CN107226862A - 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用 - Google Patents

特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107226862A
CN107226862A CN201710389206.1A CN201710389206A CN107226862A CN 107226862 A CN107226862 A CN 107226862A CN 201710389206 A CN201710389206 A CN 201710389206A CN 107226862 A CN107226862 A CN 107226862A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
antibody
ews
fli1
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710389206.1A
Other languages
English (en)
Inventor
林世康
徐士杰
孙钵清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
NANJING CHUANBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
NANJING CHUANBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by NANJING CHUANBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical NANJING CHUANBO BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201710389206.1A priority Critical patent/CN107226862A/zh
Publication of CN107226862A publication Critical patent/CN107226862A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

特异性人EWS‑FLI1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用：1）多肽设计：两组每组三条，组1：多肽1：Cys‑SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ‑Cys；多肽3：Cys‑PSYDSVR；组2：多肽4：Cys‑SSSYGQQSSLLAYN；多肽5同多肽2；多肽6：Cys‑SSLLAYN；2）多肽合成；3）抗原制备：将多肽1、4与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；4）免疫；5）抗体纯化：抗体经三步多肽层析柱亲和纯化得到特异性抗体；6）浓缩；7）抗体鉴定：证明目标抗体特异性。本发明能够实现规模化工业生产，所制备的抗体在尤文肉瘤诊断中应用。

Description

特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉 瘤诊断抗体试剂的应用
技术领域
本发明专利涉及一种人类融合蛋白的抗体制备及应用方法。具体涉及到一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法及其在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。本方法制备的抗体，只对人EWS与FLI1蛋白融合后的人EWS-FLI1融合蛋白有特异反应，对人EWS或FLI1蛋白无反应。
技术背景
尤文肉瘤是一种高度恶性骨肿瘤，其发病率在儿童及青少年原发恶性骨肿瘤中仅次于骨肉瘤。尤文肉瘤根治术后较高的复发与转移率已成为制约尤文肉瘤（Ewing'ssarcoma）疗效提高的关键性障碍。目前发现，尤文肉瘤具有特异的染色体易位t（11；22）（q24；q12），重排的22号染色体上EWS基因的3’端与FLI1基因的5’端相结合，产生一个新的融合基因，编码的融合蛋白EWS-FLI1诱导一系列基因的异常表达导致了尤文肉瘤的发生和发展。95%的尤文肉瘤家族具有特异的融合蛋白EWS-FLI1，此蛋白是尤文肉瘤发生、发展的关键，同时也是治疗尤文肉瘤理想的特异性靶点。实验证实EWS-FLI1基因修饰的树突状细胞对尤文肉瘤细胞具有特异性杀伤作用，提示EWS-FLI1可能是EWS细胞的特异性抗原成分。
EWS-FLI1融合蛋白是由EWS的氨基末端和FLI1的羧基末端组合而成，作为调节异常的转录因子EWS-FLI1发挥着强大的致癌基因作用。除了EWS氨基末端的反式激活结构域之外，富含脯胺酸结构域的FLI1羧基末端能显著增强EWS-FLI1融合蛋白的转录活性（RekhiB, et al. J Postgrad Med, 2010, 56(3): 201-205.）。然而目前对于EWS-FLI1融合蛋白的非转录功能还缺乏研究。研究表明，EWS-FLI1的致癌过程是与DNA结合而非依赖的方式来实现的，因为在尤文肉瘤细胞中发现EWS-FLI1与DNA结合并不能增加前者的致癌潜能。另外有研究发现，EWS-FLI1还能结合靶基因启动子的GGAA卫星重复序列（GGAA-microsatelliterepeat sequences），CAV1和GSTM4参与EWS-FLI1介导的肿瘤形成，进一步证实在尤文肉瘤的肿瘤形成过程中，EWS-FLI1的转录活性是通过卫星重复序列来完成的。 EWS-FLI1融合蛋白有多种类型（type），其中两种占绝大多数。其中最普通的类型为型1（EWS-FLI1 type 1），约占60%。与其它的融合类型相比，EWS-FLI1 型1编码功能较弱的反式激活因子，对预后有利。 其次是型2（EWS-FLI1 type 2），约占25%，编码功能较强的反式激活因子，对预后不利。
融合基因是指将两个或多个基因的编码区首尾相连．置于同一套调控序列（包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等）控制之下，构成的嵌合基因，融合基因的表达产物为融合蛋白。融合基因大部分在肿瘤中被发现，并在肿瘤诊断中占有重要的意义。比如早期发现的bcr-abl融合基因在白血病分型中就极为重要。目前，融合基因的检测方法，主要通过在位杂交荧光(FISH)，反转录PCR（RT-PCR）等方法。这些方法主要基于分子生物学法，无法检测表达产物即融合蛋白。而在生物体内，正是其表达产物即融合蛋白在起着生物学效应。本发明基于免疫学方法，可以对表达产物，即融合后的蛋白进行准确地鉴定，可以定性或定量，特异性好，与未融合的蛋白无反应，可以为尤文肉瘤的科研、诊断与治疗提供新的工具。
对于普通的人EWS或FLI1蛋白的抗体，现有技术中已有标准的生产程序，但是，所生产的这些抗体只能识别未融合前的人EWS或FLI1蛋白，或者只能在识别融合前的EWS或FLI1蛋白的众多异构体的同时，附带识别EWS-FLI1融合蛋白，造成检测结果不可靠，非特异性极高。在报道中，EWS至少有6种异构体，FLI1至少4种异构体，EWS-FLI1融合蛋白至少有12种异构体。同时，因为无法准确识别EWS-FLI1融合蛋白的类型，就无法对临床提供准确的预后的判断。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法。本发明还将提供这种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体中的应用。本发明针对融合蛋白的特定拼接方式，来进行多肽抗原设计，制备的抗体是针对融合后的人EWS-FLI1蛋白。目标抗体经过融合前EWS或FLI1蛋白序列的纯化过滤后，可以达到只对EWS-FLI1融合蛋白有特异性，检测中做到结果准确可靠，有利于诊断应用。具体可以通过免疫学检测的手段，如酶联免疫法（ELISA）、免疫印迹法（WB）、免疫组化法（IHC）等方法将本发明抗体进行应用。本发明任务还包括，该制备方法能够实现规模化工业生产。
