CN108796085A - 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法 - Google Patents

用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法 Download PDF

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马荣桧
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明提出一种用于肿瘤融合基因EWS‑FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法，属于基因工程技术领域，能够解决现有的对于融合基因EWS‑FLI1的检测操作繁琐、结果判读耗时且存在主观误差等技术问题。该用于肿瘤融合基因EWS‑FLI1检测的引物对包括：用于融合基因EWS‑FLI1 I型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.2序列所示的反向引物FLI1_Exon 7&8 R；和用于融合基因EWS‑FLI1 II型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQ No.4序列所示的反向引物FLI1_Exon 6&7 R。本发明能够应用于EWS‑FLI1融合基因的定量检测中，进而有效用于尤文肉瘤家族肿瘤的检测中。

Description

用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其 一步检测法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种用于肿瘤融合基因 EWS/FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法。
背景技术
尤文肉瘤家族肿瘤(Ewingsarcomafamilyoftumors，ESFT)是一组低分化且高度恶性的小圆细胞肿瘤，包括尤文肉瘤(Ewingsarcoma，ES)、Askin瘤和原始神经外胚层肿瘤(primitiveneurotodermaltumour，PNET)。患者中位年龄为15岁，超过半数患者为青少年。每年15岁以下儿童的ESFT发病率为3人/ 百万人，且诊断时发现已伴有肺、骨等其他部位转移的患者约占30％。
目前，在ESFT患者中发现了7种染色体易位现象，而t(11；22)(q24；q12) 易位，即位于11号染色体q24上的FLI1基因与22号染色体上的EWS基因发生融合，产生的融合蛋白EWS-FLI1约占ESFT染色体易位的85％。染色体断裂位点不同可以产生不同的融合亚型，通常单个ESFT患者中只表达一种亚型。目前已经发现EWS-FLI1有12种不同的融合亚型，其中最常见的2种亚型是 EWS基因的7号外显子分别与FLI1基因的7号外显子(Ⅰ型融合)和6号外显子(Ⅱ型融合)(根据人类基因组参考hg38)组成，各占整个EWS-FLI1融合基因比例的60％和25％。
EWS基因位于22号染色体上，由17个外显子组成，编码一种多功能蛋白。EWS蛋白的5’氨基末端是转录引导区域，3’羧基末端是RNA结合区，在基因表达、细胞信号调节以及RNA的加工处理和运输等方面发挥重要作用。 FLI1基因位于11号染色体上，由9个外显子组成，编码一种转录因子。FLI1 蛋白5’氨基末端是转录活性区域，3’羧基末端是DNA结合区，主要功能是在促进细胞增殖和肿瘤发生等方面。融合蛋白EWS-FLI1是EWS的5’端与FLI1的 3’端发生融合，形成了由EWS转录活性区与FLI1的DNA结合区反常连接的融合蛋白。融合蛋白EWS-FLI1没有稳定的结构，5’端相对有序，主要由螺旋-转角-螺旋构成；而3’端含有多个芳香族氨基酸残基的重复多肽，构成了EWS-FLI1 的无序区域，这种无序结构有利于与其他转录因子的结合和分离。
目前在临床上对EWS-FLI1融合基因的检测主要是运用探针荧光原位杂交技术(FISH)，特异性的检测出尤文氏肉瘤相关基因EWSR1基因的断裂分离情况，从而为尤文氏肉瘤的临床诊断提供辅助判断依据。但是FISH检测耗时长、探针成本较为昂贵且需要经过专业培训的技术人员进行较为繁琐的操作、结果判读耗时且存在主观误差等。
发明内容
本发明提出一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法，利用该试剂盒可实现对融合基因EWS-FLI1的定量检测，操作方法较为简便，且检测结果客观准确。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对，包括：
用于融合基因EWS-FLI1 I型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物 EWS_F、如SEQ No.2序列所示的反向引物FLI1_Exon 7&8R；和
用于融合基因EWS-FLI1 II型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物 EWS_F、如SEQ No.4序列所示的反向引物FLI1_Exon 6&7R。
本发明还提供了一种用于肿瘤融合基因EWS/FLI1检测的探针，包括：用于融合基因EWS-FLI1 I型融合的如SEQ No.3序列所示的探针PRFAM 7&7R以及用于融合基因EWS-FLI1 II型融合的如SEQ No.5序列所示的探针PRCy 7&6，其中所述探针带有发光基团，所述发光基团为FAM或Cy。
本发明还提供了一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的试剂盒，包括如上述技术方案所述的引物对和如上述技术方案所述的探针。
本发明还提供了一种利用如上述任一项技术方案所述的试剂盒对肿瘤融合基因EWS-FLI1进行的一步检测法包括以下步骤：
从肿瘤细胞或组织中提取Total RNA作为样品；
