CN105543339B - 一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法，具体包括胚胎细胞样本的获取、全基因组扩增、目的基因突变位点扩增、全基因组扩增产物及目的基因突变位点的建库、高通量测序和数据分析各主要步骤，通过利用全基因组扩增技术结合高通量测序，一步完成多项综合性检测，避免了使用多方法、多步骤分别进行单基因遗传病突变位点、染色体疾病和连锁分析的检测。本发明所提供的方法为微量样本提供了有利条件，不仅可用于PGD检测，确定胚胎是否携带致病基因和染色体拷贝数异常情况；也适用于反复流产、高龄妇女胚胎的遗传性筛选，实现一个步骤完成单个样本多项检测。因其操作简单、周期短、可行性强，有利于推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因组序列分析领域和生物信息学领域，具体涉及一种利用MALBAC扩增技术结合高通量测序，一步完成单细胞单基因疾病、染色体疾病及连锁分析的方法。
背景技术
遗传疾病是指人体中的遗传物质(染色体或者线粒体DNA上的基因序列)发生改变而引起的疾病，近年来遗传病的发病率逐年增高。在我国，每年有多达数万例染色体异常的患儿出生，染色体异常患儿至今仍无法治愈。而目前已经发现的单基因遗传疾病有7000多种，其中已经明确致病基因的有4000多种，虽然单基因遗传病的单个病种发病率较低，但由于其种类繁多，所以在出生活婴中的总体发病率和人群中的总体患病率并不低，并且大部分单基因遗传病具有致死性、致残性或致畸性，除少部分可以通过某些治疗手段进行校正外，大部分至今尚无有效的治疗手段。解决上述问题的根本途径就是进行出生前或胚胎移植前诊断，避免此类患儿的出生，因此，胚胎着床前遗传诊断对预防单基因遗传病及染色体遗传病的发生和传递具有重要的科学及社会意义。
遗传病的胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是生殖医学重要内容，可以阻断在胚胎着床前，避免患儿出生，从而避免和减少遗传病的发生，减轻家庭和社会的经济负担。目前，胚胎着床前遗传学诊断主要采用FISH和单细胞PCR技术，以及近几年应用到临床PGD的CGHarray和SNP array技术。其中，应用FISH进行胚胎筛选受到探针的限制，不能同时检测所有染色体状态；单细胞固定易导致信号丢失，单细胞PCR技术易造成等位基因脱扣(ADO)，从而引起误诊；CGH array只能诊断染色体数目改变及大片段染色体结构(非平衡易位，重复、缺失)，而SNP array虽能进行所有CGH能诊断的染色体异常，分辨率较CGH提高，但不能同时完成单基因遗传病和染色体疾病的诊断。可见，现有的胚胎植入前遗传学诊断技术仍存在各种不足，无法满足实际需求，在使用和推广上均受到一定的限制。
此外，连锁分析方法现有的主要是采用STR和SNP两种遗传标记。多重荧光PCR技术将多重PCR结合荧光探针检测STR分型，由于STR连锁标记较少，应用到具体案例中可能会没有可用STR位点，所以进行临床检测前需要做大量预实验工作，STR遗传标记大多距离致病位点距离较远，易发生染色体重组导致误诊，且检测成本较高，故此技术无法进行批量检测。而芯片和探针捕获SNP的方法，与普通PCR捕获SNP方法相比较，成本偏高，周期偏长。
现有技术无法通过一步检测同时完成单基因遗传病、染色体异常和连锁分析三项，而由少量细胞获得的全基因组样本，实验过程中分别进行多种检测容易出现等位基因脱扣(ADO)、污染等现象，本领域急需一种能够解决该问题的技术方案。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的不足，提供一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法，利用MALBAC扩增技术结合高通量测序，一步完成胚胎单基因遗传病、染色体疾病及连锁分析等综合性检测，适用范围广，避免了使用多方法、多步骤分别进行单基因遗传病突变位点、染色体疾病和连锁分析的检测。本发明操作简单、工作周期短，实践可行性强，尤其利用高通量测序方法，检测和数据分析快速。
为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下所示：
一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法，包括以下各步骤：
(1)胚胎细胞样本的获得：通过单精子注射获得受精卵，培养至囊胚期在外滋养层细胞分离获得包含3-10个细胞的样本，其中胚胎细胞为非人的其他哺乳动物的胚胎细胞。
(2)全基因组扩增：在样本中加入裂解液放入PCR仪中进行裂解、失活蛋白酶，对获得的细胞裂解样本进行全基因组扩增，优选采用多重退火环状扩增技术(MALBAC)实现；具体而言，在细胞裂解样本中加入预扩增混合液进行第一轮线性扩增，之后再加入扩增混合液进行第二轮指数扩增，将扩增产物进行纯化；MALBAC扩增后的产物在300-2000bp之间。
其中，第一轮线性扩增的条件为：