完成上述发明任务的技术方案是一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，共提供两种类型（EWS-FLI1 type 1与type 2）的制备方法，步骤如下：
1）多肽设计：设计两组多肽序列，每组三条，分别为：
组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；
组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；
说明：
a)多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1 type 1融合蛋白信息如图1所示。
b)多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS蛋白信息如图2所示。
c)多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
d)多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1type 2融合蛋白信息如图4所示。
e)多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列。
f)多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
g)其中多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的Cys（半胱氨酸）添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。
2）多肽合成：多肽纯度≥85%，分子量正确。通常在免疫实验中，对多肽纯度的要求可以降低至70%。
3）抗原制备：将多肽1、多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物。KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys（半胱氨酸）与多肽1相联接。
4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测。收集经ELISA检测阳性的兔子血清。
5） 抗体纯化：
a. 组1层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1、多肽2与多肽3分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶(sulfolink-Gel)上，制备一组共三根亲和层析柱。
b. 组1纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤。处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时。用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸(glycine) pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液。收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH。
将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。
再将经多肽2纯化过的收集液与多肽3偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全。
穿透液即含有纯化组1目标抗体（EWS-FLI1 type 1抗体）。
c. 组2的层析柱制备与纯化的步骤与组1类似，不同的是多肽1，2，3对应换成多肽4，5，6，最后得到纯化组2目标抗体（EWS-FLI1 type 2抗体）。
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上。可根据各种应用的需要调制相应浓度。
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法（ELISA）、斑点杂交法（Dot-Blot）法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将所设计的多肽分别偶联BSA的偶联物同作为检测抗原。以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。经间接ELISA检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图5所示。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：将多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。经Dot-Blot法检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图6所示。
本发明工艺流程图如图6所示。
完成本申请第二个发明目的的技术方案是，上述特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。具体方法是：
免疫；通常选用BALB/c小鼠以10μg/只的剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经3天，取血样，对血清进行ELISA检测。
细胞融合：取经ELISA检测阳性血清的小鼠，取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP20进行融合，制备杂交瘤细胞。
选择培养：将杂交瘤细胞用96孔板铺板培养，再加选择培养基进行选择培养。
筛选克隆：对杂交瘤细胞进行筛选，使杂交瘤细胞克隆化，形成单克隆细胞株。
单克隆抗体的鉴定：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将所设计的多肽分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原。单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1type 1目标抗体。对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2目标抗体。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1目标抗体。对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2目标抗体。
本发明专利的方法可以应用于各种融合蛋白特异性抗体的制备。具体为依据本发明中的方法，选择融合蛋白拼接位置左右两端的序列进行多肽设计，再根据本发明中多肽合成，抗原制备，免疫，ELISA检测，收集血清步骤，再根据本发明中纯化原理与方法，采用设计的多肽分别制备的层析柱进行亲和层析，得到目标抗体。