利用试剂盒中对应的正向引物、反向引物和探针分别配制样品的 EWS-FLI1 I型融合的PCR反应液和EWS-FLI1 II型融合的PCR反应液，同时配制各自的阴性对照的PCR反应液；
对上述三种PCR反应液分别进行PCR反应，得到EWS-FLI1 I型融合和 EWS-FLI1 II型融合的循环交叉点。
作为优选，EWS-FLI1 I型融合的PCR反应液具体配制如下：
作为优选，EWS-FLI1 II型融合的PCR反应液具体配制如下：
作为优选，Total RNA的加入量为1pg-10ng。
作为优选，PCR反应具体如下：
55℃反转录10min；95℃变性1min；然后45个循环，95℃变性10sec， 60℃延伸30sec。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供了一种用于尤文肉瘤家族肿瘤融合基因EWS-FLI1定量检测的试剂盒，该试剂盒中包含有分别用于检测EWS-FLI1 I型融合和II型融合的正向引物、反向引物和探针，可有针对性的对其进行检测。结合一步法RT-qPCR可实现对融合基因EWS-FLI1的定量检测，操作方法较为简便，且检测结果客观准确。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的尤文肉瘤细胞系A673梯度Total RNA的 EWS-FLI1 I型融合含量检测图；
图2为本发明实施例所提供的尤文肉瘤肿瘤组织Z63梯度Total RNA的 EWS-FLI1II型融合的含量检测图；
图3为本发明实施例所提供的尤文肉瘤肿瘤组织Z63Total RNA QC结果图。
具体实施方式
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的用于肿瘤融合基因EWS-FLI1 检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
材料说明：
模板:本实施例提供的样本为从肿瘤组织提取的Total RNA，但由于尤文肉瘤的发病率很低,极难得到样品,因此，本实施例中使用尤文肉瘤细胞系A673 (CRL-1598)的Total RNA作为I型融合的阳性对照、尤文肉瘤病患Z63的肿瘤组织Total RNA作为II型融合的阳性对照进行说明。
1、样品一步法RT-qPCR实验
PCR实验采用NEBUniversal Probe One-Step RT-qPCR试剂盒，具体步骤包括：
1)将Universal ProbeOne-Step Reaction Mix(2x)在室温下融解，轻柔得上下颠倒混匀并进行短暂离心，备用，在使用过程中始终保持避光；
2)配制样品的PCR反应液
在冰上分别配制样品EWS-FLII型融合的PCR反应液和EWS-FLI1 II型融合的PCR反应液，具体如下：
EWS-FLI1 I型融合PCR反应液总体积10μl：
EWS-FLI1 II型融合PCR反应液总体积10μl：
同时，设计了NTC(No Template Control)作为阴性对照，即在反应中用水来代替模板cDNA，其它试剂不变，从而质控体系是否有污染。
其中，正向引物、反向引物和探针的序列具体如下：
正向引物EWS_F：5’-ATCCTACAGCCAAGCTCCAA-3’
用于EWS-FLI1 I型融合的反向引物FLI1_Exon 7&8R:
5’-CCAAGGGGAGGACTTTTGTT-3’
用于EWS-FLI1 I型融合的探针PRFAM 7&7R:
5’-ATAAGAAGGGTTCTGCTGCCCGT-3’
用于EWS-FLI1 II型融合的反向引物FLI1_Exon 6&7R:
5’-GAAGGGTCTTCTTTGACACTC-3’
用于EWS-FLI1 II型融合的探针PRCy 7&6:
5’-GCAGCAGAGTTCACTGCTGGCC-3’
上述探针均带有FAM或Cy的发光基团。
迅速将上述PCR反应液混匀，并加入96或者说384孔的反应平板中。
3)将上述反应平板进行短暂离心，确保所有反应液在反应孔底部；
4)PCR反应：55℃反转录10min；95℃变性1min；然后45个循环， 95℃变性10sec，60℃延伸30sec。
3、试验结果及分析
如图1-2所示，本实施例采用一步法RT-qPCR可准确测得作为EWS-FLI1 I 型融合的阳性对照A673(CRL-1598)的Total RNA以及作为EWS-FLI1 II型融合的阳性对照Z63的Total RNA中的融合基因,并且其检测下限均可达到1pg Total RNA，而阴性对照NTC则为0，由此可见，在质控体系无污染的情况，可准确检测到A673和Z63Total RNA中的融合基因。另在A673(R2＝0.9862) 中取得的结果要优于Z63(R2＝0.9414)，这是因为通常从肿瘤组织中提取的 Total RNA质量要比从细胞系中提取的低所导致的。如图3所示,Z63TotalRNA 的RIN值只有7.7,而从细胞系中提取的Total RNA的RIN值通常有9或10,RIN 值越高,说明Total RNA的质量越好。
序列表
<110> 青岛普泽麦迪生物技术有限公司
<120> 用于肿瘤融合基因EWS/FLI1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcctacagc caagctccaa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaaggggag gacttttgtt 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataagaaggg ttctgctgcc cgt 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaagggtctt ctttgacact c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcagcagagt tcactgctgg cc 22

