CN105368958A - 采用兼并引物复合扩增21个短串联重复序列的试剂盒 - Google Patents

Abstract

采用兼并引物复合扩增21个短串联重复序列的试剂盒，一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，在一个复合扩增反应体系中同时扩增21个基因座，分为下述四组：第一组为D19S433、TH01、D21S11、D18S51和Penta？E；第二组为D3S1358、D13S317、D7S820、D5S818、CSF1PO和Penta？D；第三组为Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、D6S1043和D1S1656；第四组为D16S539、D12S391、D2S1338、FGA；在基因座重复序列的侧翼分别设计特异性引物，使得基因座组内各个片段峰值均衡性达到40％以上，将上述四组基因座复合扩增，调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。本发明容易得到均衡稳定的复合扩增结果，是一种低成本高效率的复合扩增体系。

Description

采用兼并引物复合扩增21个短串联重复序列的试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因。本发明涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座。运用兼并引物的方法改进和提高引物序列在人类单核苷酸多态性(SNP)位点的扩增效率，有效避免由于SNP引起的座位丢失或分型错误的现象。

背景技术

短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分部广泛，约占整个基因组的3％(InternationalHumanGenomeSequencingConsortium，2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。

目前STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地的DNA实验室得到广泛应用(《ForensicDNATyping》secondedition，JohnButler)。在案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供有力证据。随着发展，很多国家利用这一技术建立犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的DNA数据分析并录入到数据库中，便于进行比对和排查等工作。

早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因座，随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTRIdentifiler试剂盒和美国Promega公司的16试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。国内也有类似的产品，比如公安部二所的DNATyper15能够同时实现15个基因座扩增(DNATyper15基因座的研究与选择，叶健等，《刑事技术》，2007年03)。

但是，近年来随着DNA作为鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和扩增时间有了更高的要求。在DNA数据库建设方面，对于试剂盒兼容性也提出了新的要求。我国的目前DNA数据库中有200万份左右，我国将在DNA数据库建设方面进一步加速，到2013年DNA数据库中的数据将超过1000万份，英国等发达国家的数据库中约有占总人口10％的数据(http://www.forensic.gov.uk,Asplen,2004)。随着我国DNA数据库建设规模将不断扩大，数据比对的作用越来越重要。数据比对是建立在STR复合扩增分析得到的数据基础之上，需要各个STR试剂盒在基因座位上具有兼容性(中国法庭科学DNA数据库，《中国法医学杂志》，姜先华，2006年第12卷第5期)。

目前所采用的试剂盒大多以美国的CODIS标准规定的13个核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX)为基础，在此基础只是选择增加其他基因座，还有部分产品删除了13个核心序列中的部分基因座。但是随着用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性的的更高需求，各厂商推出了具有更多位点且符合最新CODIS位点的试剂盒。各厂商试剂盒基因座信息见表1。所以，如果采用不同生产商的STR试剂盒，导入到DNA数据库中的数据是有基因座差异的。这样在比对的时候，不是所有数据都有效，只是相同基因座部分的数据可以比对，而不同的部分就无法应用。例如，Identifiler试剂盒和16试剂盒之间相同STR基因座为13个，其他两个STR基因座由于不同所以在数据比对时没有作用。并且，这13个可比对基因座数据用于排除的时候是可靠的，但是用于认定的情况下往往是不够的。需要更多的基因座数据。所以，由于各STR试剂盒基因座不同，导致了DNA数据库部分数据资源浪费，并且有效性不够。因此，目前不同生产厂商开发出可以同时得到更多基因座位的产品，以增加自身产品的兼容性。理论上，STR检测试剂盒包含座位数越多，对于DNA数据库建设越有利，获得的DNA身份数据有效性就越高。鉴于目前以PCR扩增和毛细电泳分离不同荧光片段为技术基础的STR身份鉴定试剂盒大多以20-24个基因座位为主(表1)，少数产品达到25-26个基因座位。另一方面，在一定大小的片段内基因座位越多，不同等位基因的排列则比较拥挤，在大量人群数据库数据收集过程中，不同的或者稀有的等位基因型出现会造成相邻等位基因的交错，引起分型错误。最后，得到的有效基因型数据会少于产品规定的基因座数目。因此，在目前应用最为广泛的试剂盒仍以20个左右基因座位为主。近年来，新兴的高通量测序技术应用于STR身份鉴定可以收集更多的基因座位信息，身份识别位点达到200个，其中包括染色体基因座位位点数目可达69个。由于目前此技术成本较高，操作复杂限制了其实际应用，身份鉴定仍以现在常用的技术为主。