本发明专利制备产生的抗体，采用但不限于以下多种免疫学检测方法进行应用。结果可以用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途。
1)夹心酶联免疫法（ELISA）
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取人EWS-FLI融合蛋白或EWS蛋白或FLI1蛋白抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体。可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，细胞培养液，患者血样及体液等样品进行夹心ELISA检测。
2) 免疫印迹法（WB）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法（WB）检测。
3) 免疫组化法（IHC）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织进行免疫组化法（IHC）检测。
4) 免疫沉淀法（IP）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫沉淀法（IP）检测。
5) 免疫荧光法（IF）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫荧光法（IF）检测。
6) 流式细胞术（FCM）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术（FCM），可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行检测。
在分子生物学检测法中，因只能检测融合基因而无法检测具体发挥功能作用的EWS-FLI1融合蛋白，故无法对表达产物即融合蛋白表达与否及表达量进行分析，鉴定结果明显有缺陷。本发明能克服与弥补这些缺陷。本发明还克服了现有技术生产方法所制备的人EWS或FLI1蛋白的抗体，只能识别未融合前的人EWS或FLI1蛋白，或者只能在识别EWS或FLI1蛋白的众多异构体的同时，附带识别EWS-FLI1融合蛋白，造成检测结果不可靠，非特异性极高等不足；本发明专利制备的抗体，针对融合蛋白的特定拼接方式进行多肽抗原设计，制备的抗体是针对融合后的人EWS-FLI1蛋白。目标抗体经过融合前EWS或FLI1蛋白序列的纯化过滤后，可以达到只对EWS-FLI1融合蛋白有特异性，检测中做到结果准确可靠，有利于诊断应用。同时，本发明能够进一步明确鉴定出EWS-FLI1融合蛋白的类型，给临床预后提供了有力的依据。
表1为ELISA检测结果。
基于本发明目标抗体直接测定的是融合后的人EWS-FLI1蛋白，且具有高准确率与特异性的检测结果的优势，大大提高了应用的方便性与检测速度。通常抗体诊断应用中，一次性得到检测结果。比如在应用于患者细胞或组织的免疫印迹（WB）、免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）检测中体现尤其明显，通过本发明抗体的检测就可以一次性得到明确结果。这对于普通的人EWS或FLI1蛋白抗体的检测是无法做到的。本发明的工艺步骤经过严格生产程序与鉴定程序的标准化，可以应用于规模化工业生产。
附图说明
图1为人EWS-FLI1 type 1蛋白信息；
图2为人EWS蛋白信息；
图3为人FLI1蛋白信息；
图4为 人EWS-FLI1 type 2蛋白信息
图5 为Dot-Blot检测结果；
图6为本发明工艺流程图。
具体实施方式
本发明专利可以应用于单克隆抗体的制备，具体实施方式为：
实施例1，一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法
A、提供两种类型EWS-FLI1融合蛋白（type 1与type 2）的制备方法，步骤如下：
1)多肽设计：设计两组多肽序列，每组共三条，分别为：
组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；
组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5：同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；
说明:
a.多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1 type 1融合蛋白信息如图1所示。
b.多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS蛋白信息如图2所示。
c.多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
d.多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278。多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1。多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人EWS-FLI1type 2融合蛋白信息如图4所示。
e.多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列。
f.多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。人FLI1蛋白信息如图3所示。
g.其中多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的Cys（半胱氨酸）添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。
2) 多肽合成：多肽纯度≥85%，分子量正确。通常在免疫实验中，对多肽纯度的要求可以降低至70%。
3) 抗原制备：将多肽1、多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物。KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys（半胱氨酸）与多肽1相联接。
4)免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测。收集经ELISA检测阳性的兔子血清。
5)抗体纯化：
a. 组1层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1、多肽2与多肽3分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶(sulfolink-Gel)上，制备一组共三根亲和层析柱。
b. 组1纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤。处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时。用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸(glycine) pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液。收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH。
将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。
再将经多肽2纯化过的收集液与多肽3偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全。
穿透液含有纯化组1目标抗体。
