CN101818192A - 20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增20个基因座：Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01和TPOX。本发明还涉及同时分析DNA样品的方法和试剂盒，以及它们的用途。

Description

20个短串联重复序列的复合扩增试剂盒

技术领域：

本发明涉及生物技术领域。进一步，本发明涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座。

背景技术：

短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分部广泛，约占整个基因组的3％(International Human Genome Sequencing Consortium，2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。

目前STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地的DNA实验室得到广泛应用(《Forensic DNA Typing》secondedition，John Butler)。在案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供有力证据。随着发展，很多国家利用这一技术建立犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的DNA数据分析并录入到数据库中，便于进行比对和排查等工作。

早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因座，随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTR Identifiler试剂盒和美国Promega公司的

16试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。国内也有类似的产品，比如公安部二所的DNATyper15能够同时实现15个基因座扩增(DNATyper15基因座的研究与选择，叶健等，《刑事技术》，2007年03)。

但是，近年来随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性有了更高的要求。作为在某些遗传鉴定中，需要更多的基因座提供更多的信息量。比如亲子鉴定、失踪人口比对时，检测的基因座数量少的话，可能发生误判(STR基因座在二联体亲子鉴定中的应用分析，张文红等，《法医学杂志》，2008年第24卷第6期)，往往需要17个甚至更多个基因座联合使用才能保证准确性。目前的做法通常是选择两种厂家的复合扩增试剂盒作为补充，联合使用，达到17个STR基因座以上的效果。如果能够实现一次反应扩增18个以上基因座，不仅可以节约试剂成本，还可以提高工作效率、节省人力成本等。

另外，在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。我国的目前DNA数据库中有200万份左右，我国将在DNA数据库建设方面进一步加速，到2013年DNA数据库中的数据将超过1000万份，英国等发达国家的数据库中约有占总人口10％的数据(http://www.forensic.gov.uk，Asplen，2004)。随着我国DNA数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用越来越重要。数据比对是建立在STR复合扩增分析得到的数据基础之上，需要各个STR试剂盒在基因座位上具有兼容性(中国法庭科学DNA数据库，《中国法医学杂志》，姜先华，2006年第12卷第5期)。然而目前所采用的试剂盒大多以美国的CODIS标准规定的13个核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX)为基础，在此基础只是选择增加其他基因座，还有部分产品删除了13个核心序列中的部分基因座，各厂商试剂盒基因座信息见表1。所以，如果采用不同生产商的STR试剂盒，导入到DNA数据库中的数据是有基因座差异的。这样在比对的时候，不是所有数据都有效，只是相同基因座部分的数据可以比对，而不同的部分就无法应用。例如，Identifiler试剂盒和

16试剂盒之间相同STR基因座为13个，其他两个STR基因座由于不同所以在数据比对时没有作用。并且，这13个可比对基因座数据用于排除的时候是可靠的，但是用于认定的情况下往往是不够的。需要更多的基因座数据。所以，由于各STR试剂盒基因座不同，导致了DNA数据库部分数据资源浪费，并且有效性不够。

因此，DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增更多基因座、能提供更多信息量和具有更好兼容性的STR复合扩增体。

表1：各主流生产商试剂盒的基因座位信息

注：黑色字体表示CODIS 13个基因座位，+表示被包括的基因座，-表示不包括的基因座

发明内容：

本发明是针对上述需求，首先建立了一次检测20个STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座包含了目前国内外各个生产商所采用的全部基因座位。

所述的基因座为Amelogenin(AMEL)、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01、TPOX。

本发明的扩增体系包含引物混合物、反应缓冲液和热启动Taq DNA聚合酶等。

首先针对上述20个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Primer 3软件，每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度在90-450bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。引物序列见下表2。