随着STR检测试剂盒在实际应用中，特别是在DNA身份鉴定数据库建设中试剂盒对于样品的适应性要求不断提高，即可以直接扩增不同样品材料(比如：血滤纸片、唾液卡片、FTA卡等材料)，而不必对材料进行预处理，使用更加方便。另外，要求尽量缩短扩增的时间。传统的试剂盒扩增时间在3至4小时左右，本公司上一代Goldeneye20A试剂盒扩增时间也在2.5小时左右。如果能实现1.5小时内完成一次扩增反应，也是试剂盒性能提升的表现之一。

因此，DNA鉴定领域需要具有一个反应扩增较多的基因座、提供较多的信息、具有更好兼容性和更快扩增速度的STR复合扩增体。能够在一小时30分钟内实现一次反应扩增21个有效的基因座，满足数据库建设和其它身份鉴定需求。

表1：各主流生产商试剂盒的基因座位信息

注：黑色字体表示CODIS13个基因座位，+表示被包括的基因座，－表示不包括的基因座

人类基因组序列中除含有串状重复序列的多态性外，还存在广泛单核苷酸多态性(SNP)。有报道在人类编码区平均220-350bp出现1个SNP，而在人类全基因组中平均1000bp则出现一个SNP。SNP也具有良好的多态性和稳定的遗传性，因此继限制性片段多态性(RFLP)和短串联重复(STR)作为遗传标记后，SNP已发展成为新一代的遗传标记手段。多个STR基因座复合扩增身份鉴定试剂盒，是基于PCR扩增技术设计制备。因此，引物序列的选择不可避免会遇到SNP位点。有些SNP位点发生率比较稀少且发生比率未知，但在人类身份鉴定DNA数据库的建设过程中，样品数量很大，因此出现的可能性也增加。因此SNP需要在STR身份鉴定试剂盒的设计开发中不可忽视。引物序列设计的原则是尽量避开SNP位点，或者是尽量避免SNP位点出现在靠近引物的3’末端。因为3’末端的碱基不匹配会严重降低PCR的扩增成功率，造成位点片段信号降低甚至缺失，从而引起分型错误。通过GeneBanK的SNP数据库的查询发现在专利CN101818192A和CN103820559A公开的引物序列中SNP位点(表2和表3)。性别识别位点一引物在3’端最末一个碱基在扩增发生SNP突变的某些样品很容易扩增失败，造成这一位点缺失。因此，本发明按照上述原则进行引物设计，尽量避免在SNP位点靠近引物序列的3’末端。对于引物序列中不可避免的SNP位点采用设计兼并引物的方法，防止引物遇到SNP序列时碱基不匹配引起的扩增失败。

表2CN103820559A中引物序列中含有的SNP位点

座位名称	引物序列	SNP位点
			D13S317-f	ATTACAGAAGTCTGGGATGTG	ATTACA(G/A)AAGTCTGGGATGTG
D13S317-r	GTTGGCAGCCCAAAAAGACAGA	GTTGGCAGCCCAAAAAGA(C/T)AGA
			D16S539-f	TGGGGGTCTAAGAGCTTGTAAAAA	TGGGGGTCTAAGAGCTT(G/C)TAAAAA
Penta D-f	TCGGTGAAGGTCGAAGCTGAAGTG	TCGGTGAAGG(T/C)CGAAGCTGAAGTG
			D8S1179-f	ATTGCAACTTATATGTATTTTTGTA	ATTGCAACTTATAT(G/A)TATTTTTGTA
AMEL-r	GATCAGAGCTTAAACTGGGAAG	GATCAGAGCTTAAACTGGGAA(G/A)