(1)90-98℃反应90s-5min；
(2)15-25℃反应30s-1min；
(3)25-35℃反应30s-1min；
(4)35-45℃反应20s-1min；
(5)45-55℃反应20s-1min；
(6)55-65℃反应20s-1min；
(7)65-85℃反应2min-6min；
(8)90-98℃反应10-40s；
(9)45-65℃反应5-20s；
(10)重复步骤(2)到步骤(9)5至20个循环。
第二轮指数扩增的条件为：
(1)90-98℃反应10s-50s；
(2)90-98℃反应10s-40s；
(3)45-65℃反应20s-45s；
(4)65-80℃反应75s-5min；
(5)重复步骤(2)到步骤(4)10至30个循环；
(6)将扩增后的产物在0-5℃保存。
(3)目的基因突变位点扩增：在完成引物设计、引物评估之后，将目的基因突变位点进行普通PCR扩增获得PCR产物，将同一样本的PCR产物与步骤(2)中获得的片段化的基因组DNA按照1：(1-100)的质量比混合。其中在进行引物设计时，引物长度为20-25bp，扩增片段大小根据测序用的reads来进行调整设计，单端的不能超过reads长度，双端的不能超过2倍长。
(4)MALBAC扩增产物与目的基因突变位点进行建库。
(5)采用高通量测序平台，对样本进行测序；如果只进行单基因致病位点和染色体拷贝数变异(CNV)分析，每个标本测序平均深度最低为基因组的0.1倍；如果要同时获得SNP连锁信息，每个标本需测序平均深度最低为基因组的2倍。
(6)数据分析
(6.1)将步骤(5)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比对到参考基因组；
(6.2)下机的数据经质控后比对到参考序列上，统计位点的等位基因的分布及其频率，检测目的基因位点突变信息；
(6.3)下机的数据经质控后比对到参考序列上，序列按照一定窗口进行GC矫正，以几千例MALBAC扩增的单细胞数据为数据库进行修正，最终检测出染色体拷贝数变异(CNV)；
(6.4)采用SNP-单体型进行连锁分析：
(6.4.1)选择SNP区域，界定在目的基因上下游1M范围内；
(6.4.2)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；
(6.4.3)SNP过滤：等位基因杂合度差异最低为10％，除去潜在错误的SNP；
(6.4.4)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型：同一SNP位点，在父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；
(6.4.5)分析SNP-单体型：胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传；其中区分型SNP最低为10个，若有3个以上SNP错误，此胚胎SNP-单体型数据视为数据量不足，难以进行分析；
(6.4.6)结果分析：根据步骤(6.4.4)确定父本和母本SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比，根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。
优选地，所述步骤(2)中第一轮线性扩增的条件为：
(1)94℃反应3min；
(2)20℃反应40s；
(3)30℃反应40s；
(4)40℃反应30s；
(5)50℃反应30s；
(6)60℃反应30s；
(7)70℃反应4min；
(8)95℃反应20s；
(9)58℃反应10s；
(10)重复步骤(2)到步骤(9)8个循环。
优选地，所述步骤(2)中第二轮指数扩增的条件为：
(1)94℃反应30s；
(2)94℃反应20s；
(3)58℃反应30s；
(4)72℃反应3min；
(5)重复步骤(2)到步骤(4)17个循环；
(6)将扩增后的产物在4℃保存。
本发明利用MALBAC扩增技术结合高通量测序，一步完成胚胎单基因遗传病、染色体疾病及连锁分析等综合性检测，可操作性强，降低成本，操作简单快速，适用范围广，避免了使用多方法、多步骤分别进行单基因遗传病突变位点、染色体疾病和连锁分析的检测。本发明所提供的方法为微量样本(如胚胎样本)的多种检测提供有利条件，应用广泛，不仅可用于PGD检测，确定胚胎是否携带致病基因位点和染色体拷贝数异常情况；同样适用于反复流产、高龄妇女胚胎的遗传性筛选，实现一个步骤完成单个样本多项检测。综上，本发明操作简单、工作周期短，实践可行性强，尤其利用高通量测序方法，检测和数据分析快速，有利于推广和应用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明MALBAC扩增结果的产物电泳图；
图2为本发明实施例1中胚胎全基因组测序的CNV分析图；
图3为本发明实施例1中目的基因突变位点的Sanger测序图；
图4为本发明实施例1中STR位点连锁分析图。
具体实施方式
