CN114277187B - 一种呼吸道合胞病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，本发明公开了一种呼吸道合胞病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用，所述MNP标记组合包括15个标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.15所示；所述引物对组合包括15对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.16‑SEQ ID NO.45所示。所述MNP标记组合能特异的鉴定呼吸道合胞病毒并精细的检测变异；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏、高精准和免培养的检测优势，可应用于大规模样本的呼吸道合胞病毒的鉴定和遗传变异检测，对呼吸道合胞病毒的研究和防疫监测均具有重要意义。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种呼吸道合胞病毒的MNP 标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus)是一种RNA病毒，属于副黏 病毒科肺病毒属，已知的有A和B两个亚型。该病毒在世界范围内广泛流行， 主要通过飞沫传播和密切接触传播，易感人群主要是儿童、老年人和免疫力缺 陷患者。呼吸道合胞病毒感染后婴幼儿症状较重，可有高热、鼻炎、咽炎及喉 炎等症状，后表现为细支气管炎及肺炎等下呼吸道感染，少数患者可并发中耳 炎、胸膜炎及心肌炎等；成年人和较大儿童感染后，主要表现为鼻炎、感冒等 上呼吸道感染。目前尚无特异性的呼吸道合胞病毒治疗药物和预防疫苗，治疗 主要以支持和对症疗法为主。因此，快速、准确的呼吸道合胞病毒的检测对于及时诊断病因，做到早发现早治疗，减少病情恶化具有重要意义。
现有的呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒检测技术主要通过对呼吸道分泌物 进行病毒的血清型鉴定、分离培养鉴定、间接或直接免疫荧光法和检测遗传物 质的分子检测技术，包括PCR、核苷酸杂交和测序技术。这些技术各有优势， 但在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面 也存在一个或多个局限。比如病毒分离鉴定操作复杂、耗时长；血清型鉴定、 间接或直接免疫荧光法容易出现交叉反应，导致分型不准确，且不能监测变异； PCR检测技术一次反应仅针对病毒的1到2个标记进行检测，效率低下，且容 易由于病毒的变异导致检测失败。宏基因组测序技术是另一种检测呼吸道合胞病毒的技术，但其往往包括大量的宿主测序数据，对低病毒载量的样本进行检 测时，尤其需要超深度的测序，导致高的成本。因此，开发快速、准确的、一 次性高通量的检测分型呼吸道合胞病毒的呼吸道合胞病毒检测分析方法对于呼 吸道合胞病毒的检测和防疫都具有重要意义。
本发明开发了新型分子标记-MNP标记，并融合超多重PCR扩增和高通量 测序技术分析检测MNP标记，一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记进 行分型，实现对已知的7种呼吸道合胞病毒的高通量、灵敏检测和精准分型， 具有样本需要量少、、诊断结果精确、节约数据量、检测变异的优势。
本发明开发物种特异的新型分子标记-MNP标记。MNP标记是指在基因组 上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与SSR标记和SNP标记相比， MNP标记具有以下优势：(1)等位基因型丰富，单个MNP标记上有2n种等位 基因型，高于SSR和SNP；(2)物种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能 实现物种鉴定，减少了检测错误率。基于超多重PCR结合二代高通量测序技术 检测MNP标记的MNP标记法具有以下优势：(1)输出的是碱基序列，无需平 行实验，可构建标准化的数据库进行共享共用；(2)高效率，利用样品DNA条 形码，突破测序样品数量的局限，可一次性对成百上千份样本的数万个MNP 标记分型；(3)高灵敏度，利用多重PCR一次检测多个靶标，避免单个靶标扩 增失败导致高的假阴性和低的灵敏度；(4)高准确性，利用二代高通量测序仪 对扩增产物测序数百次。
鉴于以上优点和特性，MNP标记及其检测技术MNP标记法可实现群体生 物多等位基因型的分类与溯源，在病原微生物的鉴定、指纹数据库构建、遗传 变异检测等方面都具有应用潜力。目前在呼吸道合胞病毒的研究中，尚未有关 于MNP标记的报道，也缺乏相应的技术。
因此，亟需开发病原微生物呼吸道合胞病毒的MNP标记和检测引物。本发 明所开发的标记和引物组合将用于制定病原体检测的国家标准(计划编号 20201830-T-469)，该国家标准将于2021年底发布。
发明内容
本发明实施例目的是提供一种呼吸道合胞病毒的MNP标记组合、引物对组 合、试剂盒及其应用，可以对呼吸道合胞病毒的2个亚型进行鉴定和变异检测， 具有免培养、多靶标、高通量、高特异、高灵敏和精细分型的效果。
