CN108410979A - 一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片及其应用 - Google Patents

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Anhui Huada Medical Laboratory Co Ltd
Shenzhen BGI Life Science Research Institute
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Abstract

本发明公开了一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片及其应用。本发明提供了本发明提供的芯片，为根据检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域设计与其互补的探针，再将所述探针固定到芯片上，得到芯片；该芯片同时能够对snp、Indel和大片段缺失重复进行检测的芯片，预计检测单基因疾病4235余种，并根据疾病的具体特点去除了动态突变、体细胞突变及基因组印迹相关基因。通过在特定区域增加捕获区，对来源于DECIPHER、OMIM数据库的148余种染色体疾病进行拷贝数异常检测。通过整合现有已知的单基因及染色体疾病，做到“一站式”解决遗传突变，提高疾病突变的检出率的同时降低检测成本。

Description

一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片及其应用。
背景技术
CNV即拷贝数变异(copy number variation)，在人类基因组中分布广泛，是人类疾病的重要致病因素之一。致病性CNV可引起智力障碍、生长发育迟缓、自闭症、各种各样的出生缺陷、白血病和肿瘤等多种疾病。目前对CNV进行检测的方法主要有aCGH,SNP-array,CNV-seq、MLPA等。aCGH也称为基于芯片的比较基因组杂交(array-based comparativegenomic hybridization)。其采用的双杂交策略，可以检测全基因组水平上的CNV。SNP-array利用待测样本与芯片探针进行单杂交，通过比较不同样本信号的强度来确定每个位点的拷贝数。CNV-seq，即通过低倍全基因组测序检测CNV的技术，检测原理与aCGH相似。MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplication，多重连接依赖式探针扩增)是针对待检DNA靶序列进行定性和半定量分析的技术。验证高度怀疑的特定基因中的点突变、甲基化、CNV。该技术具有快速及特异性高的特点，但是不能对染色体组进行全局分析。以上所有方法，除了SNP-array可对于某些固定的snp进行检测外，基本上无法对点突变进行检测。而对于某些疾病，特别是智力低下相关的疾病，除了大片段的缺失和重复致病外，还有很大可能是由点突变导致。这就意味着，如果智力低下患者未检出致病的大片段缺失和重复，还需要专门进行点突变方面的检测。点突变方面的检测现在的主要方法是基因捕获测序。该方法的主要优势在于可针对特定区域进行测序，有效降低了测序成本，提高了测序深度和准确性。但是，这类技术往往针对检测点突变和基因CDS区域的缺失重复，由于捕获的区域并不均匀，对于大片段，特别是染色体层面的缺失重复基本无能为力。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片。
本发明提供的芯片，为根据检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域设计与其互补的探针，再将所述探针固定到芯片上，得到芯片；
所述检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域按照包括如下步骤的方法获得：
1)、选取单基因疾病捕获区域和选取染色体疾病捕获区域；
所述选取单基因疾病捕获区域的方法包括如下步骤：
1)-1、将单基因疾病相关的每个基因的唯一转录本的CDS区，且将每个CDS区两边分别扩充10bp，记作捕获区域a；将与单基因疾病相关的每个基因对应每个转录本的差异序列，记作捕获区域b；
上述每个基因的唯一转录本为将每个基因根据Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)确定最常用或长度最长的转录本作为该基因对应的唯一转录本；
上述每个转录本的差异序列为每个基因对应的每个转录本两两比较的不同的序列；每个基因的每个转录本数据来源于https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables。
1)-2、将所述捕获区域a和所述捕获区域b合起来记作与单基因疾病相关的基因的捕获区域；
所述选取染色体疾病捕获区域按照包括如下步骤的方法获得：
