CN110616260B

CN110616260B - 基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN110616260B
Application number: CN201910863175.8A
Authority: CN
Inventors: 骆明勇; 胡思琪; 王继成; 杨笑涵; 詹文丽; 谢佳; 陈柯艺; 胡听听; 杜丽; 尹爱华
Original assignee: Guangdong Maternal and Child Health Hospital
Current assignee: Guangdong Maternal and Child Health Hospital
Priority date: 2019-09-12
Filing date: 2019-09-12
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2039-09-12
Also published as: CN110616260A

Abstract

本发明公开一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物、试剂盒及应用。该检测引物的序列如SEQ ID NO.1～14所示。本发明提供检测试剂盒，包括前述引物。该检测引物涉及6个SNP位点，对待检样本进行PCR扩增后，根据样本SNP基因型的杂合型存在与否判断是否发生了β‑珠蛋白基因簇缺失型突变。若实验结果显示样本的6个SNP中存在杂合型位点，则可以排除9种β‑珠蛋白基因簇缺失型突变。反之，若6个SNP位点分型检测结果都是纯合型，则该样本很有可能发生了β‑珠蛋白基因簇缺失突变而导致杂合性丢失，提示需做进一步临床检测。本发明提供的检测引物及试剂盒对SNP的分型检测操作简便，成本低廉。

Description

基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物、试剂盒及应用。

背景技术

地中海贫血是最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫，分别由α-珠蛋白基因簇和β-珠蛋白基因簇异常表达引起。主要分布于东南亚地区，据估计全球约1.5％的人口(80至9000万人)是地中海贫血携带者，每年至少有6万多新生儿受到严重影响，在发展中国家占绝大多数。在我国长江以南地区是地贫的高发区，主要是广西，广东，海南三省。目前对本病尚无有效的治疗方法，重型α地贫患儿在出生的24－48小时之内死亡，而且产妇因胎儿水肿、大胎盘，极易导致死产；重型β地贫患者在出生后半年起始出现进行性贫血，只能靠输血维持生命，多在童年夭折。这已成为一个重大的公共卫生问题，造成了巨大的经济负担，影响社会发展。

β-地贫主要是由β-珠蛋白基因的点突变引起，也有少部分是由β-珠蛋白基因簇的大片段缺失所致。β- 珠蛋白基因簇位于11号染色体上，包括5个功能基因和1个假基因。基因排列顺序从5'到3'分别是： ε(HBE1)、^Gγ(HBG2)、^Aγ(HBG1)、ψβ(HBBP1)、δ(HBD)和β(HBB)(图1、表1)。我国目前已报道了中国人群的β珠蛋白基因簇的11种大片段缺失，包括Chinese ^Gγ(^Aγδβ)⁰-Thal缺失，Yunnanese缺失，Cantonese 缺失，Taiwanese缺失，(SEA)-HPFH缺失，Chinese ^Gγ(^Aγδβ)⁰-Thal-2缺失，HPFH-6缺失，Filipino del缺失， β118k del缺失，β21.9k del缺失和β7.3k del缺失(图1、表2)。目前国内对于地贫的基因检测产品通常只限于α-地贫的常见三种缺失与点突变，和β地贫的常见17个位点的点突变的检测，不能检测β珠蛋白基因簇的缺失型突变。实验室诊断HPHF和δβ地贫主要依赖血液学分析，这需要综合多项RBC和Hb指标才能作出诊断，且常难确诊。对于单纯携带缺失型β地贫基因的患者而言，其血液学表现特点及分子病理基础，在常规血液学筛查与基因检测中往往被漏诊，这类患者当其与β地贫携带者结合时，则可导致中度和重度β-地贫患儿的出生。

表1β-珠蛋白基因簇

表2中国人群β-珠蛋白基因簇11种缺失型突变

对于缺失型突变的检测，目前国内外主流技术为跨越断裂位点PCR法(Gap-PCR)，通过设计两对引物：一对位于缺失基因断裂点两侧；另一对引物其中一侧与上述引物中的一侧共享,另一侧位于缺失区域, 用以扩增正常基因作为正常对照带。从而能区分野生型、突变纯合子、突变杂合子或双重杂合子。部分实验室采用自己建立的Gap-PCR方法能增加检测缺失突变类型，然而基于已知缺失片段建立的方法只能检测该缺失类型，检测结果阴性也无法完全排除存在其它缺失型的可能，而且各种可能的缺失型只能分开逐一进行检测，费时费力、检测效率低。荷兰学者Sehouten等于2002年研发的多重连接酶依赖探针扩增技术 (multiplex ligation-dependent probe amplification assay，MLPA)也是另一种可选择的用于缺失型地贫的分子诊断技术。此外还有DNA测序技术，常用於检测出不常见或者罕见类型的点突变、微缺失或者插入突变。但这些方法操作相对繁琐、仪器设备条件要求较高，不适合基层单位常规应用，而且这只能逐一增加有限的检测类型，仍未能检测出β珠蛋白基因簇所有的缺失型突变。

因此，临床上急需一种通用、高效和准确的地贫缺失型突变检测技术，尽可能多的覆盖中国人群β珠蛋白基因簇缺失突变类型，减少缺失型β地贫的漏检率，来指导临床诊断、人群筛查和遗传咨询，为地中海贫血的预防、诊断和治疗提供科学的理论根据。