在本发明的第一方面，提供了一种呼吸道合胞病毒的MNP标记组合，所述 MNP标记是指在呼吸道合胞病毒基因组上筛选的物种特异地、且在物种内具有 多个核苷酸多态性的基因组区域，所述MNP标记组合包括呼吸道合胞病毒参考 序列上MNP-1～MNP-15的15个标记。
上述技术方案中，15个标记具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.15 所示，其中ID NO.16-SEQ ID NO.30为上引物，ID NO.31-SEQ ID NO.45为下引物。 说明书表1对其进一步地说明，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置 是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记组合的多重PCR 引物对组合，所述多重PCR引物对组合包括15对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.16-SEQ IDNO.45所示，其中ID NO.16-SEQ ID NO.30为上引物ID NO.31-SEQ ID NO.45为下引物。
上述技术方案中，每个MNP标记的引物包括上引物和下引物，具体如说 明书表1所示。
在本发明的第三方面，提供了一种用于检测所述呼吸道合胞病毒MNP标记 组合的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对组合。
进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
以及所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或所述的引物对组合或所述 的检测试剂盒在非诊断目的呼吸道合胞病毒定性检测中的应用，在制备呼吸道 合胞病毒定性检测产品中的应用。
在本发明的第四方面，提供了所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或者 所述的多重PCR引物对组合或者所述的检测试剂盒在呼吸道合胞病毒的鉴定、 MNP指纹数据库的构建、遗传变异检测中的应用。
以上所述的应用中，首先是获取待测样本的病毒总RNA；利用商业化试剂 盒对所述总RNA进行cDNA合成；利用本发明的试剂盒对所述cDNA和空白对 照进行第一轮多重PCR扩增，循环数不高于25个；对扩增产物进行纯化后，进 行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯 化后定量；检测多个毒株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序； 测序结果比对到所述的呼吸道合胞病毒的参考序列上，获取在所述cDNA中的 检测序列数目和基因型数据。根据在所述cDNA和所述空白对照获得的呼吸道 合胞病毒测序序列数量和检出MNP标记的数目，对所述cDNA的测序数据进行 数据质量控制和数据分析，获得在所述样本中检出的呼吸道合胞病毒MNP标记 数目、覆盖每个所述MNP标记的测序序列数目和所述MNP标记基因型数据。
当用于呼吸道合胞病毒鉴定时，根据在待测样品和空白对照中检出的呼吸 道合胞病毒的测序序列数量和检出MNP位点的数目，进行质控后判定待测样品 中是否含有呼吸道合胞病毒的核酸。其中，所述的质控方案和判定方法是以拷 贝数已知的呼吸道合胞病毒的RNA为检测样本，评估所述试剂盒检测呼吸道合 胞病毒的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测呼吸道合胞病毒时的 质控方案和判定方法。当用于呼吸道合胞病毒遗传变异检测时，包括毒株间和 毒株内部的遗传变异检测。毒株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方 法，获得待比较毒株各自在15个MNP标记的基因型数据。通过基因型比对，分析待比较毒株在所述15个MNP标记上的主基因型是否存在差异。若待比较 毒株在至少一个MNP标记的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作 为一种备选方案，也可以通过单重PCR对待比较毒株的15个标记分别进行扩增， 然后对扩增产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较毒株每个MNP标记 的基因型进行比对。如果存在主基因型不一致的MNP标记，则待比较毒株之间 存在变异。当检测毒株内部的遗传变异时，则通过统计模型判定在待测毒株所 述的MNP标记是否检出主基因型以外的次基因型。若待测毒株在至少一个MNP 标记存在次基因型，则判定待测毒株内部存在遗传变异。
当用于构建呼吸道合胞病毒MNP指纹数据库时，将从样本中鉴定的呼吸道 合胞病毒的所述MNP标记的基因型数据，录入数据库文件，构成呼吸道合胞病 毒的MNP指纹数据库；每次鉴定不同的样本时，通过和所述呼吸道合胞病毒的 MNP指纹数据库比对，鉴定样本中的呼吸道合胞病毒是否和数据库中的毒株在 所述MNP标记存在主基因型(在一个MNP标记具有超过50％测序片段支持的 基因型)的差异，在至少1个MNP标记存在主基因型差异的呼吸道合胞病毒即 为新的变异类型，收录进MNP指纹数据库。