1)-3、选取各个染色体疾病相关的突变区域的所有基因中关键基因的捕获区域和非关键基因的捕获区域(在数据库中记载关键基因和非关键基因，具体在OMIM数据库中记载)；
所述选取所有基因中关键基因的捕获区域的方法，包括如下步骤：
a)将所述所有基因中的每个关键基因的唯一转录本的CDS区，且将每个CDS区两边分别扩充10bp，记作捕获区域甲，且将所述每个关键基因对应所有转录本的差异序列，记作捕获区域乙；
b)、再将所述捕获区域甲和所述捕获区域乙合起来记作与染色体疾病相关的关键基因的捕获区域；
所述选取所有基因中非关键基因的捕获区域的方法，为如下c)-e)中任一种：
c)、若所有基因中含有小于等于15个非关键基因，则选取每个非关键基因CDS区上随机的100bp作为非关键基因的捕获区域；
d)、若所有基因中含有多于15个非关键基因且小于40个非关键基因，每三个非关键基因选取两个非关键基因的CDS区上随机的100bp作为非关键基因的捕获区域；
e)、若所有基因中含有大于等于40个非关键基因，每隔一个非关键基因的CDS区上随机的100bp作为非关键基因的捕获区域；
1)-6)将所有基因中关键基因的捕获区域和非关键基因的捕获区域组成染色体疾病捕获区域；
2)将所述单基因疾病捕获区域和所述染色体疾病的捕获区域作为检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域。
上述芯片中，
所述单基因疾病相关的基因来源于所述基因疾病关联数据库或测序panel；
或所述各个染色体疾病相关的突变区域的所有基因来源于染色体疾病关联数据库。
上述芯片中，
所述基因疾病关联数据库为OMIM、GeneReviews和/或Orphanet；
或所述染色体疾病关联数据库为Decipher数据库和/或OMIM数据库。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述的芯片的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：根据上述芯片中的方法按照检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域设计与其互补的探针，再将所述探针固定到芯片上，得到芯片。
本发明第3个目的是提供一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，包括上述的芯片。
上述中，所述单基因疾病为1种或多种；
所述染色体疾病为1种或多种。
上述中，所述单基因疾病是由于基因组中碱基突变或致病性CNV引起的疾病；
所述染色体疾病是由于染色体突变或致病性CNV引起的疾病；
所述碱基突变为碱基缺失、碱基插入、碱基点突变或碱基重复；
所述染色体突变为染色体部分缺失或重复。
上述的芯片或上述的试剂盒在同时检测单基因疾病和染色体疾病中的应用也是本发明保护的范围。
上述的芯片或上述的试剂盒在同时捕获与单基因疾病相关基因和与染色体疾病相关基因中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述单基因疾病为1种或多种；
所述染色体疾病为1种或多种；
或所述单基因疾病是由于基因组中碱基突变或致病性CNV引起的疾病；
所述染色体疾病是由于染色体突变或致病性CNV引起的疾病；
所述碱基突变为碱基缺失、碱基插入、碱基点突变或碱基重复；
所述染色体突变为染色体部分缺失或重复。
本发明基于以上事实，设计了一款同时能够对snp、Indel和大片段缺失重复进行检测的芯片。基因靶点是根据多方面的信息确定的，包括OMIM(Online MendelianInheritance in Man)、GeneReviews和Orphanet及其他市售的测序panel。常见染色体异常靶点来源于Decipher数据库和OMIM数据库。预计检测单基因疾病4235余种，并根据疾病的具体特点去除了动态突变、体细胞突变及基因组印迹相关基因。通过在特定区域增加捕获区，对来源于DECIPHER、OMIM数据库的148余种染色体疾病进行拷贝数异常检测。使用BGIseq500测序平台对目前临床研究背景下关注的所有基因及常见染色体变异进行检测。通过整合现有已知的单基因及染色体疾病，做到“一站式”解决遗传突变，提高疾病突变的检出率的同时降低检测成本。
附图说明
图1为芯片设计流程。
图2为微缺失微重复阳性样本检测结果示意图(A)样本测序分析电子核型图(B)微缺失区域信息(C)微缺失区域单基因疾病信息。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片的制备
一、同时检测单基因疾病和染色体疾病的捕获区域的获得
具体流程如图1所示。
1、单基因疾病捕获区域的选取
1)与各个单基因疾病相关的基因的获得
从基因疾病关联数据库如：OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、GeneReviews和Orphanet和其他市售的测序panel中获得与各个单基因疾病相关的基因。