发明内容

本申请的首要目的在于提供一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物。

本申请的另一目的在于提供一种基于SNP分析的缺失型β-地中海贫血检测试剂盒。

本申请的再一目的在于提供上述基于SNP分析的缺失型β-地中海贫血检测试剂盒的应用。

本发明的上述目的，通过以下技术方案予以实现：一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物，包括引物SNP1-in-F、SNP1-in-R、SNP2-in-F、SNP2-in-R、SNP3-in-F、SNP3-in-R、SNP4-in-F、SNP4-in-R、 SNP5-in-F、SNP5-in-R、SNP6-in-F、SNP6-in-R、OUT-F和OUT-R(表3)；

表3 SNP位点分型检测体系引物设计(Tetra-Primer ARMS-PCR)

内外侧引物5’端添加一段非同源序列作为通用接头(Tag)：正向引物5’端添加Tag-F(5’-GCGTACTAGCGTACCAC GTGTCGACT-3’)，反向引物5’端添加Tag-R(5’-CAGGCCACGTTTTGTCATGCAATC-3’)；

内侧引物的3’末端碱基为SNP位点(加粗)；内侧引物3’端倒数第三个碱基为人工引入的错配碱基(下划线)。

上述引物针对的SNP位点涉及6个SNP位点，分别为rs7480526、rs713040、rs10742584、rs74234654、 rs35755129和rs11036364，该组SNP位点在人群中的杂合度为93.3％，其分布区域为 NC_000011.9:g.5247733-5249004，这6个SNP位点涉及了9种中国人群β-珠蛋白基因簇缺失突变，分别为： Chinese ^Gγ(^Aγδβ)⁰-Thal缺失、Yunnanese缺失、Cantonese缺失、(SEA)-HPFH缺失、Chinese Gγ(^Aγδβ)⁰-Thal-2 缺失、HPFH-6缺失、Filipinodel缺失、β118k del缺失和β21.9k del缺失；发明人经研究发现，通用接头引物能平衡各引物间的GC含量，在保证引物扩增的特异性的情况下，提高其扩增效率，引入通用接头引物便于多重PCR反应实验体系的优化，进而发明人通过创造性劳动设计了本发明所述基于SNP位点分析的中国人群9种缺失型β-地中海贫血突变检测引物。

一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，包括上述基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物。

所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，还包括PCR反应用的DNA聚合酶、PCR 反应用的缓冲液、dNTP Mixture混合物和用于PCR扩增的水中的至少一种。

所述的用于PCR扩增的水优选为双蒸水或超纯水。

所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，优选包括引物预混液A、引物预混液B和用于PCR扩增的Premix LA Taq^TM预混液；引物预混液A包括引物SNP1-in-F、SNP1-in-R、SNP3-in-F、 SNP3-in-R、SNP5-in-F、SNP5-in-R、OUT-F和OUT-R；引物预混液B包括SNP2-in-F、SNP2-in-R、SNP4-in-F、 SNP4-in-R、SNP6-in-F、SNP6-in-R、OUT-F和OUT-R。

所述的引物预混液A中SNP1-in-F：SNP1-in-R：SNP3-in-F：SNP3-in-R：SNP5-in-F：SNP5-in-R：OUT-F： OUT-R＝摩尔比0.04：0.2：0.04：0.2：0.2：0.12：0.2：0.2。

所述的引物预混液B中SNP2-in-F：SNP2-in-R：SNP4-in-F：SNP4-in-R：SNP6-in-F：SNP6-in-R：OUT-F： OUT-R＝摩尔比0.04：0.2：0.2：0.2：0.2：0.04：0.2：0.2。

所述的用于PCR扩增的Premix LA Taq^TM预混液包括PCR反应用的DNA聚合酶、缓冲液和dNTP Mixture混合物。

所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒的应用，包括如下步骤：

(1)配制PCR反应体系，将待测样本的基因组DNA、上述基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物、PCR反应用的DNA聚合酶、PCR反应用的缓冲液、dNTP Mixture混合物和用于PCR扩增的水混合，配制得到PCR反应体系A和PCR反应体系B；其中，PCR反应体系A中，各引物的浓度如下：SNP1-in-F 0.04μM、SNP1-in-R 0.2μM、SNP3-in-F 0.04μM、SNP3-in-R0.2μM、SNP5-in-F 0.2μM、SNP5-in-R 0.12μM、 OUT-F 0.2μM和OUT-R 0.2μM；PCR反应体系B中，各引物的浓度如下：SNP2-in-F 0.04μM、SNP2-in-R 0.2μM、SNP4-in-F 0.2μM、SNP4-in-R 0.2μM、SNP6-in-F 0.2μM、SNP6-in-R 0.04μM、OUT-F 0.2μM和OUT-R 0.2μM；

(2)进行PCR反应；

(3)将得到的PCR产物进行电泳，根据电泳条带大小鉴定分型；

(4)结果判读：根据样本SNP基因型的杂合型存在与否可以判断是否发生了9种中国人群β-珠蛋白基因簇缺失突变；多重PCR分型体系中SNP分型结果的判读如图2所示，根据各个SNP的特异性产物带出现与否判断位点基因型：只有一条特异性产物条带即该位点为纯合型，若有两条特异性产物条带即该位点为杂合型；无论各个SNP位点显示何种基因型，每个SNP位点至少呈现一条位点特异性产物带，否则扩增失败；每个样本都必须有共同外侧产物带(1660bp)，否则扩增失败；若实验结果显示样本的6个SNP 中存在杂合型位点，则可以排除上述9种缺失型突变；反之，若6个SNP位点分型检测结果都是纯合型，则该样本很有可能发生了9种中国人群β-珠蛋白基因簇缺失突变中的某种β-珠蛋白基因簇缺失导致了杂合性丢失(基于本实验的105例人群测序数据显示：正常人群中该组SNP位点至少有一个位点是杂合型的人群占总人群量的93.3％)，提示需做进一步临床检测。

