CN113862394A - 一种番茄不孕病毒的rpa检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种番茄不孕病毒的RPA检测方法，包括如下步骤：(1)样品处理：从待测植物样品中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA；(2)RPA扩增：以cDNA为模板，使用番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对进行RPA扩增；(3)结果判读：凝胶电泳检测RPA扩增结果，根据电泳结果判读检测的植物样品是否感染番茄不孕病毒。与其他核酸等温扩增技术相比，本发明的方法仅需一对引物，不需要PCR仪，简化了检测流程，缩短了检测时间，适合于病毒的快速诊断和现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及园林植物分子生物学领域，特别是涉及一种番茄不孕病毒的RPA检测方法。
背景技术
番茄不孕病毒是菊科植物中普遍存在，目前其检测技术主要有血清学检测法、PCR技术、多重PCR技术、环介导等温扩增技术等。现有技术需要PCR仪器，且反应时间很长，需要付出大量精力和时间，成本也较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简便、反应时间短的番茄不孕病毒的RPA检测方法。
一种番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对，其特征在于：核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
本发明所述的番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对在检测或辅助检测番茄不孕病毒，或制备检测或辅助检测番茄不孕病毒的产品中的应用。
一种用于番茄不孕病毒检测的试剂盒，包括本发明所述的番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对。
本发明所述的用于番茄不孕病毒检测的试剂盒，还包括RPA恒温扩增试剂、植物总RNA提取试剂和反转录试剂。
本发明所述的用于番茄不孕病毒检测的试剂盒在检测或辅助检测番茄不孕病毒，或制备检测或辅助检测番茄不孕病毒的产品中的应用。
一种番茄不孕病毒的RPA检测方法，包括如下步骤：
(1)样品处理：从待测植物样品中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA；
(2)RPA扩增：以cDNA为模板，使用番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对进行RPA扩增；
(3)结果判读：凝胶电泳检测RPA扩增结果，根据电泳结果判读检测的植物样品是否感染番茄不孕病毒；
检测标准为：
若RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为225bp的片段，则检测的植物样品感染番茄不孕病毒，若RPA扩增产物不含有大小为225bp的片段，则检测的植物样品未感染番茄不孕病毒。
本发明所述的番茄不孕病毒的RPA检测方法，其中，所述RPA扩增的反应体系及条件如下：
向已装有冻干酶粉的PCR试管中依次加入干粉溶解缓冲液29.5μL，ddH2O 11.2μL，权利要求1中所述的引物对中的上下游引物各2.4μL，引物的浓度为10μmol/L，模板cDNA2μL，用移液枪混匀后，加入浓度为280mmol/L的醋酸镁2.5μL，反应体系总体积50μL，离心，于40℃金属浴40min；反应结束后，加入50μL体积比为1：1的氯仿/苯酚溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μL上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳。
本发明番茄不孕病毒的RPA检测方法与现有技术不同之处在于：
本发明建立了番茄不孕病毒的RPA检测方法，与PCR技术相比，该技术操作简便，灵敏度高，不需PCR仪，在水浴锅、金属浴等恒温装置内均可完成扩增，反应温度在35℃～40℃内即可扩增到清晰的目的条带。与其他核酸等温扩增技术相比，该方法仅需一对引物，不需要PCR仪，简化了检测流程，缩短了检测时间，适合于病毒的快速诊断和现场检测。
下面结合附图对本发明的番茄不孕病毒的RPA检测方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明RPA扩增体系获得的电泳图；
图2为本发明RPA扩增体系的反应温度优化结果图；
图3为本发明中单一PCR与RPA检测的灵敏度比较图。
具体实施方式
1、实验材料：
TAV阳性对照为经PCR鉴定为阳性的菊花叶片。
2、引物设计
根据NCBI数据库下载的TAV的CP蛋白的基因序列，利用clustal X软件进行序列多重比对，选择保守区域使用Primer 5.0软件设计多对用于RPA扩增的特异性引物序列。引物设计要求如下：引物长度30～35bp，GC含量40％～60％，尽量避免引物二聚体、发卡环等结构，扩增产物的大小为150～300bp。具体的引物序列、产物大小见下表：
3、RNA提取及反转录
取0.1g叶片使用Takara公司的Mini BEST Plant RNAExtraction Kit试剂盒提取植物总RNA，取1μg的总RNA采用Promega公司的Reverse Transcription System反转录试剂盒进行反转录，最终体积为100μL。
4、RPA扩增引物的筛选