2)与各个单基因疾病相关的基因的捕获区域的选取
与各个单基因疾病相关的基因的捕获区域按照如下方法选择：
a、由于一个基因往往对应多个转录本，首先将每个基因根据Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index)确定最常用或长度最长的转录本作为该基因对应的唯一转录本；然后选取所有基因的唯一转录本(mRNA)的CDS区，且将每个CDS区两边分别扩充10bp，记作捕获区域a；
b、各个单基因疾病相关的每个基因对应每个转录本的差异序列均记作捕获区域b，
目的是为了后期使用的时候可以自由选择转录本进行分析。
将上述捕获区域a和捕获区域b合起来记作与各个单基因疾病相关的基因的捕获区域。
2、染色体疾病捕获区域的选取
1)与各个染色体疾病相关突变区域及该突变区域中的所有基因的获得
从染色体疾病关联数据库如Decipher数据库和OMIM数据库中获得与各个染色体疾病相关的突变区域，将这些突变区域中的所有基因，记作与各个染色体疾病相关的所有基因。
与各个染色体疾病相关的所有基因由关键基因和非关键基因组成(OMIM数据库中记载)。
2)与各个染色体疾病相关的关键基因的捕获区域的选取
根据上述1中2)的与各个单基因疾病相关的基因的捕获区域的选取方法确定与各个染色体疾病相关的关键基因的捕获区域，具体如下：
选取与染色体疾病相关的关键基因的唯一转录本中的CDS区及CDS区两侧各10bp的核酸，记作捕获区域甲；且选取与染色体疾病相关的关键基因的所有转录本的差异区域，记作捕获区域乙；再将所述捕获区域甲和所述捕获区域乙合起来记作与染色体疾病相关的关键基因的捕获区域。
3)与各个染色体疾病相关的非关键基因的捕获区域的选取
与各个染色体疾病相关的非关键基因的捕获区域按照如下方法选取：
a、对于与各个染色体疾病相关的突变区域中小于等于15个非关键基因，选取每个非关键基因CDS区上随机的100bp作为捕获区域。
b、对于与各个染色体疾病相关的突变区域中多于15个非关键基因且小于40个非关键基因，每三个非关键基因选取(随机不重复选取)两个非关键基因的CDS区上随机的100bp作为捕获区域。
c、对于与各个染色体疾病相关的突变区域中大于等于40个非关键基因，每隔一个非关键基因的CDS区上随机的100bp作为捕获区域。
上述3)中a、b和c选取的3种捕获区域与2)选取的捕获区域共同记作染色体疾病捕获区域。
二、同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片的制备
根据上述目标捕获区域设计与其互补的探针，固定到芯片(罗氏NimblegenSeqCap EZ Choice Library)上(液态芯片，也就是杂交发生在液体环境中)，得到同时检测单基因疾病和染色体疾病的液态芯片。
实施例2、同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片的应用
(一)、同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片的制备
一、同时检测单基因疾病和染色体疾病的捕获区域的获得
1、单基因疾病捕获区域的选取和对应杂交探针的设计合成
1)与各个单基因疾病相关的基因的获得
从基因疾病关联数据库如：OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、GeneReviews和Orphanet和其他市售的测序panel中获得与各个单基因疾病相关的基因。
2)与各个单基因疾病相关的基因的捕获区域的选取
按照实施例1的方法选取捕获区域a和捕获区域b。
与各个单基因疾病相关的基因及其对应的捕获区域a和捕获区域b见表1所示：
表1为与各个单基因疾病相关的基因及其对应的捕获区域a和捕获区域b
2、染色体疾病捕获区域的选取
1)与各个染色体疾病相关突变区域及该突变区域中的所有基因的获得
从染色体疾病关联数据库如Decipher数据库和OMIM数据库中获得与各个染色体疾病相关的突变区域，将这些突变区域中的所有基因，记作与各个染色体疾病相关的所有基因。
2)与各个染色体疾病相关的关键基因的捕获区域的选取
按照实施例1的方法选取，结果如表2。
表2
关键基因 捕获区域a
RAI1 NM_030665.3
3)与各个染色体疾病相关的非关键基因的捕获区域的选取
按照实施例1的方法选取。
与各个染色体疾病相关的非关键基因及其对应的捕获区域a和捕获区域b见表3所示。
表3为与各个染色体疾病相关非关键基因及其捕获区域
二、同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片的制备
按照实施例1的方法将上述一的同时检测单基因疾病和染色体疾病的捕获区域合成探针(合成厂家Nimblegen)，再制备得到同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片。