当用于呼吸道合胞病毒分型时，是对待测样本中的呼吸道合胞病毒进行鉴 定，获得每个所述MNP位点的基因型；收集网上公开的呼吸道合胞病毒的基因 组序列和已构建的呼吸道合胞病毒MNP指纹数据库组成呼吸道合胞病毒参考 序列库；将待测样本中呼吸道合胞病毒的基因型和所述呼吸道合胞病毒的参考 序列库进行比对，筛选遗传上一致或最接近的菌株，获得待测样本中呼吸道合 胞病毒的分型。根据同所述参考序列库的比对结果，鉴定样品中的呼吸道合胞 病毒是已有的型还是新的变型，实现对呼吸道合胞病毒的精细分型。
本发明在呼吸道合胞病毒领域属于首创，并未见相关文献报道；MNP标记 主要基于参考序列开发，根据已报道的呼吸道合胞病毒代表小种的重测序数据 可以挖掘大规模的区分于其他物种、在呼吸道合胞病毒物种内部多态、两侧序 列保守的MNP标记；通过MNP标记两侧的保守序列可以设计适用于于多重PCR 扩增的MNP标记检测引物；再根据标准品的测试结果，可筛选出一套多态性最 大、特异性高的一套MNP标记、兼容性最好的引物组合以及检测试剂盒。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒 及其应用。所提供的呼吸道合胞病毒的15个MNP标记和其引物组合，可进行 多重PCR扩增，融合二代测序平台进行扩增产物的测序，满足对结合分枝杆菌 进行高通量、高效率、高准确性和高灵敏度检测的需求，满足呼吸道合胞病毒 标准的、可共享的指纹数据构建的要求；准确检测呼吸道合胞病毒毒株间遗传 变异的需求；鉴定呼吸道合胞病毒纯合和杂合的需求，为呼吸道合胞病毒的科 学研究、科学监测和防治提供技术支撑。
附图说明
图1为MNP标记多态性原理图；
图2为呼吸道合胞病毒MNP标记的筛选和引物设计流程图；
图3为MNP标记的检测流程图；
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的 说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形 式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的 是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与 属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所 使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设 备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1呼吸道合胞病毒MNP标记组合的筛选和多重PCR扩增引物的设计
S1、呼吸道合胞病毒MNP标记组合的筛选
基于网上公开的呼吸道合胞病毒的13744个呼吸道合胞病毒基因组为参考 序列，通过序列比对，和与NCBI数据库进行对比，获得15个呼吸道合胞病毒 特异的MNP标记。对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序 获得待检测微生物物种代表小种的基因组序列信息，其中高通量测序可以是全 基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10 个遗传上具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。
筛选的15个MNP标记如表1所示：
表1所述MNP标记以及检测引物在参考序列上的起始位置
所述步骤S1具体包括：
选择所述呼吸道合胞病毒的一个或多个代表株的基因组序列作为参考基因 组，将所述基因组序列和所述参考基因组进行序列比对，获得所述呼吸道合胞 病毒各毒株的单核苷酸多态性标记；
在所述参考基因组上，以100-300bp为窗口，以1bp为步长进行窗口平移， 筛选获得多个候选MNP标记区域，其中，所述候选MNP标记区域含有≥2个所 述单核苷酸变异标记，且两端各30bp的序列上均不存在所述单核苷酸多态性标 记；
在所述候选多核苷酸多态性标记区域中筛选区分度DP≥0.2的区域作为 MNP标记；其中，DP＝d/t，t是在所述候选多核苷酸多态性标记区域中所有小 种两两比较时的比较对数，d是在所述候选多核苷酸多态性标记区域中至少两 个单核苷酸多态性差异的样品对数。
作为一种可选的实施方式，在所述参考基因组上，以100-300bp为窗口进 行筛选时，也可选用其他步长，本实施方式采用步长为1bp，有利于全面的筛 选。
S2、多重PCR扩增引物的设计
通过引物设计软件设计所述MNP标记的多重PCR扩增引物，引物设计遵循 引物间互不干扰，所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计 的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。
S3、引物组合的检测效率评估
