CN114717337B - 一种细胞交叉污染检测方法及其应用 - Google Patents

一种细胞交叉污染检测方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114717337B
CN114717337B CN202210542989.3A CN202210542989A CN114717337B CN 114717337 B CN114717337 B CN 114717337B CN 202210542989 A CN202210542989 A CN 202210542989A CN 114717337 B CN114717337 B CN 114717337B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
contamination
cross
cells
haplotype
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210542989.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114717337A (zh
Inventor
伍义行
张彤彤
朱羽婕
廉润通
叶子弘
俞晓平
马爱进
赵同标
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Jiliang University
Original Assignee
China Jiliang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Jiliang University filed Critical China Jiliang University
Priority to CN202210542989.3A priority Critical patent/CN114717337B/zh
Publication of CN114717337A publication Critical patent/CN114717337A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114717337B publication Critical patent/CN114717337B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种细胞交叉污染检测方法，包括如下步骤：S1：制备细胞交叉污染样本，并进行细胞DNA提取；S2：根据位点信息设计引物建立多重PCR扩增体系；S3：文库构建成功后进行高通量测序分析；S4：按照判定标准，确认细胞是否存在交叉污染。本发明通过高通量测序技术对微单倍型进行分析，能够获得微单倍型复合体系中SNP位点的全部基因分型，具有速度快、准确可靠性高、集成化等优点。本发明可适用于细胞制剂的质量控制和细胞库对储存细胞系质量的监测。

Description

一种细胞交叉污染检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种细胞交叉污染检测方法及应用。
背景技术
细胞交叉污染(cell cross-contamination)是指细胞在分离、培养和使用过程中，混入了来源于种属内或种属外的非目标细胞而造成的污染。1952年第一株人源细胞系HeLa细胞系被成功建立，从此细胞培养成为生物医药产业发展不可或缺的工具。伴随着细胞培养的广泛应用，细胞错误鉴定或培养物交叉污染逐渐成为一个长期困扰的问题。据统计全球广泛使用的细胞系中有超过400种细胞系经证实被错误鉴定或交叉污染，在美国、欧洲和亚洲等实验室中至少有20％存储的细胞系被错误鉴定或交叉污染。2016年中国科学院昆明细胞库公布在其储存的细胞中发现61种错误鉴定和污染的细胞系。经国家生物医学实验细胞资源库检测，截止2020年3月，共发现107种错误细胞系，其中47种属于建系过程中被污染。而对来自中国22个机构的278种细胞系进行检测，发现有46％的细胞系(128/278)被错误鉴定/交叉污染，其中由中国研究者建立的细胞系中有73.2％(52/71) 被错误鉴定。交叉污染或细胞系身份错误识别而导致的研究结论错误问题，对科研以及生产、临床应用等造成了严重危害。因此，确保细胞系身份真实且不存在交叉污染，是生产用细胞基质以及治疗用细胞产品的关键质控指标。原国家卫生与计划生育委员会、原国家食品药品监督管理总局于2015年发布的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》和2017年发布的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》，也明确指出临床用细胞或细胞治疗产品应进行细胞鉴定，确定细胞无交叉污染。但目前仍缺乏可靠的细胞交叉污染检测体系，迫切需要开发具有更高灵敏度和更具特异性的细胞交叉污染检测新技术。