所述的PCR反应体系A的组成优选如下：每50μL反应体系中，Premix LA Taq^TM预混液25μL、 SNP1-in-F(10μM)0.2μL、SNP1-in-R(10μM)1μL、SNP3-in-F(10μM)0.2μL、SNP3-in-R(10μM) 1μL、SNP5-in-F(10μM)1μL、SNP5-in-R(10μM)0.6μL、OUT-F(10μM)1μL和OUT-R(10μM) 1μL；DNA模板100～120ng，余量为用于PCR扩增的水。

所述的PCR反应体系B的组成优选如下：每50μL反应体系中，Premix LA Taq^TM预混液25μL、 SNP2-in-F(10μM)0.2μL、SNP2-in-R(10μM)1μL、SNP4-in-F(10μM)1μL、SNP4-in-R(10μM) 1μL、SNP6-in-F(10μM)1μL、SNP6-in-R(10μM)0.2μL、OUT-F(10μM)1μL和OUT-R(10μM) 1μL；DNA模板100～120ng，余量为用于PCR扩增的水。

所述的PCR反应的条件优选如下：95℃预变性5min；95℃变性30s、50℃复性30s、72℃延伸60s，循环20次；95℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸60s，循环15次；最后72℃延伸10min。

所述的电泳优选为琼脂糖凝胶电泳。

所述的琼脂糖凝胶的浓度为质量体积比1.5％。

所述的电泳的条件优选为：电压120V，电泳10分钟；电压150V，电泳60分钟。

所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒可在非诊断目的的研究中进行应用，如实验研究领域中。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点及有益效果：

(1)本发明首次将SNP杂合度分析技术应用于β-珠蛋白基因簇缺失型突变检测，开发一种基于DNA 片段缺失可导致常见SNP位点的杂合度缺失这一原理的β-珠蛋白基因簇缺失型突变基因检测新方法，覆盖了中国人群9种β-珠蛋白基因簇缺失型突变。

(2)本发明通过整理中国人群β-珠蛋白基因簇缺失型突变类型(表2)，对105例正常人群样本进行测序，结合生物信息学分析筛选得到了一组β-珠蛋白基因簇缺失型突变范围内的6个SNP位点，根据样本SNP基因型的杂合型存在与否可以判断是否发生了β-珠蛋白基因簇缺失型突变。若实验结果显示样本的6个SNP中存在杂合型位点，则可以排除9种β-珠蛋白基因簇缺失型突变。反之，若6个SNP位点分型检测结果都是纯合型，则该样本很有可能发生了β-珠蛋白基因簇缺失突变而导致杂合性丢失(基于本实验的105例人群测序数据显示：正常人群中该组SNP位点至少有一个位点是杂合型的人群占总人群量的93.3％)，提示需做进一步临床检测。

(3)本发明通过7对引物的设计、PCR反应体系和条件优化，采用四引物扩增受阻突变PCR (Tetra-Primer ARMS-PCR)技术，并将6个SNP位点的检测整合至两个多重PCR体系，PCR产物通过 1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。对SNP的分型检测操作简便，成本低廉，不需要特殊仪器设备。

附图说明

图1为中国人群β-珠蛋白基因簇的11种缺失突变示意图。

图2为多重Tetra-Primer ARMS-PCR的SNP分型检测体系的结果判读方法示意图；其中，泳道M为 DL2000 DNA Marker，泳道A为多重体系A中3个SNP位点分型产物带，泳道B为多重体系B中3个SNP 位点分型产物带；PCR反应体系A：1660bp条带为必需条带；263bp条带为SNP1位点T型，1492bp条带为SNP1位点G型，2条带同时存在为TG杂合型；1300bp条带为SNP3位点C型，451bp条带为SNP3 位点T型，2条带同时存在为CT杂合型；1390bp条带为SNP5位点T型，381bp条带为SNP5位点C型， 2条带同时存在为TC杂合型；PCR反应体系B：1660bp条带为必需条带；772bp条带为SNP2位点T型， 976bp条带为SNP2位点C型，2条带同时存在为TC杂合型；1372bp条带为SNP4位点A型，396bp条带为SNP4位点T型，2条带同时存在为AT杂合型；1537bp条带为SNP6位点T型，215bp条带为SNP6位点C型，2条带同时存在为TC杂合型。

图3为SNP位点筛选方案示意图。

图4为SNP位点MAF筛选及连锁不平衡分析结果示意图。

图5为Tetra-Primer ARMS-PCR引物的优选结果电泳图；其中，A为体系A中SNP1、SNP3、SNP5 位点引物的优选结果图，B为体系B中SNP2、SNP4、SNP6位点引物的优选结果图；泳道M为DL2000 Marker，泳道1-T为SNP1位点T基因型条带，泳道1-G代表SNP1位点G基因型条带，泳道3-C代表SNP3 位点C基因型条带，泳道3-T代表SNP3位点T基因型条带，泳道5-T代表SNP5位点T基因型条带，泳道5-C代表SNP5位点C基因型条带，泳道2-T代表SNP2位点T基因型条带，泳道2-C代表SNP2位点 C基因型条带，泳道4-A代表SNP4位点A基因型条带，泳道4-T代表SNP4位点T基因型条带，泳道6-T 代表SNP6位点T基因型条带，泳道6-C代表SNP6位点C基因型条带，泳道OUT代表共同外侧带。

