CN108753952A - 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 - Google Patents
一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108753952A CN108753952A CN201810628142.0A CN201810628142A CN108753952A CN 108753952 A CN108753952 A CN 108753952A CN 201810628142 A CN201810628142 A CN 201810628142A CN 108753952 A CN108753952 A CN 108753952A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- gene
- pcr
- site
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
本发明属于人核酸体外检测技术领域,具体涉及人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点的基因分型检测试剂盒。本发明首先设计了对分布于人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点同时进行基因分型的复合PCR扩增系统,其中PCR扩增引物组为:SEQ ID No.1~SEQ ID No.27;本发明的基因分型检测试剂盒包括引物组合物容器、PCR反应母液容器、辅助液容器;引物组合物容器包含引物SEQ ID No.1~SEQ ID No.27组合物贮存液。本发明实现了对10个基因位点的单管扩增,FAM荧光通道内的基因位点扩增均衡,分型图谱良好;而且可显著节省成本、人力和时间,提高工作效率。
Description
技术领域
本发明属于人核酸体外检测技术领域,具体涉及对人基因组DNA中具有多态性的基因位点的基因型的检测,具体涉及一个采用多重聚合酶链式反应对人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点进行Citrin蛋白缺陷症基因分型检测的试剂盒。
背景技术
Citrin是由位于7号染色体长臂的SLC25A13基因编码的线粒体内肝型天冬氨酸/谷氨酸载体(Aspartate/Glutamate Carrier,AGC)蛋白,在尿素循环及其他代谢过程中发挥重要作用。SLC25A13基因的突变将导致Citrin蛋白缺陷,目前已发现80余种突变。Citrin缺陷症被认为是世界范围内最常见的尿素循环障碍性疾病。
Citrin缺陷症为常染色体隐性遗传病,主要分为成年发作Ⅱ型瓜氨酸血症(AdultOnset Type Ⅱ Citrullinemia,CTLN2)和Citrin缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症(Neonatal Intrahepatic Cholestasis caused by Citrin Deficiency,NICCD)两种不同表型。而新的研究表明,由Citrin缺陷引起的生长障碍和血脂异常(Failure to Thriveand Dyslipidemia caused by Citrin Deficiency,FTTDCD)是介于两种表型之间的第三种表型。
其中成年发作Ⅱ型瓜氨酸血症是最早被发现的Citrin缺陷症的表型,主要出现在青年期和成年人中,临床主要有突发意识障碍、精神错乱等肝性脑病表现,预后往往较为严重。半数以上初次发作后存活不超过17个月,最终多死于脑水肿。
Citrin缺陷所致新生儿肝内胆汁淤积症,最常见表现为黄疸、血瓜氨酸升高以及脂肪肝,此外还有半乳糖血症、低蛋白血症、出血倾向、低血糖以及甲胎蛋白明显升高,可有瓜氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸等多种氨基酸升高。研究认为NICCD患儿病程多为自限性,临床及实验室表现多数在一岁内自然缓解,最初这一过程被普遍认为是介于NICCD出现后和CTLN2开始前的“无声”或“健康表型”阶段。而部分患者临床和实验室表现的累积现象表明这一假设具有争议,直至FTTDCD表型提出并被认为是介于两种表型间的第三种表型。
对于Citrin缺乏症的两种常见表型,治疗方式有所不同,但仍主要以饮食限制和对症治疗为主。研究表明早期的乳糖(半乳糖)限制和MCT补充配方的治疗对NICCD有效,对CTLN2可能有效。目前认为对CTLN2有效的治疗方法仍是肝移植,然而其效果难以评价。
发明内容
本发明的目的就是针对临床Citrin蛋白缺陷症筛查和诊断中常见的10个基因突变位点的分型检测的需求,提供一种可同时对人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点进行Citrin蛋白缺陷症的基因分型检测试剂盒。
本发明第一方面提供了一个可在一个PCR反应中用于对分布于人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点同时进行基因分型检测的复合PCR扩增系统。所述复合PCR扩增的系统包括以下10个基因位点对应的PCR扩增引物,其中所述10个基因位点为:c.955C>T(CT1),c.1638_1660dup23(CT2),c.754G>A(CT3),IVS16ins3kb(CT4),IVS6+5G>A(CT5),IVS11+1G>A(CT6),g.1592G>A(CT7),851-854del4(CT8),c.1399C>T(CT9)和c.1092_1095delT(CT10)。根据每一基因位点扩增子长度分布范围,将所述10个基因位点排序,其对应PCR扩增引物分别为:
位点c.955C>T(CT1),相应引物序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3;
位点c.1638_1660dup23(CT2),相应引物序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5;
位点c.754G>A(CT3),相应引物序列为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8;
位点IVS16ins3kb(CT4),相应引物序列为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11;
位点IVS6+5G>A(CT5),相应引物序列为SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14;