下面参照附图对本发明进行更加全面的描述，其中说明本发明的示例性实施例。本发明的示例性实施例及其说明用于解释本发明，但并不构成对本发明的不当限定。
实施例1
一常染色体显性遗传病模型，致病基因为A。本家系中，父本及父本的父亲均为携带者，分别携带Mutation突变位点(c.233delC)。经分析，胚胎9、10、11和12为父源突变携带者的致病性胚胎，胚胎7和8不携带突变位点。
1.取胚胎单细胞：
1.1精卵受精
对MII期的卵子显微注射单精子(ICSI)，将卵子放到(G-MOPS)操作液中，转移到显微操作仪平台上，进行显微操作。
1.2胚胎体外培养
将受精胚在G1培养液(Vitrolife)或Gm培养液中(Global)中培养72小时左右至5-8细胞期，在透明带上进行激光打孔，转移至已经平衡过的G2培养液(Vitrolife)或Gm培养液中(Global)继续培养至囊胚，借助激光将孵化的囊胚外滋养层细胞分离一小团，包含3-10个细胞。
其中，胚胎细胞为非人的其他哺乳动物的胚胎细胞。
2.MALBAC扩增
2.1MALBAC扩增
2.1.1裂解细胞
将胚胎细胞转移至含有5ul裂解液的PCR管中，放入PCR仪中进行裂解，50℃50分钟。
2.1.2失活蛋白酶
将PCR管放入PCR仪中失活，80℃10分钟。
2.1.3第一轮线性扩增
在5μl的细胞裂解样品中加入30μL预扩增混合液。
温度流程：94℃3分钟，8×(20℃---40秒，30℃---40秒，40℃---30秒，50℃---30秒，60℃---30秒，70℃---4分钟，95℃---20秒，58℃---10秒)。
2.1.4第二轮指数扩增
在35μl的预扩增混合液中加入30μl扩增混合液。
温度流程：94℃---30秒，17×(94℃---20秒，58℃---30秒，72℃---3分钟)，4℃保存。
2.2MALBAC扩增结果
单细胞或等量DNA可通过单细胞扩增反应，从每65μL的反应体系中，获得范围在300-2000bp之间的扩增产物2-4μg，产物电泳如图1。图中M表示2K DNA ladder，E1、E2、E3、E4表示四个胚胎扩增产物，NC表示阴性对照，由图1可知，单细胞扩增终产物大小范围在250-2000bp。
2.3MALBAC产物纯化
利用商业纯化试剂盒，进行MALBAC产物的纯化。
3.目的基因突变位点扩增
3.1引物设计
利用Oligo、Primer等引物设计软件或引物专业设计网站进行引物设计，设计时，引物长度20-25bp左右，扩增片段大小根据测序用的reads来进行调整设计，单端的不能超过reads长度，双端的不能超过2倍长。
3.2引物评估
引物设计完成后采用NCBI或UCSC等专业网站进行引物特异性评估(如错配率、发夹结构等等)，评估合格后进行引物合成。
3.3目的基因突变位点扩增
将目的基因突变位点进行普通PCR扩增，来自同一样本的PCR产物和片段化的基因组DNA按照一定质量比进行混合，目的基因突变位点PCR产物：基因组DNA＝1：(10—100)。
4.MALBAC产物及目的基因突变位点的建库
利用商业建库试剂盒，进行MALBAC产物及目的基因突变位点的建库。
5.高通量测序
采用高通量测序平台，对样本进行测序。测序平台不受特别限制，第二代测序平台包括但不限于Illumina公司的GA、GAII、GAIIx、HiSeq1000/2000/2500/3000/4000、X Ten、XFive、NextSeq500/550、MiSeq，Applied Biosystems的SOLiD，Roche的454FLX，ThermoFisher Scientific(Life Technologies)的Ion Torrent、Ion PGM、Ion Proton I/II；第三代单分子测序平台：包括但不限于Helicos BioSciences公司的HeliScope系统，PacificBioscience的SMRT系统，Oxford Nanopore Technologies的GridION、MinION。测序类型可为单端(Single End)测序或双端(Paired End)测序。
如果只进行单基因致病位点和染色体拷贝数变异(CNV)分析，每个标本测序平均深度为只需0.1X；如果要同时获得SNP连锁信息，每个标本需测序平均深度为2X。
6.数据分析
6.1参考序列比对
将测序结果去掉接头及低质量数据，比对到参考基因组。参考基因组可为全基因组、任意染色体、染色体的一部分、基因。参考基因组通常选择已被公认确定的序列可为NCBI或UCSC的基因序列为参考序列(如人类Hg19,小鼠mm10)，或任意一条染色体。比对软件可用任何一种免费或商业软件，如BWA(Burrows-Wheeler Alignment tool)、SOAPaligner/soap2(Short Oligonucleotide Analysis Package)、Bowtie/Bowtie2。
6.2目的基因突变位点分析
下机的数据，经质控后比对到参考序列(如人类Hg19，小鼠mm10)上，统计位点的等位基因(Allele)分布及频率，检测目的基因位点突变信息。
