CN109811055A - 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统 - Google Patents

肉瘤融合基因检测试剂盒及系统 Download PDF

Info

Publication number
CN109811055A
CN109811055A CN201910017163.3A CN201910017163A CN109811055A CN 109811055 A CN109811055 A CN 109811055A CN 201910017163 A CN201910017163 A CN 201910017163A CN 109811055 A CN109811055 A CN 109811055A
Authority
CN
China
Prior art keywords
artificial sequence
dna
ewsr1
sarcoma
fusion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910017163.3A
Other languages
English (en)
Inventor
黄晓强
刘菲菲
欧小华
胡昌明
徐艳艳
赵薇薇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Original Assignee
Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd filed Critical Guangzhou Kingmed Diagnostics Central Co Ltd
Priority to CN201910017163.3A priority Critical patent/CN109811055A/zh
Publication of CN109811055A publication Critical patent/CN109811055A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明涉及一种肉瘤融合基因检测试剂盒及系统，属于医学检测技术领域。该试剂盒对与肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行了检测，可用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。

Description

肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，特别是涉及一种肉瘤融合基因检测试剂盒及系统。
背景技术
软组织肉瘤是源于基质细胞(mesemchymal cell)的罕见恶性肿瘤，可能发生于身体任何部位，年龄分布也很广。软组织肉瘤约占成人恶性肿瘤1％，但是占儿童恶性肿瘤15％，是儿童中常见的实体肿瘤之一。
软组织肉瘤诊断的金标准是组织病理学诊断，然而，多种良性与恶性肿瘤之间以及不同的肉瘤亚型之间存在相似的形态学，这给诊断带来了困难。有研究报道，近25％的案例转诊至肉瘤诊治中心后出现明显的诊断不一致性，且这些案例有一半以上影响治疗方案的制定及预后判断。因此，对良恶性肿瘤正确的诊断是至关重要的，是预测恶性肿瘤生物学行为及确定适当治疗方案的前提。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种肉瘤融合基因检测试剂盒及系统，采用该试剂盒及系统能够辅助进行软组织肉瘤的诊断。
一种肉瘤融合基因检测试剂盒，包括用于检测以下融合基因对的引物组：
序号 基因对 序号 基因对
1 COL1A1-PDGFB 12 EWSR1-NFATC2
2 EWSR1-NR4A3 13 EWSR1-POU5F1
3 EWSR1-CREB1 14 FUS-CREB3L2
4 EWSR1-FLI1 15 FUS-ERG
5 EWSR1-WT1 16 FUS-DDIT3
6 EWSR1-DDIT3 17 PAX3-FOXO1
7 EWSR1-FEV 18 PAX7-FOXO1
8 EWSR1-ATF1 19 SS18-SSX4
9 EWSR1-ERG 20 SS18-SSX1
10 EWSR1-ETV4 21 SS18-SSX2
11 EWSR1-ETV1 22 ETV6-NTRK3。
对多种软组织肉瘤进行了研究，发现染色体易位对这些肿瘤有特征性的诊断价值，因此检测软组织肉瘤中特征性的染色体易位及相应融合基因对于辅助软组织肉瘤的病理诊断有重要意义。例如腺泡状横纹肌肉瘤的t(2:13)(q37:q14)易位，透明细胞肉瘤的t(12:22)(q13:q12)易位，Ewing瘤的t(11:22)(q24:q12)和t(21:22)(q21:q12)易位，粘液型脂肪肉瘤的t(12:16)(q13:p11)易位，滑膜肉瘤的t(x:18)(p11:p11)易位。
在上述研究的基础上，本发明以上述与肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行了检测，可用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。上述肉瘤融合基因检测试剂盒中各融合基因的临床意义如下表所示。
表1.22对融合基因与肉瘤的对应提示关系
上述22对融合基因，皆为恶性肿瘤所特有，不存在于正常人群，具有良好的临床特异性。根据COSMIC Fusion数据库，该22对融合基因在各软组织肉瘤中发生率较高，具有较好的临床灵敏度，具体如下：
表2.22对融合基因临床灵敏度
在其中一个实施例中，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.274所示的引物序列。
针对上述22对融合基因的137个融合转录产物，本发明人通过设计千重扩增引物，扩增产物两端加上通用的测序接头，构建测序文库，利用乳液PCR技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，利用半导体测序系统进行测序。然而在实践中发现，由于扩增引物众多，在试验中会产生引物同聚物，导致检测失控，例如：DDIT3基因经过2轮的引物筛选，才能确保特异性引物实现有效扩增。
而本发明人通过多番摸索和筛选最终选定采用上述引物组，能够具有较好的扩增和检测效果，避免检测失控或无效。
在其中一个实施例中，该试剂盒还包括内参基因，所述内参基因选自：MYC，TBP，JUN，CFHR5，AFM，LMNA，MRPL13，MTTP，ITGB7，HMBS，APOB，LRP1。
由于上述实施例中，检测初始模板为RNA，采用多重PCR扩增技术富集目的基因cDNA。由于RNA的表达差异与PCR扩增的特点，所以覆盖均一性参数并不适用。但为了增加文库的多样性，本发明人通过多番筛选后确定上述广泛表达的内参基因，其检出率可提示文库的多样性，同时反映样本RNA的质量。
在其中一个实施例中，所述内参基因的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.275～SEQ ID NO.298所示的引物序列。
在其中一个实施例中，还包括文库扩增引物，所述文库扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.299～SEQ ID NO.300所示的引物序列。
本发明还公开了一种肉瘤融合基因检测系统，包括：
检测模块，采用上述的试剂盒进行高通量测序；
分析模块，获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果；
质控模块，通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。
上述肉瘤融合基因检测系统，采用了采用上述的试剂盒进行高通量测序，能够对肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行检测，用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。并且，上述系统中还设置了质控模块，对样本检测的准确有效性提供了坚实的保障。
在其中一个实施例中，所述检测模块中，通过下述步骤进行高通量测序：
RNA提取：提取生物样本中RNA；
反转录：将上述RNA进行反转录；
目的基因扩增：使用上述的试剂盒中的引物组扩增目的基因片段；
连接接头：对扩增后各样本的PCR产物连接特异性核苷酸标签接头；
文库扩增：将上述连接产物纯化后，以文库扩增引物进行文库扩增，纯化扩增后文库；
乳液PCR：将上述文库扩增后的产物经过油包水PCR扩增，得到测序模板；
富集：富集上述测序模板；
芯片测序：将上述富集的测序模板导入半导体测序系统进行高通量测序。
所述生物样本包括：新鲜冰冻组织、石蜡组织或石蜡组织切片。
上述检测模块的流程为：基于半导体测序基本原理，将上述22个基因对融合类型设计千重扩增引物，扩增产物两端加上通用的测序接头，构建测序文库，利用乳液PCR技术对测序文库进行扩增，形成测序模板。利用半导体测序系统通过在芯片的微孔中固定DNA链，DNA聚合酶以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原理，合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部pH变化，离子传感器检测pH变化，并将化学信号转换成数字信号，从而可以实时判读碱基，最终获得每个DNA片段的碱基序列。然后利用生物信息学方法将扩增产物序列与预先配置在Ion ReporterTM服务器的融合类型Reference进行比对分析，进而检测标本是否存在基因融合。
在其中一个实施例中，所述分析模块中，当样本融合基因reads≥32，则判定为阳性。
上述reads指高通量测序平台产生的小片段的序列数据，即可视为测序深度的体现，经过试验验证，当reads大于等于32，则可认为测序结果是可信的，再结合其他质控程序校验，予以报告为阳性。
在其中一个实施例中，所述质控模块中，所述质控程序校验包括：内参基因质控校验和/或比对率校验。
通过质控程序进行校验，能够提高检测准确性和可靠性，避免出现假阴性和假阳性等问题。
在其中一个实施例中，所述检测模块中，采用上述的试剂盒进行高通量测序；
所述质控模块中，所述内参基因质控校验为：如所述内参基因中至少5个内参基因的总reads均≥200，则通过内参基因质控校验；
所述比对率校验为：如样本比对率≥80％，且匹配的reads总数大于等于46000，则通过比对率校验。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种肉瘤融合基因检测试剂盒，对和肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行了检测，可用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。