图6为Tetra-Primer ARMS-PCR单个SNP分型体系的优化结果电泳图；其中，A为体系A中单个SNP 位点分型检测结果图，B为体系B中单个SNP位点分型检测结果图；泳道M为DL2000 Marker，泳道1-TT 代表SNP1纯合型(TT)，泳道1-GG代表SNP1纯合型(GG)，泳道1-TG代表SNP1杂合型(TG)，泳道 3-CC代表SNP3纯合型(CC)，泳道3-TT代表SNP3纯合型(TT)，泳道3-CT代表SNP3杂合型(CT)，泳道5-TT代表SNP5纯合型(TT)，泳道5-CC代表SNP5纯合型(CC)，泳道5-TC代表SNP5杂合型(TC)，泳道2-TT代表SNP2纯合型(TT)，泳道2-CC代表SNP2纯合型(CC)，泳道2-TC代表SNP2杂合型(TC)，泳道4-AA代表SNP4纯合型(AA)，泳道4-TT代表SNP4纯合型(TT)，泳道4-AT代表SNP4杂合型(AT)，泳道6-TT代表SNP6纯合型(TT)，泳道6-CC代表SNP6纯合型(CC)，泳道6-TC代表SNP6杂合型(TC)。

图7为多重Tetra-Primer ARMS-PCR的SNP分型检测体系优化结果电泳图；其中，泳道M为DL2000 Marker，泳道A为反应体系A得到的产物，泳道B为反应体系B得到的产物；反应体系A得到的产物包括SNP1杂合型(TG)、SNP3杂合型(CT)以及SNP5杂合型(TC)，反应体系B得到的产物包括SNP2杂合型 (TC)条带、SNP4杂合型(AT)和SNP6杂合型(TC)。

图8为实施例2中临床标本检测结果电泳图；其中，泳道M为DL2000 Marker；泳道1-A中的条带代表标本1的SNP1纯合型(TT)、SNP3纯合型(TT)、SNP5纯合型(CC)，泳道1-B中的条带代表标本1的SNP2纯合型(TT)、SNP4纯合型(AA)、SNP6纯合型(CC)，泳道2-A中的条带代表标本2的SNP1 纯合型(GG)、SNP3纯合型(TT)、SNP5纯合型(CC)，泳道2-B中的条带代表标本2的SNP2纯合型 (CC)、SNP4纯合型(TT)、SNP6纯合型(CC)，泳道3-A中的条带代表标本3的SNP1纯合型(TT)、 SNP3纯合型(CC)、SNP5纯合型(TT)，泳道3-B中的条带代表标本3的SNP2纯合型(TT)、SNP4纯合型(AA)、SNP6纯合型(TT)，泳道4-A中的条带代表标本4的SNP1杂合型(TG)、SNP3杂合型(CT)、 SNP5纯合型(CC)，泳道4-B中的条带代表标本4的SNP2纯合型(TT)、SNP4杂合型(AT)、SNP6杂合型(TC)，泳道5-A中的条带代表标本5的SNP1杂合型(TG)、SNP3杂合型(CT)、SNP5杂合型(TC)，泳道5-B中的条带代表标本5的SNP2杂合型(TC)、SNP4杂合型(AT)、SNP6杂合型(TC)，泳道6-A 中的条带代表标本6的SNP1纯合型(TT)、SNP3杂合型(CT)、SNP5纯合型(CC)，泳道6-B中的条带代表标本6的SNP2纯合型(CC)、SNP4纯合型(TT)、SNP6纯合型(CC)。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本发明建立了一种基于SNP分析的β-珠蛋白基因簇缺失突变检测方法。本发明通过生物信息学分析和大量人群样本测序数据，筛选出一组针对β珠蛋白基因簇缺失突变检测的6个SNP位点。基于四引物扩增受阻突变PCR的原理，设计了针对上述SNP位点的特异性引物，并将6个SNP位点的分型检测整合至两个多重PCR体系。同时对引物进行了优选，对多重PCR扩增反应体系进行了优化。

本发明中所使用的基因组模板为从外周血提取基因组得到，外周血标本采集自广东省。

(一)SNP位点筛选

基于DNA片段缺失可导致常见SNP位点杂合度缺失的原理，本实验室首先通过查阅相关数据库整理了中国人群β-珠蛋白基因簇缺失突变类型，明确缺失片段的断裂位点。同时结合β-珠蛋白基因簇的信息确认 SNP的候选范围。随后获取此基因区域内中国南方人群所有的SNP位点信息，剔除最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)<0.05和连锁不平衡的位点，确定候选SNP。针对候选SNP位点进一步做人群样本测序分析，调查正常人群样本中各个候选SNP位点的基因型，挑选出一组SNP位点使得存在杂合型位点的人群样本在总人群中占比最高(图3)。

1.1生物信息学分析

1.1.1确定SNP位点选取区域

我国目前已经报道的中国人群β-珠蛋白基因簇大片段缺失型突变类型有11种(http://globin.cse.psu.edu/hbvar/menu.html)，包括Chinese Gγ(Aγδβ)0-Thal缺失，Yunnanese缺失，Cantonese 缺失，Taiwanese缺失，(SEA)-HPFH缺失，Chinese Gγ(Aγδβ)0-Thal-2缺失，HPFH-6缺失，Filipino del 缺失，β118k del缺失，β21.9k del缺失和β7.3kdel缺失(图1、表2)。根据β珠蛋白基因簇11种缺失突变的断裂区域，结合β珠蛋白基因簇信息，确定SNP位点选取的范围为HBD基因-5'端至SEA-HPFH缺失型-3'端(NC_000011.9:g.5222878-5255858)。