位点IVS11+1G>A(CT6),相应引物序列为SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ IDNo.17;
位点g.1592G>A(CT7),相应引物序列为SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ IDNo.20;
位点851-854del4(CT8),相应引物序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22;
位点c.1399C>T(CT9),相应引物序列为SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和SEQ IDNo.25;和
位点c.1092_1095delT(CT10),相应引物序列为SEQ ID No.26和SEQ ID No.27;
其中各基因位点对应的的引物组中均有一条非特异性引物采用FAM荧光素进行标记。
在另一优选例中,所述复合PCR扩增的系统中,引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.4、SEQ ID No.8、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23和SEQ ID No.26采用FAM荧光素标记。
在另一优选例中,所述10个基因位点对应的复合PCR扩增引物及其荧光素修饰特征见表1和表2:
表1
表2
基因位点PCR扩增产物长度相互不重叠。调整各基因位点PCR引物工作浓度,使纯合子间或杂合子间片段峰高相差在40%以内。基因位点PCR扩增引物的工作浓度为50~300nmol/L。
本发明所述的PCR扩增系统中,引物由SEQ ID No.1至SEQ ID No.27所示寡核苷酸序列的PCR扩增引物的干粉或溶液组成。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述PCR扩增系统在制备同时对人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点进行Citrin蛋白缺陷症的基因分型检测的试剂盒的用途。
本发明第三方面提供了一种同时对人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点进行Citrin蛋白缺陷症的基因分型检测的试剂盒,其包含含有本发明第一方面所述PCR扩增系统的引物组合物容器、PCR反应母液容器和辅助液容器,其中,
所述引物组合物容器内含有序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.27所示的引物的贮存液,贮存液中各引物的浓度为相应引物工作液浓度的10倍;
所述PCR反应母液容器内含有进行PCR反应的2倍反应浓度的PCR反应母液,PCR反应母液包含10-20ng/μL的DNA聚合酶、15-30mmol/L的镁离子、5-10nmol/L的dNTP;
所述辅助液容器内含有进行PCR反应的10倍反应浓度的辅助液,PCR反应辅助液包含,按辅助液总质量计,0.1-0.6wt%的NaCl、30-50wt%的甘油、0.03-0.07mol/L的Tris。
本发明第四方面提供了一种本发明第三方面所述检测试剂盒的使用方法,具体如下:
(1)提取人基因组DNA,紫外分光定量基因组DNA浓度为1-3ng/μL;
(2)多重PCR扩增:总反应体系为20μL,反应体系组成如下:
(3)PCR反应在普通PCR仪上进行,PCR反应条件如下:95℃15分钟启动后,95℃30秒、58℃45秒、72℃60秒,共28个循环,然后72℃保温60分钟,然后4℃保温;
(4)PCR产物取1μL,按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳;
(5)对电泳后的数据利用专用数据分析软件分析,可以得到每一个基因位点的分型图谱和数据。
其中,所述DNA模板是指人类基因组DNA。人类基因组DNA可采用各种常规方法(如Chelex-100法、磁珠法、酚氯仿法以及各种商品化的人基因组DNA提取试剂盒等)从以下组织或检材中提取得到:人血液、血斑、精液、精斑、唾液、唾液斑、羊水、毛发、肌肉组织、骨骼等。较佳地,20μL的PCR扩增体系中,DNA模板量在1ng至3ng的范围内能够得到较好的扩增与分型结果。
本发明第五方面提供了本发明第三方面所述检测试剂盒在非诊断性进行Citrin蛋白缺陷症的基因分型检测中的用途。
本发明所提供的10个基因位点复合PCR扩增系统的PCR扩增产物可采用遗传分析仪(如AB3130XL、AB3500Genetic Analyzer)进行毛细管电泳分析,电泳后的数据可以在GeneMapper等数据分析软件上分析,得到每一个基因位点的分型图谱和数据。
本发明的有益效果:
在建立多重PCR扩增系统过程中,随着所检测基因位点个数的增加,各对引物间的相互干扰也会增加。本发明通过优化的设计,实现了对10个基因位点的单管扩增,荧光通道内的基因位点扩增均衡,分型图谱良好。
本发明所提供的10个基因位点复合扩增系统,其中包括7号染色体上SLC25A13基因的10个常见的基因突变位点。10个检测位点分别对Citrin蛋白缺陷症的10个突变类型,包括c.955C>T(CT1),c.1638_1660dup23(CT2),c.754G>A(CT3),IVS16ins3kb(CT4),IVS6+5G>A(CT5),IVS11+1G>A(CT6),g.1592G>A(CT7),851-854del4(CT8),c.1399C>T(CT9)和c.1092_1095delT(CT10)进行定性分型检测。
采用本发明所提供的人类SLC25A13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒,可通过一次反应即可以有效解决常见突变位点的分型。显著节省成本、人力和时间,从而提高工作效率。
附图说明
图1为一例未突变DNA样本采用本发明所提供试剂盒得到的10个基因位点分型图谱。
图2为一例c.1638_1660dup23(CT2)杂合突变携带者DNA样本采用本发明所提供试剂盒得到的10个基因位点分型图谱。
图3为一例IVS16ins3kb(CT4)杂合突变携带者DNA样本采用本发明所提供试剂盒得到的10个基因位点分型图谱。
图4为一例851-854del4(CT8)杂合突变携带者DNA样本采用本发明所提供试剂盒得到的10个基因位点分型图谱。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容,下面以人血样本中10个基因位点分型检测为具体实施例作进一步说明。应理解,下列具体实施例仅用于说明本发明,而不是对本发明的限制。