并且，本发明还通过选用特定的千重扩增引物，扩增产物两端加上通用的测序接头，构建测序文库，利用乳液PCR技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，利用半导体测序系统进行测序，能够具有较好的扩增和检测效果，避免检测失控或无效。
本发明的一种肉瘤融合基因检测系统，采用了采用上述的试剂盒进行高通量测序，能够对肉瘤相关的22对融合基因(137个融合转录产物)进行检测，用于辅助软组织肉瘤的病理诊断，还可用于对靶向用药进行提示。并且，上述系统中还设置了质控模块，对样本检测的准确有效性提供了坚实的保障。
附图说明
图1为实施例3中FISH阴性结果；
图2为实施例3中FISH阴性样本的测序图谱。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种肉瘤融合基因检测试剂盒，包括以下引物组：
表3.融合基因对及引物组
上述引物对为每一融合位点对应一当量引物对计，如COL1A1-PDGFB.C15P2.COSF1293和COL1A1-PDGFB.C16P2.COSF595以及COL1A1-PDGFB.C16P2.COSF596采用相同的引物对，则需按照SEQ ID No.1-2引物对的3倍量加入SEQID No.9-10的引物对。
本实施例的试剂盒中还包括如下内参基因引物组：
表4.内参基因引物组
实施例2
一种肉瘤融合基因检测系统，包括以下模块：
检测模块，采用实施例1的试剂盒进行高通量测序；
分析模块，获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果；
质控模块，通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。
上述检测系统的工作流程如下：
一、检测。
1、RNA提取
取FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)组织，提取RNA。
1.1实验前准备
a.除非特别指明，所有离心均在室温中进行，离心速度为13200rpm；
b.FFPE组织用量：4张10μm厚度，表面积<150mm2(12mm×12mm)玻片，或，2张20μm厚度，表面积<150mm2(12mm×12mm)玻片。用量过多，降低核酸纯化效率；
c.Wash Solution 2 Concentrate使用前需加入168mL无水乙醇充分混匀；
d.RNA Wash Buffer Concentrate使用前需加入46mL异丙醇，充分混匀；干式加热器需调节的温度：45℃，55℃，90℃。
1.2脱蜡
a.加入1mL的二甲苯，剧烈震荡10s。室温，最高速(13.200rpm)离心2min，用枪头吸弃上清。如仍观察到有石蜡存在，重复此步骤。
b.加1mL的乙醇(96-100％)于沉淀中，震荡混匀，室温，最高速(13.200rpm)离心2min，弃上清。
c.45℃孵育5～10min，直到残留的无水乙醇完全挥发。
1.3裂解。
向每个样品中加入100～200μL Protease Digestion Buffer重悬；加入10μLProtease充分混匀后55℃孵育1h，接着90℃孵育1h。
1.4 RNA的提取
a.在DNA提取结束后留下的板1中，每个样品孔中分别加入20μL Nucleic AcidBinding Beads，加入100μL Binding Solution，加入300μL异丙醇。
b.取一个新的96孔板,编号为板2，在每个相对应的样品孔中加入500μL RNA WashBuffer Concentrate。
c.取一个新的96孔板，编号为板3，在每个相对应的样品孔中加入1mL WashSolution 2Concentrate。
d.取一个新的96孔板，编号为板4，在每个相对应的样品孔中分别加入70μLNuclease-Free Water，加入20μL DNase，加入10μL DNase Buffer。
e.取一个新的96孔板,编号为板5，在每个相对应的样品孔中加入500μL RNA WashBuffer Concentrate。
f.取一个新的96孔板，编号为板6，在每个相对应的样品孔中加入1mL WashSolution 2Concentrate。
g.取一个新的96孔板，编号为板7，在每个相对应的样品孔中加入50μL ElutionSolution。
h.取一个新的96孔板和一个新的磁套，把两者套在一起，编号为板8。
i.在DNA提取结束后，按照仪器提示操作提取RNA
j.并将RNA转移至新的EP管-20℃保存。
1.5测定RNA浓度
使用RNA Assay Kit及3.0Fluorometer测定RNA浓度。
由于RNA质量直接影响文库的多样性，与实验的成功率有重要的关联。当RNA浓度低于2ng/μl时的8例样本都检测失败，因此设定低于3.5ng/μl则重提。
2、反转录
将上述RNA进行反转录。
2.1取0.2mL PCR管，向管中加入100ng RNA，补水至总体积14μL，运行变性程序：80℃,10min；程序完成后马上放于冰盒上；
2.2变性后的产物依次加入5×VILOTM RT Reaction Mix 4μL、10×III Enzyme Mix 2μL，充分混匀，微离心，运行程序：25℃10min；42℃,30min；85℃,5min；10℃，保温。
3、扩增
使用实施例1试剂盒中的引物组扩增目的基因片段，其中引物对的使用按照表3，每一融合位点对应一当量的引物对计，如COL1A1-PDGFB.C15P2.COSF1293和COL1A1-PDGFB.C16P2.COSF595以及COL1A1-PDGFB.C16P2.COSF596采用相同的引物对，则需按照SEQID No.1-2引物对的3倍量加入SEQ ID No.9-10的引物对。
3.1扩增。
a.冰上解冻扩增酶溶液及肉瘤相关融合基因扩增引物，混匀后微离心，按下表配制PCR反应体系：
试剂 体积(μL)
cDNA 12
5×Ion AmpliSeq<sup>TM</sup> HiFi Mix 4
5×Ion AmpliSeq<sup>TM</sup> SARC Panel(WG_IAD148185) 4
Total 20
b.上下吹打5次，微离心；
c.按下表扩增程序扩增模板：
表5.扩增程序
3.2消化引物。
a.向PCR管中加入2μL FuPa Reagent，总体积为22μL，上下吹打5次，微离心；
b.按下表程序进行消化反应：
表6.消化程序
温度 时间
50℃ 10min
55℃ 10min
60℃ 20min
10℃ ≦1h
4、连接接头
对扩增后的PCR产物连接特异性核苷酸标签接头，用以在后续分析过程中识别样本。
a.冰上解冻连接缓冲液和特异性接头；
b.按下表比例配制特异性接头稀释液：
表7.用于4个反应的特异性接头稀释液
组分 P1接头 特异性接头 Nuclease-free Water
体积(μL) 2 2 4
c.向完成消化的PCR产物中加入以下试剂：
d.上下吹打5次，微离心；
e.按下表程序进行连接反应：
表8.连接程序
温度 时间
22℃ 30min
72℃ 10min
10℃ ≦1h
5、文库扩增
将上述连接产物纯化后，以下述文库扩增引物进行文库扩增，纯化扩增后文库；
上游：5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG(SEQ ID NO.229)
下游：5'CCATCTCATCCCTGCGTGTC(SEQ ID NO.230)
5.1纯化未扩增文库
a.取出XP Reagent，使平衡至室温，使用前充分震荡；
b.将完成连接反应的扩增产物转移至1.5mL EP管中，并加入45μLXPReagent(1.5×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温下放置5min；
c.置于磁力架上2min，或至溶液澄清，吸去上清；
d.加入200μL新鲜配制的80％乙醇，转动EP管几次，溶液澄清后吸去上清；
e.重复步骤d；
f.室温放置5min，挥发酒精。
5.2扩增文库
a.PCR SuperMix High Fidelity和Library Amplification PrimerMix，分别取50μL和2μL加入纯化后的样本文库中，上下吹打使充分混匀；
b.置于磁力架上2min或以上，小心转移50μL上清液至0.5mL PCR管中；
c.按下表程序进行文库扩增反应：
表9.文库扩增程序
5.3纯化扩增后文库
注：纯化扩增后文库两步法纯化：第一步加入0.5×样本体积的XPReagent：高分子质量的DNA分子结合在珠子上，扩增产物及引物留在溶液中，保留上清；第二步加入1×样本体积的XP Reagent：扩增产物结合在珠子上，引物留在溶液中，保留珠子。
a.XP Reagent，使平衡至室温，使用前充分震荡；
b.将完成连接反应的扩增产物转移至1.5mL EP管中，并加入25μLXPReagent(0.5×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温下放置5min；
c.置于磁力架上5min，或至溶液澄清，转移上清至新的1.5mL EP管中；
d.加入50μLXP Reagent(1×样本体积)，上下吹打使充分混匀，室温下放置5min；
e.置于磁力架上3min，或至溶液澄清，吸去上清；
f.加入150μL新鲜配制的80％乙醇，转动EP管几次，溶液澄清后吸去上清；
g.重复步骤f；
h.室温放置5min，挥发酒精；
i.加入50μL DNA洗脱液重悬珠子，上下吹打使充分混匀，置于磁力架上2min或以上，小心转移50μL上清液至新管中；
5.4测定文库浓度。
参照测定gDNA浓度步骤，吸取5μL Library使用dsDNA HS Assay Kit及2.0 Fluorometer测定文库浓度，并记录浓度数据。
实践中8例检测失败的样本的RNA文库浓度均低于1000ng/ml。由此保守推荐：如果出库浓度低于1000ng/ml,则考虑重新构库。
6、乳液PCR
将上述文库扩增后的产物经过油包水PCR扩增(Ion OneTouchTM 2)，得到测序模板。
a.将构建的Library稀释至3ng/mL；pooling按每个样本25M bp，每次上满32个样本(按318chip计算：800M/25M＝32个)；
b.往两个收集管中各添加150μL Breaking solution，放置于仪器相应的位置；
c.充分震荡Ion PGMTM Hi-QTM Reagent Mix、Ion PGMTM Hi-QTM ISPs(1min以上)，微离心，迅速吹打几下，加入到反应体系中。Ion PGMTM Hi-QTM Enzyme Mix微离心。
d.按以下比例配制油包水PCR的水相：
充分震荡以上反应体系，微离心，全部吸入到反应槽中。
e.再向反应槽中加入1.7mL Reaction Oil，进行油包水PCR反应。
f.油包水PCR反应结束后，从One Touch上把两个收集管取出，吸去两收集管中的上清，大概留50μL的液体，上下吹打混匀2个收集管中的溶液，并吸到新的1.5mL EP管中。
g.加1mL Ion OneTouchTM wash solution到2个收集管中，吹打混匀，把所有的液体转移到EP管中，15,500g离心3min。
h.吸去上清，留大概100μL的液体。