单倍型(haplotype)是指在一条染色体上，紧密连锁的多个等位基因的线性组合，每一种组合方式可视为一种单倍型。与基因类似，单倍型是具有统计学关联性的遗传标记，可由多个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNP)位点构成，包含丰富的遗传信息，研究单倍型比研究单个SNP位点效果更佳。2013年Kidd教授首次提出微单倍型(microhaplotype)概念，微单倍型的片段长度更短， 200bp范围内可包含2～4个SNP。微单倍型是由SNP线性排列而成，但它具有其独特性，并克服了SNP的缺点，具体表现在：高度多态性、较低突变率、检测方法背景影响小、适用于混合样本和降解样本检测、序列跨度小且长度均衡，能较大程度避免扩增不平衡问题。作为一种新型遗传标记，微单倍型为祖源推断、个体识别及亲子鉴定、法医学以及遗传学相关研究等领域提供了一种新的选择。
目前，细胞交叉污染的检测方法包括细胞形态学特征分析、染色体核型分析、同工酶谱分析、人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型、基于DNA保守序列的PCR种属鉴定法、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)分析、短串联重复序列(short tandem repeat，STR)分析等。2011年美国ATCC发布了基于STR 分型的人源细胞系鉴定标准《Authentication of Human Cell Lines:Standardization of STRProfiling》。2015年美国发布了基于线粒体CO1 DNA条形码的动物细胞种属鉴定标准《Species-Level Identification of Animal Cells through MitochondrialCytochrome Oxidase Subunit 1(CO1)DNA Barcodes》。另外，2010年中国发布了《畜禽体细胞库检测技术规程》(GB/T 24862-2010)；2021年又发布了《哺乳动物细胞交叉污染检测方法通用指南》(GB/T 40172-2021)。目前，人源细胞系的鉴定及交叉污染的检测常采用STR方法。细胞库对细胞质量的监测常采用染色体核型分析、同工酶谱分析以及STR分型技术联合进行。
虽然已开发多种细胞系鉴定和交叉污染检测方法，也发布了多项相关标准，但每种鉴定方法都有自己的局限性，且现有方法存在灵敏度和特异性不足、适用范围有限等问题。据报道采用STR分型法对在中国使用的482种人源肿瘤细胞系进行鉴定，结果发现96种细胞系被错误鉴定，更重要的是还发现单独采用STR法不足以排除细胞交叉污染，因为在被STR鉴定认为无污染的剩余386种细胞系中，采用基于PCR的物种鉴定法仍检出3种细胞系存在交叉污染。STR 分型法虽广泛用于人源细胞系鉴定，但该技术具有局限性：(1)细胞系基因稳定性问题，因在不同实验(培养)条件下，由于外在因素影响可能导致细胞系的DNA STR图谱发生改变从而影响其鉴定结果；(2)随机遗传漂变问题，是由于配子的随机取样引起的基因频率的变动，该因素引起的基因频率的变化是随机的，与由突变、选择和迁移所引起的变化无关；(3)检测灵敏度问题，目前STR技术在实际应用中只能检测10％以上的细胞污染，其灵敏度仍有待提高；(4) STR存在突变率较高且对混合物检测能力不足等缺陷。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明创造性地利用DNA短片段(<200bp)高度多态性和低突变率的优势，建立了一种基于微单倍型(microhaplotype)遗传标记的细胞交叉污染检测方法及应用，克服了传统STR分型方法因产生阴影带和扩增不平衡对复杂混合细胞体系分析能力不足的问题。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种细胞交叉污染检测方法，包括如下步骤：
S1：制备细胞交叉污染样本，并进行细胞DNA提取；
S2：根据位点信息设计引物建立多重PCR扩增体系；
S3：文库构建成功后进行高通量测序分析；
S4：按照判定标准，确认细胞是否存在交叉污染。
进一步的，步骤S2中，在131个微单倍型位点上拆分成172个扩增片段，每个扩增片段均包括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQ ID No.1-SEQID No.344。
进一步的，步骤S2中，共进行两轮PCR反应，第1轮多重PCR 反应分为2个反应管进行，第1轮PCR扩增后，将2个反应管的PCR 产物合并，经磁珠纯化后，进行第2轮多重PCR反应；取第2轮多重PCR反应产物磁珠纯化后，吸取上清液，并将其转移到新的PCR管中，即为制备的多重PCR文库。