本发明PCR反应体系试剂中的引物组合物所包括的核苷酸序列为SEQ ID No.1至SEQ IDNo.27的引物为发明人通过引物设计,由DNA合成公司按照本领域所通用的常规合成方法合成的,然后将其配制为工作浓度50~300nmol/L。
在本实施例中扩增反应在ABI 9700热循环仪上进行,电泳及检测在ABI 3500遗传分析仪上进行,数据分析采用GeneMapper ID v3.2软件。所使用其它试剂和材料如内标、POP7、毛细管电泳缓冲液、Hi-Di、等位基因阶梯(ladder)均为本领域技术人员常用的常规材料。
实施例
1:人血样本基因组DNA制备
测试样本在知情同意下由志愿者捐献。按医疗常规采外周静脉血1mL,EDTA抗凝。采用QIAGEN公司的人外周血基因组抽提试剂盒抽提基因组DNA,洗脱体积为100微升,采用紫外分光定量仪定量,稀释基因组DNA浓度至2ng/μL。
2:PCR体系配制
按以下体系配制PCR反应体系(总反应体系为20μL):
在试剂盒中取出引物组合物容器、PCR反应母液容器和辅助液容器。按总反应数乘以上述反应体系中单个反应需要量分别计算出所需要的PCR反应母液量、引物组合物量、PCR反应辅助液量和ddH2O量,在一个1.5mL EP管中将上述试剂混均匀,在按每个PCR反应管19μL进行分装、编号,然后按样本编号分别加入样本DNA模板1μL,并再次混匀。
3:PCR反应
采用ABI 9700PCR仪进行PCR反应。
PCR条件如下:95℃15分钟启动后,95℃30秒、58℃45秒、72℃60秒,共28个循环,然后72℃保温60分钟,然后4℃保温。
4:毛细管电泳分型检测
1)取(1μL内标+10μL Hi-Di)×(样品数+1)配成混合液,混合后按每管10μL分装在96孔板板孔中。其中一孔中加入1μL等位基因阶梯(Ladder)。
2)取1μL PCR产物按样本编号加入相应的96孔板板孔中。
3)样品95℃变性5分钟,然后迅速冰上冷却4分钟。
4)将样品放入基因分析仪的样品托盘中,按常规参数进行毛细管电泳(参见遗传分析仪厂商操作说明书)。
5)毛细管电泳结束,用GeneMapper软件分析实验数据得到分型图谱,参见图1、图2和图3所示。
如图1所示的一例未突变DNA样本的基因组DNA分型图谱,FAM标记的10个基因位点(从左至右依次为c.955C>T(CT1),c.1638_1660dup23(CT2),c.754G>A(CT3),IVS16ins3kb(CT4),IVS6+5G>A(CT5),IVS11+1G>A(CT6),g.1592G>A(CT7),851-854del4(CT8),c.1399C>T(CT9)和c.1092_1095delT(CT10)),均分型清楚,且各位点均为野生纯合型单峰。
如图2所示的一例c.1638_1660dup23(CT2)杂合突变携带者DNA样本的基因组DNA分型图谱,FAM标记的10个基因位点(从左至右依次为c.955C>T(CT1),c.1638_1660dup23(CT2),c.754G>A(CT3),IVS16ins3kb(CT4),IVS6+5G>A(CT5),IVS11+1G>A(CT6),g.1592G>A(CT7),851-854del4(CT8),c.1399C>T(CT9)和c.1092_1095delT(CT10)),均分型清楚,其中c.1638_1660dup23(CT2)位点为杂合型,表现为双峰接近等高,其他位点均为野生纯合型单峰。
如图3所示的一例IVS16ins3kb(CT4)杂合突变携带者DNA样本的基因组DNA分型图谱,FAM标记的10个基因位点(从左至右依次为c.955C>T(CT1),c.1638_1660dup23(CT2),c.754G>A(CT3),IVS16ins3kb(CT4),IVS6+5G>A(CT5),IVS11+1G>A(CT6),g.1592G>A(CT7),851-854del4(CT8),c.1399C>T(CT9)和c.1092_1095delT(CT10)),均分型清楚,其中IVS16ins3kb(CT4)位点为杂合型,表现为双峰接近等高,其他位点均为野生纯合型单峰。
如图4所示的一例851-854del4(CT8)杂合突变携带者DNA样本的基因组DNA分型图谱,FAM标记的10个基因位点(从左至右依次为c.955C>T(CT1),c.1638_1660dup23(CT2),c.754G>A(CT3),IVS16ins3kb(CT4),IVS6+5G>A(CT5),IVS11+1G>A(CT6),g.1592G>A(CT7),851-854del4(CT8),c.1399C>T(CT9)和c.1092_1095delT(CT10)),均分型清楚,其中851-854del4(CT8)位点为杂合型,表现为双峰接近等高,其他位点均为野生纯合型单峰。
本发明所提出的一种人类SLC25A13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒可在具有PCR仪以及遗传分析的实验室稳定实施,检测时间约为3-4小时。同时,本发明所提供的试剂可以方便地在生物技术公司生产以及在生物医学检测机构用于检测,具备产业化以及推广应用的条件。
本发明已参照其特定的实施例作了描述。对于本领域技术人员而言,依据前面的描述,可能对本发明做各种修改或变换,包括(但不仅限于):改变不同组别的荧光素标记,改变荧光素标记的引物(如由标记上游引物改变为标记下游引物),依据各基因位点等位基因范围改变基因组的分组排布,依据其它的PCR反应母液对PCR扩增条件、引物反应浓度进行优化,以及改变所推荐的反应体系等。很显然,上述修改或变换对于本领域技术人员而言都是可能的,但这些修改和变换并不背离本发明的精神和范围。
序列表
<110> 上海五色石医学研究股份有限公司
<120> 一种用于人类SLC25A13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒
<130> Z001039180061CN
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
ttttctgtca cctgttttcc tgc 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
attcaacttg tagaagaact gggcg 25
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