7、富集
以Ion OneTouchTM ES富集上述测序模板：
a.按以下的比例制备Melt-off溶液：
b.把MyoneTM streptavidin C1Beads充分震荡，微离心。
c.取一个新的1.5mL的EP管，吸取130μL MyoneTM Beads wash solution到EP管中，加入20μL MyoneTM streptavidin C1Beads，上下吹打几次，震荡微离心，磁力架上放置2min，吸去上清，再往EP管中加入130μL MyoneTM Beads wash solution，震荡微离心。
d.加样到ES的8联管中：
进行ES反应:将8联管放置ES仪器的槽的右端；取1个200ul的PCR管，加入10ulNeutralization Solution，放置于富集仪模板收集管处；插入专用的tip；按Start开始富集反应。
f.反应结束后，取出收集管，15,500g，离心2min。
g.吸去上清，吸剩10μL液体左右，加入200μL Ion OneTouchTM wash solution，上下吹打10次，15,500g，离心2min。
h.吸去上清，留下大概10μL液体，加入90μL Ion OneTouchTM wash solution。
i.再往管中加入5μL control Ion sphereTM Partides，加入100μL AnnealingBuffer，上下吹打混匀，15,500g，离心2min。
j.吸去上清，吸剩3μL(314芯片)/15μL(316/318芯片)。
k.往管中加入3μL/12μL sequencing primer，上下混匀，微离心，总体积为6μL/27μL。
l.在ABI 9700PCR仪中，按以下程序进行处理：95℃,2min→37℃,2min→25℃保温
m.向PCR管中加入1μL/3μL Ion PGMTM Hi-QTM Sequencing Polymerase，室温放置5min；准备loading芯片或长时间可放置于4℃。
8、芯片测序
将上述富集的测序模板导入半导体测序系统Ion Torrent PGMTM进行高通量测序。
二、分析。
获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果，当样本融合基因reads≥32，则判定为阳性。
三、质控。
通过预定的内参基因质控校验和比对率校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。
1、内参基因质控校验：如所述内参基因中至少5个内参基因的总reads均≥200，则通过内参基因质控校验。
2、所述比对率校验：如样本比对率≥80％，则通过比对率校验。
实施例3
肉瘤融合基因检测方法学验证。
一、样本来源。
1、18例CAP Sarcoma Translocation PT项目样本，为官方(CAP)确认样本的融合基因的状态。
2、临床收集Sarcoma FFPE样本：共21例，玻片1～3片，所有样本经FISH进行过相关检测，检测结果显示如下：
表10.21例临床SARC FFPE样本相关信息
以上FISH检测结果判断标准如下：
1)分析200个细胞，阳性信号的细胞数大于25％，判为重排阳性；
2)阳性信号的细胞数小于10％，判为重排阴性；
3)阳性信号在10％～25％之间的样本，进行重新检测；第二次检测的阳性信号大于15％的样本判为重排阳性；小于15％的样本判为阴性。
3、正常人群样本：选择10例来源于移植供者外周血，提取总RNA作为阴性样本。
二、生物信息学分析手段
Ion PGM产生的数据传送到Torrent Server进行处理：
1)本检测采用测序仪数据分析配套的Torrent Server(version 5.4.0)进行处理，最终生成BAM文件；
2)BAM文件传送至Ion Reporter采用WG_IAD148185(该文件包括引物设计的相关Bed文件与panel的参考序列)插件对BAM文件进行注释；
3)Ion Reporter分析得到融合基因结果，最终使用IGV软件(版本号2.3.72)人工确认融合位点。
4)初始数据QC参数：Total Mapped Fusion Panel Reads>40000，Fusion READ_COUNT>20，且Fusion Read Counts Per 100k Total Mapped Reads(CP100K)>25。
本检测数据经Ion Reporter(Version5.6)分析得出的序列数据记录的格式为每个靶点有多少读数。这些检测具有很高的灵敏度，和其他大部分分析平台一样，在解读结果时应考虑到背景信号水平，本发明利用CP100K数值评估特异性融合基因的检测结果。CP100K数值即Read Counts Per 100K Reads，其综合考虑了测序深度与检出Target的read数据，计算公式为：
三、引物特异性。
1、引物合成
本发明的PCR扩增引物由Thermo Fisher Scientific公司合成，将read数据与参考序列比对，序列比对结果显示与预期一致。
2、Mapping Rate
比对率(Mapping Rate)是反映引物扩增特异性的重要参数。上述Sarcoma FFPE样本的测序数据统计如下：
表11.测序数据统计
参数 mean stdev Low 99％CI
Mapping rate 94.6％ 4.2％ 82.1％
验证中发现，扩增引物会产生一定的引物同聚物，据此，测序数据的mapping rate>80％,否则提示FFPE RNA降解严重或者建库效率不理想。
并且，测序后的样本序列与参考序列比对，得到total mapped reads，即该样本的有效数据量。分析中发现，可分析的实验例数为71例，最小值，1/4分位，中位数，3/4分位和最大值分别为：2，62233.5，136579，231116，569032。
本验证过程中，Fusion Sample QC设置为Total Mapped Fusion Panel Reads>20000。根据上文，我们的PPA为100％。假设所有样本的Total mapped reads为20000，计算Fusion Read Counts，去判断阳性样本是否仍然检测为阳性。数据显示，所有阳性样本的Fusion Read Counts值中，最低是81.8，所以即使Total mapped reads降低到为20000，阳性样本仍然被准确判断为阳性。提示当数据量达到20000mapped reads已具有较好的阳性检出能力。结合复查率，Minimum number of mapped reads设定越高，复查的可能性越大。因此，设定复查率为80％，那么Minimum number of mapped reads为46228。即：设定最低匹配序列总数>46000,且Mapping rate>80％。
3、内参基因质量控制标准
本实施例中，初始模板为RNA，采用多重PCR扩增技术富集目的基因cDNA。由于RNA的表达差异与PCR扩增的特点，所以覆盖均一性参数并不适用。但为了增加文库的多样性，本panel纳入12个广泛表达的内参基因(MYC，TBP，JUN，CFHR5，AFM，LMNA，MRPL13，MTTP，ITGB7，HMBS，APOB，LRP1)。以下列举6例软组织肉瘤样本的内参基因表达值(CP100K)。内参基因的检出率提示文库的多样性，同时反映样本RNA的质量。
为确认阴阳性判断标准，对以下样本进行统计和计算，得到内参的控制标准为：12个看家基因当中，至少有5个基因的(Total reads)≧200允许进行下步分析。
表12.内参基因的表达数据(部分数据)
注：MTTP基因在白细胞与软组织中的表达均较低，数据不显示。
四、最低检出限。
1、空白检出限
1.1验证样本：纯水(NTC)。
1.2验证方法：将纯水样本同其他样本一起进行正常构库，测序分析后所得数据如下。
表13.空白样本数据
参数 均值 标准差 X±3SD
library concentration(ng/ml) 198.2 217.0 [-452.9，849.3]
Mapped Reads 7.6 8.0 [-16.5，31.7]
Mean Length(bp) 39.0 6.1 [20.6，57.4]
通过上述结果可以看出：
1)如若样本文库的浓度<1000ng/ml，提示FFPE RNA降解严重或者建库效率不理想；
2)如若NTC的Mapped reads>32，判断为本批检测样本污染，需排查原因，并行失控处理；在数据分析时，当融合基因Read≤32时，应报告为未检测到融合基因：
2、融合基因检出限。
根据10正常人提取的RNA的数据，我们评估建库流程可能存在的交叉污染(即出现与同一批次的其他阳性样本相同类型的融合基因，并在重复实验时消失)：
实验中发现1例样本(SARC-HXQ)检出融合基因EWSR1-ATF1，read count为44，计算其CP100K值为22。当CP100K<25，即判为阴性。
即：
1)当融合基因reads>32,但CP100K<25时，判为阴性；
2)且当融合基因的CP100K<25时，可能会导致假阴性结果。
3、最低RNA输入量
为验证最低RNA输入量，我们将11例CAP Sarcoma Translocation PT项目样本以等量混合，然后从中分别取10ng,20ng,30ng,50ng RNA(每个梯度设3个重复)进行建库实验。该11例样本均经过单独检测，并成功检测融合基因。该混合样本含4个融合基因，其CP100K值如下：
表14.4个融合基因CP100K
fusion genes CP100K
PAX3/FOXO1,t(2；13) 2326
EWSR1/ATF1,t(12；22) 190
EWSR1/FLI1,t(11；22) 15330
EWSR1/WT1,t(11；22) 8417
本发明针对临床FFPE组织提取的RNA，质量差，我们特意选取降解严重的样品RNA。在此我们分别探讨RNA输入量对建库成功率与融合基因检出率的影响。
1)按照mapping rate≥80％,mapped reads>40000,read count>200的内参基因≧5的QC条件，12个文库中有5个通过。4个组的检测成功率没有差别。因此我们保守建议将RNA输入量定为100ng。
2)5个通过QC的数据中，只有一个样本(SARC-I-10ng-02)检测出全部4个融合基因(判读标准：融合基因reads≧32,CP100K>25)，同时该样本的mapping rate最高，达到97％。其余4个样本均只检测出3个丰度较高的融合基因(除了EWSR1/ATF1，其CP100K值最低)。
因此，定义本检测的最低突变频率检出限为：融合reads≥32，QC参数：mappingrate≥80％,mapped reads>40000,read count>200的内参基因数≥5时，突变检出下限(CP100K值)为50。后面所有参数分析时，均依据本判断标准进行突变分析。
五、准确性。
本验证中纳入10例正常人的白细胞样本与18例CAP Sarcoma Translocation PT项目样本以及21例临床SARC FFPE样本。49例样本中10例没有通过QC，不纳入统计。余39例样本中，由对比方法(PCR扩增或FISH)检测确认：21阳性样本，18例阴性样本。由于参比方法的检测范围不同，统计时只以融合基因计算。