组2的层析柱制备与纯化的步骤与组1类似，不同的是多肽1，2，3对应换成多肽4，5，6，最后得到纯化组2目标抗体。具体操作是：
c. 组2的层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽4、多肽5与多肽6分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一组共三根亲和层析柱；
d. 组2的纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽4偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；
将收集液与多肽5偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽5抗原吸收完全；
再将经多肽5纯化过的收集液与多肽6偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽6抗原吸收完全；
穿透液含有纯化组2目标抗体。
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上。可根据各种应用的需要调制相应浓度。
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法（ELISA）、斑点杂交法（Dot-Blot）法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将所设计的多肽分别偶联BSA的偶联物同作为检测抗原。以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。经间接ELISA检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图5所示。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：将多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。经Dot-Blot法检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应。组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。结果如图6所示。
B、免疫；通常选用BALB/c小鼠以10μg/只的剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经3天，取血样，对血清进行ELISA检测。
C、细胞融合：取经ELISA检测阳性血清的小鼠，取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP20进行融合，制备杂交瘤细胞。
D、选择培养：将杂交瘤细胞用96孔板铺板培养，再加选择培养基进行选择培养。
E、筛选克隆：对杂交瘤细胞进行筛选，使杂交瘤细胞克隆化，形成单克隆细胞株。
F、单克隆抗体的鉴定：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将多肽分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原。单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽与BSA的偶联物作为检测抗原。单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体。
本发明专利的方法可以应用于各种特异性融合蛋白抗体的制备。具体为依据本发明中的方法，选择融合蛋白拼接位置左右两端的序列进行多肽设计，再根据本发明中多肽合成，抗原制备，免疫，ELISA检测，收集血清步骤，再根据本发明中纯化原理与方法，采用设计的多肽分别制备的亲和柱进行亲和层析，得到目标抗体。
本发明专利制备产生的抗体，采用但不限于以下多种免疫学检测方法进行应用。结果可以用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途。
1)夹心酶联免疫法（ELISA）
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取人EWS-FLI1融合蛋白或EWS蛋白或FLI1蛋白抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体。可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，细胞培养液，患者血样及体液等样品进行夹心ELISA检测。
2) 免疫印迹法（WB）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法（WB）检测。
3) 免疫组化法（IHC）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织进行免疫组化法（IHC）检测。
4) 免疫沉淀法（IP）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫沉淀法（IP）检测。
5) 免疫荧光法（IF）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫荧光法（IF）检测。
6) 流式细胞术（FCM）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术（FCM），可以应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行检测。

Claims (9)

1.一种特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
多肽设计， 设计两组多肽序列，每组共三条，分别为：
组1：多肽1：Cys-SSSYGQQNPSYDSVR；多肽2：SSSYGQQ-Cys；多肽3：Cys-PSYDSVR；
组2：多肽4：Cys-SSSYGQQSSLLAYN；多肽5：同多肽2；多肽6：Cys-SSLLAYN；
多肽合成：多肽纯度≥70%；
抗原制备：将多肽1与多肽4分别与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过半胱氨酸与多肽1相联接；
免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测；收集经ELISA检测阳性的兔子血清；
抗体纯化；
浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，1mg/ml以上；
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经过酶联免疫法、斑点杂交法法鉴定，证明组1目标抗体只对多肽1有特异反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有特异反应，对其它多肽均无反应。
2.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的多肽具有以下特征：
a) 多肽1为15aa肽，对应人EWS-FLI1 type 1融合蛋白位置aa264-278；多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 1融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，PSYDSVR序列来自人FLI1，中间N为拼接位点；多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
