WO2011023131A1 - 20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒 - Google Patents

20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒 Download PDF

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WO2011023131A1
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composite amplification
amplification system
penta
dna
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高阳
陈初光
王曙光
马斌
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基点认知技术(北京)有限公司
鼎生科技（北京）有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to the field of biotechnology. Further, the present invention relates to the detection of genetic marker genes having polymorphisms in the human genome. In particular, the invention relates to the simultaneous amplification of multiple short tandem repeat loci in an amplification system by polymerase chain reaction. Background technique
  • Short tandem repeats also known as microsatellites or simple sequence repeats (SSRs) are a series of DNA tandem repeats that are widely present in the genome of eukaryotes, with a core sequence of 2-6 base repeats.
  • the STR locus is large in number and has a wide division, accounting for about 3% of the entire genome (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001), and its polymorphism is high. Its polymorphism is mainly due to the difference in the number of core sequence repeats among individuals. And this difference follows the Mendelian inheritance law in the genetic process. Therefore, STR amplification detection technology is widely used in individual identification and phylogenetic studies.
  • STR compound amplification technology is the main technical means for forensic individual identification and paternity testing, and is widely used in DNA laboratories around the world (Forensic DNA Typing second edition, John Butler). It has been widely used in case analysis and provides strong evidence for case detection. With development, many countries have used this technology to establish a DNA database of criminals and suspects, that is, to analyze the DNA data of detainees and suspects and enter them into a database for comparison and investigation.
  • kits are based on 13 core loci (vWA, D21S11, D18S51, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, FGA, D8S1179, D3S1358, CSF1PO. TH01, TPOX) specified by the US CODIS standard.
  • 13 core loci vWA, D21S11, D18S51, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, FGA, D8S1179, D3S1358, CSF1PO. TH01, TPOX
  • Table 1 for information on the kits of each manufacturer. Therefore, if STR kits from different manufacturers are used, the data imported into the DNA database is genetically different.
  • the field of DNA identification needs to have a STR complex that responds to amplify more loci, provides more information, and has better compatibility.
  • Table 1 Gene loft information for all major manufacturers' kits Manufacturers Base Point Cognition Company Promega ABI Public Security Department Sino-German Union
  • the black font indicates CODIS 13 gene loci, + indicates the included locus, - indicates the locus not included.
  • the present invention is directed to the above needs.
  • a complex amplification system for detecting 20 STR loci is included. These STR loci contain all the gene loci used by various manufacturers at home and abroad.
  • the loci are Amelogenin (AMEL), vWA, D21S11, D18S51, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, FGA, D2S1338, D19S433, D6S1043, D12S391, D8S1179, D3S1358, CSFIPO, Penta D, Penta E. TH01, TPOX .
  • Amelogenin AMEL
  • vWA D21S11, D18S51, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, FGA, D2S1338, D19S433, D6S1043, D12S391, D8S1179, D3S1358, CSFIPO, Penta D, Penta E. TH01, TPOX .
  • the amplification system of the present invention comprises a primer mixture, a reaction buffer, a hot-start Taq DNA polymerase, and the like.
  • primers were designed for the above 20 loci in the flanks of their repeats.
  • the primer design was performed using Primer 3 software, and each primer was annealed to a temperature close to or higher than 60.
  • Each pair of primers was tested for intensification and optimized until a clear single amplified band was obtained.
  • the primer sequences are shown in Table 2 below.
  • the above loci are divided into 4 groups according to the length of the amplified fragment, etc.
  • the first group contains D19S433, D5S818, D21S11, D18S51 and D6S1043, and the second group contains D3S1358, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO and PentaD, third
  • the group contains Amelogenin, vWA, D8S1179, TPOX and Penta E
  • the fourth group contains TH01, D12S391, D2S1338 and FGA.
  • Each group was labeled with a different fluorescein, and the amplification products of each locus in each group were separated according to the length difference, and the two loci could not overlap.
  • Each group of primers was subjected to a composite amplification test. After confirming that there is no non-specific amplification phenomenon in the group and no cross-reaction, adjust the concentration of each pair of primers so that the peak balance of each fragment in the group reaches 40% or more.