Claims (8)

1.一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的引物对，其特征在于，包括：
用于融合基因EWS-FLI1 I型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQNo.2序列所示的反向引物FLI1_Exon 7&8 R；和
用于融合基因EWS-FLI1 II型融合的如SEQ No.1序列所示的正向引物EWS_F、如SEQNo.4序列所示的反向引物FLI1_Exon 6&7 R。
2.一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的探针，其特征在于，包括：用于融合基因EWS-FLI1 I型融合的如SEQ No.3序列所示的探针PRFAM 7&7 R以及用于融合基因EWS-FLI1 II型融合的如SEQ No.5序列所示的探针PRCy 7&6，其中所述探针带有发光基团，所述发光基团为FAM或Cy。
3.一种用于肿瘤融合基因EWS-FLI1检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物对和如权利要求2所述的探针。
4.一种利用如权利要求3所述的试剂盒对肿瘤融合基因EWS-FLI1进行的一步检测法，其特征在于，包括以下步骤：
从肿瘤组织中提取Total RNA作为样品；
利用试剂盒中对应的正向引物、反向引物和探针分别配制样品的EWS-FLI1 I型融合的PCR反应液和EWS-FLI1 II型融合的PCR反应液，同时配制各自的阴性对照的PCR反应液；
对上述三种PCR反应液分别进行PCR反应，得到EWS-FLI1 I型融合和EWS-FLI1 II型融合的循环交叉点。
5.根据权利要求4所述的一步检测法，其特征在于，EWS-FLI1 I型融合的PCR反应液具体配制如下：
6.根据权利要求4所述的一步检测法，其特征在于，EWS-FLI1 II型融合的PCR反应液具体配制如下：
7.根据权利要求5或6所述的一步检测法，其特征在于，Total RNA的加入量为1pg-10ng。
8.根据权利要求4所述的一步检测法，其特征在于，PCR反应具体如下：
55℃反转录10min；95℃变性1min；然后45个循环，95℃变性10sec，60℃延伸30sec。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109811055A (zh) * 2019-01-08 2019-05-28 广州金域医学检验中心有限公司 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
CN113005200A (zh) * 2021-04-14 2021-06-22 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107226862A (zh) * 2017-05-27 2017-10-03 南京川博生物技术有限公司 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107226862A (zh) * 2017-05-27 2017-10-03 南京川博生物技术有限公司 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ENRIQUE DE ALAVA等: "EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing"s sarcoma", 《J CLIN ONCOL》 *
MARTINE PETER等: "A multiplex real-time PCR assay for the detection of gene fusions observed in solid tumors", 《LABORATORY INVESTIGATION》 *
TRACEY B LEWIS等: "Differentiating Ewing"s sarcoma from other round blue cell tumors using a RT-PCR translocation panel on formalin-fixed paraffin-embedded tissues", 《MODERN PATHOLOGY》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109811055A (zh) * 2019-01-08 2019-05-28 广州金域医学检验中心有限公司 肉瘤融合基因检测试剂盒及系统
CN113005200A (zh) * 2021-04-14 2021-06-22 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用
CN113005200B (zh) * 2021-04-14 2023-07-04 深圳乐土生物科技有限公司 一种检测肉瘤融合基因突变的引物组合物、试剂盒及应用

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