进一步的，已知单一细胞样本测序分型结果，步骤S4的结果判定标准如下：与单一细胞样本分型结果比较，若检测到单一细胞样本不存在的基因型，即可判断培养细胞存在细胞交叉污染。
进一步的，未知单一细胞样本测序分型结果，步骤S4的结果判定标准如下：至少两个基因座出现三个及三个以上等位基因时，或者该检测体系中两个以上扩增片段出现多于3个基因型，即可判断培养细胞存在细胞交叉污染。
上述一种细胞交叉污染检测方法，在细胞制剂的质量控制中的应用。
上述一种细胞交叉污染检测方法，在细胞库对储存细胞系质量的监测中的应用。
本发明的突出效果为：
本发明利用DNA短片段(<200bp)高度多态性和低突变率的优势，基于微单倍型遗传标记建立了一种细胞交叉污染检测方法，能够对细胞交叉污染样品中较低含量细胞贡献者进行检测，灵敏度高(能检测 1％的细胞污染)，特异性高，克服了STR扩增不平衡和等位基因覆盖度低等问题，弥补了传统STR分型法对复杂混合细胞体系分析能力的不足。另外，本发明通过高通量测序技术对微单倍型进行分析，能够获得微单倍型复合体系中SNP位点的全部基因分型，具有速度快、准确可靠性高、集成化等优点。本发明可适用于细胞制剂的质量控制和细胞库对储存细胞系质量的监测。
附图说明
图1为本发明实施例的方法流程图；
图2为本发明实施例1的文库质量检测结果图；
图3为本发明实施例3的HEL:HLF＝1:3的混合细胞样品STR分析图谱；
图4为本发明实施例33的HEL:HLF＝1:9的混合细胞样品STR分析图谱。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
微单倍型属于多等位基因遗传标记，能够提供更加丰富的遗传信息，其检测多采用高通量测序技术，能够完整且精准地检测混合DNA 中次要供体的全部基因型，具有以下优势：(1)高度多态性，微单倍型是多个SNP的组合，其所包含的等位基因不是n个SNP等位基因的加和，而是n个SNP的多重组合-2n；(2)低突变率，微单倍型的突变率与SNP相等，约为10-9-10-8/代，而STR突变率却在10-3/代左右，比微单倍型和SNP高了5-6个数量级；(3)检测无阴影带，STR采用毛细管电泳进行分型，存在PCR扩增不平衡，DNA复制滑脱产生 stutter峰等问题，这些会对结果造成不确定性，同理STR不适用于比例失调混合样本的分析，stutter峰的存在会导致无法区分次要供体的等位基因；(4)长度优势，微单倍型序列跨度小于STR，长度也较为均衡，在降解样本检测方面更具优势，且不会出现扩增不平衡问题。微单倍型分析与STR分型相比，其最大优势在于能够对混合DNA 中较低含量贡献者进行检测，克服了STR扩增不平衡和等位基因覆盖度低等问题，且检测限度远低于STR。而采用高通量测序技术分析微单倍型，能够获得微单倍型复合体系中SNP位点的全部基因分型，且具有速度快、准确性高、集成化等优点。
本发明的目的是建立适用于人源细胞系交叉污染的检测方法，以弥补STR分型法的不足。而检测细胞交叉污染，即是对混合细胞样品进行检测，其实质则是对混合的DNA样品进行检测。在微单倍型分析中，如果在单一样品中至少两个位点检测到三个及以上的基因型时，样本可能为混合物，则提示被检细胞样品发生了细胞交叉污染。检测混合物的可能性随着等位基因频率的增加而增加，在群体遗传学概念中一个位点上有效的等位基因数，称为Ae，高Ae的DNA标记具有很高的个体化能力，检测混合物的累积概率也会增加，Ae值越高，检测混合物的可能性就越大。
因此，本发明根据检测人群来源、有效等位基因数(Ae值)、染色体物理空间间隔、微单倍型多态性等标准进行微单倍型位点筛选，共筛选出131个合适位点，经多态性验证后组成微单倍型复合体系。利用构建的微单倍型复合体系，开展不同组合细胞交叉污染的模拟检测。通过建立多重PCR扩增体系，并结合高通量测序技术进行分析。当细胞DNA样本中多个微单倍型位点检测到三个或更多基因型时，可判定为检测细胞发生了交叉污染(方法流程如图1所示)。结果表明：由筛选的131个位点组成的微单倍型检测体系稳定、特异且检测灵敏度高，能检测1％的细胞交叉污染。
主要材料：
1、供试细胞：人肝癌细胞(HuH-7)，购自国家模式与特色实验细胞资源库；人肺成纤维样细胞(HLF)和人皮肤成纤维细胞(HSF)，购自中国科学院昆明细胞库；人胚肝二倍体细胞(CCC-HEL-1)，购自国家生物医学实验细胞资源库；除HuH-7由日本建系外，上述均为中国自建细胞系，出库前通过STR鉴定以确定细胞身份且无污染。
2、DNA Marker A、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、琼脂糖、 50×TAE Buffer、Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒、2X Taq PCR Mix、无水乙醇、Nuclease-free water、QubitdsDNA HS Assay Kit(Thermo Fisher)、Agencourt AMPure XP Kit(Beckman)、HighSensitivity DNA Kit(Agilent)等。