  • the blue label can be selected from 5-FAM (5-carboxyfluorescein), 6-FAM (6-carboxyfluorescein) or a similar spectrum of fluorescein molecules, and the green label can be selected as HEX (hexachloro-6-methylfluorescein).
  • yellow label can be selected TMR (4-mercapto-6 -Carboxyl-rhodamine) or a similarly fluorescing fluorescein molecule
  • the red marker can select ROX (carboxy-X-rhodamine) or a similar spectrum of fluorescein molecules.
  • the PCR amplification reaction of the present invention can be carried out in a certain buffer system.
  • the buffer system included: 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3, 25 ° C), 2.0 mM MgCl 2 , 0.1 mg/ml BSA (bovine serum albumin) and 0.2 mM each dNTP.
  • dNTP is an equimolar mixture of four deoxyribonucleotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
  • the Taq DNA polymerase required for the reaction is either a hot-start DNA polymerase, an antibody blocking modification or a chemical modification.
  • Each amplification system (2 ⁇ l ) of the present invention requires 2U to 4U of Taq DNA polymerase.
  • the amplification system can obtain good results on various reaction thermal cyclers (such as ABI 9700, ABI 9600, ABI2720, Bio-Rad iCycler, Bio-Rad C1000, etc.) using the following procedure:
  • the template DNA in the present invention is human genomic DNA.
  • the template DNA extracted by various conventional methods, such as magnetic bead method, phenol chloroform method, resin purification method (Molecular Cloning Experimental Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Publishing House) can obtain good results.
  • DNA can be prepared from the following tissues or cells: blood (blood spots), semen (fine spots), bones, hair, saliva (saliva spots), sweat, amniotic fluid containing fetal cells, and the like.
  • the amount of DNA template is preferably in the range of 0.5 ng to 4 ng to obtain better amplification results. Too low a template amount may result in the detection of some gene loci, and too high a template amount may result in non-specific amplification products.
  • the template DNA is amplified in the above reaction buffer system according to the specified reaction procedure, and amplification products mixed at each locus can be obtained.
  • fluorescently labeled primers are used, and the amplification product also carries a fluorescent label, and the label can be emitted under laser excitation by a sequencer (such as ABI 377, 310 DNA sequencer) or a genetic analyzer (such as ABI 3130). 3100 genetic analyzer)
  • the identified optical signal, so the amplified product can be electrophoresed and analyzed by instruments such as a sequencer or a genetic analyzer.
  • the amplified product When detecting on a sequencer or genetic analyzer, the amplified product is mixed with a molecular standard (marker, internal lane standard), hydrazine amide in a certain ratio, and electrophoretically separated into a capillary or gel of the instrument.
  • the molecular weight internal standard consists of a number of fluorescently labeled DNA fragments of known length used to calculate the length of the PCR amplification product fragment so that genotyping and alignment with the allelic ladder can be determined.
  • Yonghou's data can be analyzed in data such as GeneMapper, GeneMarker, GeneScan, etc. Software analysis, STR genotyping profiles and data were obtained.
  • the invention relates to
  • a complex amplification system for simultaneously analyzing multiple STR loci characterized in that: 20 loci are amplified in combination: Amelogenin, vWA, D21S11, D18S51, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, FGA, D2S1338, D19S433, D6S1043, D12S391, D8S1179, D3S1358, CSFIPO, PentaD, PentaE, TH01 and TPOX.
  • the composite amplification system according to any one of items 1 to 5, wherein the system comprises a primer mixture.
  • a method of simultaneously analyzing a DNA sample characterized in that the composite amplification system described in the preceding claims is used for detecting DNA.
  • the DNA sample comprises blood, blood spots, semen, spots, bones, hair, saliva, saliva spot, sweat, amniotic fluid.
  • the present invention also provides a primer sequence selected from the group consisting of Table 2, wherein one or more, preferably 1 - 15, preferably 1 - 10, preferably 1 - 5 nucleotides are substituted, deleted and/or added The resulting modified sequence.
  • the invention also relates to a primer sequence mixture for use in a complex amplification system as shown in Table 2.
  • the invention also relates to the above primer sequences, kits and/or composite amplification systems for analyzing multiple
  • Figure 1 DNA sample using the amplified analytical profile of the present invention.
  • FIG. 1 The DNA sample was amplified using ABI's SinoFiler kit.