表15.准确性统计数据
根据上表，计算检测准确率：
Accuracy＝(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)，即Accuracy＝(21+470)/(491)，亦即100％。
检测敏感性即阳性比例一致性，即PPA＝TP/(TP+FN)，为100％；阳性预测值，即PPV＝TP/(TP+FP)，为100％。
六、检测特异性。
本检测的检测特异性定义为阴性符合率。
根据是上表15，计算检测特异性：
NPA＝TN/(TN+FP),为100％。NPV，即阴性预测值＝TN/(TN+FN)，为100％。
然后，在检测过程中，我们发现一例NGS法与FISH检测的结果不一致的样本。随后采用Sanger测序方法进行确认，Sanger测序的结果与NGS法一致。详细如下：
NGS数据显示，FT18EWSR1-0006样本检测到EWSR1-WT1阳性，total mapped reads为87307，CP100K为29637，其基因重排的断裂点具有惟一性(其他样本未见)。重复实验确认，FT18EWSR1-0006仍为EWSR1-WT1阳性。该样本的FISH结果如图1所示，即为阴性结果。
而FISH检测的下限为10％，低于10％可能导致假阴性。我们采用梯度稀释的方法确认NGS法能够检测低于10％的EWSR1-WT1融合变异：取样本SARC-1506，将其融合基因比例定义为100％，与一融合基因阴性样本SARC-HXQ，按比例混合获得融合基因比例分别为20％，10％，5％与1％的RNA样本，进行平行NGS实验。数据显示如下，4个梯度均能被检测到阳性的融合基因。所以本NGS方法具有较好的灵敏度，其检测下限可到达1％。数据如下：
表16.NGS检测结果数据
Ratio 20％ 10％ 5％ 1％
Variants EWSR1-WT1 EWSR1-WT1 EWSR1-WT1 EWSR1-WT1
Read Counts 11084 3130 952 360
Total Mapped Reads 542462 227321 325772 212402
Read Counts Per 100K 2043 1377 292 169
Total Mapped Reads>20000 pass pass pass pass
再者，我们采用Sanger测序确认该样本的变异。我们根据检出的融合基因的参考序列设计PCR引物，对FT18EWSR1-0006样本的cDNA进行扩增并采用ABI 3730xlDNAAnalyzer(thermofisher)测序。引物序列如下：
EWS-WT-M13F:5’-tgtaaaacgacggccagtTATAGCCAACAGAGCAGCAG-3’；
EWS-WT-M13R:5’-caggaaacagctatgaccTGGTGTCTTTTGAGCTGGTC-3’
采用Sequencer软件进行分析，测序图谱如图2所示。
提取序列为：TGTAAAACGACGGCCAGTTATAGCCAACAGAGCAGCAGCTACGGG GCAGCAGAGTGAGAAACCATACCAGTGTGACTTCAAGGACTGTGAACGAAGGTTTTCTCGTTCAGACCAGCTCAAAAGACACCAGGTCATAGCTGTTTCCTGAA。BLAST结果显示为EWSR1-WT1基因融合的序列。
综上，我们确认FT18EWSR1-0006检测到EWSR1-WT1阳性。Sanger测序结果与NGS法的结果一致。
七、精密度。
本检测的精密度为对标本进行重复检测得到同一结果的能力，包括批内和批间精密度，数据如下：
1、批内精密度
对2例样本设置3复孔，作平行检测，结果显示均检出同一融合基因。精密度满足临床需要，结果如下。
表17.批内精密度结果
样本 重复01 重复02 重复03
SARC-1501 PAX3-FOXO1 PAX3-FOXO1 PAX3-FOXO1
SARC-1506 EWSR1-WT1 EWSR1-WT1 EWSR1-WT1
2、批间精密度
对5例样本进行3个批次检测，评估不同天，不同技术员间的差异，检测结果统计如下所示，精密度满足临床需要。
表18.批间精密度结果
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州金域医学检验中心有限公司
<120> 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
<160> 230
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtcgcttcc cctgtgatg 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtcgcttcc cctgtgatg 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctcgggac caaggatca 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gatttcgact cggcgtact 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgacgcaagg gagatcgt 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgatcgacgt actcgacgtg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcccgagcg tctgaag 17
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgtgcgcctc gtggaaa 17
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 19
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcctcctcg acccaag 17
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccaaaggat ctcctcgaga ag 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cacgacagcg tcgacagat 19
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tccgacctcg tgcgaaag 18
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctccacgaga acgagcgaa 19
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gacgcacgac acgaagg 17
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cttcagggaa tcgctcgaga a 21
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgcacccacg actgact 17
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cctcgagaca agcgagaaac a 21
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 43
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gcggaacctc gagatcgt 18
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cctgcgccca ttcgaaatca t 21
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 47
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tcgaccccct cgacgta 17
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
accacctcga gaacatcgac 20
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ttcgtggaca cgcacga 17
<210> 52
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cccctggatt gcgtggac 18
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ctcgtgcgaa gacacgagat 20
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cgagacaagc gagagacagg 20
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tcctgcgtct cctcgagaa 19
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
caaagatgga ctcaaccgac tc 22
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cacctcgcca gacctcaa 18
<210> 68
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ctcgatcgcg gagacgat 18
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 71
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gagatgcgat ccctggaca 19
<210> 72
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ctttcgtccc cacgtcactt a 21
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cgacctccac gactccct 18
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ccccctggaa agaatggaga tg 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ctcagcgacg tcgaggattg 20