主要仪器：
1、CO2培养箱
2、XP基因扩增仪
3、全自动核酸蛋白分析系统
4、Agilent 2100Bioanalyzer system
5、2.0Fluorometer
6、lumina NovaSeq6000基因DNA测序仪
7、MicroreaderTM21 ID System
8、Thermo ABI 3730xl遗传分析仪
9、其它常规分子生物学研究设备。
实施例1基于混合细胞样品的细胞交叉污染模拟检测
1、细胞培养
采用含10％的胎牛血清的DMEM培养基，在含5％二氧化碳的37℃下的培养箱中培养，待细胞长成单层后即可应用。
2、模拟细胞交叉污染：
贴壁细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液，测定相应的细胞浓度，根据具体细胞数量计算所需的相应单细胞悬液体积，然后将供试细胞不同细胞系按照不同细胞数量比例(1:9、1:19、1:49、1:99)进行混合，作为细胞模拟污染的检测样品。
3、模拟污染细胞的DNA提取：
采用DNA抽提试剂盒按照说明书要求，提取模拟污染细胞的DNA，并用微量核酸蛋白检测仪测定其浓度，每个模拟污染样品制备300ng DNA备测。
4、文库构建及二代测序：
根据扩增位点信息采用Primer Premier 5.0设计引物，选择 Illumina HiseqPE150测序模式，双端测序最长为300bp，对长度大于300bp的片段结合SNP位置进行拆分。在原有131个微单倍型位点 (见附录1)基础上拆分成172个扩增片段(见附录2)，由2个反应管组成，分别为T1(84个)，T2(88个)，共进行两轮PCR反应。第1 轮多重PCR反应分为2个反应管，分别向T1、T2管中加入Primer pool T1，Primer pool T2多重引物，其反应体系如表1所示：
表1第1轮多重PCR反应体系
第1轮PCR扩增后，将2个反应管的PCR产物合并(T1、T2各取15μL)，总体积为30μL。加入27μL室温平衡的AMPure XP 磁珠进行多次纯化后，吸取13.5μL处理后的上清液，转移到新的 200μL PCR管内进行第2轮多重PCR反应，其反应体系如表2所示：
表2第2轮多重PCR反应体系
取第2轮多重PCR反应产物30μL，加入27μL室温平衡的 AMPure XP磁珠进行多次纯化后，吸取20μL处理后的上清液，并将其转移到新的PCR管中，即为制备的多重PCR文库。经浓度、纯度及片段长度等质量检测合格后，在illumina Nova 6000测序平台上进行检测，结果如图2所示。
5、数据分析：
采用BWA软件MEM算法将Clean data与参考基因组 (GRCh37/hg19)比对，同时利用Samtools进行排序等工作。根据 bam结果文件中的cigar值及MD tag值生成单倍型结果。选取部分位点进行Sanger测序以验证结果的重复性和准确性。
6、结果判定：
(1)若已知单一细胞样本测序分型结果，则与单一细胞样本分型结果比较即可，若检测到单一细胞样本不存在的基因型，即可判断培养细胞存在异种细胞污染。
(2)若未知单一细胞样本测序分型结果，则至少两个基因座出现三个及三个以上等位基因时，可考虑该样本为混合物；或者该检测体系中两个以上扩增片段出现多于3个基因型(每种基因型占比大于 2％)，可怀疑样本存在细胞交叉污染。
7、结论：
本方法能准确、特异、灵敏地确认细胞培养物是否存在交叉污染，可用于细胞制剂的质量控制和细胞库对储存细胞系质量的监测。
实施例2基于混合细胞DNA样品的细胞交叉污染模拟检测
1、细胞培养：
采用含10％的胎牛血清的DMEM培养基，在含5％二氧化碳的37℃下的培养箱中培养，待细胞长成单层后即可应用。
2、细胞DNA提取：
贴壁细胞经胰酶消化后，制成单细胞悬液；然后按照DNA抽提试剂盒说明书要求，分别提取每种细胞的DNA，并用微量核酸蛋白检测仪测定其浓度。
3、模拟细胞交叉污染：
根据所测DNA浓度确定稀释比例，将提取的每种细胞DNA稀释至 10ng/μL浓度。然后按不同比例(1:9、1:19、1:49、1:99)将不同细胞的提取DNA进行混合，以模拟细胞交叉污染，并作为细胞交叉污染模拟检测的DNA样品。
4、文库构建及二代测序：
同实施例1
5、数据分析：
同实施例1
6、结果判定：
同实施例1
7、结论：
同实施例1
实施例3本发明方法与STR分型法的比较
1、细胞培养：
采用含10％的胎牛血清的DMEM培养基，在含5％二氧化碳的37℃下的培养箱中培养，待细胞长成单层后即可应用。
2、细胞DNA样品制备：
采用实施例1中同批提取的细胞系DNA，按照不同细胞数量比例(1:9、1:19、1:49、1:99)进行混合，作为细胞模拟交叉污染的检测样品，样本浓度≥50ng/μL。
3、STR分析鉴定：
