CN106011229A - 用于人的18个str位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于人的18个STR位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途，同时扩增18个基因座：Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y‑GATA‑H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898，可以一次得到18个基因座信息，具有很高的个体识别率和非父排除率，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。特别是，本发明的复合扩增系统相比现有系统更加适合中华民族遗传多态性的位点分析，可以作为中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准。

Description

用于人的18个STR位点的复合扩增系统、试剂盒及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人类基因组中具有多态性的遗传标记基因的检测技术，特别涉及用聚合酶链式反应在一个复合扩增系统中同时扩增18个基因座的系统、检测试剂盒及其用途。
背景技术
短串联重复序列(Short Tandom Repeat，STR)，也称为微卫星，或简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，是一类广泛存在于人类基因组中的DNA重复序列，核心序列为2-6个碱基重复单位。因其在人类基因组中分布广泛、具有高度的遗传多态性、检测方法简单而被广泛应用于个体识别、亲权鉴定和群体遗传学研究。
目前，STR复合扩增技术已成为法医个体识别和亲权鉴定的主要技术手段，在世界各地的DNA实验室得到广泛应用。同时也在案件分析中得到广泛应用，为案件侦破提供了有力证据。随着STR复合扩增技术的快速发展，很多国家利用这一技术建立了犯罪分子及嫌疑人的DNA数据库，便于进行比对和排查等工作。
早期的STR复合扩增技术能够实现在一个反应体系中扩增10个左右的STR基因座，随着应用的广泛和数据比对的增加，10个基因座提供的信息不能满足要求，国内外的厂家开发出新的更多基因座的产品，比如美国ABI公司的AmpFlSTR Identifiler试剂盒和美国Promega公司的16位点试剂盒都是15个STR基因座加性别决定基因。
近年来，随着DNA鉴定手段的应用越来越广，用户对试剂盒的基因座数量、信息含量和兼容性有了更高的要求。作为在某些遗传鉴定中，需要更多的基因座提供更多的信息量。比如亲权鉴定、失踪人口比对时，检测的基因座数量过少可能导致误判。为了达到这一目的，目前的做法通常是选择两种厂家的复合扩增试剂盒作为补充，联合使用，达到17个STR基因座以上的效果。如果能够实现一次反应扩增18个以上基因座，不仅可以节约试剂成本，还可以提高工作效率、节省人力成本等。
目前国外比较流行的个体识别和亲权鉴定试剂盒主要有AB公司的IdentifilerTM、SinofilerTM、GlobalFilerTM和Promega公司的PowerPlex 16和PowerPlex 21；国内有基点认知公司的Goldeneye 20A，阅微基因的MicroReaderTM 21D，中德美联公司的AGCU Expressmarker 22，宁波海尔施基因科技有限公司的STRtyper-21G等。这些试剂盒均采用4色/5色荧光标记复合扩增体系。
然而目前所采用的试剂盒大多以美国的CODIS标准规定的13个核心基因座(vWA、D21S11、D18S51、D5S818、D7S820、D13S317、D16S539、FGA、D8S1179、D3S1358、CSF1PO、THO1、TPOX)为基础，在此基础增加其他基因座。而在13个CODIS基因座中，TPOX和TH01两个位点在中华民族群体中的遗传多态性很低，其中，TPOX在中华民族中主要以8，9和11三个等位基因为主，其多态性远低于南非人群，TH01则在中华民族中主要以6,7和9三个等位基因为主，并且TPOX和TH01两个位点的个体识别率(DP)、排除率(EP)、杂合度(He)以及多态信息量(PIC)等法医学参数也低于其他位点。D18S51、CSF1PO、D8S1179、VWA和FGA5个位点易出错，易出现丢失峰的情况，这些位点的突变率高于其他基因座。其中，FGA的突变率为0.25％。并不适合用于中华民族群体的鉴定。
因此，选取一套适合中华民族遗传多态性的位点，建立中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准，显得尤为重要。
发明内容
本发明提供一种检测18个STR基因座的复合扩增系统，包含15个常染色STR、一个X-STR、一个Y-STR和一个性别鉴定位点Amel；本发明还提供相关引物、试剂盒及其用途。
根据本发明的第一方面，本发明提供一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，该复合扩增系统同时扩增如下18个基因座：Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898。
作为本发明的进一步改进的方案，上述基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。