1.1.2获取SNP位点数据

根据上述选取的SNP位点分布区域，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中提取序列位置 11_5222878-5255858(GRCh37版本)，在千人基因组计划(1000GenomesProject) (http://browser.1000genomes.org/Homo_sapiens/UserData/Haploview？db＝core)中获取该区域内所有SNP位点数据(中国南方人群)，共233个SNP位点。

1.1.3SNP位点MAF筛选及连锁不平衡分析

通过Haploview软件筛选出最小等位基因频率(Minor Allele Frequency,MAF)大于0.05的SNP(88个)，随后剔除这些位点中连锁不平衡分析(linkage disequilibrium,LD)r2>0.8的SNP，筛选出不完全连锁的SNP 位点共10个：rs7484061、rs11036342、rs10837631、rs7480526、rs713040、rs10742584、rs74234654、rs3575512、 rs11036364、rs7936823(图4)。

1.2候选SNP的人群测序数据分析

随机选取了2018-2019年于广东省妇幼保健院行地贫筛查的样本105例。入选标准：地贫筛查(血常规筛查和血红蛋白分析)和地贫基因检测结果都阴性；排除标准：地贫基因携带者。

针对上述10个候选SNP位点设计PCR扩增引物。105例样本经DNA提取、PCR扩增和一代测序来分析位点基因型，用Chromas软件分析测序结果。分析每个样本的候选SNP位点基因型，统计在候选SNP位点中至少存在一个杂合型位点的人群样本占总人群样本的比例，挑选出一组SNP使得存在杂合型位点的人群样本在总人群中占比最高。

根据10个候选SNP位点的105例人群样本测序数据分析，最终筛选出一组6个SNP，使得在105个人群样本中有98例样本都存在至少一个杂合型SNP位点，占总人群样本量的93.3％(98/105)。6个SNP分别为rs7480526、rs713040、rs10742584、rs74234654、rs35755129和rs11036364(表4)。其分布区域为 NC_000011.9:g.5247733-5249004，涉及了9种中国人群β-珠蛋白基因簇缺失突变，分别为Chinese Gγ(Aγδβ)0-Thal缺失，Yunnanese缺失，Cantonese缺失，(SEA)-HPFH缺失，Chinese Gγ(Aγδβ)0-Thal-2缺失，HPFH-6缺失，Filipino del缺失，β118k del缺失和β21.9k del缺失。

表4：6个SNP位点

根据样本SNP基因型的杂合型存在与否可以判断是否发生了这9种缺失。若实验结果显示样本的6个 SNP中存在杂合型位点，则可以排除上述9种缺失型突变。反之，若6个SNP位点分型检测结果都是纯合型，则该样本很有可能发生了某种β-珠蛋白基因簇缺失而导致杂合性丢失(基于本实验的105例人群测序数据显示，正常人群中有93.3％的人群该组SNP位点中至少有一个杂合型位点)。杂合性丢失(Loss of heterozygosity，LOH)是指在正常体细胞中有两个染色体组，由于SNP的存在正常体细胞中的基因都具备了成为杂合的可能性；当某条染色体上某个等位基因发生突变或者缺失，导致一对等位基因只剩下了一个等位基因,就丧失了成为杂合的可能性，即杂合性缺失。

基于以上分析可知，本实验成功筛选出一组6个SNP位点，其分布区域涉及了中国人群的9种β-珠蛋白基因簇缺失突变。当实验结果显示该组SNP中存在杂合型位点，则可以排除该样本的上述9种缺失型突变；若实验结果显示此组SNP全是纯合型时，该样本很有可能发生了β-珠蛋白基因簇的缺失型突变(正常人群中有93.3％的人群该组SNP位点中至少有一个杂合型位点)，提示需做进一步临床检测。

(二)6个SNP位点分型检测体系的建立(Tetra-Primer ARMS-PCR)

扩增受阻突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)又称等位基因特异性扩增法(allele specific amplification，ASA)，其基本原理是如果引物的3'端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计特异性引物，其3'端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。本实验采用四引物扩增受阻突变PCR(Tetra-Primer ARMS-PCR)，针对点突变位点设计四条引物(两条内侧特异性引物，两条外侧引物)，在单管PCR中产物通过片段大小区分，能够解决普通等位基因特异性扩增法需要分管检测的难题。为简化实验步骤同时考虑到技术方案的可行性，本发明将6个SNP位点的分型检测整合至两个多重PCR体系，包括体系A(SNP1、SNP3、 SNP5)和体系B(SNP2、SNP4、SNP6)。本发明基于四引物扩增受阻突变PCR的原理，设计了针对上述 SNP位点的特异性引物，同时对引物进行优选，对多重PCR扩增反应体系进行优化。

2.1、PCR引物设计和优选

基于Tetra-Primer ARMS-PCR的原理设计了针对6个SNP位点的特异性引物，同时为了提高 ARMS-PCR对末端碱基错配的分辨力，人为的在内侧特异性引物3'端的倒数第三个碱基引入第二个错配。错配原则：若引物3'端末端碱基与模板为强错配(G/A或C/T)，则在引物倒数第三个碱基引入一个弱错配 (G/T或C/A)，反之亦然；若引物3'端末端碱基与模板为中等错配(A/A或T/T或G/G或C/C)，则在引物倒数第三个碱基引入一个中等错配。

本实验中每个SNP位点有两条内侧特异性引物(SNP-in-F、SNP-in-R)，同时共用一对外侧引物(OUT-F、 OUT-R)。每条引物设计了两组以做备选，备选引物见表5。

