1或E1结合，
(xi)当延伸至核酸阻遏物的位置时，聚合酶的链取代作用不足以取代下强碱基互补配对的核酸阻遏物，引物延伸终止，
(xii)切口酶特异性切割出短的延伸产物，生成单链扩增产物；
所述方法生成的单链DNA产物的长度为30-60nt；
所述的反应温度为35-65℃；
所述核酸阻遏物的组成是普通脱氧核糖核酸、核糖核苷酸，或者，带修饰的核苷酸、不带修饰的核苷酸，或者肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)；
所述核酸阻遏物的长度优选为14-18nt；
所述核酸阻遏物的浓度为0.05-0.2uM；
所述核酸阻遏物的3’端距离与其互补的产物的5’端的距离为15-22nt；
所述核酸阻遏物的GC含量优选为30％-60％；
所述核酸阻遏物的3'羟基末端采用脱羟基修饰，所述的脱羟基修饰包括生物素化和C3-spacer。
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Granted publication date: 20200616 Termination date: 20210116 |
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