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gcggttgcgt atcatcaact ga 22
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tctgacttcc ctgtactcca tctg 24
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
cctgtacccc atcggtacca t 21
<210> 87
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 89
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gatttcgact cggcgtact 19
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ggtcgcttcc cctgtgatg 19
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gttcgtcctc tttcgactgg 20
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gtgatcctcc gcgttggta 19
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 100
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
ccctctgtgt gcgtgtacat tg 22
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 102
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
tgtcccgtcg ctttctgaa 19
<210> 103
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
cggcgccctg atctgatac 19
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 108
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gtgaactttc cctcgtgtaa ctga 24
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
tgacactcaa tcgtcgtgat tgg 23
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
atgttattcg cccactctcc t 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 114
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
cgacccgtac tggtccct 18
<210> 115
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
ctacttgacc tcctcctaaa ctc 23
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
ctctcctgac tgactggaca 20
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
actctcctct cgttggtggt 20
<210> 121
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
atgttattcg cccactctcc t 21
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 124
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tctgacttcc ctgtactcca tctg 24
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
gttcgtcctc tttcgactgg 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 130
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
tgtcccgtcg ctttctgaa 19
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 132
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
cggcgccctg atctgatac 19
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 134
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
gtgaactttc cctcgtgtaa ctga 24
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
tgacactcaa tcgtcgtgat tgg 23
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
atgttattcg cccactctcc t 21
<210> 139
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
gacaacacac gaatttatca acaaggat 28
<210> 140
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
cgacccgtac tggtccct 18
<210> 143
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
ttaagatgaa caagagaact ggcgaa 26
<210> 144
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tgtctcgcgc cgataact 18
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
gatcgcacac acacctatga aga 23
<210> 146
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
cgacccgtac tggtccct 18
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
gatcgcacac acacctatga aga 23
<210> 148
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
tgtctcgcgc cgataact 18
<210> 149
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
ggaagaacgc tccaatgaac acaat 25
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
ctcttcgctg tcctcatacc a 21
<210> 151
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
ggaagaacgc tccaatgaac acaat 25
<210> 152
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
ggaagaacgc tccaatgaac acaat 25
<210> 154
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
tgtctcgcgc cgataact 18
<210> 155
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ctaccccatc gacgcaca 18
<210> 156
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
gatttcgact cggcgtact 19
<210> 157
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
ccctcgggac caaggatca 19
<210> 158
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 159
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
gcgagagaat catacaattg acactca 27
<210> 160
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
ctcttcgctg tcctcatacc a 21
<210> 161
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
ctccgcggcg agacttta 18
<210> 162
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 163
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
ccacacaaag cgccctaaac c 21
<210> 164
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 165
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
cagacataca cacgatatac gcaca 25
<210> 166
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
cacgaaacgt ataatccccc tca 23
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
ggatctccct cctcgatcct 20
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