  • the blood is donated by volunteers. Template DNA was extracted from the blood by the chelex-100 method. The amplification reaction was performed on an ABI 9700 thermal cycler. Electrophoresis and detection were performed on an ABI 3100 Genetic Analyzer. Data analysis was performed using GeneMapper ID v3.2 software. Samples were also tested using ABI's SinoFiler kit and the base point recognition company's Goldeneye 16A kit. The method was performed according to the kit instructions and the results were used as controls.
  • the reagents and materials used in the present invention, such as the allelic ladder, are conventional materials commonly used by those skilled in the art.
  • reaction tube is taken out and electrophoresed and detected by ABI 3100 Genetic Analyzer.
  • the present invention first established a composite amplification system for detecting 20 STR loci through multiple experiments. These STR loci integrate all the gene loci used by various manufacturers at home and abroad. Using this amplification system, 20 loci can be detected at one time, Amelogenin, vWA, D21S1K D18S5K D5S818, D7S820, D13S317, D16S539. FGA, D2S1338, D19S433, D6S1043, D12S39K D8S1179, D3S1358. CSF1PO, Penta D, Penta E, TH01 , TPOX.
  • this system 20 loci information can be obtained in one operation, so this system has a high individual recognition rate, which is equivalent to the sum of information obtained by using 2-3 other similar products at the same time, regardless of PCR amplification and genetic analyzer.
  • the testing process saves cost and manpower and improves work efficiency.
  • the amplification step the amplification of the previous two or three kits is reduced to one kit amplification, saving more than 50% of the reagent cost and shortening the time by 50%.
  • the detection process two or three reagent cartridges need to be separately tested. With the present invention, only one test is required, and the operation time, the detection time, and the cost of the test reagent are reduced by 50% or more.
  • the invention has high compatibility, and the present invention does not have to worry about the problem of data compatibility before. Since these 20 loci contain all the loci of current mainstream products used in China and before, they have good compatibility, not only compatible with all the data already in the DNA database of our country, but also for the new generation of products. High