(二)、同时检测单基因疾病和染色体疾病
1、待测样本核酸文库的构建
待测样本为正常人全血和染色体微缺失微重复阳性全血样本，具体如表4所示：
表4为样本信息
上述WHR0407-1针对染色体微缺失微重复选取了1例明确致病区域的阳性样本WHR0407-1。样本信息如下：临床症状为下唇前凸，牙齿不齐，智力低下，多话，词不答义。该样本做过康孕TM-100K染色体检测，结果为46,XN,del(17)(p11.2)，该区域缺失会导致Smith-Magenis综合征。
1)、提取待测样本基因组DNA
从待测样本全血中提取基因组DNA。
将检测合格的DNA(DNA质量完整，未发生降解，总量不低于3ug，采用琼脂糖电泳检测DNA完整性，Qubit测定DNA含量，同时进行SNP质谱检测(Wei X,Ju X,Yi X,Zhu Q,Qu N,Liu T,et al.(2011)Identification of Sequence Variants in Genetic Disease-Causing Genes Using Targeted Next-Generation Sequencing.PLoS ONE 6(12):e29500.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0029500)；检测质谱的作用主要是检测样本是否混样，找了一些snp频率大概为0.5：0.5的位点，通过质谱对这些snp位点进行检测，然后比较质谱的结果和二代的结果，从而检测是否存在混样现象，结果待测样本没有混样现象。
2)、待测样本核酸文库的构建
将上述1)得到的待测样本基因组DNA进行文库制备，具体方法如下：
(1)利用超声波仪Covaris LE220(CovarisS2,Massachusetts,USA)将基因组DNA样本随机打断成200-300bp左右的片段，配制2％琼脂糖凝胶检测打断后的DNA片段范围，要求主带为200-300bp，如果片段偏大需要根据实际情况进行补打。
表5打断参数
参数 设置值
Duty cycle(％) 21
PIP/Intensity 500
CPB 500
Treatment Time(s) 20s*14
(2)DNA片段选择
取出4℃保存的AmpureBeeds，室温放置30min平衡，将打断后的样品(默认体积为75μL)从96孔板中吸至浅孔板中，再加入75μL XP Beads，反复吹打20次混匀，使样品与磁珠充分混匀，室温静置20min，上磁力架至澄清。回收上清液至浅孔板，再加入37.5μL XPBeads进行纯化，最后溶于45μL的TE中。配制2％琼脂糖凝胶检测打断后的DNA片段范围，要求主带集中在200-300bp。
(3)均一化
使用Qubit(Qubit Fluorometric Quantitation，Thermo Scientific)对片段选择产物进行定量，按照测定的浓度均一化下一步建库起始量至50ng，并加TE将总体积补足40μL。
(4)末端修复和加“A”
首先按照表6比例配制5:1的dATP：dNTP混合溶液，充分混匀后使用。
表6 5:1dATP:dNTP混合溶液
反应个数 1个反应(μL)
dNTP(25mM) 16
dATP(100mM) 20
然后按照表7配制酶反应体系：
表7末端修复和加A酶反应体系
将样品置入PCR仪中进行反应，反应条件：37℃30min；65℃15min；4℃hold。
(5)末端修复和加“A”
向上一步反应完成后的50μL体系中加入5μL 10μM的Ad153-2B Adapter Barcode。
按照表8配制反应体系：
表8接头连接反应体系
反应个数 1个反应(μL)
Nuclease-Free water 3.6
ATP(100mM) 0.8
10X PNK Buffer 3
50％PEG8000 16
T4DNA Ligase(600U/μL) 1.6
Total volume 25
将25μL反应体系加入已含有Barcode的样品中混匀，封膜离心。将样品置入PCR仪中反应,反应条件：23℃60min；4℃hold。向反应完成后的样品中加入20μL TE buffer是样品总体积达到100μL，再加入50μL XP Beads进行纯化，最后溶于48μL的TE中。纯化完成后用Qubit HS对纯化后的连接产物进行定量。
(6)PCR
按照表9配制PCR反应体系：
表9PCR反应体系
将156μL反应体系加入44μL的连接产物中混匀，分2管进行PCR反应(100μL每管)。
将样品置入PCR仪中按表10反应条件进行PCR反应：
表10PCR反应条件
反应完成后加入200μL XP Beads进行纯化，最后溶于45μL的TE中。纯化完成后用Qubit HS对纯化后的PCR产物进行定量。配制2％的琼脂糖凝胶检测PCR后的DNA片段范围，要求主带集中在：250-350bp。
(7)杂交
按照每张上述(一)制备的芯片1μg上样量，根据pooling两管(一管备用)的总量即2μg来计算各样本上样体积，并pooling混匀。
