CN109055576B - 多位点高个体识别能力的str引物组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多位点高个体识别能力的STR引物组、试剂盒及应用。本发明的多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，含有20个常染色体核心基因座，10个优选基因座，以及一个辅助性别判断的Y染色体的Yindel。这些基因座多态性高，识别率高，且有很多是符合中国人群特点的。本发明提供的技术方案涵盖更多基因座、个体识别能力更高。该系统包含31个基因座，这些基因座含有良好的遗传多态性，能够提供更为丰富的遗传信息，可用于法医遗传学亲权鉴定及个体识别。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域领域，特别涉及STR检测。
背景技术
早在90年代初就已经发现短串联重复序列基因座(STR)，它是由几个碱基对作为核心单位串联重复形成的一类小的DNA序列。STR遗传标记在基因组中广泛分布，平均每10000个核酸有一个，具有可快速检测、灵敏度高和多态性好等特点，被广泛应用于DNA数据库的建立。1997年，美国选择出了CSF1PO、D16S539、FGA、D18S51、TH01、D5S818、TPOX、VWA、D3S1358、D13S317、D7S820、D8S1179、D21S11共13个核心基因座。随着不断发展，FBI在2017年1月1日又公布出7个新增的STR核心基因座，即D1S1656,D2S441,D2S1338,D10S1248,D12S391,D19S433,D22S1045和Amelogeni。
STR一直被学术和商业实验室关注，并被应用于疾病基因定位研究和法医DNA分型，尤其在法医中的应用发展的尤为迅速和成熟。以美国ABI(Applied Biosystems，USA)公司为代表的研发商，在90年代中后期就建立了荧光复合扩增体系。在这个过程中，荧光复扩体系不断发展，荧光系统不断升级，最新的科研上能到八色荧光系统，商品化的最常用的是五色和六色荧光系统。单个试剂盒涵盖的基因座越来越多，成本更少，但获得的信息更多，个体识别率更高。最初，ABI的Identifiler、Promega(USA)的PowerPlex16，到现在AB公司的含有24个基因组的AmpFeSTR GlobalFiler、Promega包含27个STR的PowerPlex fusion。
与国际接轨，我国对STR的研究和应用也具有较长的历史。在90年代中期，公安部就提出了“统一规划、统一标准、分步实施、滚动发展”的DNA数据库建设原则。现STR分型鉴定已经被广泛应用，帮助破获了大量的案件，较为典型和轰动的如今年(2017年)的白银案等。目前，已经可进行跨时空多化应用DNA数据库，这对精准打击范围有着很大的作用。我国对STR DNA的数据库建设逐步标准化。
在我国，初期是由ABI公司的STR试剂盒垄断市场，随着中德美联17+1、EX20；基点认知的20A；二所的typer15的研发生产，垄断局面逐步被打破，DNA数据库建设成本大大降低，效率得到提升。随着时间的推移，国产试剂盒也在不断升级换代，如中德美联的17+1，EX20，EX25，EX27，公安部物证鉴定中心的含有25个基因座的DNATyper25，基点认知的25A，海尔施的STRtyper26G等。时代发展越来越快，我们更需要在保证扩增和检测性能的前提下，拥有更高累积鉴别力的试剂盒。
发明内容
本发明目的之一是提供一种多位点高个体识别能力的STR引物组、试剂盒及应用。本发明提供的技术方案涵盖更多基因座、个体识别能力更高。该系统包含31个基因座，这些基因座含有良好的遗传多态性，能够提供更为丰富的遗传信息，可用于法医遗传学亲权鉴定及个体识别。
根据中华人民共和国公共安全最新行业标准《法庭科学DNA数据库选用的基因座及其数据结构》，其中常染色体含有20个核心基因座即Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391，以及常染色体10个优选基因座D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435。这些基因座大部分在DNA数据库中排序靠前，具有兼容性好或中国人群遗传多态性高，识别率高。Amelogenin简写Amel。
根据本发明的一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，上述STR扩增引物组扩增的基因座包括Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E、D12S391，还包括D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435和Yindel。其中20个常染色体核心基因座即Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391，10个优选基因座D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435，以及一个辅助性别判断的Y染色体的Yindel。这些基因座大多在DNA数据库中排序靠前，多态性高，识别率高，且有很多是符合中国人群特点的。