attctgcaac ttgtagaaga actggaca 28
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
tctttagtga cccctgctga tgt 23
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gtccttcttc acgcagtatc tttcta 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
caggaaagat gttgaagtga cttagg 26
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
attcaggaaa gatgttgaag tgactatga 29
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
atcatatagt taatatgtgt caatgggata g 31
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ggtggtatgg aaataatgtg ttcttaac 28
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
cctttccact gccaacacct 20
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
catcgctgta gcaattcgta agtc 24
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
caactggagc acgcaaagc 19
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
ccacttcatt agggcaagtt aaaac 25
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
attccacttc attagggcaa gttagaat 28
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
aaggcttctt tggactgtat acagg 25
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
attgaaggct tctttggact gtatagtga 29
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
tgcctccagc ctactcccat ta 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
agcagacatc ttgcacacag ga 22
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
cactaaagat gctgcaggca aac 23
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
attcactaaa gatgctgcag gcagat 26
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
aggaggaggg cagcaatca 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
cagccaagtt aaagggcaga gt 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
tgggacaagg gctgaaacta ca 22
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
attcgacaga cagagcactg acacg 25
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
gacagacaga gcactgacgc a 21
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
ggagccactg ctgtgtatcc tat 23
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
tgtatttcca ttttaacgca gtctt 25
Claims (8)
1.一种用于对分布于人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点同时进行基因分型检测的复合PCR扩增系统,所述扩增系统中10个基因位点对应PCR扩增引物分别为:
位点c.955C>T(CT1),相应引物序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3;
位点c.1638_1660dup23(CT2),相应引物序列为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5;
位点c.754G>A(CT3),相应引物序列为SEQ ID No.6、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8;
位点IVS16ins3kb(CT4),相应引物序列为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10和SEQ IDNo.11;
位点IVS6+5G>A(CT5),相应引物序列为SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14;
位点IVS11+1G>A(CT6),相应引物序列为SEQ ID No.15、SEQ ID No.16和SEQ IDNo.17;
位点g.1592G>A(CT7),相应引物序列为SEQ ID No.18、SEQ ID No.19和SEQ ID No.20;
位点851-854del4(CT8),相应引物序列为SEQ ID No.21和SEQ ID No.22;
位点c.1399C>T(CT9),相应引物序列为SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和SEQ ID No.25;和
位点c.1092_1095delT(CT10),相应引物序列为SEQ ID No.26和SEQ ID No.27;