取适量模拟交叉污染细胞DNA，采用MicroreaderTM21 ID System 扩增20个STR位点和性别鉴定位点，使用ABI 3730xl型遗传分析仪进行PCR产物检测。
4、STR信息比对：
使用GeneMapperID-X软件(Applied Biosystems)对检测数据信息进行处理及分析，并与检测细胞系来源数据库的STR信息进行比对。
5、结果分析：
与细胞库STR信息比对显示，HEL与HLF两种细胞不存在其他人源细胞交叉污染，与微单倍型单细胞组测序结果保持一致，证明了微单倍型分析测序结果的可靠性。在二者混合比例为1:3的情况下STR 检测良好，但对于比例相差较大的混合物，如细胞中混入10％的非目标细胞(即二者混合比例为1:9)时，便无法区分stutter伪峰与交叉污染，影响结果判读，容易出现假阴性结果。STR分析结果如图3 和图4所示。
6、结论：
本发明检测细胞交叉污染的灵敏度为1％，而STR法的检测灵敏度在10％以上。
实施例4细胞交叉污染的检测
1、疑似污染细胞培养物取样：
按照大约1.0×105个细胞的数量，确定待检培养物的取样体积。
2、待检细胞样品的DNA提取：
若待检培养物是贴壁细胞，则先弃去培养液，然后用PBS缓冲液洗2次，再加入裂解液，按照DNA抽提试剂盒说明书要求提取细胞 DNA。若待检培养物是悬浮细胞，则先离心收集细胞，再加入裂解液，按照DNA抽提试剂盒说明书要求提取细胞DNA。最终制备“300ngDNA/ 细胞培养物”备测。
3、文库构建及二代测序：同实施例1
4、数据分析：同实施例1
5、结果判定：同实施例1
6、结论：
本方法能准确、特异地确认1％的人源细胞系交叉污染，可用于细胞制剂的质量控制和细胞库对储存细胞系质量的监测等。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
附录1：131个微单倍型位点信息
/>
/>
/>
/>
/>
附录2：
在原有131个微单倍型位点基础上进行拆分，拆分成172个扩增片段，每个扩增片段均包括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQ ID No.1-SEQID No.344，具体见下表：
/>
/>
/>

Claims (3)

1.一种细胞交叉污染检测方法，其特征在于包括如下步骤：
S1：采集细胞交叉污染样本，并进行细胞DNA提取；
S2：根据131个微单倍型位点的位点信息设计引物建立多重PCR扩增体系；在131个微单倍型位点上拆分成172个扩增片段，每个扩增片段均包括一个正向引物和一个反向引物，正向引物和反向引物的序列为SEQ ID No.1-SEQ ID No.344；
步骤S2中，共进行两轮PCR反应，第1轮多重PCR反应分为2个反应管进行，第1轮PCR扩增后，将2个反应管的PCR产物合并，经磁珠纯化后，进行第2轮多重PCR反应；取第2轮多重PCR反应产物磁珠纯化后，吸取上清液，并将其转移到新的PCR管中，即为制备的多重PCR文库；
131个微单倍型位点信息：
S3：文库构建成功后进行高通量测序分析；
S4：按照判定标准，确认细胞是否存在交叉污染；
当已知单一细胞样本测序分型结果，步骤S4的结果判定标准如下：与单一细胞样本分型结果比较，若检测到单一细胞样本不存在的基因型，即可判断培养细胞存在细胞交叉污染；
当未知单一细胞样本测序分型结果，步骤S4的结果判定标准如下：至少两个基因座出现三个及三个以上等位基因时，或者该检测体系中两个以上扩增片段出现多于3个基因型，即可判断培养细胞存在细胞交叉污染。
2.权利要求1所述的任意一种细胞交叉污染检测方法在细胞制剂的质量控制中的应用。
3.权利要求1所述的任意一种细胞交叉污染检测方法在细胞库对储存细胞系质量的监测中的应用。
CN202210542989.3A 2022-05-18 2022-05-18 一种细胞交叉污染检测方法及其应用 Active CN114717337B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210542989.3A CN114717337B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 一种细胞交叉污染检测方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210542989.3A CN114717337B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 一种细胞交叉污染检测方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114717337A CN114717337A (zh) 2022-07-08
CN114717337B true CN114717337B (zh) 2023-10-13

Family