6.3CNV分析
下机的数据，经质控后比对到参考序列(如人类Hg19，小鼠mm10)上，序列按照一定窗口(bin)进行GC矫正，以几千例MALBAC扩增的单细胞数据为数据库进行修正，最终检测出染色体拷贝数，见CNV分析示例：表1和图2。图2中X坐标表示染色体编号，Y坐标表示染色体拷贝数目，箭头所示染色体拷贝数异常染色体。
表1 CNV分析结果
6.4连锁分析
本方法中以SNP-单体型为示例。
6.4.1SNP calling和SNP过滤
选择SNP区域，界定在目的基因上下游1M范围内，杂合度较高(千份个体数据库中频率大于0.3)；SNP间距越小，重组率越小。
用软件获得目标区域的SNP，软件包括但不限于samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少之一。
SNP过滤，等位基因杂合度差异最低10％，除去潜在错误的SNP。
6.4.2筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型。
区分型SNP，即同一SNP位点，父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分。如表2，A-SNP1,父本等位基因型为A/G，母本等位基因型为A/A，父本的父亲个体等位基因型为A/A。说明，父本此位点碱基A与致病位点连锁在同一单体型中，并遗传给后代；父本此位点碱基G与正常等位基因连锁在同一单体型中。这个SNP位点即为区分型SNP，其他位点以此类推，详见表2示例。
表2 A基因区域部分SNP基因型
注释：
1.表2中“_”表示无法得到相应SNP数据(无数据覆盖或深度较低)；
2.粗斜体表示携带的c.233delC致病突变；
3.表2中父本单体型1表示致病突变所在单体型；
4.表2中Mutation为致病突变。
6.4.3分析胚胎SNP-单体型
胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传。胚胎SNP-单体型分析中，区分型SNP最低为10个，若有3个以上SNP错误，此胚胎SNP-单体型分析错误。
6.4.4结果分析
根据6.4.2确定父本和母本SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比。例如，分析表2A-SNP1，胚胎7、8的等位基因中均有碱基G，说明这2个胚胎均不携带父源的致病基因位点；胚胎9、10、11、12的等位基因中均有碱基A，说明这4个胚胎均携带父源的致病基因位点。根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。
7.方法可行性验证
7.1 Sanger测序
对目的基因突变位点设计特异性引物，进行普通PCR扩增和Sanger测序，与高通量测序结果进行比较，用于验证本专利中目的基因突变位点检测方法的可行性，具体结果见图3。图3中黑色标注位置为目的基因突变位点；Sanger测序图中除“A/T/C/G”四种碱基外，另有“R/S/M/W/V”等简单碱基，分别表示由突变引起的A/G、G/C、A/C、G/A/C杂合峰。从图3中可以得知，Sanger测序结果与表2中高通量测序结果一致。
7.2 STR位点连锁分析
对目的基因连锁两个STR位点(STR1和STR2)设计特异性引物，进行STR位点连锁分析，用于验证本发明中高通量测序SNP-单体型分析方法的可行性，具体见图4。其中“■”表示患病男性，“●”表示患病女性，“□”表示正常男性，“○”表示正常女性。图中数字“229”、“235”和“238”表示STR1位点等位基因型，“193”、“195”和“197”表示STR2位点等位基因型。从图4中可以得知，STR位点连锁分析结果与表2中SNP-单体型分析结果一致。
综上，本发明中所述一次测序完成单基因、染色体和连锁分析的方法，可行性和准确性强。
虽然已经通过示例对本发明的特定实施例进行了详细地说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附的权利要求来限定。
Claims (12)
1.一种非疾病诊断的同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法，其特征在于，包括以下各步骤：
(1)胚胎细胞样本的获得：通过单精子注射获得受精卵，培养至囊胚期在外滋养层细胞分离获得包含3-10个细胞的样本，所述胚胎细胞为非人的其他哺乳动物的胚胎细胞；
(2)全基因组扩增：在样本中加入裂解液放入PCR仪中进行裂解、失活蛋白酶，对获得的细胞裂解样本进行全基因组扩增；
(3)目的基因突变位点扩增：在完成引物设计、引物评估之后，将目的基因突变位点进行普通PCR扩增获得PCR产物，将同一样本的PCR产物与步骤(2)中获得的片段化的基因组DNA按照一定比例混合；
(4)全基因组扩增产物与目的基因突变位点进行建库；
(5)采用高通量测序平台，对样本进行测序；
(6)数据分析
(6.1)将步骤(5)获得的测序结果去掉接头以及低质量数据，采用比对软件比对到参考基因组；