compatibility. It is to be understood that the foregoing description is only illustrative of the invention, and the scope of the invention is not limited by the specific embodiments disclosed herein. Any equivalent embodiments are considered to be within the scope of the invention. In fact, it will be apparent to those skilled in the art that ⁇ RTIgt; ⁇ /RTI> ⁇ RTIgt; ⁇ /RTI> ⁇ /RTI> ⁇ RTIgt; Inside.

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Description

20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域。 进一步， 本发明涉及检测人类基因组中具有 多态性的遗传标记基因。 本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系 中同时扩增多个短串联重复基因座。 背景技术
短串联重复序列 （简称 STR )也称为微卫星或简单序列重复（SSR ), 是一类广泛存在于真核生物基因组中的 DNA串联重复序列，核心序列为 2-6 个碱基重复单位。 STR基因座数量大， 分部广泛， 约占整个基因组的 3% ( International Human Genome Sequencing Consortium, 2001 ),而且多态性高, 其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异， 并且这种差异在遗传 过程中遵循孟德尔遗传规律。因此， STR扩增检测技术被广泛用于个体识另^ 亲缘鉴定和群体遗传学研究。
目前 STR 复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段， 在世界各地的 DNA实验室得到广泛应用 （ 《Forensic DNA Typing》 second edition, John Butler )。 在案件分析中得到广泛应用， 为案件侦破提供有力证 据。 随着发展， 很多国家利用这一技术建立犯罪分子及嫌疑人的 DNA数据 库， 也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的 DNA数据分析并录入到数据库中， 便于进行比对和排查等工作。
早期的 STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增 10个左右的 STR基因座， 随着应用的广泛和数据比对的增加， 10个基因座提供的信息不 能满足要求， 国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品， 比如美国 ABI公 司的 AmpFlSTR Identifiler试剂盒和美国 Promega公司的 PowerPlex® 16试剂 盒都是 15个 STR基因座加性别决定基因。 国内也有类似的产品， 比如公安 部二所的 DNATyperl 5能够同时实现 15个基因座扩增（ DNATyperl 5基因座 的研究与选择， 叶健等， 《刑事技术》 ， 2007年 03 ) 。
但是， 近年来随着 DNA作为鉴定手段的应用越来越广， 用户对试剂盒 的基因座数量、信息含量和兼容性有了更高的要求。作为在某些遗传鉴定中， 需要更多的基因座提供更多的信息量。 比如亲子鉴定、 失踪人口比对时， 检 测的基因座数量少的话， 可能发生误判 （STR基因座在二联体亲子鉴定中的 应用分析， 张文红等， 《法医学杂志》 , 2008年第 24卷第 6期） ， 往往需 要 17个甚至更多个基因座联合使用才能保证准确性。目前的做法通常是选择 两种厂家的复合扩增试剂盒作为补充， 联合使用， 达到 17个 STR基因座以 上的效果。如果能够实现一次反应扩增 18个以上基因座， 不仅可以节约试剂 成本， 还可以提高工作效率、 节省人力成本等。
另夕卜， 在 DNA数据库建设方面， 对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。 我国的目前 DNA数据库中有 200万份左右，我国将在 DNA数据库建设方面 进一步加速， 到 2013年 DNA数据库中的数据将超过 1000万份， 英国等发 达国家的数据库中约有占总人口 10%的数据 ( http：〃 www.forensk.gov.uk. Asplen,2004 ) 。 随着我国 DNA数据库建设规模将不断扩大， 数据比对的作 用越来越重要。 数据比对是建立在 STR复合扩增分析得到的数据基础之上， 需要各个 STR试剂盒在基因座位上具有兼容性（中国法庭科学 DNA数据库， 《中国法医学杂志》 ， 姜先华， 2006年第 12卷第 5期） 。 然而目前所采用 的试剂盒大多以美国的 CODIS标准规定的 13个核心基因座（ vWA、 D21S11、 D18S51、 D5S818、 D7S820、 D13S317, D16S539、 FGA、 D8S1179、 D3S1358, CSF1PO. TH01、 TPOX ) 为基础， 在此基础只是选择增加其他基因座， 还 有部分产品删除了 13个核心序列中的部分基因座，各厂商试剂盒基因座信息 见表 1。 所以， 如果采用不同生产商的 STR试剂盒， 导入到 DNA数据库中 的数据是有基因座差异的。 这样在比对的时候， 不是所有数据都有效， 只是 相同基因座部分的数据可以比对，而不同的部分就无法应用。例如， Identifier 试剂盒和 PowerPlex® 16试剂盒之间相同 STR基因座为 13个，其他两个 STR 基因座由于不同所以在数据比对时没有作用。并且，这 13个可比对基因座数 据用于排除的时候是可靠的， 但是用于认定的情况下往往是不够的。 需要更 多的基因座数据。 所以， 由于各 STR试剂盒基因座不同， 导致了 DNA数据 库部分数据资源浪费， 并且有效性不够。