b) 多肽2为7aa肽，对应融合前人EWS融合蛋白aa258-264，对应多肽1的N端序列，并在多肽2的C端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
多肽3为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa220-226，对应多肽1的C端序列，并在多肽3的N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
多肽4为14aa肽，对应人EWS-FLI1 type 2融合蛋白位置aa264-278；多肽序列选择恰为人EWS-FLI1 type 2融合蛋白的拼接位置，其中SSSYGQQ序列来自人EWS，SSLLAYN序列来自人FLI1；多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；
多肽5序列同多肽 2，对应多肽4的N端序列；
多肽6为7aa肽，对应融合前人FLI1融合蛋白aa197-203，对应多肽4的C端序列，并在多肽6的N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联。
3.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述多肽2与多肽3，多肽5与多肽6的半胱氨酸添加在多肽上的位置不同，以便于抗体纯化。
4.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤2) 所合成的多肽纯度≥85%，分子量正确。
5.根据权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，步骤5）所述的抗体纯化具体操作方法是：
a. 组1层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1、多肽2与多肽3分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一组共三根亲和层析柱；
b. 组1纯化：血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBSpH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；
将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全；
再将经多肽2纯化过的收集液与多肽3偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽3抗原吸收完全；
穿透液含有纯化组1目标抗体；
c. 组2的层析柱制备：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽4、多肽5与多肽6分别偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一组共三根亲和层析柱；
d. 组2的纯化：
血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽4偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；
将收集液与多肽5偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽5抗原吸收完全；
再将经多肽5纯化过的收集液与多肽6偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽6抗原吸收完全；
穿透液含有纯化组2目标抗体。
6.根据权利要求1-5之一所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法，其特征在于，7）抗体鉴定中检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法：将所设计的多肽分别偶联BSA的偶联物同作为检测抗原；以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板；经间接ELISA检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应；
b．斑点杂交法：将多肽与BSA的偶联物作为检测抗原；经Dot-Blot法检测，证明组1目标抗体只对多肽1有极强反应，对其它多肽均无反应；组2目标抗体只对多肽4有极强反应，对其它多肽均无反应。
7.权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法所制备的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用。
8.权利要求1所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法所制备的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用，其特征在于，其中单克隆抗体的鉴定方法是：
a. 间接酶联免疫法：将所设计的多肽分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原；单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体；
b．斑点杂交法：采用多肽与BSA的偶联物作为检测抗原；单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 1抗体；对多肽4有反应，对其它多肽无反应的抗体即为EWS-FLI1 type 2抗体。
9.权利要求7或8所述的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体的制备方法所制备的特异性人EWS-FLI1融合蛋白抗体在制备恶性肿瘤--尤文肉瘤诊断抗体试剂中的应用，其特征在于，用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途；所述的应用为以下应用方法之一：
1)夹心酶联免疫法：
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取人EWS-FLI1融合蛋白或EWS蛋白或FLI1蛋白抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体；应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，细胞培养液，患者血样及体液等样品进行夹心ELISA检测；
2) 免疫印迹法：
采用本发明专利制备产生的抗体，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法检测；
3) 免疫组化法：
采用本发明专利制备产生的抗体，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织进行免疫组化法检测；
4) 免疫沉淀法：
采用本发明专利制备产生的抗体，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫沉淀法检测；
5) 免疫荧光法：
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行免疫荧光法检测；
6) 流式细胞术：
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术，应用于尤文肉瘤相关细胞或组织，患者血样及体液进行检测。