作为本发明的进一步改进的方案，上述复合扩增系统包括如下18对引物：
用于扩增Amel的上游引物如SEQ ID NO：1所示；
用于扩增Amel的下游引物如SEQ ID NO：2所示；
用于扩增D5S818的上游引物如SEQ ID NO：3所示；
用于扩增D5S818的下游引物如SEQ ID NO：4所示；
用于扩增D21S11的上游引物如SEQ ID NO：5所示；
用于扩增D21S11的下游引物如SEQ ID NO：6所示；
用于扩增D18S1364的上游引物如SEQ ID NO：7所示；
用于扩增D18S1364的下游引物如SEQ ID NO：8所示；
用于扩增D6S1043的上游引物如SEQ ID NO：9所示；
用于扩增D6S1043的下游引物如SEQ ID NO：10所示；
用于扩增D3S1358的上游引物如SEQ ID NO：11所示；
用于扩增D3S1358的下游引物如SEQ ID NO：12所示；
用于扩增D13S317的上游引物如SEQ ID NO：13所示；
用于扩增D13S317的下游引物如SEQ ID NO：14所示；
用于扩增D7S820的上游引物如SEQ ID NO：15所示；
用于扩增D7S820的下游引物如SEQ ID NO：16所示；
用于扩增D16S539的上游引物如SEQ ID NO：17所示；
用于扩增D16S539的下游引物如SEQ ID NO：18所示；
用于扩增PentaD的上游引物如SEQ ID NO：19所示；
用于扩增PentaD的下游引物如SEQ ID NO：20所示；
用于扩增D19S433的上游引物如SEQ ID NO：21所示；
用于扩增D19S433的下游引物如SEQ ID NO：22所示；
用于扩增D22S1045的上游引物如SEQ ID NO：23所示；
用于扩增D22S1045的下游引物如SEQ ID NO：24所示；
用于扩增Y-GATA-H4的上游引物如SEQ ID NO：25所示；
用于扩增Y-GATA-H4的下游引物如SEQ ID NO：26所示；
用于扩增PentaE的上游引物如SEQ ID NO：27所示；
用于扩增PentaE的下游引物如SEQ ID NO：28所示；
用于扩增D2S441的上游引物如SEQ ID NO：29所示；
用于扩增D2S441的下游引物如SEQ ID NO：30所示；
用于扩增D12S391的上游引物如SEQ ID NO：31所示；
用于扩增D12S391的下游引物如SEQ ID NO：32所示；
用于扩增D2S1338的上游引物如SEQ ID NO：33所示；
用于扩增D2S1338的下游引物如SEQ ID NO：34所示；
用于扩增DXS9898的上游引物如SEQ ID NO：35所示；
用于扩增DXS9898的下游引物如SEQ ID NO：36所示。
作为本发明的进一步改进的方案，上述基因座分为下述四种组合：第一组包含Amel、D5S818、D21S11、D18S1364和D6S1043；第二组包含D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和PentaD；第三组包含D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4和PentaE；第四组包含D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898；上述四种组合的引物分别由四种不同的荧光素标记。
作为本发明的进一步改进的方案，上述四种不同的荧光素分别是蓝色、绿色、黄色和红色荧光素，上述蓝色荧光素是6’-FAM(6’-羧基荧光素)，上述绿色荧光素是HEX(六氯-6-甲基荧光素)，上述黄色荧光素是TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)，上述红色荧光素是ROX(羧基-X-罗丹明)。
作为本发明的进一步改进的方案，在一个复合扩增反应体系中同时扩增上述18个基因座；上述复合扩增反应体系中，用于扩增如下18个基因座Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898的引物的终浓度依次分别是：0.05μM，0.08μM，0.18μM，0.13μM，0.25μM，0.07μM，0.09μM，0.18μM，0.08μM，0.35μM，0.08μM，0.15μM，0.21μM，0.88μM，0.25μM，0.20μM，0.40μM，0.20μM。
根据本发明的第二方面，本发明提供一种同时分析DNA样品中多个STR基因座的方法，该方法应用第一方面的复合扩增系统检测DNA。
根据本发明的第三方面，本发明提供一组用于第一方面的复合扩增系统的引物，包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36所示的18对引物。
根据本发明的第四方面，本发明提供一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，上述基因座为Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898，上述试剂盒包含第三方面的引物。