表3CN101818192A中引物序列中含有的的SNP位点

座位名称	引物序列	SNP位点
			D13S317-f	CATGGTATCACAGAAGTCT	CATGGTATCACA(G/A)AAGTCT
D13S317-r	CCAAAAAGACAGACAGAAAGATAG	CCAAAAAGA(C/T)AGACAGAAAGATAG
			Penta D-f	GAAGGTCGAAGCTGAAGTG	GAAGG(T/C)CGAAGCTGAAGTG
D8S1179-f	GCAACTTATATGTATTTTTGTA	GCAACTTATAT(G/A)TATTTTTGTA
			AMEL-r	AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG	GATCAGAGCTTAAACTGGGAA(G/A)CTG

发明内容

本发明是针对上述现有技术的缺陷，建立了一次检测21个STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座包含了目前国内外各个生产商所采用的常用基因座位。

所述的基因座为Amelogenin(AMEL)、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX。

本发明的扩增体系包含引物混合物、反应缓冲液和热启动DNA耐热聚合酶等。

首先针对上述21个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Primer5软件，每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度在90-450bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。引物序列见下表4。

表4：复合扩增体系各基因座引物序列

根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组：第一组包含D19S433、TH01、D21S11、D18S51和PentaE，第二组包含D3S1358、D13S317、D7S820、D5S818、CSF1PO和PentaD，第三组包含Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、D6S1043和D1S1656，第四组包含D16S539、D12S391、D2S1338、FGA。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。

将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择5-FAM(5-羧基荧光素)，6-FAM(6-羧基荧光素)或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX(六氯-6-甲基荧光素)，JOE(6-羧基-4,5-二氯-2,7-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯)或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX(羧基-X-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子。将4组20个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述20个基因座复合扩增。

本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mMKCl，10mMTris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mMMgCl2，0.2mg/mlBSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。

反应所需的DNA聚合酶为热启动耐热DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的均可。本发明的每个扩增体系(25μl)需要2U至4U的耐热DNA聚合酶。

扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI9700、ABI9600、ABI2720、Bio-RadiCycler、Bio-RadC1000等)采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温30秒钟，该步骤运行30个循环；60℃保温30分钟；4-10℃保温。

本发明中的模板DNA为人类基因组DNA。由各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法(《分子克隆实验手册》第三版，冷泉港出版社)提取的模板DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量优选在0.5ng至4ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。

在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪(如ABI377、310DNAsequencer)或遗传分析仪(如ABI3130、3100geneticanalyzer)识别的光信号，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。

在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标(marker,internallanestandard)、甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。

电泳后的数据可以在GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，得到STR基因分型图谱和数据。

本发明是这样实现的，一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，采用避开SNP位点序列设计引物，或者利用兼并引物的方法提高产生SNP的不同样本模板的扩增效率和稳定性，进而提高分析多个STR基因座复合扩增系统的可靠性和稳定性。

在一个复合扩增反应体系中同时扩增21个基因座：Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01和TPOX；