因此， DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增更多基因座、 能提供更多 信息量和具有更好兼容性的 STR复合扩增体。
表 1 : 各主流生产商试剂盒的基因座位信息 生产商 基点认知公司 Promega ABI公司 公安部 中德美联
Figure imgf000004_0001
注： 黑色字体表示 CODIS 13个基因座位， +表示被包括的基因座， - 表示不包括的基因座 发明内容
本发明是针对上述需求， 首先建立了一次检测 20个 STR基因座的复合 扩增体系，这些 STR基因座包含了目前国内外各个生产商所采用的全部基因 座位。
所述的基因座为 Amelogenin(AMEL)、 vWA、 D21S11、 D18S51、 D5S818、 D7S820、 D13S317、 D16S539、 FGA、 D2S1338、 D19S433、 D6S1043、 D12S391、 D8S1179, D3S1358、 CSFIPO, Penta D, Penta E. TH01、 TPOX。
本发明的扩增体系包含引物混合物、 反应緩冲液和热启动 Taq DNA聚 合酶等。
首先针对上述 20个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。 引物设计釆用 Primer 3软件， 每条引物退火温度接近或高于 60。C。 不能产生 引物二聚体、 其它相互作用或交叉反应， 扩增产物长度在 90-450 bp之间。 对每对引物进行 ·Τ增测试并优化， 直至得到清晰单一扩增条带。 引物序列见 下表 2。
表 2 复合 4广增体系各基因座引物序列 基因座名称 上游引物序列 ( 5'-3' ) 下游引物序列 （5'-3' )
D19S433 GCGAATAAGATTCTGTTGAAGG CCGAATAAAAATCTTCTCTCTT
D5S818 GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC GTGCTTTTTAGCCAAGTGATTCC
D21S11 CTCAGTCTCCATAAATATGT TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT
D18S51 TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA CTACCAGCAACAACACAAATA
D6S1043 CTCCAGAGAGATAGAAGCAATAGT CTCTCTTTCTTCTGGAGCTGAGA
GTG
D3S1358 TATGATTCCCCCACTGCAGT ATGAAATCAACAGAGGCTTGC
D13S317 CATGGTATCACAGAAGTCT CCAAAAAGACAGACAGAAAGATAG
D7S820 GAGACGGGGTTTCACCATGTTG TCATTGACAGAATTGCACC
D16S539 CAGATGCTCGTTGTGCACA GCCTACAGAGTGATTCCATTTTTAT
CSF1PO CGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAG TCCTGTGTCAGACCCTGTT
Penta D GAAGGTCGAAGCTGAAGTG AGAATTCTTTAATCTGGACACAAG
Amelogenin CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG vWA GCCCTAGTGGATGATAAGAATAATC GGACAGATGATAAATACATAGGATGGA
TGG
D8S1179 GCAACTTATATGTATTTTTGTATTTC ACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGTTT
ATG C
TPOX TTCCTCTGCTTCACTTTTCACC AGGTCTTACTCCTGTTCCCTTC
Penta E GAGGCCGATGCAGGTGTATT ATACATGGAAAGAATTCTCTTATTTG
ΓΗ01 GTGATTCCCATTGGCCTGTTC ATTCTTCCGAGTGCAGGTCA
D12S391 AACAGGATCAATGGATGCAT GGACTGTCATGAGATTTTTCAGC
D2S1338 AAAGACTTCATGGTCCTGACTACA ATCATGAGTTATTCAGTAAGTTAAAGG
G A