根据本发明的第五方面，本发明提供第一方面的复合扩增系统、第三方面的引物或第四方面的试剂盒在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途。也就是说，本发明提供第一方面的复合扩增系统在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途；还提供第三方面的引物在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途；又提供第四方面的试剂盒在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途。
随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，本发明通过多次实验，建立了一次检测18个基因座的复合扩增系统，这些STR基因座包含了CODIS系统中D5S818、D21S11、D3S1358、D13S317、D7S820和D16S539共6个在中华民族中多态性和稳定性较好的位点，以及PentaD、Penta E、D2S1338、D12S391和D19S433共5个欧洲标准位点，并新增了D18S1364、D2S441和D22S1045共3个中华民族多态性高的非CODIS位点以及性染色体STR基因座DXS9898和Y-GATA-H4辅助性别鉴定。利用本发明的复合扩增系统可以一次性检测18个基因座，得到18个基因座信息，因此这一系统具有很高的个体识别率和非父排除率，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。特别是，本发明的复合扩增系统相比现有系统更加适合中华民族遗传多态性的位点分析，可以作为中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准。
附图说明
图1为本发明的18个STR基因座在人类基因组中的定位示意图；
图2为本发明中D19S433、D6S1043和PentaE共3个STR基因座的引物筛选电泳胶图；
图3、图4和图5是本发明一个实施例中复合扩增体系建立和优化过程中的一些分型结果图；其中，图3中D19S433、D12S391扩增出现多个杂峰；图3和图4中由于引物比例不当(引物比例见表7)，导致多个位点未检出；图5中D18S1364明显优势扩增，D2S441则扩增十分微弱；
图6、图7和图8是本发明一个实施例中用GeneMapperIDx软件分析实验数据得到的图谱和分型结果，其中图6是一男性样本的分型结果；图7是一女性样本的分型结果；图8是等位基因阶梯分型结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明建立了一种检测18个STR基因座的复合扩增系统，包含15个常染色STR、一个X-STR、一个Y-STR和一个性别鉴定位点Amel。本发明的18个STR基因座具体为Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898。这18个基因座在基因组中的定位如图1所示。
本发明的复合扩增系统具体可以是复合扩增体系，这样的复合扩增体系可以包含引物混合物、反应缓冲液和热启动Taq DNA聚合酶等。
首先针对上述18个基因座在其重复序列的侧翼分别设计特异性引物。引物设计采用PrimerPrimier5和Oligo7软件，每条引物退火温度接近或高于60℃。不能产生引物二聚体或者错配引起的其它非特异性产物，扩增产物长度在90-450bp之间。并用Blast对每对引物进行比对，保证序列的特异性。对每对引物进行PCR扩增测试，琼脂糖凝胶电泳检测并反复优化，直至得到清晰单一扩增条带(具体见实施例1)。本发明得到了一组优化的引物序列，见下表1。
表1复合扩增各基因座的引物序列
根据扩增片段长度等将上述基因座分为4组，第一组包含Amel、D5S818、D21S11、D18S1364和D6S1043，第二组包含D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和PentaD，第三组包含D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4和PentaE，第四组包含D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898。每组分别由不同荧光素标记，每组之中各基因座扩增产物根据长度差异分开，相邻两个基因座不能有重叠。其中每个位点的扩增长度范围如表2所示。分别对每组引物进行复合扩增试验，确定该组没有非特异扩增现象，无交叉反应等情况后，反复调整每对引物的浓度(PCR终浓度见表1)，使组内各个片段峰值均衡性达到40％以上。
表2各基因座的扩增片段范围
基因座 最小扩增片段(bp) 最大扩增片段(bp)
AMEL 100 115
D5S818 130 185
D21S11 200 250
D18S1364 257 320
D6S1043 370 442
D3S1358 115 165
D13S317 170 210
D7S820 211 255
D16S539 260 320
Penta D 360 442
D19S433 110 160
D22S1045 165 211
Y-GATA-H4 212 245
Penta E 315 442
D2S441 100 144
D12S391 146 208
D2S1338 213 280
DXS9898 310 350
将4组引物分别用蓝色、绿色、黄色和红色荧光素标记。每对引物中只标记一条链，标记在引物的5’端。蓝色用6’-FAM(6’-羧基荧光素)标记，绿色用HEX(六氯-6-甲基荧光素)标记，黄色用TAMRA(4-甲基-6-羧基-罗丹明)标记，红色用ROX(羧基-X-罗丹明)标记。将4组18个基因座复合扩增，根据产物峰高情况调整各基因座引物浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％以上。得到的引物混合物可以用于上述18个基因座复合扩增。