根据本发明的另一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，STR扩增引物组包含31对特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对序列如下：
Yindel引物对序列为SEQ ID NO.1～2；
D3S1358引物对序列为SEQ ID NO.3～4；
vWA引物对序列为SEQ ID NO.5～6；
D1S1656引物对序列为SEQ ID NO.7～8；
CSF1PO引物对序列为SEQ ID NO.9～10；
D8S1132引物对序列为SEQ ID NO.11～12；
D19S253引物对序列为SEQ ID NO.13～14；
D6S477引物对序列为SEQ ID NO.15～16；
Amel引物对序列为SEQ ID NO.17～18；
D8S1179引物对序列为SEQ ID NO.19～20；
D21S11引物对序列为SEQ ID NO.21～22；
D16S539引物对序列为SEQ ID NO.23～24；
TPOX引物对序列为SEQ ID NO.25～26；
D3S3045引物对序列为SEQ ID NO.27～28；
Penta D引物对序列为SEQ ID NO.29～30；
D2S441引物对序列为SEQ ID NO.31～32；
D5S818引物对序列为SEQ ID NO.33～34；
TH01引物对序列为SEQ ID NO.35～36；
FGA引物对序列为SEQ ID NO.37～38；
D15S659引物对序列为SEQ ID NO.39～40；
D22S1045引物对序列为SEQ ID NO.41～42；
D19S433引物对序列为SEQ ID NO.43～44；
D13S317引物对序列为SEQ ID NO.45～46；
D7S820引物对序列为SEQ ID NO.47～48；
D6S1043引物对序列为SEQ ID NO.49～50；
D10S1435引物对序列为SEQ ID NO.51～52；
D10S1248引物对序列为SEQ ID NO.53～54；
D2S1338引物对序列为SEQ ID NO.55～56；
D18S51引物对序列为SEQ ID NO.57～58；
D12S391引物对序列为SEQ ID NO.59～60；
Penta E引物对序列为SEQ ID NO.61～62。
根据本发明的另一方面，提供一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，引物对在扩增体积中的终浓度如下：
Yindel引物对0.5μM、
D3S1358引物对0.45μM、
vWA引物对0.6μM、
D1S1656引物对0.6μM、
CSF1PO引物对0.6μM、
D8S1132引物对1μM、
D19S253引物对1μM、
D6S477引物对1μM、
Amel引物对0.45μM、
D8S1179引物对0.7μM、
D21S11引物对1μM、
D16S539引物对0.65μM、
TPOX引物对1μM、
D3S3045引物对1μM、
Penta D引物对1μM、
D2S441引物对0.4μM、
D5S818引物对0.4μM、
TH01引物对0.4μM、
FGA引物对0.45μM、
D15S659引物对0.8μM、
D22S1045引物对0.3μM、
D19S433引物对0.45μM、
D13S317引物对0.45μM、
D7S820引物对0.6μM、
D6S1043引物对0.8μM、
D10S1435引物对1μM、
D10S1248引物对0.5μM、
D2S1338引物对0.6μM、
D18S51引物对0.6μM、
D12S391引物对0.5μM、
Penta E引物对0.9μM。
根据本发明的另一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，STR扩增引物组包含31对特异性扩增引物对中每个引物对中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记，引物对都经过了分组标记，分为五组，分组如下：
Yindel引物对、D3S1358引物对、vWA引物对、D1S1656引物对、CSF1PO引物对、D8S1132引物对、D19S253引物对和D6S477引物对为第一组；
Amel引物对、D8S1179引物对、D21S11引物对、D16S539引物对、TPOX引物对、D3S3045引物对和Penta D引物对为第二组；
D2S441引物对、D5S818引物对、TH01引物对、FGA引物对、D15S659引物对为第三组；
D22S1045引物对、D19S433引物对、D13S317引物对、D7S820引物对、D6S1043引物对、D10S1435引物对为第四组；
D10S1248引物对、D2S1338引物对、D18S51引物对、D12S391引物对、Penta E引物对为第五组。
根据本发明的另一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，荧光染料标记用的荧光染料为蓝色荧光染6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料SUM、红色荧光染料标记LYN和紫色荧光染料PUR，荧光染料分别对上述的五组引物对进行荧光染料标记，且每组之间的荧光染料都不相同。