FGA CAAATGCCCCATAGGTTTTG GCTTCAGGACTTCAATTCTGCT 根据扩增片段长度等将上述基因座分为 4 组， 第一组包含 D19S433、 D5S818、 D21S11、 D18S51和 D6S1043, 第二组包含 D3S1358、 D13S317, D7S820、 D16S539, CSF1PO和 PentaD, 第三组包含 Amelogenin, vWA、 D8S1179、 TPOX和 Penta E，第四组包含 TH01、 D12S391、 D2S1338和 FGA。 每组分别由不同荧光素标记,每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开， 两个基因座不能有重叠。 分别对每组引物进行复合扩增试验。 确定该组没有 非特异扩增现象， 无交叉反应等情况后， 调整每对引物的浓度， 使组内各个 片段峰值均衡性达到 40%以上。
将 4组引物分别用蓝色、 绿色、 黄色和红色荧光素标记。 每对引物中只 标记一条链， 标记在引物的 5'端。 蓝色标记可选择 5-FAM ( 5-羧基荧光素 )， 6-FAM ( 6-羧基荧光素）或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择 HEX (六 氯 -6-甲基荧光素） ， JOE ( 6-羧基 -4,5-二氯 -2,7-二曱氧基荧光素琥珀酰亚胺 酯）或相近光谱的荧光素分子， 黄色标记可选择 TMR ( 4-曱基 -6-羧基 -罗丹 明）或相近光傳的荧光素分子， 红色标记可选择 ROX (羧基 -X-罗丹明)或相近 光谱的荧光素分子。将 4组 20个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各 基因座引物浓度， 使各基因座峰值整体均衡性达到 30%以上。 得到的引物混 合物可以用于上述 20个基因座复合扩增。
本发明的 PCR扩增反应可在一定的緩冲体系中进行。 緩冲体系中包括： 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 , 25°C), 2.0 mM MgCl2, 0.1 mg/ml BSA (牛血清白蛋白）和各 0.2 mM的 dNTP。 dNTP是四种脱氧核糖核苷酸（ dATP、 dTTP、 dCTP、 dGTP )等摩尔混合物。
反应所需的 Taq DNA聚合酶为热启动 DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化 学修饰的都可以。 本发明的每个扩增体系 （ 2 μ1 )需要 2U至 4U的 Taq DNA 聚合酶。
扩增体系在各种反应热循环仪上（如 ABI 9700、 ABI 9600、 ABI2720、 Bio-Rad iCycler, Bio-Rad C1000等）采用以下的程序可以得到较好的结果：
95。C保温 5 分钟； 94。C保温 30 秒钟， 60。C保温 35秒钟， 70。C保温 50秒钟， 该步骤运行 30个循环； 60。C保温 30 分钟； 4-10。C保温。
本发明中的模板 DNA为人类基因组 DNA。 由各种常规方法， 比如磁珠 法、 酚氯仿法、 树脂纯化等方法 （《分子克隆实验手册》第三版， 冷泉港出 版社）提取的模板 DNA均可以得到较好的结果。 DNA可以由以下组织或细 胞制备： 血液（血斑）、 精液（精斑）、 骨骼、 毛发、 唾液（唾液斑）、 汗液、 含有胎儿细胞的羊水等。 DNA模板量优选在 0.5 ng至 4 ng的范围内能够得 到较好的扩增结果， 模板量太低可能导致某些基因座位检测不出， 模板量太 高会导致非特异性的扩增产物产生。
在上述反应緩冲体系中按照指定的反应程序扩增模板 DNA, 可以得到 各基因座混合的扩增产物。 本发明由于采用了荧光标记的引物， 扩增产物也 带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪（如 ABI 377、 310 DNA sequencer )或遗传分析仪（如 ABI 3130、 3100 genetic analyzer ) 识别的光信号， 所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电 泳和检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候， 扩增产物与分子量内标 (marker, internal lane standard), 曱酰胺按照一定比例混合， 进入仪器毛细管 或凝胶中电泳分离。 分子量内标是由多条已知长度的荧光标记 DNA片段组 成， 用来计算 PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基 因阶梯比对。
电:;永后的数据可以在 GeneMapper、 GeneMarker. GeneScan等数据分析 软件上分析， 得到 STR基因分型图谱和数据。
本发明涉及
(1)一种同时分析多个 STR基因座的复合扩增系统， 其特征在于： 复 合扩增 20个基因座： Amelogenin、 vWA、 D21S11、 D18S51、 D5S818、 D7S820、 D13S317、D16S539、 FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、 D3S1358, CSFIPO, PentaD, PentaE, TH01和 TPOX。
(2)本发明所述的复合扩增系统， 其中所述的基因座分为下述组合： D19S433、 D5S818. D21S11、 D18S51 和 D6S1043; D3S1358. D13S317, D7S820, D16S539, CSFIPO和 PentaD; Amelogenin, vWA、 D8S1179. TPOX 和 PentaE; TH01、 D12S391, D2S1338和 FGA。