cacgaaacgt ataatccccc tca 23
<210> 172
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
gtggcggcga aatcgct 17
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
cacgaaacgt ataatccccc tca 23
<210> 174
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 175
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
cgcgatatgc gaatcaagac c 21
<210> 176
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
atcgtcgtcc gtcgtcgta 19
<210> 187
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
cgcgatatgc gaatcaagac c 21
<210> 188
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 189
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
cgcgatatgc gaatcaagac c 21
<210> 190
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
atcgtcgtcc gtcgtcgta 19
<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
atcgtcgtcc gtcgtcgta 19
<210> 159
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
ggtcgcttcc cctgtgatg 19
<210> 161
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 162
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
atcgtcgtcc gtcgtcgta 19
<210> 163
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 164
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 165
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
cgatacaacc cgacgacag 19
<210> 166
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
tcgctttgga tccttctcgt tt 22
<210> 167
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
ttttccacgt atacagacac gtttca 26
<210> 168
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
cgtcatccac cactaacttt ttcc 24
<210> 169
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
acgttctcca cgtactctga ca 22
<210> 170
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
cgtcatccac cactaacttt ttcc 24
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
gatatagacc aacacacgct gga 23
<210> 172
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
cttctgacac tcccttcgaa tcatt 25
<210> 173
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
gatatagacc aacacacgct gga 23
<210> 174
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
gattttctcc cgtgatttca tcttttcc 28
<210> 175
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
gatatagacc aacacacgct gga 23
<210> 176
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
cccatcattt tgtggcgcct at 22
<210> 177
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
tcatcgggaa gacctgcgtt a 21
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
ctttctccgt tcctcacgat 20
<210> 179
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
acacgcggac gacatactg 19
<210> 180
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
cccttgaccg tgcggtg 17
<210> 181
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
ttaacacaga acatctgcga gactca 26
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
cttctgcgac ttcctccgaa 20
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
gatatagacc aacacacgct gga 23
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
cttctgcgac ttcctccgaa 20
<210> 185
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
tcatcgggaa gacctgcgtt a 21
<210> 186
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
cccttgaccg tgcggtg 17
<210> 187
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 188
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
tcctttggtg tcttttcgtc tgg 23
<210> 189
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 190
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
taattcatct gaccggcgaa actt 24
<210> 191
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 192
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
cgtccgtttc tttctcgctc t 21
<210> 193
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
tcctttggtg tcttttcgtc tgg 23
<210> 195
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
gatcctacac gcaacgtcca a 21
<210> 196
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
tccgtgacac tttttacact ggaa 24
<210> 197
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
ctaccccatc gacgcaca 18
<210> 198
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
cgtccgtttc tttctcgctc t 21
<210> 199
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
gatttgatcc aggagcgatg ag 22
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
tcctttggtg tcttttcgtc tgg 23
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
ctcgaggacc catggatgaa 20
<210> 202
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
tcctttggtg tcttttcgtc tgg 23
<210> 203
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
acgtcacact cgatatgcga c 21
<210> 204
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
taattcatct gaccggcgaa actt 24
<210> 205
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
cgttctctga aagcgtctcc tt 22
<210> 206
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
aaatacgcgt cgacccgtt 19
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