本发明的PCR扩增反应可在一定的缓冲体系中进行。缓冲体系中包括：50mM KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3，25℃)，2.0mM MgCl2，0.1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)和各0.2mM的dNTPMix。dNTPMix是四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)等摩尔混合物。
反应所需的Taq DNA聚合酶为热启动DNA聚合酶，抗体封闭修饰或化学修饰的都可以。本发明的每个扩增体系(25μL)需要1U至2U的Taq DNA聚合酶。
扩增体系在各种反应热循环仪上(如ABI 9700、ABI Veriti、Bio-Rad myCycler等)采用表3的温度循环条件可以得到较好的结果。
表3复合扩增体系温度循环条件
本发明中的模板DNA为人类基因组DNA。由各种常规方法，比如磁珠法、酚氯仿法、树脂纯化等方法提取的模板DNA均可以得到较好的结果。DNA可以由以下组织或细胞制备：血液(血斑)、精液(精斑)、骨骼、毛发、唾液(唾液斑)、汗液、含有胎儿细胞的羊水等。DNA模板量优选在0.05ng至5ng的范围内能够得到较好的扩增结果，模板量太低可能导致某些基因座位检测不出，模板量太高会导致非特异性的扩增产物产生。
在上述反应缓冲体系中按照指定的反应程序扩增模板DNA，可以得到各基因座混合的扩增产物。本发明由于采用了荧光标记的引物，扩增产物也带有荧光标记物，并且标记物可以在激光激发下发出可以通过遗传分析仪(如ABI3130、3100、3500等)识别的光信号，所以扩增产物可以通过测序仪或遗传分析仪等仪器上进行电泳和检测分析。
在测序仪或遗传分析仪上进行检测的时候，扩增产物与分子量内标、去离子甲酰胺按照一定比例混合，进入仪器毛细管或凝胶中电泳分离。分子量内标是由多条已知长度的荧光标记DNA片段组成，用来计算PCR扩增产物片段长度，从而可以判断基因分型以及与等位基因阶梯比对。
电泳后的数据可以在GeneMapperIDx、GeneMarker等数据分析软件上分析，得到STR基因分型图谱和数据。
下面通过具体案例的方式进一步说明本发明。下面的案例仅仅是为了说明的目的，而并非限制本发明的范围。
实施例1引物的初筛
本发明所用的引物在上海invitrogen公司合成，引物初筛采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳的方法进行。所用Taq酶为热启动Taq酶，血液由志愿者贡献，DNA采用chelex-100法提取。反应体系如表4所示，温度循环条件如表5所示。所有引物采用primer primier5和oligo7软件进行设计，每个位点设计2-8对引物备选。
1.1.chelex-100方法提取DNA(具体方法参考《Forensic DNA Protocol》，Humana Press，1998)。
1)取3μL加抗凝剂的血液于1.5ml离心管中；
2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μL 5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)；
3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟；
5)小心吸出约150μL上清，转移至新的1.5ml离心管中。
1.2聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、模板DNA、Taq酶、无核酸水按照表4配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管20μL，加入个位点的引物。
表4引物筛选反应体系
组分 体积(μL)
10×Buffer 2
热启动Taq酶 0.1(0.5U)
MgCl2 1.6
dNTPmix 1.6
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
DNA 1(约10ng)
无核酸水 补充至20μL
2)按照表5的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪)，将PCR反应管放入仪器中进行PCR扩增。
表5引物筛选PCR温度循环条件
1.3琼脂糖凝胶电泳
1)配制3％的琼脂糖凝胶电泳；
2)PCR产物按照1:5加入4μL6×上样染料(loadingDye)，上样10μL，DNAMarker采用50bp ladder，上样5μL；
3)设定电压120V，电泳40min；
4)EB染色5min，凝胶成像仪拍摄电泳胶图。
其中，D19S433、D6S1043和PentaE基因座的电泳胶图如图2所示。在筛选过程中，尤其是D19S433，前后共设计8对引物，才筛选到了条带单一清晰的引物。
实施例2复合扩增体系的建立
血液由志愿者贡献，DNA采用chelex-100法提取。荧光标记引物在上海invitrogen公司合成。引物混合物按照一定比例混合并根据毛细管电泳结果不断调整比例，至各位点扩增均一稳定。