将湖北省疾控预防控制中心提供的拷贝数已知的呼吸道合胞病毒RNA样品经商业化反转 录试剂盒反转录成cDNA后，加入到人基因组DNA中，制备成1000拷贝/反应的模板，使用所 设计的引物组合，通过多重PCR结合二代测序的检测方法进行检测。构建了4个重复的测序文 库，根据测试结果，最终获得本发明提供的15个MNP标记及其检测引物对组合，具体如表1 所示。
实施例2所述MNP标记组合和引物组合鉴定呼吸道合胞病毒的阈值设置和性 能评估
本实施例中，将湖北省疾控预防控制中心提供的拷贝数已知的呼吸道合胞病毒RNA样品 经商业化反转录试剂盒反转录成cDNA后，加入到人基因组DNA中，制备成1拷贝/反应、10 拷贝/反应和100拷贝/反应的呼吸道合胞病毒模拟样本。同时设置的等体积的无菌水作为空白 对照。共计4个样本，每个样本每天构建3个重复文库，连续检测4天，即每个样本获得12 组测序数据，具体如表2所示。根据在12次重复实验中，在空白对照和呼吸道合胞病毒核苷 酸标准品中检出的呼吸道合胞病毒的MNP标记的测序片段数和标记数，评估检测方法的重现 性、准确性、灵敏度，制定质控体系污染和目标病原体检出的阈值和判定标准。
MNP标记的检测流程如图3所示。
1、MNP标记组合检测试剂盒检测呼吸道合胞病毒的灵敏度和稳定性评估 如表2所示，所述试剂盒能在10拷贝/反应的样本中稳定的检出5个以上MNP 位点，而在0拷贝/反应的少数样本中最多检出2个MNP位点，所述试剂盒能 够明显区分10拷贝/反应和0拷贝/反应的样品，具有技术稳定性和低至10拷 贝/反应的检测灵敏度。
表2呼吸道合胞病毒的MNP标记法的检测灵敏度、稳定性分析
2、MNP标记组合检测试剂盒检测呼吸道合胞病毒的重现性和准确性评估
基于两次重复中，共同检出标记的基因型是否可重现，评估MNP标记检测 方法检测呼吸道合胞病毒的重现性和准确性。具体地，对100拷贝样品的12 组数据分别进行两两比较，结果如表3所示，主基因型存在差异的MNP标记数 目都为0；依据2次重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则，准确率 a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，r代表重现率，即主基因型可重现的标记数目占共有标 记数目的比率。本项目重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间 MNP标记主基因型的差异对数为0，重现率r＝100％，准确率a＝100％。
表3呼吸道合胞病毒MNP标记检出方法的重现性和准确率评估
基于此，所述试剂盒能够准确地检测低至10拷贝/反应的呼吸道合胞病毒。
1、MNP标记检测试剂盒检出呼吸道合胞病毒的阈值判定
如表3所示，在1个拷贝/反应的样本中能检出比对到呼吸道合胞病毒的 序列，至少覆盖1个MNP标记。而在部分空白对照中也检出了呼吸道合胞病毒 的序列。由于MNP标记检测方法的极度灵敏，因此检测过中的数据污染容易导 致假阳性的产生。因此本实例中制定如下质控方案。
质控方案具体如下：
1)测序数据量大于4.5百万碱基。测算依据是每个样品检测MNP标记的 数目是15个，一条测序片段的长度是300个碱基，所以当数据量大于4.5百万 碱基时，大部分样品一次实验可以保证覆盖每个标记的测序片段数量达到1000 倍，保证对每个MNP标记碱基序列的精准分析。
2)根据测试样品中的呼吸道合胞病毒的信号指数S和空白对照中呼吸道合 胞病毒的噪音指数P判定污染是否可接受，其中：
空白对照噪音指数P＝nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中，呼吸道合胞 病毒的测序片段的数量和总测序片段数量。
测试样品的信号指数S＝nt/Nt，其中nt和Nt分别代表测试样品中，呼吸道合胞 病毒的测序片段的数量和总测序片段数量。
3)计算测试样品中MNP标记的检出率，指的是检出标记数和总设计标记 数的比值。
如表4所示，呼吸道合胞病毒1个拷贝的样品和空白对照的信噪比的平均 值是2.5，在10个拷贝的样品和空白对照的信噪比的平均值是31.1，因此，本 发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的。
在10拷贝/反应的12组数据中，能稳定的检出至少5个MNP标记，占总标记 的33.3％。因此，在保证临床检测模板背景的复杂性、核苷酸易降解，兼顾准 确性和灵敏度的情况下，本标准规定呼吸道合胞病毒的信噪比判定阈值是30， 即当样品中呼吸道合胞病毒的信噪比大于30，且标记检出率大于等于30％时， 判定样本中检出了呼吸道合胞病毒的核苷酸。因此本发明所提供的试剂盒能准 确、灵敏的检测到10copy/反应的呼吸道合胞病毒。
表4待测样品中呼吸道合胞病毒的信噪比
4、MNP标记组合检测方法检测呼吸道合胞病毒的特异性评估
人为的将呼吸道合胞病毒和人冠状病毒HCoV-229E、HCoV-NL63、 HCoV-HKU1、HCoV-OC43、SARS-CoV-2、以及人副流感病毒、偏肺病毒、人鼻 病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、肠病毒EV71型、冠状病毒、甲型流感病 毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、禽流感病毒和寨卡病毒的RNA混在一起， 制备混合模板，以空白模板作为对照，采用本发明所提供的试剂盒对混合模板 中的病原体进行检测，进行3个重复实验。结果在3个重复中获得的测序序列 都仅能比对到呼吸道合胞病毒的15个MNP位点。按照所述的质控方案和判定 阈值进行分析后，在3个重复实验中都特异的检出呼吸道合胞病毒的核酸，表 明所述MNP标记组合和所述试剂盒在复杂模板中检测肺炎支原体的高特异性。