根据本发明的另一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组的应用，上述任意一种STR扩增引物组可以应用于制备STR试剂盒。
根据本发明的还有一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒，该STR试剂盒包含上述的任意一种STR扩增引物组。
根据本发明的还有一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒，该STR试剂盒中还包含分子量内标，分子量内标为橙色荧光标记的SIZ600，STR试剂盒还包括如下组成：基因组DNA，10ng；PCR缓冲液Super Mix，2mL；sdH2O，1.95mL；PCR增强剂；
根据本发明的还有一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒，上述的PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl 50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL。
上述的PCR增强剂可选的种类为：海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20或NP40。选择其中的一种或两种加入到PCR缓冲液Super mix中。
本发明其中一个技术方案包含31个基因座、具有更高个体识别能力的常染色体STR六色荧光标记复合扩增的引物组的试剂盒，可同时做到更多基因座扩增、高效和快速扩增。优化了PCR缓冲液和荧光染料系统，操作更为简便，检测效率更高，能够通过单管扩增获得31个基因座的信息，PCR扩增时间可控制在80min内。
根据本发明的还有一方面，提供了一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒的应用上述任意一种STR试剂盒在人类个体识别和亲权鉴定中的应用。
本发明的构思如下：
一、基因座的确定
主要是参照即将公布中华人民共和国公共安全最新行业标准《法庭科学DNA数据库选用的基因座及其数据结构》，包含了其中常染色体含有20个核心基因座即Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391，以及其中常染色体10个优选基因座D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435，以及一个辅助性别判断的Yindel。完全包含FBI推荐的所有的核心基因座，大部分的基因座在DNA数据库中排序靠前，兼容性好，识别率高，如Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01和TPOX；有些则在DNA数据库中排序靠前，中国人群遗传多态性高，识别率高，如D6S1043、Penta D和Penta E；D12S391、D1S1656、D2S441、D22S1045和D10S1248是公布的NEW CODIS，同时在欧洲的标准(ESS)中也包含这5个基因座，与D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477和D10S1435这些基因座在中国人群遗传多态性高，识别率高。
通常对每个样本都可进行性别判断，主要依据的是性别基因座Amelogenin，但其存在Y等位基因丢失风险。通过添加一个Y染色体上的插入缺失位点Yindel则可解决这一问题，为性别判断作辅助。即当Amelogenin的等位基因丢失时，再查看Yindel，若能检测到Yindel分型则说明是男性，若Yindel无扩增峰则说明是女性样本。
二、荧光标记复合扩增体系的基因座组合方案设计
本研究采用了优化后的的6色荧光组合方案，选用的是蓝、绿、黄、红、紫、橙六种荧光标记物。
选择Yindel、D3S1358、vWA、D1S1656、CSF1PO、D8S1132、D19S253、D6S477、Amel、D8S1179、D21S11、D16S539、TPOX、D3S3045、Penta D、D2S441、D5S818、TH01、FGA、D15S659、D22S1045、D19S433、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1435、D10S1248、D2S1338、D18S51、D12S391、Penta E后，查找各基因座序列和等位基因等信息，统计和整理，遵循引物排布位置尽量小的原则，对各个基因座进行合理的排布和分组，采用不同的荧光染料对每组进行标记。确定了各个基因座的排布后进行引物设计，注意避开文献报道的SNP或插入缺失位点。设计好一对引物后，选择对其中一条引物的5’端用荧光染料标记例如，其中的一种较优的组合方式为：用蓝色荧光染料对Yindel、D3S1358、vWA、D1S1656、CSF1PO、D8S1132、D19S253、D6S477这些基因座进行标记；用绿色荧光染料对Amel、D8S1179、D21S11、D16S539、TPOX、D3S3045、Penta D这些基因座进行标记；用黄色荧光染料对D2S441、D5S818、TH01、FGA、D15S659进行标记；用红色荧光染料对D22S1045、D19S433、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1435进行标记；用紫色荧光染料对D10S1248、D2S1338、D18S51、D12S391、Penta E进行标记。选用SIZ-600作为内标，其标记的是橙色荧光染料。