所述的基因座分为下述四组，每组分别由不同荧光素标记：

第一组为D19S433、TH01、D21S11、D18S51和PentaE；

第二组为D3S1358、D13S317、D7S820、D5S818、CSF1PO和PentaD；

第三组为Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、D6S1043和D1S1656；

第四组为D16S539、D12S391、D2S1338、FGA；

针对上述分组在基因座重复序列的侧翼分别设计特异性引物所述，使得基因座组内各个片段峰值均衡性达到40％以上，引物分为如下组合：

引物第一组为SEQIDNO：1-10；

引物第二组为SEQIDNO：11-22；

引物第三组为SEQIDNO：23-34；

引物第四组为SEQIDNO：35-42；

将上述四组基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。

进一步地，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。

进一步地，该复合扩增系统的每个25ul扩增体系包括5ul上述引物混合物、10ul反应缓冲液和2U～4U的热启动TaqDNA聚合酶。

进一步地，采用以下程序进行：

1)制作模板DNA；

2)聚合酶链式反应(PCR)扩增，

每25ul扩增体系配成混合液，混匀后分装至PCR反应管中，将2.5ul模板DNA加入PCR反应管中；

按照下面的反应条件设置热循环仪，将PCR反应管放入热循环仪中开始扩增基因片段，95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温直至取出样品；

3)电泳、检测

取0.5ul分子量内标和10ul去离子甲酰胺，乘以样品数，配成混合液；

以每管10ul混合液加入1ul扩增产物和等位基因阶梯，离心将液体收集到离心管的底部；

样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并保持变性状态；

将样品放在基因分析仪中开始电泳检测；

电泳结束，分析实验数据得到图谱和基因分型结果。

一种复合扩增系统的对应基因座分组的SEQIDNO：1-50所示的用于复合扩增体系的引物序列或所述引物序列的混合物。

一种应用复合扩增系统的25个短串联重复序列的复合扩增试剂盒，所述基因座为Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX。该试剂盒包含SEQIDNO：1-42所示的引物。

该试剂盒包含SEQIDNO：1-42所示的引物。

本发明具有如下有益的技术效果，本发明通过国内多家公安单位试用，结果表明系统多态性高，平衡性好，灵敏度高，特异性高，分型结果准确，完全能满足实际案件检验、DNA数据库建设和亲子鉴定的需要。

附图说明

图1DNA样本采用本发明扩增后的分析图谱。

图2DNA样本采用Promega公司PP21试剂盒扩增后的分析图谱。

图3DNA样本采用基点认知公司Goldeneye20A试剂盒扩增后的分析图谱。

具体实施方式

实施例1

兼并引物21个基因座位复合扩增试剂盒检测样本基因座分型

血液由志愿者捐献。模板DNA由血液中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI3100遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapperIDv3.2软件。样品同时采用Promega公司的PP21试剂盒和基点认知公司的Goldeneye20A试剂盒检测，操作方法按照试剂盒说明书进行，结果作为对照。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。

1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《ForensicDNAProtocol》，HumanaPress，1998)

1)取3μl加抗凝剂的血液于500μl离心管中

2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/ml，购自天根生化科技有限公司)

3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟，

4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟

5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μlPCR反应体系取1μl作为模板

1.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增

1)取缓冲液、引物混合物、耐热聚合酶，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μl，加入模板DNA。

表5:25μl体系

2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温，直至取出样品。

1.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3100遗传分析仪进行电泳和检测

1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液

2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基因阶梯(ladder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部

3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态

4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测

5)大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱及分型结果(见图1、2、3及表6、表7)。

表6:本发明与两种商品试剂盒扩增同一样本的基因分型结果

	本发明	Goldeneye 20A	Promega PP21
				D21S11	29,32	29,32	29,32
FGA	19,24	19,24	19,24
				vWA	15,18	15,18	15,18
TH01	6,9	6,9	6,9
				D3S1358	16,17	16,17	16,17
D8S1179	13,15	13,15	13,15
				D18S51	13,18	13,18	13,18
D16S539	11,12	11,12	11,12
				TPOX	11,11	11,11	11,11
CSF1PO	12,12	12,12	12,12
				D13S317	8,8	8,8	8,8
D7S820	10.1,11	10.1,11	10.1,11
				D5S818	11,11	11,11	11,11
AMEL	X,Y	X,Y	X,Y
				D2S1338	17,22	17,22	17,22
D19S433	13,14	13,14	13,14
				Penta D	12,13	12,13	12,13
Penta E	12,15	12,15	12,15
				D6S1043	11,13	11,13	11,13
D12S391	18,20	18,20	18,20
				D1S1656	15,16	无	15,16

表7本发明和非兼并引物21个基因座的复合扩增试剂盒的检测结果比较

发明效果：

人类基因组序列中含有大量的SNP位点，基于STR片段多态性的身份鉴定试剂盒以PCR技术为基础。引物序列设计是试剂盒设计的关键因素之一，对于扩增的结果影响很大。引物在复性过程中，3’末端的碱基不配对使聚合酶无法识别从而不能进行延伸扩增，导致扩增失败。另外，在靠近3’末端的碱基不配对，也会对下游配对碱基的复性与不利影响，也会降低此位点片段的扩增效率，造成均衡性较差,特别是在复合座位的多重PCR扩增条件下,极易发生座位缺失。本发明首先在引物设计时尽量在保守序列处(非SNP位点)选择引物序列，对于无法避开的SNP位点，根据数据库的报道的SNP变异运用兼并引物的方法在扩增SNP样品时提高扩增效率，从而获得较稳定准确的数据结果。此外，21个STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座整合了目前国内外各个生产商所采用的常用基因座位。利用这个扩增体系可以一次性检测21个基因座，Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX。

利用该体系可以一次操作得到21个基因座信息，因此这一体系具有较高的个体识别率并且基因座位检出的成功率和基因分型的准确率提高。

采用本发明具有很高的兼容性，由于这21个基因座在多数身份鉴定试剂盒中使用，实用有效。

Claims (6)

1.一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：

在一个复合扩增反应体系中同时扩增21个基因座：Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01和TPOX；

所述的基因座分为下述四组，每组分别由不同荧光素标记：

第一组为D19S433、TH01、D21S11、D18S51和PentaE；

第二组为D3S1358、D13S317、D7S820、D5S818、CSF1PO和PentaD；

第三组为Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、D6S1043和D1S1656；

第四组为D16S539、D12S391、D2S1338、FGA；

针对上述分组在基因座重复序列的侧翼分别设计特异性引物所述，使得基因座组内各个片段峰值均衡性达到40％以上，引物分为如下组合：

引物第一组为SEQIDNO：1-10；

引物第二组为SEQIDNO：11-22；

引物第三组为SEQIDNO：23-34；

引物第四组为SEQIDNO：35-42；

将上述四组基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。

2.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。

3.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，该复合扩增系统的每个25ul扩增体系包括5ul上述引物混合物、10ul反应缓冲液和2U～4U的热启动TaqDNA聚合酶。

4.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，采用以下程序进行：

1)制作模板DNA；

2)聚合酶链式反应(PCR)扩增，

每25ul扩增体系配成混合液，混匀后分装至PCR反应管中，将2.5ul模板DNA加入PCR反应管中；

按照下面的反应条件设置热循环仪，将PCR反应管放入热循环仪中开始扩增基因片段，95℃保温5分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温40秒钟，70℃保温50秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温直至取出样品；

3)电泳、检测

取0.5ul分子量内标和10ul去离子甲酰胺，乘以样品数，配成混合液；

以每管10ul混合液加入1ul扩增产物和等位基因阶梯，离心将液体收集到离心管的底部；

样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并保持变性状态；

将样品放在基因分析仪中开始电泳检测；

电泳结束，分析实验数据得到图谱和基因分型结果。

5.一种如权利要求1所述的复合扩增系统的对应基因座分组的SEQIDNO：1-42所示的用于复合扩增体系的引物序列或所述引物序列的混合物。

6.一种应用权利要求1所述复合扩增系统的21个短串联重复序列的复合扩增试剂盒，所述基因座为Amelogenin、vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D2S1338、D19S433、D6S1043、D12S391、D8S1179、D3S1358、D1S1656、CSF1PO、PentaD、PentaE、TH01、TPOX。该试剂盒包含SEQIDNO：1-42所示的引物。