2.1.chelex-100方法提取DNA
1)取3μL加抗凝剂的血液于1.5ml离心管中；
2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μL 5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)；
3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟；
5)小心吸出约150μL上清，转移至新的1.5ml离心管中。
2.2.引物混合物配置
1)将引物干粉中加入定量灭菌超纯水，配成50μM母液；
2)将18个位点的36条引物按比例混合，同一位点的引物等量加入，引物比例和浓度通过毛细管电泳检测结果不断调整。
2.3聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表6配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入模板DNA。
表6复合扩增反应体系
组分 体积(μL)
引物混合物(5×PrimerSets) 5
缓冲液(2.5×PCRMasterMix) 10
热启动Taq酶 0.4(2U)
DNA 0.2ng-5ng
无核酸水 补充至25μL
2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪)，将PCR反应管放入仪器中进行PCR扩增。
2.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测
1)取(0.25μL分子量内标(LIZ-500)+9.25μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液；
2)混匀后分装至96孔板，每管9.5μL，再分别加入0.5μL扩增产物，简短离心将液体收集到管子底部；
3)样品95℃变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态(这一步变性可选，甲酰胺本身可以使DNA变性)；
4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测，电压15kV，炉温60℃；
5)大约37分钟后，电泳结束，用GeneMapperIDx软件分析实验数据，观察各位点的扩增情况，观察是否有杂峰，更换个别位点的引物，不断调整引物比例，建立均一稳定的复合扩增体系。
其中，图3、图4和图5是在复合扩增体系建立和优化过程中的一些分型结果。图3中D19S433、D12S391扩增出现多个杂峰，图3和图4中由于引物比例不当(引物比例见表7)，导致多个位点未检出。图5中D18S1364明显优势扩增，D2S441则扩增十分微弱。
在实施过程中，为解决上述问题，修改了D19S433和D12S391的引物，修改前后的序列见表8。
表7实施例2对应的引物比例及浓度
表8部分位点替换前后的引物序列
实施例3复合扩增两个样本(男性1例，女性1例)18个基因座并分析其基因型
血液由志愿者捐献。模板DNA由血液中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI VeritiPCR仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapper ID x软件。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因ladder均为本领域技术人员常用的常规材料。
3.1.chelex-100方法提取DNA
1)取3μL加抗凝剂的血液于1.5ml离心管中；
2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μL 5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)；
3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟；
5)小心吸出约150μL上清，转移至新的1.5ml离心管中。
3.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表6配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入模板DNA。反应体系中，各引物的终浓度如表1所示。
2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪)，将PCR反应管放入仪器中进行PCR扩增。
3.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测
1)取(0.25μL分子量内标(LIZ-500)+9.25μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液；
2)混匀后分装至96孔板，每管9.5μL，再分别加入0.5μL扩增产物和等位基因ladder标准物，简短离心将液体收集到管子底部；
3)样品95℃变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态；
4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间10秒钟)，开始电泳检测，电压15kV，炉温60℃；