三、荧光标记STR复合扩增体系的优化及建立
1、引物的确定
设计好31个位点的单个基因座的引物，先进行单对引物的扩增测试，然后将所有的引物进行复合扩增，在这个过程中需要关注引物的扩增效率、特异性和峰形等。在这个过程中，根据每一步的引物测试的结果，不断的调整引物和反复测试，初步筛选出能够进行较好的复合扩增的所有的基因座的引物。
2、PCR缓冲液的优化
根据实验需要，对PCR缓冲液进行优化。添加或减少组分，对PCR缓冲液的各组分进行浓度梯度测试，采用不同的测试和评价方法，筛选出更利于引物扩增(如提高扩增效率、减少Stutter比例、增强对抑制剂的容忍度和更广泛的样本适应性等)的最优PCR缓冲液Buffer。一般这个过程中需要反复测试和确定，保证实验的稳定性和可重复性。
3、PCR扩增程序优化
PCR扩增体系对各引物的扩增结果也会有很大影响。一般情况下也需要反复调整测试，如调整复合扩增中的循环参数、退火温度、复合扩增反应体积的变化以及模板DNA量等参数，在保证可同时扩增出31个位点的情况下，也需要使各基因座的均衡性、特异性、准确性和一致性等都符合要求。筛选出最利于所有基因座的扩增的最优PCR扩增程序。
由于涵盖的基因座多，特别是针对某些排布在较大位置的基因座来说，对引物的扩增效率要求很高，需要不断测试、修改和测试，该过程具有不确定性，并非可以大量非创造性的重复实验可以获得，最终找到最佳引物、确定最佳的复扩体系和最优的PCR扩增程序。
本发明的其中一些有益效果：
1、单管扩增即可获得31个位点信息，且试剂盒的灵敏度和抗抑制能力可满足日常实验要求。
2、本发明通过对荧光染料、酶和PCR缓冲液的优化，尽管单管扩增31个STR位点信息，试剂盒仍能高效和稳定。
3、本发明的产出和投入比例增高，通过单管扩增可获得更多基因座的信息，个体识别率更高。
4、本发明在保证高个体识别率的情况下，仍尽可能的缩短PCR扩增时间，PCR扩增最快可到达80min。
5、本发明添加了Y染色体上的位点Yindel，对性别基因Amelogenin起到辅助判定的作用。
附图说明
图1、本发明一施例中EX30扩增125pg 9948标准品的结果图；
图2、本发明一施例中博坤(加强型)血卡EX30扩增图；
图3、本发明一施例中博坤(迷你型)血卡EX30扩增图；
图4、本发明一施例中Whatman血卡EX30扩增图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明针对的基因座位点为：
含有用于扩增Yindel、D3S1358、vWA、D1S1656、CSF1PO、D8S1132、D19S253、D6S477、Amel、D8S1179、D21S11、D16S539、TPOX、D3S3045、Penta D、D2S441、D5S818、TH01、FGA、D15S659、D22S1045、D19S433、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1435、D10S1248、D2S1338、D18S51、D12S391、Penta E这31个位点的引物。
上述引物对的序列以及在扩增体系中的浓度如表1所示：
表1各基因座引物序列及浓度
应用荧光染料对每个引物对中至少一条引物的5’端进行标记。
一般会对上述的引物对进行分组标记，如下：
Yindel、D3S1358、vWA、D1S1656、CSF1PO、D8S1132、D19S253、D6S477为第一组，采用蓝色荧光染6-FAM进行标记；
Amel、D8S1179、D21S11、D16S539、TPOX、D3S3045、Penta D为第二组，采用绿色荧光染料HEX进行标记；
D2S441、D5S818、TH01、FGA、D15S659为第三组，采用黄色荧光染料SUM进行标记；
D22S1045、D19S433、D13S317、D7S820、D6S1043、D10S1435为第四组，采用红色荧光染料LYN进行标记；
D10S1248、D2S1338、D18S51、D12S391、Penta E为第五组，采用紫色荧光染料PUR进行标记。
本发明其他一些实施方案中可采用蓝色荧光染6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料SUM、红色荧光染料标记LYN、紫色荧光染料PUR中的任意一种对每组进行荧光染料标记，只需保证每组之间的染料都不相同即可。
分子量内标为橙色荧光标记的SIZ600。
上述引物构成引物混合物。