表5：待筛选引物

将各个引物配制成10μM备用。以人群外周血样本提取基因组DNA为模板，采用上述备选的引物，每个SNP位点的一条内侧特异性引物与一条外侧共用引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系如下：每50μL 反应体系的组成如下：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的正向引物Primer-F 2μL，反向引物 Primer-R 2μL；DNA模板3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL；振荡混匀后立即进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、50℃复性30s、72℃延伸60s，35个循环；最后72℃ 延伸10min，4℃保存。反应结束后取5μL PCR扩增产物，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压120V，电泳10分钟；电压150V，电泳60分钟。用凝胶成像系统显像拍照，根据电泳条带验证各条引物扩增性能。

各SNP位点扩增效率最高的引物分别为：SNP1-in-F1、SNP1-in-R2、SNP2-in-F1、SNP2-in-R1、 SNP3-in-F1、SNP3-in-R1、SNP4-in-F2、SNP4-in-R2、SNP5-in-F1、SNP5-in-R2、SNP6-in-F2、SNP6-in-R1、 OUT-F1、OUT-R2。

2.2、通用接头引物设计

基于上述扩增效率最高的引物，本发明为平衡多重PCR中各引物的扩增效率，在每条正向引物5'端加正向通用接头Tag-F：5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGTCGACT-3'；在每条反向引物5'端加反向通用接头 Tag-R：5'-CAGGCCACGTTTTGTCATGCAATC-3'；比较加通用接头后的引物与不加通用接头引物的扩增性能。

结果表明，在同样PCR条件下(95℃预变性5min；95℃变性30s、50℃复性30s、72℃延伸60s，35 个循环；最后72℃延伸10min)，加了通用接头的引物其扩增条带亮度高于未加接头的引物，说明通用接头引物能平衡各引物间的GC含量，在保证引物扩增的特异性的情况下，提高其扩增效率，引入通用接头引物便于多重PCR反应实验体系的优化。最终，用于本发明的引物序列见表3所示，引物电泳结果如图5 所示。

2.3、单个SNP分型PCR体系的建立和优化

基于上述设计的SNP位点特异性引物和外侧通用引物，验证引物对单个SNP分型的性能。由于内侧特异性引物和外侧通用引物彼此之间存在竞争性抑制，造成同一管内产物量不等，导致电泳条带亮度相差较大，因此，以SNP1位点为例，对ARMS-PCR反应体系中各引物终浓度进行优化，具体优化过程如下：

以该位点的杂合型为模板DNA，首先进行等浓度引物的ARMS-PCR扩增，每50μL反应体系的组成如下：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的引物SNP-in-F 1μL，SNP-in-R 1μL，Out-F 1μL，Out-R 1μL；模板DNA 3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL。经电泳发现，各目的条带亮度不均，个别引物无扩增条带，因此按倍比关系调整引物浓度：降低亮带引物浓度，增加暗带引物浓度，各引物量从0.1～1μL，相差10倍，将扩增条带亮度趋于一致的一组定为最优的引物浓度。

结果表明，对于SNP1而言，ARMS-PCR最优的反应组分为：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为 10μM的引物SNP1-in-F 0.2μL、SNP1-in-R 1μL、OUT-F 1μL和OUT-R 1μL；DNA模板3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL。参照上述优化过程，优化SNP2～SNP6 5个位点的单个SNP分型PCR体系 (图6)。6个SNP位点最优的单个SNP分型PCR体系如表6所示。

表6：单个SNP分型体系的优化结果

2.4、多重PCR分型体系的建立和优化

2.4.1、多重PCR分型体系的引物浓度优化

对于多重PCR分型体系(反应体系A、反应体系B)，由于不同SNP位点特异性引物之间存在竞争性抑制，造成同一管内产物量不等，导致电泳条带亮度相差较大，因此，以反应体系A为例，对多重PCR反应体系中各引物终浓度进行优化，具体优化过程如下：

基于单个SNP分型的PCR体系优化结果，等比例加入各个SNP的特异性引物。反应体系A的多重PCR 反应组分为：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的引物SNP1-in-F0.2μL、SNP1-in-R 1μL、SNP3-in-F 0.2μL、SNP3-in-R 1μL、SNP5-in-F 1μL、SNP5-in-R 0.2μL、OUT-F 1.5μL和OUT-R 1.5μL；DNA模板3μL (40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL。然后按倍比关系降低亮带引物浓度，增加暗带引物浓度，各引物量从0.1～2μL，相差10倍，将扩增条带亮度趋于一致的一组定为最优的引物浓度。

根据上述实验体系，选取6个SNP位点都为杂合型的样本为模板DNA进行PCR扩增。反应条件为： 95℃预变性5min；95℃变性30s、50℃复性30s、72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min。将所得产物于4℃保存，反应结束后取5μL PCR扩增产物，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析。

将扩增条带亮度趋于一致的一组定为最优的引物浓度，结果表明，多重PCR反应体系A最优的反应组分为：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的引物SNP1-in-F 0.2μL、SNP1-in-R 1μL、SNP3-in-F 0.2μL、SNP3-in-R 1μL、SNP5-in-F 1μL、SNP5-in-R 0.6μL、OUT-F 1μL和OUT-R 1μL；DNA模板3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL(如图7泳道A和表7)。

参照上述引物浓度优化过程，对多重PCR反应体系B中的引物浓度进行优化。反应体系B最优的反应体系成分为：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的引物SNP2-in-F0.2μL、SNP2-in-R 1μL、SNP4-in-F 1μL、SNP4-in-R 1μL、SNP6-in-F 1μL、SNP6-in-R 0.2μL、OUT-F 1μL和OUT-R 1μL；DNA模板3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL(如图7泳道B和表7)。