(6.2)下机的数据经质控后比对到参考序列上，统计位点的等位基因的分布及其频率，检测目的基因位点突变信息；
(6.3)下机的数据经质控后比对到参考序列上，序列按照一定窗口进行GC矫正，以几千例全基因组扩增的单细胞数据为数据库进行修正，最终检测出染色体拷贝数变异(CNV)；
(6.4)采用SNP-单体型进行连锁分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的全基因组扩增由多重退火环状扩增技术(MALBAC)实现，包括第一轮线性扩增和第二轮指数扩增。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一轮线性扩增的条件为：
(1)90-98℃反应90s-5min；
(2)15-25℃反应30s-1min；
(3)25-35℃反应30s-1min；
(4)35-45℃反应20s-1min；
(5)45-55℃反应20s-1min；
(6)55-65℃反应20s-1min；
(7)65-85℃反应2min-6min；
(8)90-98℃反应10-40s；
(9)45-65℃反应5-20s；
(10)重复步骤(2)到步骤(9)5至20个循环。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第一轮线性扩增的条件优选为：
(1)94℃反应3min；
(2)20℃反应40s；
(3)30℃反应40s；
(4)40℃反应30s；
(5)50℃反应30s；
(6)60℃反应30s；
(7)70℃反应4min；
(8)95℃反应20s；
(9)58℃反应10s；
(10)重复步骤(2)到步骤(9)8个循环。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第二轮指数扩增的条件为：
(1)90-98℃反应10s-50s；
(2)90-98℃反应10s-40s；
(3)45-65℃反应20s-45s；
(4)65-80℃反应75s-5min；
(5)重复步骤(2)到步骤(4)10至30个循环；
(6)将扩增后的产物在0-5℃保存。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中第二轮指数扩增的条件优选为：
(1)94℃反应30s；
(2)94℃反应20s；
(3)58℃反应30s；
(4)72℃反应3min；
(5)重复步骤(2)到步骤(4)17个循环；
(6)将扩增后的产物在4℃保存。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，MALBAC扩增后的产物在300-2000bp之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的引物设计在设计时，引物长度为20-25bp，扩增片段大小根据测序用的reads来进行调整设计，单端的不能超过reads长度，双端的不能超过2倍长。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR产物与片段化的基因组DNA的混合比例为1：(1-100)。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的高通量测序如果只进行单基因致病位点和染色体拷贝数变异(CNV)分析，每个标本测序平均深度最低为基因组的0.1倍；如果要同时获得SNP连锁信息，每个标本测序平均深度最低为基因组的2倍。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6.4)采用SNP-单体型进行连锁分析具体操作如下：
(1)选择SNP区域，界定在目的基因上下游1M范围内；
(2)用软件获得目标区域的SNP，所述软件包括但不限于samtools mpileup，GATK，FreeBayes，VarScan中的至少一种；
(3)SNP过滤：等位基因杂合度差异最低为10％，除去潜在错误的SNP；
(4)筛选区分型SNP，并构建父本和母本SNP-单体型：同一SNP位点，在父本和母本的4个等位基因碱基中，有1个碱基不同于其他3个即可区分；
(5)分析SNP-单体型：胚胎SNP-单体型有2个，分别遗传自父本和母本各1条，根据区分型SNP和孟德尔遗传原理，判断其SNP-单体型具体哪个是父源遗传，哪个是母源遗传；
(6)结果分析：根据步骤(4)确定父本和母本SNP-单体型，区分出与致病位点连锁的单体型，将胚胎所在SNP的具体等位基因对比，根据孟德尔遗传原理，判断胚胎是否携带致病基因位点。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(5)的胚胎SNP-单体型分析中，区分型SNP最低为10个，若有3个以上SNP错误，此胚胎SNP-单体型数据视为数据量不足，难以进行分析。
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