实施例3、呼吸道合胞病毒毒株间的遗传变异检测
利用所述的试剂盒和MNP标记组合检测方法对对收集到的一个呼吸道合胞病毒株的6份 拷贝毒株进行检测，样本依次命名为S1-S6，每个MNP标记的测序平均覆盖倍数达1000倍， 每个毒株均可以检出全部15个MNP标记(表5)。将6个毒株的指纹图谱进行两两比对，结 果如表5所示，有1份(S-2)和同批次一起检测的5份呼吸道合胞病毒均存在部分标记的主 基因型差异(表5)，存在毒株间变异。
所述的试剂盒通过检测MNP标记组合鉴定毒株间遗传变异的应用可以用 于保证不同实验室相同命名呼吸道合胞病毒毒株的遗传一致性，从而保证研究 结果的可比较性，这对于呼吸道合胞病毒的科学研究具有重要意义。而在临床 上，可针对差异标记是否影响抗药性斟酌诊断方案。
表4 6个呼吸道合胞病毒的检测分析
实施例4、呼吸道合胞病毒毒株内部的遗传变异检测
作为群体生物，呼吸道合胞病毒群体内部部分个体发生变异，使群体不再 纯合，形成异质的杂合群体，影响尤其是试验用微生物表型的稳定性和一致性。 这种变异体在对群体进行分子标记检测时，表现为标记的主基因型外的等位基 因型。当变异个体还未累积时，只占群体的极少部分，表现为低频率的等位基 因型。低频率的等位基因型往往和技术错误混在一起，导致现有技术难以区分。 本发明检测的是高多态性的MNP标记。基于多个错误同时发生的几率低于一个 错误发生的几率，MNP标记的技术错误率显著低于SNP标记。
本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行：首先按照以下规则排除 具有链偏好性(在DNA双链上覆盖的测序序列数的比值)的等位基因型：链偏 好性大于10倍，或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。
不存在链偏好性的基因型基于表6测序序列数目和比例判定其真实性。表 6列出了基于BINOM.INV函数计算在α＝99.9999％的概率保障下，emax(n＝1)和 emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％时，在各个标记中次等位基因型测序序列数目 的临界值，只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等 位基因型。当存在多个候选次等位基因时，对各候选等位基因型的P值进行多 重校正，FDR<0.5％的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。
表6涉及到的参数emax(n＝1)和emax(n≥2)指的是携带n个SNP的错误等位基 因的测序序列数占该标记总测序序列数的最高比例。emax(n＝1)和emax(n≥2)分别 为1.03％和0.0994％是根据在930个纯合MNP标记检测到的所有次等位基因型 的频率获得。
表6部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值
按照上述参数，将表5中展示的基因型存在差异的两个毒株的核苷酸按照 以下8个比例1/1000，3/1000，5/1000，7/1000，1/100，3/100，5/100，7/100混 合，制备人工杂合样本，每个样本检测3次重复，获得共计24个测序数据。通 过和所述两个毒株的MNP标记的基因型进行精准比对，在24个人工杂合样本 中均检测到了存在杂合基因型的标记，说明了所开发的呼吸道合胞病毒的MNP 标记检测方法在检测毒株群体内部遗传变异的适用性。
实施例5呼吸道合胞病毒MNP指纹数据库的构建
利用常规CTAB法、商业化试剂盒等方法提取用于构建呼吸道合胞病毒MNP 指纹数据库的所有毒株或是样本的RNA，采用琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检 测RNA的质量。将上述6个毒株的测序数据进行序列比对后获得每个毒株每个 标记的主基因型，形成每个毒株的MNP指纹图谱，录入数据库文件，形成呼吸 道合胞病毒MNP指纹数据库。所构建的MNP指纹数据库基于检测的毒株的基 因序列，因此和所有的高通量测序数据兼容。通过将每次检测获得的毒株的 MNP指纹图谱同已构建的MNP指纹数据库进行比对，将主基因型存在差异的毒株的MNP指纹图谱所构建的MNP指纹数据库，实现数据库的共建共享和随 时更新。
实施例6、在呼吸道合胞病毒精细分型中的应用