表7：多重PCR分型体系的引物浓度优化结果

2.4.2、多重PCR分型体系的反应条件优化

基于上述最优的PCR反应体系，在保证扩增效率的情况下为了提高PCR反应的特异性，本实验采取两阶段复性温度进行扩增，并对两阶段的循环数进行优化。两阶段退火温度分别为50℃和56℃，3种不同的循环参数设计如表8所示，用标准PCR反应程序对照。实验结果显示，PCR反应程序采取“循环数2”时扩增效果最好。通过第一轮20个循环的低退火温度程序对模板进行富集，再通过第二轮15个循环的高退火温度程序进行特异性扩增，兼顾了目的产物扩增的高效性和特异性。最终PCR反应条件为：95℃预变性5min； 95℃变性30s、50℃复性30s、72℃延伸60s，循环20次；95℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸60s，循环15次；最后72℃延伸10min，4℃保存。

表8：PCR反应条件优化的循环参数设置

实施例2

取10例为β-珠蛋白基因簇缺失型突变的患者外周血样本，其中包括Chinese ^Gγ(^Aγδβ)⁰-Thal缺失型3例， Yunnanese缺失型2例，Cantonese缺失型2例，(SEA)-HPFH缺失型3例；另取5例无β-珠蛋白基因簇缺失型突变的正常人外周血样本，所有样本基因突变类型经Gap-PCR或MLPA验证。提取上述15例样本的DNA，用以下体系进行扩增，SNP分型结果与测序法对比。

3.1、多重PCR扩增体系配制

反应体系A：每50μL反应体系的组成如下：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的引物 SNP1-in-F 0.2μL、SNP1-in-R 1μL、SNP3-in-F 0.2μL、SNP3-in-R 1μL、SNP5-in-F1μL、SNP5-in-R 0.6μL、 OUT-F 1μL和OUT-R 1μL；DNA模板3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL；混匀后立即进行 PCR扩增。

反应体系B：每50μL反应体系的组成如下：Premix LA Taq^TM预混液25μL、浓度为10μM的引物 SNP2-in-F 0.2μL、SNP2-in-R 1μL、SNP4-in-F 1μL、SNP4-in-R 1μL、SNP6-in-F 1μL、SNP6-in-R 0.2μL、OUT-F 1μL和OUT-R 1μL；DNA模板3μL(40ng/μL)，用于PCR扩增的水补足至50μL；混匀后立即进行PCR扩增。

3.2、PCR扩增

PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s、50℃复性30s、72℃延伸60s，循环20次； 95℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸60s，循环15次；最后72℃延伸10min，随后将PCR扩增产物于 4℃保存。

3.3、琼脂糖凝胶电泳检测

PCR反应结束后取5μL扩增产物，经1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为电压120V，电泳10分钟；电压150V，电泳60分钟。用凝胶成像系统显像拍照，根据电泳条带大小鉴定分型。

3.4、结果判读

临床标本的SNP分型检测结果分别如图8和表9所示，分型结果与测序结果一致。标本1～3、7～13 为β-珠蛋白基因簇缺失，临床诊断为缺失型地中海贫血杂合子，经本实验SNP分型检测显示样本SNP都是纯合型位点；标本4、5、6、14、15临床未检测到β-珠蛋白基因簇缺失，经本实验SNP分型检测显示样本都存在杂合型SNP，可以排除缺失型突变，与临床诊断结果一致。

表9：15例临床样本SNP分型结果

由此可见，本发明能准确地对SNP位点进行分型，而且只需两个多重PCR反应即可以检测6个SNP 位点。实验操作简单、成本低廉、不需要复杂的仪器设备。根据样本SNP基因型的杂合型存在与否即可判断是否发生了中国人群9种缺失型β地中海贫地突变。若实验结果显示样本的6个SNP中存在杂合型位点，则可以排除上述9种缺失型突变。反之，若6个SNP位点分型检测结果都是纯合型，则该样本很有可能发生了上述的某种β-珠蛋白基因簇缺失而导致杂合性丢失(基于本实验的105例人群测序数据显示，正常人群中有93.3％的人群该组SNP位点中至少有一个杂合型位点)，提示需做进一步临床检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省妇幼保健院

<120> 基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物、试剂盒及应用

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP1-in-F

<400> 1

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactgttc atgtcatagg aagggaat 48

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP1-in-R

<400> 2

caggccacgt tttgtcatgc aatcttctaa actgtaccct gttacctc 48

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP2-in-F

<400> 3

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactcaaa cagacaccat ggtgaat 47

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP2-in-R

<400> 4

caggccacgt tttgtcatgc aatcttctcc tcaggagtcc gg 42

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP3-in-F

<400> 5

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactagga gaagatatgc ttagaccc 48

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP3-in-R

<400> 6

caggccacgt tttgtcatgc aatctggatg aaaactctac cgca 44

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP4-in-F

<400> 7

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactatgt atatgtatgt gtgtatatat acacacatat 60

atatattta 69

<210> 8

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP4-in-R

<400> 8

caggccacgt tttgtcatgc aatcgattaa aaccttctgg taagaaaaga aaataa 56

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP5-in-F

<400> 9

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactatgc atatatatgt atatgtatgt gtggat 56

<210> 10

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP5-in-R

<400> 10

caggccacgt tttgtcatgc aatcctggta agaaaagaaa aaatatatat atatatgtgt 60

gtatctg 67

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP6-in-F

<400> 11

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactctgc attaagaggt ctctagtttt tgat 54