5)大约37分钟后，电泳结束，用GeneMapperIDx软件分析实验数据得到图谱和分型结果，如图6、图7和图8及表9所示。
表9实施例3的检测结果
检测基因座 样本1基因型 样本2基因型
Amel X,Y X
D5S818 12 7,11
D21S11 29 29,32.2
D18S1364 14,16 14,16
D6S1043 11,12 11,13
D3S1358 15,17 15
D13S317 10,14 8
D7S820 11,12 10,11
D16S539 11,12 9,13
Penta D 11,13 10,14
D19S433 14 13,16.2
D22S1045 11,15 16
Y-GATA-H4 13 -
Penta E 15,21 15
D2S441 11,12 10,12
D12S391 18,20 19,22
D2S1338 19 22,23
DXS9898 12 12,13
实施例4复合扩增两个样本(父亲和女儿，已由基点认知Goldeneye 20A证明是亲生父女关系)18个基因座并分析其基因型
血液由志愿者捐献。模板DNA由血液中用chelex-100方法提取。扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行，电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行，数据分析采用GeneMapperIDx软件。本发明所用的试剂和材料诸如等位基因ladder均为本领域技术人员常用的常规材料。
4.1.chelex-100方法提取DNA
1)取3μL加抗凝剂的血液于1.5ml离心管中；
2)振荡混匀chelex溶液，使chelex充分悬浮，每管加200μL 5％的chelex-100(100-200mesh，购自Bio-Rad公司)；
3)振荡样品，恒温金属浴上56℃温浴2小时后，取出样品振荡2分钟；
4)煮沸8-10分钟，13000rpm离心3分钟；
5)小心吸出约150μL上清，转移至新管中，10μL PCR反应体系取1μL作为模板。
4.2.聚合酶链式反应(PCR)扩增
1)取缓冲液、引物混合物、Taq酶，按照表6配成混合液，振荡混匀后分装至PCR反应管中，每管25μL，加入模板DNA。反应体系中，各引物的终浓度如表1所示。
2)按照表3的反应条件设置热循环仪增仪(ABI VeritiPCR仪)，将PCR反应管放入仪器中开始扩增基因片段。
4.3.扩增反应结束后，取出反应管，用ABI 3500遗传分析仪进行电泳和检测
1)取(0.25μL分子量内标(LIZ-500)+9.25μL去离子甲酰胺)×(样品数)配成混合液；
2)混匀后分装，每管9.5μL，再分别加入0.5μL扩增产物和等位基因ladder标准物，简短离心将液体收集到离心管管子底部；
3)样品95℃变性3分钟，然后迅速冰上冷却4分钟，使DNA完全变性并且保持变性状态(这一步变性可选，甲酰胺本身可以使DNA变性)；
4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中，设置仪器参数(进样电压3kV，进样时间15秒钟)，开始电泳检测，电压15kV，炉温60℃。
5)大约37分钟后，电泳结束，用GeneMapperIDx软件分析实验数据得到图谱和分型结果(表10)。
表10实施例4的分型结果
表10的分型数据显示，父亲和女儿未出现任何矛盾基因座，与Goldeneye20A鉴定结果一致(表11)。
表11利用Goldeneye 20A获得的实施例4的分型结果
随着复合基因座数目的增加，由于竞争的影响，各基因座的相对平衡控制难度加大，本发明通过多次实验，建立了一次检测18个基因座的复合扩增系统，这些STR基因座包含了CODIS系统中D5S818、D21S11、D3S1358、D13S317、D7S820和D16S539共6个在中华民族中多态性和稳定性较好的位点，以及PentaD、Penta E、D2S1338、D12S391和D19S433共5个欧洲标准位点，并新增了D18S1364、D2S441和D22S1045共3个中华民族多态性高的非CODIS位点以及性染色体STR基因座DXS9898和Y-GATA-H4辅助性别鉴定。
利用本发明的复合扩增系统可以一次性检测18个基因座，Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898。
利用这个扩增体系可以一次操作得到18个基因座信息，因此这一系统具有很高的个体识别率和非父排除率，无论在PCR扩增和遗传分析仪检测环节，都节省了成本和人力，提高了工作效率。特别是，本发明的复合扩增系统相比现有系统更加适合中华民族遗传多态性的位点分析，可以作为中华民族个体识别和亲权鉴定新的参考标准。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1. 一种同时分析多个STR基因座的复合扩增系统，其特征在于，所述复合扩增系统同时扩增如下18个基因座：Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898。
2. 根据权利要求1所述的复合扩增系统，其特征在于，所述基因座被位于该基因座两侧的一对引物扩增，其中每对引物中有一个引物的5’端进行荧光素标记。
3. 根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其特征在于，所述复合扩增系统包括如下18对引物：
用于扩增Amel的上游引物如SEQ ID NO：1所示；