其中各基因位点对应的的引物组中均有一条非特异性引物采用FAM荧光素进行标记。
2.如权利要求1所述的复合PCR扩增系统,其特征在于,10个基因位点对应的PCR扩增引物的工作浓度为50~300nmol/L。
3.如权利要求1所述的复合PCR扩增系统,其特征在于,引物由SEQ ID No.1至27所示核苷酸序列的PCR扩增引物的干粉或溶液组成。
4.一种对分布于人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点进行Citrin蛋白缺陷症分型检测的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含含有权利要求1所述PCR扩增系统的引物组合物容器、PCR反应母液容器和辅助液容器;其中,
所述引物组合物容器包含序列为SEQ ID No.1至SEQ ID No.27所示的引物的贮存液,贮存液中各引物的浓度为相应引物工作液浓度的10倍;
所述PCR反应母液容器内含有进行PCR反应的2倍反应浓度的PCR反应母液,PCR反应母液包含10-20ng/μL的DNA聚合酶、15-30mmol/L的镁离子、5-10nmol/L的dNTP;
所述辅助液容器内含有进行PCR反应的10倍反应浓度的辅助液,PCR反应辅助液包含0.1-0.6wt%的NaCl、30-50wt%的甘油、0.03-0.07mol/L的Tris。
5.权利要求4所述试剂盒在非诊断性进行Citrin蛋白缺陷症的基因分型检测中的用途。
6.一种如权利要求4所述检测试剂盒的使用方法,其特征在于,包括步骤:
(1)提取人基因组DNA,紫外分光定量基因组DNA浓度为1-3ng/μL;
(2)多重PCR扩增:总反应体系为20μL,反应体系组成如下:
(3)PCR反应在普通PCR仪进行,PCR反应条件如下:95℃15分钟启动后,95℃30秒、58℃45秒、72℃60秒,共28个循环,然后72℃保温60分钟,然后4℃保温;
(4)PCR产物取1μL,按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳;
(5)对电泳后的数据利用专用数据分析软件分析,得到每一个基因位点的分型图谱和数据。
7.如权利要求6所述的使用方法,其特征在于,所述DNA模板为人类基因组DNA,所述人类基因组DNA来自人血液、血斑、精液、精斑、唾液、唾液斑、羊水、毛发、肌肉组织、骨骼中的一种或多种。
8.权利要求1所述PCR扩增系统在制备同时对人类7号染色体上SLC25A13基因的10个基因位点进行Citrin蛋白缺陷症的基因分型检测的试剂盒中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810628142.0A CN108753952A (zh) | 2018-06-19 | 2018-06-19 | 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810628142.0A CN108753952A (zh) | 2018-06-19 | 2018-06-19 | 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108753952A true CN108753952A (zh) | 2018-11-06 |
Family
ID=63978691
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810628142.0A Pending CN108753952A (zh) | 2018-06-19 | 2018-06-19 | 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108753952A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109628587A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-16 | 江门市妇幼保健院 | 用于检测slc25a13基因4种突变的引物组、试剂盒及其应用 |
CN112725432A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-30 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种检测Citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒 |
CN113174432A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-07-27 | 浙江大学 | 一种slc25a13基因突变位点检测试剂盒及方法 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000316577A (ja) * | 1999-05-10 | 2000-11-21 | Keiko Kobayashi | 成人発症ii型シトルリン血症の診断方法 |
US20050095607A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-05-05 | Arcturus Bioscience, Inc. University Of Louisville | Breast cancer signatures |
CN103421909A (zh) * | 2013-09-02 | 2013-12-04 | 上海览冥生物科技有限公司 | Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用 |
CN105803091A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-27 | 暨南大学 | Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频I型突变筛查引物及试剂盒 |
CN106701987A (zh) * | 2017-02-09 | 2017-05-24 | 上海五色石医学研究股份有限公司 | 人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增系统和检测试剂盒 |
CN106912197A (zh) * | 2011-04-28 | 2017-06-30 | 生命技术公司 | 用于多重pcr的方法和组合物 |