接头block的配制，加入8μL的Block 3与8μL的Block 4。
将Cot-1DNA按照每管10μg进行分装。在Cot-1DNA管上标记相应的样品编号，将pooling后的样品和配制好的接头block加入Cot-1DNA管中。
现在杂交混合物中含有以下几种成分：
表11
Pooling样品 1μg
Block 3(100μM) 8μL
Block 4(100μM) 8μL
cot-1DNA 1管(10μg)
盖好管盖，用干净的注射器针在分装的EP管盖上戳一个孔，将上述样品文库和block的混合物置于真空浓缩仪中蒸干，模式设置V-AQ，温度设置为60℃。
将干式加热器调到95℃，将分装好的4.5μLExome Library从-20℃冰箱中拿出，放在冰上解冻。
将样品取出，分别加入以下两种试剂：7.5μL 2X SC Hybridiation Buffer和3μLSC Hybridiation Component A。
将样品震荡混匀后置于离心机上全速离心10s。将离心后样品移至95℃干式加热器中10min，每5min取出进行震荡并离心。
将样品取出，震荡混匀后室温条件下全速离心10秒。
将上述杂交混合物转入4.5μL Exome Library中(0.2mL PCR管或96孔PCR板，震荡混匀后置于离心机上全速离心10秒。
放在PCR仪上47℃杂交64h-72h，PCR仪热盖应设置保持在57℃。
(8)洗脱
提前解冻所需buffer试剂，按照比例将五种buffer试剂(10XSC Wash BufferⅠ、10XSC Wash BufferⅡ、10XSC Wash BufferⅢ、10XStringent Wash Buffer和2.5XBindingBuffer)稀释配制成1X溶液。其中BufferⅠ分两管，一管47℃预热(110μL)，一管室温(220μL)。
表12
47℃预热以下种溶液：
1X Stringent Wash Buffer和1X SC Wash BufferⅠ
从4℃冰箱中拿出链霉素磁珠，混匀后平衡30min待用。
在1.5ml的EP管中加入100ul磁珠后，将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
加入200ul Streptavidin Dynabead Binding and Wash Buffer,Vortex 10s混匀，将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
重复一次，总共洗涤两次。
吸100ul的Streptavidin Dynabead Binding and Wash Buffer到200ul的EP管中，悬浮磁珠。
用磁力架结合磁珠(将小管靠到磁力架上)，直到液体澄清，去除上清；此磁珠用来结合捕获的DNA。
将杂交混合物转到准备好的磁珠中,吹打混匀10次。
将小管放在PCR仪上47℃孵育45min(PCR仪热盖应设置保持在57℃，每隔15min拿出来在vortex 3s以防磁珠沉淀)
孵育45min后，将产物转至1.5ml的EP管中，再将EP管置于磁力架上到液体澄清，去除上清。
加入100ul 47℃的1X Wash Buffer 1，vortex 10s混匀，再将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
从磁力架上取下EP管，加入200ul 47℃的1X Stringent Wash Buffer，吹打混匀10次，47℃孵育5min，再将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。再重复此步骤一次，即共用1X Stringent Wash Buffer洗两次。
加入200ul常温的1X Wash Buffer Ⅰ，于vortex上混匀2min，再将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
加入200ul常温的1X Wash Buffer Ⅱ，于vortex上混匀1min，再将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
加入200ul常温的1X Wash Buffer Ⅲ，于vortex上混匀30s，再将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
加入44ul TE(不用将DNA从磁珠上洗脱下来，可以直接进行PCR)。
(9)post-PCR
按表13配制好反应体系：
表13为Post-PCR反应体系
反应个数 1个反应(μL)
2X KAPA HiFi HotStartReadyMix 100μL
Nuclease-Free water 44μL
AD153-F(20μM) 6μL
AD153-R(20μM) 6μL
Total volume 156μL