表2  复合扩增体系各基因座引物序列

基因座名称	上游引物序列(5’-3’)	下游引物序列(5’-3’)
			D19S433	GCGAATAAGATTCTGTTGAAGG	CCGAATAAAAATCTTCTCTCTT
D5S818	GGTGATTTTCCTCTTTGGTATCC	GTGCTTTTTAGCCAAGTGATTCC
			D21S11	CTCAGTCTCCATAAATATGT	TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGT
D18S51	TTCTTGAGCCCAGAAGGTTA	CTACCAGCAACAACACAAATA
			D6S1043	CTCCAGAGAGATAGAAGCAATAGTGTG	CTCTCTTTCTTCTGGAGCTGAGA
D3S1358	TATGATTCCCCCACTGCAGT	ATGAAATCAACAGAGGCTTGC
			D13S317	CATGGTATCACAGAAGTCT	CCAAAAAGACAGACAGAAAGATAG
D7S820	GAGACGGGGTTTCACCATGTTG	TCATTGACAGAATTGCACC
			D16S539	CAGATGCTCGTTGTGCACA	GCCTACAGAGTGATTCCATTTTTAT
CSF1PO	CGGAGGTAAAGGTGTCTTAAAG	TCCTGTGTCAGACCCTGTT
			PentaD	GAAGGTCGAAGCTGAAGTG	AGAATTCTTTAATCTGGACACAAG
Amelogenin	CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG	ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG
			vWA	GCCCTAGTGGATGATAAGAATAATC	GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG
D8S1179	GCAACTTATATGTATTTTTGTATTTCATG	ACCAAATTGTGTTCATGAGTATAGTTTC

基因座名称	上游引物序列(5’-3’)	下游引物序列(5’-3’)
			TPOX	TTCCTCTGCTTCACTTTTCACC	AGGTCTTACTCCTGTTCCCTTC
Penta E	GAGGCCGATGCAGGTGTATT	ATACATGGAAAGAATTCTCTTATTTG
			TH01	GTGATTCCCATTGGCCTGTTC	ATTCTTCCGAGTGCAGGTCA
D12S391	AACAGGATCAATGGATGCAT	GGACTGTCATGAGATTTTTCAGC
			D2S1338	AAAGACTTCATGGTCCTGACTACAG	ATCATGAGTTATTCAGTAAGTTAAAGGA
FGA	CAAATGCCCCATAGGTTTTG	GCTTCAGGACTTCAATTCTGCT

根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组，第一组包含D19S433、D5S818、D21S11、D18S51和D6S1043，第二组包含D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO和PentaD，第三组包含Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX和Penta E，第四组包含TH01、D12S391、D2S1338和FGA。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。

将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择5-FAM(5-羧基荧光素)，6-FAM(6-羧基荧光素)或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX(六氯-6-甲基荧光素)，JOE(6-羧基-4，5-二氯-2，7-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯)或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX(羧基-X-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子。将4组20个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述20个基因座复合扩增。

本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3，25℃)，2.0mM MgCl₂，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。

反应所需的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μl)需要2U至4U的Taq DNA聚合酶。

扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI 9600、ABI2720、Bio-Rad iCycler、Bio-Rad C1000等)采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温35秒钟，70℃保温50秒钟，该步骤运行30个循环；60℃保温30分钟；4-10℃保温。

本发明中的模板DNA为人类基因组DNA。由各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法(《分子克隆实验手册》第三版，冷泉港出版社)提取的模板DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量优选在0.5ng至4ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。

在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪(如ABI 377、310DNA sequencer)或遗传分析仪(如ABI 3130、3100geneticanalyzer)识别的光信号，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。

在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标(marker，internal lane standard)、甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。

电泳后的数据可以在GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，得到STR基因分型图谱和数据。

本发明涉及

(1)一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增20个基因座：Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01和TPOX。

(2)本发明所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组合：D19S433、D5S818、D21S11、D18S51和D6S1043；D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO和PentaD；Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX和Penta E；TH01、D12S391、D2S1338和FGA。

(3)根据项1或2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应体系中同时扩增20个基因座。

(4)根据项2所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。

(5)根据项1-4中任一项所述的复合扩增系统，其中复合扩增多个STR基因座是利用聚合酶链式反应进行的。

(6)根据项1-5中任一项所述的复合扩增系统，其中该系统包含引物混合物。

(7)一种同时分析DNA样品的方法，其特征在于应用前述权利要求之一所述的复合扩增系统检测DNA。

(8)根据项7所述的方法，其中DNA样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液、羊水。

(9)一种具有表2中所示的用于复合扩增体系的引物序列。

(10)一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，所述基因座为Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01和TPOX。