本发明试剂盒由如下组成：引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液SuperMix，2mL；sdH2O，1.95mL；其中，PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL，一种或两种PCR增强剂。PCR增强剂，增强剂有多种可选，如海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40等。
1、操作步骤如下：
1.1扩增体系为：
1.2扩增程序为：
本发明试剂盒
1.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
取1μL PCR产物或系统中等位基因分析标准Allelic Ladder，与12μL去离子甲酰胺和0.5μL AGCU Marker SIZ-600(无锡中德美联生物技术有限公司))混合物混匀，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，遗传分析仪3500检测
1.4、分型分析
应用GeneMapper ID-X(Lifetech公司，美国)软件分析。
2、结论
将人类基因组DNA标准品Control DNA 9948(Promega公司美国)梯度稀释到125pg，应用本发明的EX30试剂盒扩增和检测，可有效检测出所有基因座的分型(图1)，灵敏度满足日常实验需求。博坤(加强型)血卡、博坤(迷你型)血卡和Whatman FTA血卡在市场长较多，且含有的抑制PCR扩增的组分含量相对较高，具有一定代表性。应用EX30试剂盒扩增博坤(加强型)血卡、博坤(迷你型)血卡和Whatman FTA血卡，扩增结果如图2、3、4所示，扩增峰较高，均衡性较好，准确可靠。这说明，EX30试剂盒均有较好的抗抑制能力，可适用于多种不同类型的检材的扩增。
实施例2：
检材：分别附着了父亲和儿子的血迹的血卡。
使用实施例1中的试剂盒
本发明试剂盒由如下组成：引物混合物，1mL；基因组DNA，10ng；PCR缓冲液SuperMix，2mL；sdH2O，1.95mL；其中，PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl50mM～125mM,dNTPs 5.0mM～7.5mM,KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL，一种或两种PCR增强剂。PCR增强剂，增强剂有多种可选，如海藻糖、浓度低于5％的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20、NP40等。
1、操作步骤如下：
1.1扩增体系为：
1.2扩增程序为：
本发明试剂盒
1.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μL产物或EX30Allelic Ladder与0.5μL AGCUMarker SIZ-600和12μL去离子甲酰胺混合，离心，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
14、分型分析
将遗传分析仪检测收集的所有数据导入到片段分析软件GeneMapper IDX中进行分析。
4、结论
应用EX30荧光检测试剂盒检测父亲和儿子的各基因座的所有分型，同时与无锡中德美联生物技术有限公司的AGCU Expressmarker 20荧光检测试剂盒(EX20)和AGCU EX25(EX25)荧光检测试剂盒做对比。父亲和儿子各基因座的具体分型如下表所示，除D2S1338基因座外(发生了两步突变)，其他的各基因座都符合孟德尔遗传规律。参照2016年的“司法鉴定技术规范(SF/Z JD0105001——2016)，分别计算出这3个试剂盒检测出儿子的累计亲权指数(Combined paternity index,CPI)。EX20：CPI＝84.7299，大于0.0001，小于10000，需要增加被检测基因座；EX25：CPI＝4209.1972，大于0.0001，小于10000，需要增加被检测基因座；EX30：CPI＝3646543.0144，大于10000，支持被检测男子是孩子生物学父亲的假设。由此可见，通过EX30一次检测即可确定被检测男子和孩子的关系，EX30具有更高的鉴别能力，更省时省力。
表三种不同常染色体试剂盒检出父亲和儿子的各基因座分型
注：“-”：表示无该基因座
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 多位点高个体识别能力的STR引物组、试剂盒及应用
<141> 2018-09-21
<160> 62
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gtcgttcttt agcagtgatt tctg 24
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tctgggatgt ggaggagagt t 21
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tgttggtcaa atctcctcct tcaa 24
<210> 47
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tccggactat ggagttattt taaggt 26