(3)根据项 1或 2所述的复合扩增系统， 其中在一个复合扩增反应体 系中同时扩增 20个基因座。
(4)根据项 2所述的复合扩增系统， 其中基因座被位于该基因座两侧 的一对引物扩增， 其中每对引物中有一个引物的 5，端进行荧光素标记。
( 5 )根据项 1-4中任一项所述的复合扩增系统，其中复合扩增多个 STR 基因座是利用聚合酶链式反应进行的。
(6)根据项 1-5 中任一项所述的复合扩增系统， 其中该系统包含引物 混合物。
( 7 )一种同时分析 DNA样品的方法， 其特征在于应用前述权利要求之 —所述的复合扩增系统检测 DNA。
(8)根据项 7所述的方法， 其中 DNA样品包括血液、 血斑、 精液、 精 斑、 骨骼、 毛发、 唾液、 唾液斑、 汗液、 羊水。
(9)一种具有表 2中所示的用于复合扩增体系的引物序列。
( 10) 一种用于同时分析多个 STR基因座的试剂盒， 所述基因座为 Amelogenm, vWA、 D21S11、 D18S51、 D5S818、 D7S820、 D13S317, D16S539、
FGA、 D2S1338, D19S433、 D6S1043、 D12S39 D8S1179, D3S1358, CSFIPO, PentaD、 PentaE、 TH01和 TPOX。
本发明还提供具有选自表 2中所述的引物序列， 其中一个或多个， 优选 1 - 15个， 优选 1 - 10, 优选 1 - 5个核苷酸被取代、 删除和 /或添加而得到的 经修饰的序列。
本发明还涉及表 2中所示的用于复合扩增体系的引物序列混合物。 本发明还涉及上述的引物序列，试剂盒和 /或复合扩增系统用于分析多个
STR基因座的用途。 附图说明
图 1 DNA样本采用本发明扩增后的分析图谱。
图 2 DNA样本采用 ABI公司 SinoFiler试剂盒扩增后的分析图借。
图 3 DNA样本釆用基点认知公司 Goldeneye 16A试剂盒扩增后的分析图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目 的， 而并非限制本发明的范围。
实施例 1复合扩增 20个基因座位并分析其基因型
血液由志愿者捐献。 模板 DNA由血液中用 chelex-100方法提取。 扩增 反应在 ABI 9700热循环仪上进行， 电泳及检测在 ABI 3100遗传分析仪上进 行， 数据分析采用 GeneMapper ID v3.2 软件。 样品同时采用 ABI 公司的 SinoFiler 试剂盒和基点认知公司的 Goldeneye 16A试剂盒检测， 操作方法按 照试剂盒说明书进行， 结果作为对照。 本发明所用的试剂和材料诸如等位基 因阶梯 (ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。
1.1. chelex-100方法提取 DNA (具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，
Humana Press , 1998 )
1)取 3μ1加抗凝剂的血液于 500μ1 离心管中
2)振荡混匀 chelex 溶液， 使 chelex 充分悬浮， 每管加 195 μΐ 5 %的 chelex-100 ( 100-200 mesh , 购自 Bio-Rad 公司 ）， 再加入 5μ1 蛋白酶 Κ ( 20mg/ml, 购自天根生化科技有限公司）
3)振荡样品， 恒温金属浴上 56 °C 温浴 2小时后， 取出样品振荡 2分钟，
4)煮沸 8-10分钟， BOOOrpm离心 3分钟
5)小心吸出约 150 μΐ上清， 转移至新管中， 10 μΐ PCR反应体系取 1 μΐ 作为模板
1.2. 聚合酶链式反应 （ PCR )扩增
1)取緩冲液、 引物混合物、 Taq酶， 按照下表配成混合液， 振荡混匀后 分装至 PCR 应管中， 每管 25μ1, 加入模板 DNA。
25 μ1体系
去离子水 7
2.5x反应緩冲液 10
5 χ引物混合物 5
Taq酶 0.5
模板 DNA 2.5
反应总体积 25
2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪（ΑΒΙ 9700 PCR仪） ， 将 PCR 反应管放入仪器中开始扩增基因片段。 95。C保温 5 分钟； 94。C保温 30 秒钟， 60。C保温 35秒钟， 70。C保温 50秒钟，运行 30个循环； 60。C保温 30 分钟； 4。C 持续保温， 直至取出样品。
1.3. 扩增反应结束后， 取出反应管， 用 ABI 3100遗传分析仪进行电泳 和检测
1)取（ 0.5μ1 分子量内标 + ΙΟμΙ去离子曱酰胺 ) (样品数） 配成混合液
2)混勾后分装， 每管 10 μΐ, 再分别加入 1 μΐ 扩增产物和等位基因阶梯 (ladder), 简短离心将液体收集到离心管管子底部
3)样品 95°C变性 4分钟， 然后迅速水上冷却 4分钟， 使 DNA完全变性并且 保持变性状态
4)将样品放 因分析仪的样品托盘中， 设置仪器参数（进样电压 3kV, 进样时间 10秒钟） ， 开始电泳检测
5)大约 40分钟后， 电泳结束， 用 GeneMapper软件分析实验数据得到图谱 和分型结果（见图 1， 图 2， 图 3及表 3 ) 。 表 3 三种试剂盒扩增同一样本的基因分型结果
Figure imgf000009_0001
D13S317 11 , 11 11 , 11 11 , 11
D16S539 11 , 12 11 , 12 11 , 12