cgcgaagcga ttctcgattg 20
<210> 208
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
cccttcgcat actcgatcat tg 22
<210> 209
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
cgatgactcg aacgagataa cacatg 26
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
actatactcg cgacctgcgt 20
<210> 211
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
cgactcacac tcaataaacg ggaaat 26
<210> 212
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
gaacctctac tttttctcca tcctgata 28
<210> 213
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
accctggatc ccgaagagaa at 22
<210> 214
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
tttgcgcacc tcctcaaaat ga 22
<210> 215
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
acgaaacacg cagaggacat t 21
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
ccgttctcac tcgtctcctt 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
ctcgttgcga catacgcatt 20
<210> 218
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
ccatattctc tcaaacttgc gccatt 26
<210> 219
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 219
tcacacagaa tgaagcgtcg aa 22
<210> 220
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 220
gacttgggat cgcttctgga a 21
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 221
cgcgggaata cacaccgttt 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 222
cttgtccctc cctccttcct 20
<210> 223
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
cgaccctgag gaatcgatca at 22
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 224
cgctcctgac tcgcctttc 19
<210> 225
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 225
cacccagact tcacacgaga ata 23
<210> 226
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 226
tcgtgtgcgt atcgctttct tg 22
<210> 227
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 227
tcacctccaa gacacacgtt t 21
<210> 228
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 228
tcctctcctg accttcatac aca 23
<210> 229
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 229
ccactacgcc tccgctttcc tctctatg 28
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 230
ccatctcatc cctgcgtgtc 20

Claims (10)

1.一种肉瘤融合基因检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测以下融合基因对的引物组：
序号 基因对 序号 基因对 1 COL1A1-PDGFB 12 EWSR1-NFATC2 2 EWSR1-NR4A3 13 EWSR1-POU5F1 3 EWSR1-CREB1 14 FUS-CREB3L2 4 EWSR1-FLI1 15 FUS-ERG 5 EWSR1-WT1 16 FUS-DDIT3 6 EWSR1-DDIT3 17 PAX3-FOXO1 7 EWSR1-FEV 18 PAX7-FOXO1 8 EWSR1-ATF1 19 SS18-SSX4 9 EWSR1-ERG 20 SS18-SSX1 10 EWSR1-ETV4 21 SS18-SSX2 11 EWSR1-ETV1 22 ETV6-NTRK3。
2.根据权利要求1所述的肉瘤融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.204所示的引物序列。
3.根据权利要求1所述的肉瘤融合基因检测试剂盒，其特征在于，还包括内参基因，所述内参基因选自：MYC，TBP，JUN，CFHR5，AFM，LMNA，MRPL13，MTTP，ITGB7，HMBS，APOB，LRP1。
4.根据权利要求3所述的肉瘤融合基因检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因的扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.205～SEQ ID NO.228所示的引物序列。
5.根据权利要求1所述的肉瘤融合基因检测试剂盒，其特征在于，还包括文库扩增引物，所述文库扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.229～SEQ ID NO.230所示的引物序列。
6.一种肉瘤融合基因检测系统，其特征在于，包括：
检测模块，采用权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行高通量测序；
分析模块，获取上述测序结果，通过生物信息学分析，得到融合基因检测结果；
质控模块，通过预定的质控程序校验，校验通过则输出检测结果，校验不通过则提示样本失效。
7.根据权利要求6所述的肉瘤融合基因检测系统，其特征在于，所述检测模块中，通过下述步骤进行高通量测序：
RNA提取：提取生物样本中RNA；
反转录：将上述RNA进行反转录；
目的基因扩增：使用权利要求1-5任一项所述的试剂盒中的引物组扩增目的基因片段；
连接接头：对扩增后各样本的PCR产物连接特异性核苷酸标签接头；
文库扩增：将上述连接产物纯化后，以文库扩增引物进行文库扩增，纯化扩增后文库；
乳液PCR：将上述文库扩增后的产物经过油包水PCR扩增，得到测序模板；
富集：富集上述测序模板；
芯片测序：将上述富集的测序模板导入半导体测序系统进行高通量测序。
8.根据权利要求6所述的肉瘤融合基因检测系统，其特征在于，所述分析模块中，当样本融合基因reads≥32，则判定为阳性。
9.根据权利要求7所述的肉瘤融合基因检测系统，其特征在于，所述质控模块中，所述质控程序校验包括：内参基因质控校验和/或比对率校验。
10.根据权利要求9所述的肉瘤融合基因检测系统，其特征在于，所述检测模块中，采用权利要求3-4任一项所述的试剂盒进行高通量测序；
所述质控模块中，所述内参基因质控校验为：如所述内参基因中至少5个内参基因的总reads均≥200，则通过内参基因质控校验；
所述比对率校验为：如样本比对率≥80％，且匹配的reads总数大于等于46000，则通过比对率校验。
CN201910017163.3A 2019-01-08 2019-01-08 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统 Pending CN109811055A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910017163.3A CN109811055A (zh) 2019-01-08 2019-01-08 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910017163.3A CN109811055A (zh) 2019-01-08 2019-01-08 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109811055A true CN109811055A (zh) 2019-05-28

Family

ID=66604107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910017163.3A Pending CN109811055A (zh) 2019-01-08 2019-01-08 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109811055A (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080566A (zh) * 2020-08-25 2020-12-15 上海交通大学医学院附属瑞金医院 基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品及用途
CN112094915A (zh) * 2020-11-17 2020-12-18 苏州科贝生物技术有限公司 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
CN112251501A (zh) * 2020-10-28 2021-01-22 深圳人体密码基因科技有限公司 一种内参基因集合及其筛选方法、通用引物组、试剂盒、反应体系及应用
CN112592979A (zh) * 2021-01-11 2021-04-02 长沙艾迪康医学检验实验室有限公司 一管式筛查肿瘤患者体内etv6-ntrk3融合基因的引物、探针和方法