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP6-in-R

<400> 12

caggccacgt tttgtcatgc aatcgttttg ggaaacaagc gg 42

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Out-F

<400> 13

gcgtactagc gtaccacgtg tcgactatta gtccaggcag aaacagtt 48

<210> 14

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Out-R

<400> 14

caggccacgt tttgtcatgc aatctgttat acacaatgtt aaggcattaa gt 52

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP1-in-F1

<400> 15

gttcatgtca taggaaggga at 22

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP1-in-F2

<400> 16

taagttcatg tcataggaag ggaat 25

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP1-in-R1

<400> 17

taaactgtac cctgttacct c 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP1-in-R2

<400> 18

ttctaaactg taccctgtta cctc 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP2-in-F1

<400> 19

caaacagaca ccatggtgaa t 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP2-in-F2

<400> 20

cctcaaacag acaccatggt gaat 24

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP2-in-R1

<400> 21

ttctcctcag gagtccgg 18

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP2-in-R2

<400> 22

gacttctcct caggagtccg g 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP3-in-F1

<400> 23

aggagaagat atgcttagac cc 22

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP3-in-F2

<400> 24

ataaggagaa gatatgctta gaccc 25

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP3-in-R1

<400> 25

tggatgaaaa ctctaccgca 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP3-in-R2

<400> 26

gaatggatga aaactctacc gca 23

<210> 27

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP4-in-F1

<400> 27

atatgtatgt gtgtatatat acacacatat atatattta 39

<210> 28

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP4-in-F2

<400> 28

atgtatatgt atgtgtgtat atatacacac atatatatat tta 43

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP4-in-R1

<400> 29

aaaaccttct ggtaagaaaa gaaaataa 28

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP4-in-R2

<400> 30

gattaaaacc ttctggtaag aaaagaaaat aa 32

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP5-in-F1

<400> 31

atgcatatat atgtatatgt atgtgtggat 30

<210> 32

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP5-in-F2

<400> 32

tgaatgcata tatatgtata tgtatgtgtg gat 33

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP5-in-R1

<400> 33

gtaagaaaag aaaaaatata tatatatatg tgtgtatctg 40

<210> 34

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP5-in-R2

<400> 34

ctggtaagaa aagaaaaaat atatatatat atgtgtgtat ctg 43

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP6-in-F1

<400> 35

cattaagagg tctctagttt ttgat 25

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP6-in-F2

<400> 36

ctgcattaag aggtctctag tttttgat 28

<210> 37

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP6-in-R1

<400> 37

gttttgggaa acaagcgg 18

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNP6-in-R2

<400> 38

taggttttgg gaaacaagcg g 21

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OUT-F1

<400> 39

attagtccag gcagaaacag tt 22

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OUT-F2

<400> 40

gcagattagt ccaggcagaa ac 22

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OUT-R1

<400> 41

atacacaatg ttaaggcatt aagt 24

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OUT-R2

<400> 42

tgttatacac aatgttaagg cattaagt 28

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 正向通用接头Tag-F

<400> 43

gcgtactagc gtaccacgtg tcgact 26

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 反向通用接头Tag-R

<400> 44

caggccacgt tttgtcatgc aatc 24

Claims

1.一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物组合，其特征在于所述引物组合包括如下全部引物：序列如SEQ ID NO.1所示的引物SNP1-in-F、序列如SEQ ID NO.2 所示的引物SNP1-in-R、序列如SEQ ID NO.3所示的引物SNP2-in-F、序列如SEQ ID NO.4所示的引物SNP2-in-R、序列如SEQ ID NO.5所示的引物SNP3-in-F、序列如SEQ ID NO.6所示的引物SNP3-in-R、序列如SEQ ID NO.7所示的引物SNP4-in-F、序列如SEQ ID NO.8 所示的引物SNP4-in-R、序列如SEQ ID NO.9所示的引物SNP5-in-F、序列如SEQ ID NO.10所示的引物SNP5-in-R、序列如SEQ ID NO.11所示的引物SNP6-in-F、序列如SEQ ID NO.12所示的引物SNP6-in-R、序列如SEQ ID NO.13所示的引物OUT-F和序列如SEQ ID NO.14所示的引物OUT-R。

2.一种基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测引物组合。

3.根据权利要求2所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，其特征在于：还包括PCR反应用的DNA聚合酶、PCR反应用的缓冲液、dNTP Mixture混合物和用于PCR扩增的水中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，其特征在于：所述的用于PCR扩增的水为双蒸水或超纯水。

5.根据权利要求3或4所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，其特征在于：包括引物预混液A、引物预混液B和用于PCR扩增的Premix LA Taq™预混液；引物预混液A包括引物SNP1-in-F、SNP1-in-R、SNP3-in-F、SNP3-in-R、SNP5-in-F、SNP5-in-R、OUT-F和OUT-R；引物预混液B包括SNP2-in-F、SNP2-in-R、SNP4-in-F、SNP4-in-R、SNP6-in-F、SNP6-in-R、OUT-F和OUT-R。

6.根据权利要求5所述的基于SNP分析的缺失型β地中海贫血检测试剂盒，其特征在于：所述的引物预混液A中SNP1-in-F：SNP1-in-R：SNP3-in-F：SNP3-in-R：SNP5-in-F：SNP5-in-R：OUT-F：OUT-R =摩尔比0.04：0.2：0.04：0.2：0.2：0.12：0.2：0.2；

所述的引物预混液B中SNP2-in-F：SNP2-in-R：SNP4-in-F：SNP4-in-R：SNP6-in-F：SNP6-in-R：OUT-F：OUT-R=摩尔比0.04：0.2：0.2：0.2：0.2：0.04：0.2：0.2。