FGA 23 , 24 23 , 24 23 , 24
D2S1338 19， 23 19， 23 无
D19S433 14， 15 14， 15 无
D6S1043 12, 18 12, 18 无
D12S391 18, 20 18, 20 无
D8S1179 13 , 13 13 , 13 13 , 13
D3S1358 14, 15 14 , 15 14, 15
CSF1PO 10, 12 10 , 12 10, 12
Penta D 12, 12 无 12, 12
Penta E 12, 13 无 12, 13
THOl 8 , 9.3 无 8, 9.3
TPOX 8, 8 无 8, 8 发明效果
随着复合基因座数目的增加， 由于竟争的影响， 各基因座的相对平衡控 制难度加大， 本发明通过多次的实验， 首先建立了一次检测 20个 STR基因 座的复合扩增体系，这些 STR基因座整合了目前国内外各个生产商所采用的 全部基因座位。利用这个扩增体系可以一次性检测 20个基因座， Amelogenin、 vWA、 D21S1K D18S5K D5S818、 D7S820, D13S317、 D16S539. FGA, D2S1338, D19S433 , D6S1043、 D12S39K D8S1179, D3S1358. CSF1PO, Penta D、 Penta E、 TH01 , TPOX。
利用该体系可以一次操作得到 20个基因座信息， 因此这一体系具有很 高的个体识别率， 相当于同时利用 2-3个其他同类产品得到的信息总和， 无 论在 PCR扩增和遗传分析仪检测环节， 都节省了成本和人力，提高了工作效 率。在扩增环节，将以前两种或者 3种试剂盒扩增减少为 1种试剂盒的扩增， 节约了 50%以上的试剂成本， 时间缩短 50%。 检测环节， 采用 2种或 3种试 剂盒需要分别上样检测， 采用本发明只需要一次检测， 操作时间、 检测时间 和检测试剂成本都减少 50%或更多。
釆用本发明具有很高的兼容性，使用本发明不用担心之前数据兼容性的 问题。由于这 20个基因座包含了目前国内和之前使用的主流产品的全部基因 座， 具有很好的兼容性， 不仅能够兼容 ϋ前我国 DNA数据库中已有的全部 数据， 并且对新一代产品也有很高的兼容性。 可以理解的是， 上面的描述仅是本发明的示例， 因而本发明权利要求所 保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。 任何等同的实施方 案将被认为在本发明的范围之内。 事实上， 根据前面的描述， 对本发明进行 有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的， 因而， 这种修改 和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。

Claims

权 利 要 求 书
1一种同时分析多个 STR基因座的复合扩增系统， 其特征在于： 复合扩 增 20个基因座： Amelogenin、 vWA、 D21S11、 D18S51 , D5S818、 D7S820、 D13S317、D16S539、 FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、 D3S1358, CSFIPO, Penta D, Penta E, TH01和 TPOX。
2. 根据权利要求 1所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组 合： D19S433. D5S818、 D21S11 , D18S51和 D6S1043; D3S1358. D13S317. D7S820, D16S539, CSF1PO和 PentaD; Amelogenin, vWA、 D8S1179. TPOX 和 Penta E; TH01、 D12S391 , D2S1338和 FGA。
3. 根据权利要求 1或 2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应 体系中同时扩增 20个基因座。
4. 根据权利要求 2所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两 侧的一对引物扩增， 其中每对引物中有一个引物的 5'端进行荧光素标记。
5. 根据权利要求 1-4中任一项所述的复合扩增系统，其中复合扩增多个
STR基因座是利用聚合酶链式反应进行的。
6. 根据权利要求 1-5中任一项所述的复合扩增系统，其中该系统包含引 物混合物。
7. 一种同时分析 DNA样品的方法， 其特征在于应用前述权利要求之一 所述的复合扩增系统检测 DNA。
8. 根据权利要求 7所述的方法，其中 DNA样品包括血液、血斑、精液、 精斑、 骨骼、 毛发、 唾液、 唾液斑、 汗液、 羊水。
9. 一种具有表 2 中所示的用于复合扩增体系的引物序列以及所述引物 序列的混合物。
10. 一种用于同时分析多个 STR基因座的试剂盒，所述基因座为 Amelogemn、 vWA、 D21S1 D18S5 D5S818、 D7S820、 D13S317 , D16S539, FGA、 D2S1338, D19S433 , D6S1043、 D12S39 D8S1179, D3S1358, CSFIPO, Penta D、 Penta E、 TH01和 TPOX， 其包含权利要求 9中所述的引物。
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