利用所述的引物组合和MNP标记组合检测方法对上述6份呼吸道合胞病毒 毒株进行检测，获得了每个毒株MNP指纹图谱。将每个毒株的DNA指纹图谱 进行两两比对后，同公开的呼吸道合胞病毒的基因组序列和构建的指纹数据库 进行比对，和已有毒株指纹相同的，为已有的变型，在至少一个MNP标记存在 主基因型差异的，定义为新的变型，实现对呼吸道合胞病毒的精细分型。对6 份呼吸道合胞病毒样本的检测如表5所示，所检测的6份呼吸道合胞病毒有1 份和其他5份在5个MNP标记的主基因型存在差异，可能已突变为不同的变型。 因此，所述的方法对呼吸道合胞病毒的分辨率达到了单碱基的水平，可以实现 对样本中呼吸道合胞病毒的精细分型。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵 盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不 仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种 过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得 知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附 权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和 修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱 离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属 于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包 含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种呼吸道合胞病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及应用
<130> 20210925
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttgttataat tatcttctaa ttctgaatta gca 33
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtcctctctc accacgtgtt aaa 23
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cagtaatact taggttttcc atactcaa 28
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtttattcaa gatggcgtac acctt 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ccaaggaagc atgcaataaa gtgat 25
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
actccattag ctttaacatg atatcc 26
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acggtaaatt tagcattatt aaggcgt 27
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tctcattcag cttcggtatg agaat 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gttgagagca gtgtgttaat tccat 25
Claims (9)
1.一种呼吸道合胞病毒的MNP标记组合，其特征在于，所述MNP标记组合，包括15个标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.15所示。
2.一种用于检测权利要求1所述呼吸道合胞病毒MNP标记组合的多重PCR引物对组合，其特征在于，所述多重PCR引物对组合包括15对引物，具体的引物序列如SEQ ID NO.16-SEQID NO.45所示。
3.一种用于检测权利要求1所述呼吸道合胞病毒MNP标记组合的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
5.权利要求1所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在非诊断目的呼吸道合胞病毒定性检测中的应用。
6.权利要求1所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在制备呼吸道合胞病毒定性检测产品中的应用。
7.权利要求1所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在检测呼吸道合胞病毒毒株内部和毒株间遗传变异中的应用。
8.权利要求1所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在构建呼吸道合胞病毒数据库中的应用。
9.权利要求1所述的呼吸道合胞病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在呼吸道合胞病毒精细分型检测中的应用。
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