WO2021096888A1 (en) * 2019-11-12 2021-05-20 Foundation Medicine, Inc. Methods of detecting a fusion gene encoding a neoantigen
CN113005200A (zh) * 2021-04-14 2021-06-22 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用
CN113462763A (zh) * 2021-04-21 2021-10-01 四川大学华西医院 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒
CN113981101A (zh) * 2021-12-27 2022-01-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 横纹肌肉瘤融合基因相关环状rna分子标志物及其应用
CN114317741A (zh) * 2021-11-24 2022-04-12 上海桐树生物科技有限公司 一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和系统
CN116200491A (zh) * 2022-10-24 2023-06-02 四川大学华西医院 隆突性皮肤纤维肉瘤诊断及预后相关基因靶向检测试剂盒
CN117402976A (zh) * 2023-12-15 2024-01-16 首都医科大学附属北京儿童医院 横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313023A (zh) * 2014-11-10 2015-01-28 南京大学医学院附属鼓楼医院 腺泡状软组织肉瘤的基因探针及其试剂盒应用
CN106755445A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测结直肠癌kras/nras/braf/pik3ca基因的方法及试剂盒
WO2018183897A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Higher target capture efficiency using probe extension
CN108796085A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法
CN108920896A (zh) * 2018-06-29 2018-11-30 迈凯基因科技有限公司 一种骨肿瘤基因变异及药物解读多数据库交互系统
CN108949909A (zh) * 2018-07-17 2018-12-07 厦门生命互联科技有限公司 一种用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒
CN108949768A (zh) * 2018-04-28 2018-12-07 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104313023A (zh) * 2014-11-10 2015-01-28 南京大学医学院附属鼓楼医院 腺泡状软组织肉瘤的基因探针及其试剂盒应用
CN106755445A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测结直肠癌kras/nras/braf/pik3ca基因的方法及试剂盒
WO2018183897A1 (en) * 2017-03-31 2018-10-04 Grail, Inc. Higher target capture efficiency using probe extension
CN108949768A (zh) * 2018-04-28 2018-12-07 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用
CN108796085A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法
CN108920896A (zh) * 2018-06-29 2018-11-30 迈凯基因科技有限公司 一种骨肿瘤基因变异及药物解读多数据库交互系统
CN108949909A (zh) * 2018-07-17 2018-12-07 厦门生命互联科技有限公司 一种用于基因检测的血小板核酸文库构建方法和试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KINGA SZURIAN等: "Role of Next-Generation Sequencing as a Diagnostic Tool for the Evaluation of Bone and Soft-Tissue Tumors", 《PATHOBIOLOGY》 *
原颖丽等: "横纹肌肉瘤的诊断及治疗研究进展", 《吉林大学学报》 *
李琳等: "软组织肉瘤分子诊断与个体化治疗探索", 《现代肿瘤医学》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021096888A1 (en) * 2019-11-12 2021-05-20 Foundation Medicine, Inc. Methods of detecting a fusion gene encoding a neoantigen
CN112080566A (zh) * 2020-08-25 2020-12-15 上海交通大学医学院附属瑞金医院 基于高通量测序法的甲状腺癌检测产品及用途
CN112251501A (zh) * 2020-10-28 2021-01-22 深圳人体密码基因科技有限公司 一种内参基因集合及其筛选方法、通用引物组、试剂盒、反应体系及应用
CN112094915A (zh) * 2020-11-17 2020-12-18 苏州科贝生物技术有限公司 一种肉瘤融合基因和/或突变联合检测引物组及试剂盒
CN112592979A (zh) * 2021-01-11 2021-04-02 长沙艾迪康医学检验实验室有限公司 一管式筛查肿瘤患者体内etv6-ntrk3融合基因的引物、探针和方法
CN113005200B (zh) * 2021-04-14 2023-07-04 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用
CN113005200A (zh) * 2021-04-14 2021-06-22 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用
CN113462763A (zh) * 2021-04-21 2021-10-01 四川大学华西医院 靶向检测软组织肿瘤小圆细胞肿瘤融合基因panel设计试剂盒
CN114317741A (zh) * 2021-11-24 2022-04-12 上海桐树生物科技有限公司 一种软组织肉瘤基因检测试剂盒和系统
CN113981101A (zh) * 2021-12-27 2022-01-28 首都医科大学附属北京朝阳医院 横纹肌肉瘤融合基因相关环状rna分子标志物及其应用
CN116200491A (zh) * 2022-10-24 2023-06-02 四川大学华西医院 隆突性皮肤纤维肉瘤诊断及预后相关基因靶向检测试剂盒
CN117402976A (zh) * 2023-12-15 2024-01-16 首都医科大学附属北京儿童医院 横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用
CN117402976B (zh) * 2023-12-15 2024-03-12 首都医科大学附属北京儿童医院 横纹肌肉瘤检测引物探针组、试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109811055A (zh) 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
CN105695567B (zh) 一种用于检测胎儿染色体非整倍体的试剂盒、引物和探针序列及检测方法
CN107475375A (zh) 一种用于与微卫星不稳定性相关微卫星位点进行杂交的dna探针库、检测方法和试剂盒
CN106650312A (zh) 一种用于循环肿瘤dna拷贝数变异检测的装置
CN105040111B (zh) 系统性红斑狼疮图谱模型的构建方法
CN105969857A (zh) 非小细胞肺癌靶向治疗基因检测方法
CN106845155A (zh) 一种用于检测内部串联重复的装置
CN107345253A (zh) 肺癌临床用药基因检测标准品及其应用
CN106282161A (zh) 特异捕获并重复复制低频率dna碱基变异的方法及应用
CN106845154A (zh) 一种用于ffpe样本拷贝数变异检测的装置
Zhao et al. Analysis of the expression profile of serum exosomal lncRNA in breast cancer patients
CN103074452A (zh) 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法
CN109234380A (zh) 遗传性耳聋相关基因检测试剂盒及特异性引物组
CN109337966A (zh) 一种分子标签及其试剂和应用
CN103911439A (zh) 系统性红斑狼疮羟甲基化状态的差异表达基因的分析方法和应用
CN106086169A (zh) 用于检测微量组织中egfr基因突变的引物组合及其应用
CN109735611A (zh) 一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用
CN110144386A (zh) 用于检测pole基因突变的引物、探针及试剂盒
CN114250269A (zh) 一种探针组合物、基于该探针组合物的二代测序文库及其应用
CN114196740A (zh) 用于同时识别多种基因类型的数字扩增检测方法、检测产品和检测试剂盒
CN111440876A (zh) 用于定量检测人类mgmt基因甲基化程度的试剂盒和方法
CN105039596A (zh) 一种用于检测副流感病毒的试剂盒及其应用
CN104673918B (zh) 检测csf3r点突变的引物和方法
CN110819710A (zh) 髓系肿瘤的高通量测序检测
CN117025766B (zh) 一种人类alk-e13;a20融合基因检测用dna标准品及其制备方法、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190528

RJ01 Rejection of invention patent application after publication