50μL的RPA扩增体系：向已装有冻干酶粉的PCR试管中依次加入干粉溶解缓冲液(rehydration buffer)29.5μL，ddH2O 11.2μL，上下游引物(10μmol/L)各2.4μL，模板cDNA2μL，用移液枪混匀后，加入醋酸镁(280mmol/L)2.5μL，离心，于40℃金属浴40min。反应结束后，加入50μL氯仿/苯酚(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μL上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳，结果如图1。所设计的TAV的RPA引物扩增到与预期条带大小相符的片段。说明，所设计的引物特异性良好，最终选用TAV-R3-F/R作为TAV RPA扩增的引物。
5、RPA扩增温度的优化
在引物确定的基础上，对病毒的RPA反应温度进行优化，结果如图2。在TAV的RPA反应体系中，当反应温度为25℃时，条带亮度较弱，随反应温度的升高，条带亮度逐渐增加，当反应温度达到为35℃、40℃时，条带清晰，其亮度无明显差距。说明反应温度在35℃～40℃内均可有效进行RPA扩增，选用40℃为反应温度进行后续试验。
6、RPA扩增体系
(1)根据RPA引物筛选、温度优化，最终确定TAV的RPA反应体系、反应条件如下：
向装有冻干酶粉的PCR试管中加入以下试剂(50μL)：
混匀，向PCR试管中滴加2.5μL醋酸镁MgOAc溶液(280mmol/L)，于40℃金属浴40min。待反应完成，向RPA扩增产物中加入等体积的苯酚：氯仿溶液(体积比1:1)，混匀，于12000rpm离心5min，取5μL上清液，使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
7、单一PCR与RPA检测的灵敏度比较
将TAV的cDNA进行10倍梯度稀释，依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍，以稀释的cDNA为模板，按上述RPA扩增条件进行灵敏度试验。为与普通PCR技术进行比较，本研究同时采用普通PCR进行灵敏度试验。20μL PCR扩增体系：2×Taq Plus Master Mix10μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，模板cDNA1μL，ddH2O 7μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，循环35次；72℃再延伸10min。反应产物经2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。
结果如图3，当cDNA稀释倍数为105时，TAV的RPA与PCR检测方法均可检测到225bp的目的条带，当cDNA稀释倍数为106时，病毒的RPA方法仍可以检测到目的条带，但PCR方法均未能检测到目的条带。试验结果表明，TAV的RPA检测方法的灵敏度均是单一PCR的10倍，更适合于微量病毒的检测。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 北京农业生物技术研究中心
<120> 一种番茄不孕病毒的RPA检测方法
<130> 2021-8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
gtgcaagtga gactgaaccc atccccaaag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
acccatatcg ccgatctcag caccgacatt 30
Claims (7)
1.一种番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对，其特征在于：核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对在检测或辅助检测番茄不孕病毒，或制备检测或辅助检测番茄不孕病毒的产品中的应用。
3.一种用于番茄不孕病毒检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对。
4.根据权利要求3所述的用于番茄不孕病毒检测的试剂盒，其特征在于：还包括RPA恒温扩增试剂、植物总RNA提取试剂和反转录试剂。
5.权利要求3或4所述的用于番茄不孕病毒检测的试剂盒在检测或辅助检测番茄不孕病毒，或制备检测或辅助检测番茄不孕病毒的产品中的应用。
6.一种番茄不孕病毒的RPA检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)样品处理：从待测植物样品中提取总RNA，然后将其反转录成cDNA；
(2)RPA扩增：以cDNA为模板与番茄不孕病毒检测的RPA特异性引物对进行RPA扩增；
(3)结果判读：凝胶电泳检测RPA扩增结果，根据电泳结果判读检测的植物样品是否感染番茄不孕病毒；
检测标准为：
若RPA扩增得到的RPA扩增产物含有大小为225bp的片段，则检测的植物样品感染番茄不孕病毒，若RPA扩增产物不含有大小为225bp的片段，则检测的植物样品未感染番茄不孕病毒。
7.根据权利要求6所述的番茄不孕病毒的RPA检测方法，其特征在于：所述RPA扩增的反应体系及条件如下：
向已装有冻干酶粉的PCR试管中依次加入干粉溶解缓冲液29.5μL，ddH2O 11.2μL，权利要求1中所述的引物对中的上下游引物各2.4μL，引物的浓度为10μmol/L，模板cDNA 2μL，用移液枪混匀后，加入浓度为280mmol/L的醋酸镁2.5μL，反应体系总体积50μL，离心，于40℃金属浴40min；反应结束后，加入50μL体积比为1：1的氯仿/苯酚溶液，充分混匀，12000rpm离心5min，取5μL上清液进行2.5％的琼脂糖凝胶电泳。
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| CN113862394B (zh) | 2023-10-03 |
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