本发明还提供具有选自表2中所述的引物序列，其中一个或多个，优选1-15个，优选1-10，优选1-5个核苷酸被取代、删除和/或添加而得到的经修饰的序列。

本发明还涉及表2中所示的用于复合扩增体系的引物序列混合物。

本发明还涉及上述的引物序列，试剂盒和/或复合扩增系统用于分析多个STR基因座的用途。

附图说明

图1DNA样本采用本发明扩增后的分析图谱。

图2DNA样本采用ABI公司SinoFiler试剂盒扩增后的分析图谱。

图3DNA样本采用基点认知公司Goldeneye 16A试剂盒扩增后的分析图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。

实施例1复合扩增20个基因座位并分析其基因型

血液由志愿者捐献。模板DNA由血液中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3100遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper ID v3.2软件。样品同时采用ABI公司的SinoFiler试剂盒和基点认知公司的Goldeneye 16A试剂盒检测，操作方法按照试剂盒说明书进行，结果作为对照。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。

1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press，1998)

1)取3μl加抗凝剂的血液于500μl离心管中

2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl 5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，购自天根生化科技有限公司)

3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟，

4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟

5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μl PCR反应体系取1μl作为模板

1.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增

1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μl，加入模板DNA。

2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI 9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温35秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温，直至取出样品。

1.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3100遗传分析仪进行电泳和检测

1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液

2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基因阶梯(ladder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部

3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态

4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测

5)大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果(见图1，图2，图3及表3)。

表3  三种试剂盒扩增同一样本的基因分型结果

	本发明	SinoFiler	Goldeneye16A
				Amelogenin	X，X	X，X	X，X
vWA	17，18	17，18	17，18
				D21S11	30，30	30，30	30，30
D18S51	15，19	15，19	15，19
				D5S818	11，11	11，11	11，11

	本发明	SinoFiler	Goldeneye16A
				D7S820	10，11	10，11	10，11
D13S317	11，11	11，11	11，11
				D16S539	11，12	11，12	11，12
FGA	23，24	23，24	23，24
				D2S1338	19，23	19，23	无
D19S433	14，15	14，15	无
				D6S1043	12，18	12，18	无
D12S391	18，20	18，20	无
				D8S1179	13，13	13，13	13，13
D3S1358	14，15	14，15	14，15
				CSF1PO	10，12	10，12	10，12
Penta D	12，12	无	12，12
				Penta E	12，13	无	12，13
THO1	8，9.3	无	8，9.3
				TPOX	8，8	无	8，8

发明效果：

随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，本发明通过多次的实验，首先建立了一次检测20个STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座整合了目前国内外各个生产商所采用的全部基因座位。利用这个扩增体系可以一次性检测20个基因座，Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01、TPOX。

利用该体系可以一次操作得到20个基因座信息，因此这一体系具有很高的个体识别率，相当于同时利用2-3个其他同类产品得到的信息总和，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。在扩增环节，将以前两种或者3种试剂盒扩增减少为1种试剂盒的扩增，节约了50％以上的试剂成本，时间缩短50％。检测环节，采用2种或3种试剂盒需要分别上样检测，采用本发明只需要一次检测，操作时间、检测时间和检测试剂成本都减少50％或更多。

采用本发明具有很高的兼容性，使用本发明不用担心之前数据兼容性的问题。由于这20个基因座包含了目前国内和之前使用的主流产品的全部基因座，具有很好的兼容性，不仅能够兼容目前我国DNA数据库中已有的全部数据，并且对新一代产品也有很高的兼容性。

可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。

Claims (10)

1.一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增20个基因座：Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01和TPOX。

2.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组合：D19S433、D5S818、D21S11、D18S51和D6S1043；D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO和PentaD；Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX和Penta E；TH01、D12S391、D2S1338和FGA。

3.根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应体系中同时扩增20个基因座。

4.根据权利要求2所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的复合扩增系统，其中复合扩增多个STR基因座是利用聚合酶链式反应进行的。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的复合扩增系统，其中该系统包含引物混合物。

7.一种同时分析DNA样品的方法，其特征在于应用前述权利要求之一所述的复合扩增系统检测DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其中DNA样品包括血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液、羊水。

9.一种具有表2中所示的用于复合扩增体系的引物序列以及所述引物序列的混合物。

10.一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，所述基因座为Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、Penta D、Penta E、TH01和TPOX，其包含权利要求9中所述的引物。

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