ID=82232198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210542989.3A Active CN114717337B (zh) 2022-05-18 2022-05-18 一种细胞交叉污染检测方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114717337B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017084624A1 (zh) * 2015-11-18 2017-05-26 上海序康医疗科技有限公司 一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法
CN112941201A (zh) * 2021-03-01 2021-06-11 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017084624A1 (zh) * 2015-11-18 2017-05-26 上海序康医疗科技有限公司 一种同时完成基因位点、染色体及连锁分析的方法
CN112941201A (zh) * 2021-03-01 2021-06-11 武汉珈创生物技术股份有限公司 一种用于多细胞种属鉴别和交叉污染检测的混合引物及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114717337A (zh) 2022-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115029451B (zh) 一种绵羊液相芯片及其应用
CN113718057B (zh) 一种eb病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及应用
CN110846429A (zh) 一种玉米全基因组InDel芯片及其应用
CN109182538A (zh) 奶牛乳腺炎关键SNPs位点rs88640083及2b-RAD基因分型和分析方法
CN113136422A (zh) 通过成组snp位点检测高通量测序样本污染的方法
CN106498078A (zh) 一种检测绵羊kitlg基因的单核苷酸多态性的方法及其应用
CN113564266B (zh) Snp分型遗传标记组合、检测试剂盒及用途
CN107090450B (zh) 与谷子穗长性状相关的分子标记及其检测引物和应用
CN106011259B (zh) 多浪羊snp标记及其筛选方法与应用
CN114717337B (zh) 一种细胞交叉污染检测方法及其应用
CN117106877A (zh) 一种rhd基因引物、引物混合体系、引物混合体系扩增方法、扩增产物质检方法、测序文库构建方法及测序方法
CN116064842A (zh) 一种用于降解检材推断的生物地理祖先DIPs和性别鉴定的复合扩增盒
CN105349659B (zh) 一套适于不结球白菜品种核酸指纹数据库构建的核心snp标记及其应用
CN114836574B (zh) 一种流行性腮腺炎病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN110305947A (zh) 染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法
CN109897822A (zh) 一组人永生化b淋巴细胞系的建立和应用
CN114277187B (zh) 一种呼吸道合胞病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用
CN109457019B (zh) Kcnh2基因scd相关snp检测试剂盒及检测方法
CN115044703B (zh) 一种人冠状病毒HCoV-OC43的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN117587159B (zh) 一种辣椒snp分子标记组合、snp芯片及其应用
CN114790486B (zh) 一种炭疽杆菌的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN114277185B (zh) 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用
WO2023077490A1 (zh) 一种甲、乙和丙型流感病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用
WO2023077486A1 (zh) 一种肺炎支原体的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用
CN102251059B (zh) 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant