CN103789413A - 18个短串联重复序列的复合扩增试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明18个短串联重复序列的复合扩增试剂盒涉及一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增18个基因座：Amelogenin、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253和D3S1358。本发明还涉及同时分析DNA样品的方法和试剂盒，以及它们的用途。

Description

18个短串联重复序列的复合扩增试剂盒
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。进一步，本发明涉及检测人类基因组中具有多态性的遗传标记基因。本发明特别涉及用聚合酶链式反应在一个扩增体系中同时扩增多个短串联重复基因座。
背景技术：
短串联重复序列(简称STR)也称为微卫星或简单序列重复(SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的DNA串联重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。STR基因座数量大，分部广泛，约占整个基因组的3％(International Human Genome Sequencing Consortium，2001)，而且多态性高，其多态性主要源自核心序列重复次数在个体间的差异，并且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定和群体遗传学研究。
目前STR复合扩增技术为法医个体识别和亲子鉴定的主要技术手段，在世界各地的DNA实验室得到广泛应用(《Forensic DNA Typing》second edition，John Butler)。在案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供有力证据。随着发展，很多国家利用这一技术建立犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，也就是对在押犯人和犯罪嫌疑人的DNA数据分析并录入到数据库中，便于进行比对和排查等工作。
亲权鉴定是荧光STR分型试剂盒在司法系统的重要应用方向之一，目前国内外市场上主流荧光STR分型试剂盒均以13个CODIS基因座位点为核心，并在此基础上添加数个基因座使基因座总数达到15-23个。试剂盒之间为了避免彼此不兼容而所选添加基因座基本相同，这就导致了即使选用不同厂家的试剂盒，也只能获得至多23个基因座的信息。而23个基因座信息还不足以处理在亲权鉴定上经常出现的一些问题。
国际上亲权鉴定的判断尚未见有统一标准。为了使我国从事亲权关系鉴定的实验室有一个比较科学又便于实际操作的处理策略和标准，我国法医物证学界权威专家们参照ISFG(国际法庭遗传学会)英语工作组的推荐意见，结合我国具体国情，制订出使用STR分型技术作亲权鉴定时采用的一套鉴定策略和判断标准。
在进行三联体鉴定中，标准规定：(1)亲权鉴定分析技术体系的系统效能达到累计非父排除率(cumulative probability of exclusion，CPE)＞0.9999；(2)STR分型结果符合下述条件者，可以描述为肯定(或支持)亲生关系：①起码检测15个STR基因座(单个基因座的PE值≥0.5714，下同)，争议父与孩子之间没有发现不符合孟德尔遗传规律的基因座(以下简称矛盾基因座)；或检测19个STR基因座，只发现1个矛盾基因座；或检测28个STR基因座，只发现2个矛盾基因座；或检测35个STR基因座，只发现3个矛盾基因座；②累计PI值≥10000(亲权概率W≥0.9999，假定前概率＝0.5)。(3)STR分型结果符合下述条件者，可做出否定亲生关系的结论：出现4个或更多矛盾STR基因座；累计PI值＜1/1000。
在单亲案的鉴定中，标准规定：(1)亲权鉴定分析技术体系的系统效能达到累计非父排除率(CPEm)＞0.9999。(2)STR分型结果符合下述条件者，可以做出不排除(或支持)亲生关系的结论：①最少检测18个STR基因座(单个基因座的PEm值≥0.411，下同)，无矛盾基因座出现；或检测29个STR基因座，只出现1个矛盾基因座；或检测41个STR基因座，只出现2个矛盾基因座；②累计PI值≥10000(亲权概率W≥0.9999，假定前概率＝0.5)。(3)STR分型结果符合下述条件者，可以做出否定亲生关系的结论：①出现3个或更多矛盾STR基因座；②累计PI值＜1/1000。
鉴于此种情况，在亲权鉴定领域需要一款不同于市场主流CODIS位点的试剂盒。当与主流试剂盒配合使用时可以极大的提高基因座检测数量，进一步提高个体识别率，用以满足多数出现等位基因突变情况下的检测要求。
表1：各主流生产商试剂盒的基因座位信息
Figure BSA0000099890590000021
Figure BSA0000099890590000031
注：黑色字体表示CODIS13个基因座位，+表示被包括的基因座，-表示不包括的基因座
发明内容：
本发明是针对上述需求，首先建立了一次检测16个非CODIS和1个用于样本同一认定CODIS STR基因座以及Amelogenin位点的复合扩增体系，这些STR基因座可以成为目前国内外各个生产商所采用的全部基因座的有力补充。
所述的基因座为Amelogenin(AMEL)、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253、D3S1358。
本发明的扩增体系包含引物混合物、反应缓冲液和热启动Taq DNA聚合酶等。
首先针对上述18个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用Primer5软件，每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体、其它相互作用或交叉反应，扩增产物长度在90-450bp之间。对每对引物进行扩增测试并优化，直至得到清晰单一扩增条带。引物序列见表2。
表2复合扩增体系各基因座引物序列
Figure BSA0000099890590000041
Figure BSA0000099890590000051
根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组，第一组包含D6S477、GATA198B05、D15S659、和D8S1332，第二组包含Amelogenin、D3S1358、D3S3045D17S1290和D14S608，第三组包含D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435和D11S2368，第四组包含D1S1656、D7S3048、D10S1248和D19S253。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，两个基因座不能有重叠。分别对每组引物进行复合扩增试验。确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，调整每对引物的浓度，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色标记可选择5-FAM(5-羧基荧光素)，6-FAM(6-羧基荧光素)或相近光谱的荧光素分子，绿色标记可选择HEX(六氯-6-甲基荧光素)，JOE(6-羧基-4,5-二氯-2,7-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯)或相近光谱的荧光素分子，黄色标记可选择TMR(4-甲基-6-羧基-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子，红色标记可选择ROX(羧基-X-罗丹明)或相近光谱的荧光素分子。将4组18个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述18个基因座复合扩增。
本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH8.3，25℃)，2.0mM MgCl2，0.1mg/mlBSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTP。dNTP是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
反应所需的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μl)需要2U至4U的Taq DNA聚合酶。
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI9700、ABI9600、ABI2720、Bio-RadiCyeler、Bio-Rad C1000等)采用以下的程序可以得到较好的结果：95℃保温11分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温60秒钟，70℃保温60秒钟，该步骤运行30个循环；60℃保温30分钟；4-10℃保温。
本发明中的模板DNA为人类基因组DNA。由各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法(《分子克隆实验手册》第三版，冷泉港出版社)提取的模板DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量优选在0.5ng至4ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。
在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过测序仪(如ABI377、310DNA sequencer)或遗传分析仪(如ABI3130、3100genetic analyzer)识别的光信号，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标(marker，internal lane standard)、甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。
电泳后的数据可以在GeneMapper、GeneMarker、GeneScan等数据分析软件上分析，得到STR基因分型图谱和数据。
本发明涉及
(1)一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增18个基因座：Amelogenin、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253和D3S1358。
(2)根据项1所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组合：第一组为D6S477、GATA198B05、D15S659、和D8S1332；第二组为Amelogenin、D3S1358、D3S3045、D17S1290和D14S608；第三组为D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435和D11S2368；第四组为D1S1656、D7S3048、D10S1248和D19S253，其中，扩增的引物第一组为SEQ ID NO：5-12；第二组为SEQ ID NO：1-4、13-18；第三组为SEQ ID NO：19-28；第四组为SEQ ID NO：29-36。
(3)根据项1或2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应体系中同时扩增18个基因座。
(4)根据上述任一项所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5，端进行荧光素标记。
(5)根据上述任一项所述的复合扩增系统，其中复合扩增多个STR基因座是利用聚合酶链式反应进行的。
(6)根据上述任一项述的复合扩增系统，其中该系统包含引物混合物。
(7)一种同时分析DNA样品的方法，其特征在于应用上述任一项所述的复合扩增系统检测DNA。
(8)根据项7所述的方法，其中DNA样品来自血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和羊水中的一种或多种。
(9)SEQ ID NO：1-36所示的用于复合扩增体系的引物序列或者所述引物序列的混合物。
(10)一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，为18个短串联重复序列的复合扩增试剂盒，所述基因座为Amelogenin、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253和D3S1358，该试剂盒包含SEQ ID NO：1-36所示的引物。
本发明还提供具有选自表2中所述的引物序列，其中一个或多个，优选1-15个，优选1-10，优选1-5个核苷酸被取代、删除和/或添加而得到的经修饰的序列。
本发明还涉及上述的引物序列，试剂盒和/或复合扩增系统用于分析多个STR基因座的用途。
利用本发明可以一次操作得到18个基因座信息，因此这一体系具有很高的个体识别率，相当于同时利用2-3个其他同类产品得到的信息总和，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。
附图说明
图1DNA样本采用本发明扩增后的分析图谱。
图2DNA样本采用基点认知公司Goldeneye20A试剂盒扩增后的分析图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明。下面的实施例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例1复合扩增18个基因座位并分析其基因型
测试血液由志愿者捐献，模板DNA由血液用chelex-100方法提取。以行业内通用的9947AgDNA作为阳性标准品。扩增反应在ABI9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI3100遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper ID v3.2软件。样品同时采用基点认知公司的Goldeneye20A试剂盒检测，操作方法按照试剂盒说明书进行，结果作为对照。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。
1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press，1998)
1)取3μl加抗凝剂的血液于500μl离心管中
2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加195μl5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)，再加入5μl蛋白酶K(20mg/nl，购自天根生化科技有限公司)
3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟，
4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟
5)小心吸出约150μl上清，转移至新管中，10μlPCR反应体系取1μl作为模板
1.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照下表配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μl，加入模板DNA。
Figure BSA0000099890590000091
2)按照下面的反应条件设置热循环仪增仪(ABI9700PCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。95℃保温11分钟；94℃保温30秒钟，60℃保温60秒钟，70℃保温60秒钟，运行30个循环；60℃保温30分钟；4℃持续保温，直至取出样品。
1.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI3130遗传分析仪进行电泳和检测
1)取(0.5μl分子量内标+10μl去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液
2)混匀后分装，每管10μl，再分别加入1μl扩增产物和等位基因阶梯(laadder)，简短离心将液体收集到离心管管子底部
3)样品95℃变性4分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态
4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测
5)大约40分钟后，电泳结束，用GeneMapper软件分析实验数据得到图谱和分型结果(见图1，图2及表3)。
表3三种试剂盒扩增同一样本的基因分型结果
本发明 Goldeneye20A
Amelogenin X，X X，X
D3S1358 14，15 14，15
D19S433 - 14，15
D5S818 - 11
D21S11 - 30
D18S51 - 15，19
D6S1043 - 12，18
D13S317 - 11
D7S820 - 10，11
D16S539 - 11，12
CSF1PO - 10，12
Penta D - 12
vWA - 17，18
D8S1179 - 13
TPOX - 8
PentaE - 12，13
TH01 - 8，9.3
D12S391 - 18，20
D6S477 10.2，13 -
GATA198B05 18，19 -
D15S659 14，16 -
D8S1332 19，21 -
D3S3045 9，9 -
D17S1290 1718 -
D14S608 7，11 -
D2S441 10，14 -
D18S535 13，14 -
D13S325 20，21 -
D10S1435 10，11 -
D11S2368 19，21 -
D1S1656 18.3，18.3 -
D7S3048 24,24 -
D10S1248 13，15 -
D19S253 7,8 -
发明效果：
随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，本发明通过多次的实验，首先建立了一次检测包括16个非CODIS STR基因座的复合扩增体系，这些STR基因座整合了目前国内外各个生产商所采用的杂合度高、个体识别率高的基因座位。利用这个扩增体系可以一次性检测18个基因座，Amelogenin、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253和D3S1358。
利用该体系可以一次操作得到18个基因座信息，因此这一体系具有很高的个体识别率，相当于同时利用2-3个其他同类产品得到的信息总和，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。在扩增环节，将以前2种或者3种试剂盒扩增减少为1种试剂盒的扩增，节约了50％以上的试剂成本，时间缩短50％。检测环节，采用2种或3种试剂盒需要分别上样检测，采用本发明只需要一次检测，操作时间、检测时间和检测试剂成本都减少50％或更多。
本发明与其它主流CODIS位点试剂盒同时使用可得到除AMEL外至少29个基因座信息，配合我公司Golden eye20A试剂盒使用更是能得到35个基因座信息，极大的补充了主流CODIS位点在侵权鉴定领域的不足。
可以理解的是，上面的描述仅是本发明的示例，因而本发明权利要求所保护的范围并不仅仅以此处公开的特定实施方案来限定。任何等同的实施方案将被认为在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，对本发明进行有关的修改和变化对于本领域技术人员来讲都将是可能的，因而，这种修改和变化也将落在本发明所附的权利要求的范围之内。
Figure ISA0000099890610000011
Figure ISA0000099890610000021
Figure ISA0000099890610000031
Figure ISA0000099890610000041
Figure ISA0000099890610000051
Figure ISA0000099890610000071
Figure ISA0000099890610000081
Figure ISA0000099890610000091

Claims (10)

1.一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于：复合扩增18个基因座：Amelogenin、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253和D3S1358。
2.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其中所述的基因座分为下述组合：第一组为D6S477、GATA198B05、D15S659、和D8S1332；第二组为Amelogenin、D3S1358、D3S3045、D17S1290和D14S608；第三组为D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435和D11S2368；第四组为D1S1656、D7S3048、D10S1248和D19S253，其中，扩增的引物第一组为SEQ IDNO：5-12；第二组为SEQ ID NO：1-4、13-18；第三组为SEQ ID NO：19-28；第四组为SEQ IDNO：29-36。
3.根据权利要求2所述的复合扩增系统，其中在一个复合扩增反应体系中同时扩增18个基因座。
4.根据权利要求2所述的复合扩增系统，其中基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。
5.根据权利要求1所述的复合扩增系统，其中复合扩增多个STR基因座是利用聚合酶链式反应进行的。
6.根据权利要求2所述的复合扩增系统，其中该系统包含引物混合物。
7.一种同时分析DNA样品的方法，其特征在于应用权利要求1-6之一所述的复合扩增系统检测DNA。
8.根据权利要求7所述的方法，其中DNA样品来自血液、血斑、精液、精斑、骨骼、毛发、唾液、唾液斑、汗液和羊水中的一种或多种。
9.SEQ ID NO：1-36所示的用于复合扩增体系的引物序列或者所述引物序列的混合物。
10.一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，为18个短串联重复序列的复合扩增试剂盒，所述基因座为Amelogenin、D6S477、GATA198B05、D15S659、D8S1332、D3S3045、D17S1290、D14S608、D2S441、D18S535、D13S325、D10S1435、D11S2368、D1S1656、D7S3048、D10S1248、D19S253和D3S1358，该试剂盒包含SEQ ID NO：1-36所示的引物。
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