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gctctgaggt atcaaaaact cagag 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ggaatggcac tcttattcat ctagt 25
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
catgttttga aggctttgac ttggac 26
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttcataagtc aggagagaag agatg 25
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gcaacatggt gaaatcccat ctct 24
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggaacaaatg agtgagtgga a 21
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cttgttatta aaggaacaac tctggt 26
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgtgggaggg agccagtgga tttg 24
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtggcccat aatcatgagt tat 23
<210> 57
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gtgacaaatt gagaccttgt ctca 24
<210> 58
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acaacacaaa taaacaaacc gtcagc 26
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gtaaggcttc tccagagaga aag 23
<210> 60
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ataccagggg cactccaggt tct 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtattacctg agctcaggag at 22
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gtattacctg agctcaggag at 22
Claims (7)
1.一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，其特征在于，所述STR扩增引物组扩增的基因座包括Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、PentaE、D12S391，还包括D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435和Yindel；
Amelogenin、D18S51、D21S11、D3S1358、FGA、D8S1179、vWA、CSF1PO、D16S539、D7S820、D13S317、D5S818、D2S1338、D19S433、TH01、TPOX、D6S1043、Penta D、Penta E和D12S391为核心基因座，D1S1656、D2S441、D22S1045、D10S1248、D8S1132、D15S659、D3S3045、D19S253、D6S477、D10S1435为优选基因座；
所述STR扩增引物组由31对特异性扩增引物对组成，所述特异性扩增引物对序列如下：
Yindel引物对序列为SEQ ID NO.1～2；
D3S1358引物对序列为SEQ ID NO.3～4；
vWA引物对序列为SEQ ID NO.5～6；
D1S1656引物对序列为SEQ ID NO.7～8；
CSF1PO引物对序列为SEQ ID NO.9～10；
D8S1132引物对序列为SEQ ID NO.11～12；
D19S253引物对序列为SEQ ID NO.13～14；
D6S477引物对序列为SEQ ID NO.15～16；
Amel引物对序列为SEQ ID NO.17～18；
D8S1179引物对序列为SEQ ID NO.19～20；
D21S11引物对序列为SEQ ID NO.21～22；
D16S539引物对序列为SEQ ID NO.23～24；
TPOX引物对序列为SEQ ID NO.25～26；
D3S3045引物对序列为SEQ ID NO.27～28；
Penta D引物对序列为SEQ ID NO.29～30；
D2S441引物对序列为SEQ ID NO.31～32；
D5S818引物对序列为SEQ ID NO.33～34；
TH01引物对序列为SEQ ID NO.35～36；