CN108048553A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-18 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 检测slc25a13基因突变的方法、引物和试剂盒 |
-
2018
- 2018-06-19 CN CN201810628142.0A patent/CN108753952A/zh active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000316577A (ja) * | 1999-05-10 | 2000-11-21 | Keiko Kobayashi | 成人発症ii型シトルリン血症の診断方法 |
US20050095607A1 (en) * | 2003-03-07 | 2005-05-05 | Arcturus Bioscience, Inc. University Of Louisville | Breast cancer signatures |
CN106912197A (zh) * | 2011-04-28 | 2017-06-30 | 生命技术公司 | 用于多重pcr的方法和组合物 |
CN103421909A (zh) * | 2013-09-02 | 2013-12-04 | 上海览冥生物科技有限公司 | Citrin缺乏症的基因诊断试剂及其应用 |
CN105803091A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-27 | 暨南大学 | Citrin缺陷病致病基因SLC25A13高频I型突变筛查引物及试剂盒 |
CN106701987A (zh) * | 2017-02-09 | 2017-05-24 | 上海五色石医学研究股份有限公司 | 人叶酸代谢相关的三个snp位点基因分型的pcr扩增系统和检测试剂盒 |
CN108048553A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-05-18 | 上海艾迪康医学检验所有限公司 | 检测slc25a13基因突变的方法、引物和试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
YUAN-ZONG SONG ET AL.,: "SLC25A13 Gene Analysis in Citrin Deficiency: Sixteen Novel Mutations in East Asian Patients, and the Mutation Distribution in a Large Pediatric Cohort in China", 《PLOS ONE》 * |
叶峻杰等: "云南傣族、彝族、汉族Citrin缺陷SLC25A13基因突变的筛查", 《中国计划生育学杂志》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109628587A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-16 | 江门市妇幼保健院 | 用于检测slc25a13基因4种突变的引物组、试剂盒及其应用 |
CN112725432A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-30 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种检测Citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒 |
CN112725432B (zh) * | 2020-12-31 | 2022-01-28 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种检测Citrin缺乏症基因的引物、探针及其试剂盒 |
CN113174432A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-07-27 | 浙江大学 | 一种slc25a13基因突变位点检测试剂盒及方法 |
CN113174432B (zh) * | 2021-04-02 | 2022-05-10 | 浙江大学 | 一种slc25a13基因突变位点检测试剂盒及方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20200385810A1 (en) | Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples | |
AU2010343276B2 (en) | Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples | |
US9617598B2 (en) | Methods of amplifying whole genome of a single cell | |
US20230340590A1 (en) | Method for verifying bioassay samples | |
CN106591441B (zh) | 基于全基因捕获测序的α和/或β-地中海贫血突变的检测探针、方法、芯片及应用 | |
EP3099818B1 (en) | Preimplantation assessment of embryos through detection of free embryonic dna | |
CN108753952A (zh) | 一种用于人类slc25a13基因10个常见突变位点的基因分型检测试剂盒 | |
WO2019127928A1 (zh) | 一种人染色体15q11-13遗传变异检测试剂盒及其应用 | |
CN106939334B (zh) | 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法 | |
AU2018201992B2 (en) | Sequencing methods and compositions for prenatal diagnoses | |
CN110295218B (zh) | 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法 | |
CN112779322A (zh) | 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181106 |