将156μL反应体系加入上步骤44μL产物中混匀，分成2管(每管100μL)，按照表14程序进行PCR反应：
表14
将XP Beads置于室温下平衡30min。
将2管PCR产物转入1.5ml的EP管中,再将EP管置于磁力架上至澄清，再将上清转至对应管号的EP管中，弃链霉素磁珠。上清中加入1倍的磁珠(200ul)，吸打混匀。室温下静置10min，使磁珠与DNA充分结合。
将EP管置于磁力架上至液体澄清，去除上清。
加入500ul70％的乙醇(现配现用)，颠倒十下，去除乙醇。重复此步骤。
在室温下静置，直至残余乙醇挥发，磁珠表面无反光。
加入45ul TE，吸打混匀；室温静置5min，使DNA从磁珠上完全洗脱下来。
将EP管置于磁力架上至澄清，吸40ul的上清转入相应管号的EP管中。
纯化完成后用Qubit HS对纯化后的PCR产物进行定量，并送至QC检测2100及富集度。
(10)环化
按照上一步测定的浓度均一化下一步文库制备反应使用的样本起始量，统一调整至330ng，用TE补体积至60μL，如果体积大于60μL可从环化Mix的水中扣除。
在均一化后的样品中加入10μL 10mM的Ad153splint oligo，混匀离心。
将样品置于PCR仪反应，95℃，3min；反应完后迅速取出并置于冰上冷却。
提前按表15配制反应Mix：
表15环化反应Mix
反应个数 1个反应(μL)
Nuclease-Free water 36.4
10x TA Buffer(LK1) 12
100mM ATP 1.2
T4DNA Ligase(600U/μL) 0.4
Total 50
在单链分离产物中加入反应Mix 50μL，混匀离心。
将反应体系置于PCR仪上反应：37℃，60min。
(11)make DNB
将环化后的DNA文库取20μL到0.2mL PCR管中，在PCR管中加入20μL的DNB制备缓冲液，震荡混匀，瞬时离心后置于PCR仪中反应。PCR程序为：95℃1min,65℃1min,40℃1min,4℃∞(1cycle)。程序结束后取出PCR管，加入40μL的DNB聚合酶混合液Ⅰ，再加入4μL的DNB聚合酶混合液Ⅱ，震荡混匀后瞬时离心，并立即放置于PCR仪中反应。PCR程序为：30℃20min,4℃∞(1cycle)。当PCR仪温度降至4℃时，立即结束运行程序，取出PCR管置于冰盒上，立刻加入20μL的DNB终止缓冲液。DNB制备完成后，用Qubit荧光计和ssDNA检测试剂盒检测DNB的浓度。一般浓度要求10～40ng/ul。
(12)测序
选用BGISEQ-500高通量测序平台，选用PE100测序策略进行测序，对原始数据进行信息分析主要步骤如下：
生物信息分析的流程包括数据过滤，数据比对，突变检测和结果注释。数据下机后进入信息分析部分，首先对下机的原始数据(Raw reads)进行测序质量评估，去除低质量以及被接头污染的reads。随后使用Burrows Wheeler Aligner(BWA)将有效数据映射到人参考基因组(HG19)。使用Picard消除由PCR引起的重复。在基因组分析工具包(GATK)重新比对后，使用bam结果进行单核苷酸多态性(SNPs)和Indels的检测。通过比较在同一批次中患者和正常人体样品之间的平均深度的方法鉴定CNV。紧接着对SNPs和Indels进行数据库注释，使用的数据库包括dblocal(100个正常人样本的突变频率数据库)，dbSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)，HapMap(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，dbNSFP(http://varianttools.sourceforge.net/Annotation/DbNSFP)，HGMD(http://www.hgmd.org/)和千人基因组(http：//www.1000genomes.org/)。此外，使用CNVkit(http://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/)对大片段的缺失重复的检测(>1M)。最后，对可疑突变后进行筛选、解读并验证。
各样本结果如表16所示，
表16为各样本的reads数量和数据量
三个正常成年人样本(MGN035,MGN036,MGN038)的芯片检测结果(表17)可以看出，三个样本的平均深度约为300×。在样本MGN035中，本芯片检测到的选定位点的99.97％(3731/3732)基因型与SNP Array检测到的基因型一致。在样本MGN036中，本芯片检测到的选定位点的99.94％(3718/3720)基因型与SNP Array检测到的基因型一致。在样本MGN038中，本芯片检测到的选定位点的99.92％(3781/3784)基因型与SNP Array检测到的基因型一致。因此，平均一致性为99.94％。
将表16的待测样本进行Sanger测序，结果如表17所示，验证了不一致的基因型，结果全部支持本芯片结果。