用于扩增Amel的下游引物如SEQ ID NO：2所示；
用于扩增D5S818的上游引物如SEQ ID NO：3所示；
用于扩增D5S818的下游引物如SEQ ID NO：4所示；
用于扩增D21S11的上游引物如SEQ ID NO：5所示；
用于扩增D21S11的下游引物如SEQ ID NO：6所示；
用于扩增D18S1364的上游引物如SEQ ID NO：7所示；
用于扩增D18S1364的下游引物如SEQ ID NO：8所示；
用于扩增D6S1043的上游引物如SEQ ID NO：9所示；
用于扩增D6S1043的下游引物如SEQ ID NO：10所示；
用于扩增D3S1358的上游引物如SEQ ID NO：11所示；
用于扩增D3S1358的下游引物如SEQ ID NO：12所示；
用于扩增D13S317的上游引物如SEQ ID NO：13所示；
用于扩增D13S317的下游引物如SEQ ID NO：14所示；
用于扩增D7S820的上游引物如SEQ ID NO：15所示；
用于扩增D7S820的下游引物如SEQ ID NO：16所示；
用于扩增D16S539的上游引物如SEQ ID NO：17所示；
用于扩增D16S539的下游引物如SEQ ID NO：18所示；
用于扩增PentaD的上游引物如SEQ ID NO：19所示；
用于扩增PentaD的下游引物如SEQ ID NO：20所示；
用于扩增D19S433的上游引物如SEQ ID NO：21所示；
用于扩增D19S433的下游引物如SEQ ID NO：22所示；
用于扩增D22S1045的上游引物如SEQ ID NO：23所示；
用于扩增D22S1045的下游引物如SEQ ID NO：24所示；
用于扩增Y-GATA-H4的上游引物如SEQ ID NO：25所示；
用于扩增Y-GATA-H4的下游引物如SEQ ID NO：26所示；
用于扩增PentaE的上游引物如SEQ ID NO：27所示；
用于扩增PentaE的下游引物如SEQ ID NO：28所示；
用于扩增D2S441的上游引物如SEQ ID NO：29所示；
用于扩增D2S441的下游引物如SEQ ID NO：30所示；
用于扩增D12S391的上游引物如SEQ ID NO：31所示；
用于扩增D12S391的下游引物如SEQ ID NO：32所示；
用于扩增D2S1338的上游引物如SEQ ID NO：33所示；
用于扩增D2S1338的下游引物如SEQ ID NO：34所示；
用于扩增DXS9898的上游引物如SEQ ID NO：35所示；
用于扩增DXS9898的下游引物如SEQ ID NO：36所示。
4. 根据权利要求1或2所述的复合扩增系统，其特征在于，所述基因座分为下述四种组合：第一组包含Amel、D5S818、D21S11、D18S1364和D6S1043；第二组包含D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和PentaD；第三组包含D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4和PentaE；第四组包含D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898；所述四种组合的引物分别由四种不同的荧光素标记。
5. 根据权利要求4所述的复合扩增系统，其特征在于，所述四种不同的荧光素分别是蓝色、绿色、黄色和红色荧光素，所述蓝色荧光素是6’-FAM（6’-羧基荧光素），所述绿色荧光素是HEX（六氯-6-甲基荧光素），所述黄色荧光素是TAMRA（4-甲基-6-羧基-罗丹明），所述红色荧光素是ROX（羧基-X-罗丹明）。
6. 根据权利要求3所述的复合扩增系统，其特征在于，在一个复合扩增反应体系中同时扩增所述18个基因座；
所述复合扩增反应体系中，用于扩增如下18个基因座Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898的引物的终浓度依次分别是：0.05μM，0.08μM，0.18μM，0.13μM，0.25μM，0.07μM，0.09μM，0.18μM，0.08μM，0.35μM，0.08μM，0.15μM，0.21μM，0.88μM，0.25μM，0.20μM，0.40μM，0.20μM。
7. 一种同时分析DNA样品中多个STR基因座的方法，其特征在于，所述方法应用权利要求1-6任一项所述的复合扩增系统检测DNA。
8. 一组用于权利要求1-6任一项所述的复合扩增系统的引物，其特征在于，所述引物包括SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：36所示的18对引物。
9. 一种用于同时分析多个STR基因座的试剂盒，其特征在于，所述基因座为Amel、D5S818、D21S11、D18S1364、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、PentaD、D19S433、D22S1045、Y-GATA-H4、PentaE、D2S441、D12S391、D2S1338和DXS9898，所述试剂盒包含权利要求8所述的引物。
10. 权利要求1-6任一项所述的复合扩增系统、权利要求8所述的引物或权利要求9所述的试剂盒在遗传多态性的位点分析、个体识别和/或亲权鉴定中的用途。
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