FGA引物对序列为SEQ ID NO.37～38；
D15S659引物对序列为SEQ ID NO.39～40；
D22S1045引物对序列为SEQ ID NO.41～42；
D19S433引物对序列为SEQ ID NO.43～44；
D13S317引物对序列为SEQ ID NO.45～46；
D7S820引物对序列为SEQ ID NO.47～48；
D6S1043引物对序列为SEQ ID NO.49～50；
D10S1435引物对序列为SEQ ID NO.51～52；
D10S1248引物对序列为SEQ ID NO.53～54；
D2S1338引物对序列为SEQ ID NO.55～56；
D18S51引物对序列为SEQ ID NO.57～58；
D12S391引物对序列为SEQ ID NO.59～60；
Penta E引物对序列为SEQ ID NO.61～62；
组成STR扩增引物组的31对特异性扩增引物对中每个引物对中至少有一个引物的5’端进行荧光染料标记，所述的引物对都经过了分组标记，分为五组，分组如下：
Yindel引物对、D3S1358引物对、vWA引物对、D1S1656引物对、CSF1PO引物对、D8S1132引物对、D19S253引物对和D6S477引物对为第一组；
Amel引物对、D8S1179引物对、D21S11引物对、D16S539引物对、TPOX引物对、D3S3045引物对和Penta D引物对为第二组；
D2S441引物对、D5S818引物对、TH01引物对、FGA引物对、D15S659引物对为第三组；
D22S1045引物对、D19S433引物对、D13S317引物对、D7S820引物对、D6S1043引物对、D10S1435引物对为第四组；
D10S1248引物对、D2S1338引物对、D18S51引物对、D12S391引物对、Penta E引物对为第五组；
所述的引物对在扩增体系中的终浓度如下：
Yindel引物对0.5μM、
D3S1358引物对0.45μM、
vWA引物对0.6μM、
D1S1656引物对0.6μM、
CSF1PO引物对0.6μM、
D8S1132引物对1μM、
D19S253引物对1μM、
D6S477引物对1μM、
Amel引物对0.45μM、
D8S1179引物对0.7μM、
D21S11引物对1μM、
D16S539引物对0.65μM、
TPOX引物对1μM、
D3S3045引物对1μM、
Penta D引物对1μM、
D2S441引物对0.4μM、
D5S818引物对0.4μM、
TH01引物对0.4μM、
FGA引物对0.45μM、
D15S659引物对0.8μM、
D22S1045引物对0.3μM、
D19S433引物对0.45μM、
D13S317引物对0.45μM、
D7S820引物对0.6μM、
D6S1043引物对0.8μM、
D10S1435引物对1μM、
D10S1248引物对0.5μM、
D2S1338引物对0.6μM、
D18S51引物对0.6μM、
D12S391引物对0.5μM、
Penta E引物对0.9μM。
2.根据权利要求1所述的一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组，其特征在于，所述荧光染料标记用的荧光染料为蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料SUM、红色荧光染料标记LYN和紫色荧光染料PUR，所述荧光染料分别对所述五组引物对进行荧光染料标记，且每组之间的荧光染料都不相同。
3.一种多位点高个体识别能力的STR扩增引物组的应用，其特征在于，权利要求1至2中所述的任意一种STR扩增引物组应用于制备STR试剂盒。
4.一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒，其特征在于，所述STR试剂盒包含权利要求1至2中所述的任意一种STR扩增引物组。
5.根据权利要求4所述的一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒，其特征在于，所述STR试剂盒中还包含分子量内标，所述分子量内标为橙色荧光标记的SIZ600；
所述的STR试剂盒还包括如下组成：基因组DNA 10ng；PCR缓冲液Super Mix 2mL；sdH2O1.95mL；PCR增强剂。
6.根据权利要求5所述的一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒，其特征在于，
所述PCR缓冲液Super Mix成分为：pH8.3～8.5的Tris-HCl 50mM～125mM，dNTPs 5.0mM～7.5mM，KCl 50mM～125mM，BSA 2mg/ml～5mg/ml，热启动Taq酶0.2U/μL～0.5U/μL；
PCR增强剂可选的种类为：海藻糖、浓度低于5%的聚乙二醇、二甲亚砜、Tween20或NP40，选择其中的一种或两种直接加入到PCR缓冲液Super mix中。
7.一种多位点高个体识别能力的STR试剂盒的应用，其特征在于，权利要求4至6所述的任意一种STR试剂盒在人类个体识别和亲权鉴定中的应用。
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