表17本芯片和SNP Array检测不一致的基因型
1例明确致病区域的染色体微缺失微重复阳性样本WHR0407-1的芯片检测结果如表18和图2所示(图2B的文字重叠是基因名称，是软件直接导出，所有的基因均在表18第4列列出)，
表18为检测结果
上述结果表明，本发明的芯片能够准确检测SNP位点。

Claims (10)

1.一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的芯片，为根据检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域设计与其互补的探针，再将所述探针固定到芯片上，得到芯片；
所述检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域按照包括如下步骤的方法获得：
1)、选取单基因疾病捕获区域和选取染色体疾病捕获区域；
所述选取单基因疾病捕获区域的方法包括如下步骤：
1)-1、将单基因疾病相关的每个基因的唯一转录本的CDS区，且将每个CDS区两边分别扩充10bp，记作捕获区域a；将与单基因疾病相关的每个基因对应每个转录本的差异序列，记作捕获区域b；
1)-2、将所述捕获区域a和所述捕获区域b合起来记作与单基因疾病相关的基因的捕获区域；
所述选取染色体疾病捕获区域按照包括如下步骤的方法获得：
1)-3、选取各个染色体疾病相关的突变区域的所有基因中关键基因的捕获区域和非关键基因的捕获区域；
所述选取所有基因中关键基因的捕获区域的方法，包括如下步骤：
a)将所述所有基因中的每个关键基因的唯一转录本的CDS区，且将每个CDS区两边分别扩充10bp，记作捕获区域甲，且将所述每个关键基因对应所有转录本的差异序列，记作捕获区域乙；
b)、再将所述捕获区域甲和所述捕获区域乙合起来记作与染色体疾病相关的关键基因的捕获区域；
所述选取所有基因中非关键基因的捕获区域的方法，为如下c)-e)中任一种：
c)、若所有基因中含有小于等于15个非关键基因，则选取每个非关键基因CDS区上随机的100bp作为非关键基因的捕获区域；
d)、若所有基因中含有多于15个非关键基因且小于40个非关键基因，每三个非关键基因选取两个非关键基因的CDS区上随机的100bp作为非关键基因的捕获区域；
e)、若所有基因中含有大于等于40个非关键基因，每隔一个非关键基因的CDS区上随机的100bp作为非关键基因的捕获区域；
1)-6)将所有基因中关键基因的捕获区域和非关键基因的捕获区域组成染色体疾病捕获区域；
2)将所述单基因疾病捕获区域和所述染色体疾病的捕获区域作为检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域。
2.根据权利要求1所述的芯片，其特征在于：
所述单基因疾病相关的基因来源于所述基因疾病关联数据库或测序panel；
或所述各个染色体疾病相关的突变区域的所有基因来源于染色体疾病关联数据库。
3.根据权利要求1或2所述的芯片，其特征在于：
所述基因疾病关联数据库为OMIM、GeneReviews和/或Orphanet；
或所述染色体疾病关联数据库为Decipher数据库和/或OMIM数据库。
4.一种制备权利要求1-3任一所述的芯片的方法，包括如下步骤：根据权要求1-3中任一中的检测单基因疾病和染色体疾病的目标捕获区域设计与其互补的探针，再将所述探针固定到芯片上，得到芯片。
5.一种同时检测单基因疾病和染色体疾病的试剂盒，包括权利要求1-4中任一所述的芯片。
6.根据权利要求1-3中任一所述的芯片或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述单基因疾病为1种或多种；
所述染色体疾病为1种或多种。
7.根据权利要求1-3中任一所述的芯片或权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：
所述单基因疾病是由于基因组中碱基突变或致病性CNV引起的疾病；
所述染色体疾病是由于染色体突变或致病性CNV引起的疾病；
所述碱基突变为碱基缺失、碱基插入、碱基点突变或碱基重复；
所述染色体突变为染色体部分缺失或重复。
8.权利要求1-3中任一所述的芯片或权利要求5所述的试剂盒在同时检测单基因疾病和染色体疾病中的应用。
9.权利要求1-3中任一所述的芯片或权利要求5所述的试剂盒在同时捕获与单基因疾病相关基因和与染色体疾病相关基因中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：
所述单基因疾病为1种或多种；
所述染色体疾病为1种或多种；
或所述单基因疾病是由于基因组中碱基突变或致病性CNV引起的疾病；
所述染色体疾病是由于染色体突变或致病性CNV引起的疾病；
所述碱基突变为碱基缺失、碱基插入、碱基点突变或碱基重复；
所述染色体突变为染色体部分缺失或重复。
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