CN201710389206.1A 2017-05-27 2017-05-27 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用 Pending CN107226862A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710389206.1A CN107226862A (zh) 2017-05-27 2017-05-27 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710389206.1A CN107226862A (zh) 2017-05-27 2017-05-27 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107226862A true CN107226862A (zh) 2017-10-03

Family

ID=59933999

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710389206.1A Pending CN107226862A (zh) 2017-05-27 2017-05-27 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107226862A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108559780A (zh) * 2018-06-29 2018-09-21 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法
CN108796085A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法
CN110870917A (zh) * 2018-09-03 2020-03-10 上海市第一人民医院 Ews或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5968734A (en) * 1992-05-20 1999-10-19 (Cnrs Centre National De La Recherche Scientifique Nucleic acid corresponding to a gene of chromosome 22 involved in recurrent chromosomal translocations associated with the development of cancerous tumors, and nucleic acids of fusion resulting from said translocations
US20070202076A1 (en) * 2004-09-23 2007-08-30 Triche Timothy J Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutics
WO2006117414A8 (es) * 2005-04-29 2007-12-13 Proyecto Biomedicina Cima Sl Modelo animal no humano de sarcoma
CN102548549A (zh) * 2009-08-25 2012-07-04 细胞研究有限公司 利用外代谢转换剂(辅酶q10)治疗肉瘤的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5968734A (en) * 1992-05-20 1999-10-19 (Cnrs Centre National De La Recherche Scientifique Nucleic acid corresponding to a gene of chromosome 22 involved in recurrent chromosomal translocations associated with the development of cancerous tumors, and nucleic acids of fusion resulting from said translocations
US20070202076A1 (en) * 2004-09-23 2007-08-30 Triche Timothy J Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutics
WO2006117414A8 (es) * 2005-04-29 2007-12-13 Proyecto Biomedicina Cima Sl Modelo animal no humano de sarcoma
CN102548549A (zh) * 2009-08-25 2012-07-04 细胞研究有限公司 利用外代谢转换剂(辅酶q10)治疗肉瘤的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOH,E. ET AL.: "EWSR1/FLI1 fusion protein type 1 [Homo sapiens]", 《GENBANK: ADX41459.1》 *
LOH,E. ET AL.: "EWSR1/FLI1 fusion protein type2 [Homo sapiens]", 《GENBANK: ADX41460.1》 *
方肇勤主编: "《分子生物学技术在中医药研究中的应用》", 30 September 2002, 上海科学技术出版社 *
曹凯等: "尤文肉瘤EWS-FLI1蛋白融合区的二级结构及B细胞表位的预测", 《中国免疫学杂志》 *
覃扬主编: "《医学分子生物学实验教程》", 31 March 2004, 中国协和医科大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108559780A (zh) * 2018-06-29 2018-09-21 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其两步检测法
CN108796085A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 青岛普泽麦迪生物技术有限公司 用于肿瘤融合基因ews-fli1检测的引物对、探针、试剂盒及其一步检测法
CN110870917A (zh) * 2018-09-03 2020-03-10 上海市第一人民医院 Ews或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用
CN110870917B (zh) * 2018-09-03 2022-03-15 上海市第一人民医院 Ews或其上调剂在制备治疗糖尿病及防治糖尿病个体肿瘤发生的药物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2004081047A1 (ja) モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ
CN108508200A (zh) 检测cd19 car的细胞的方法及其应用
US5443956A (en) Detection, quantitation and classification of RAS proteins in body fluids and tissues
CN107226862A (zh) 特异性人ews‑fli1融合蛋白抗体的制备方法及在制备尤文肉瘤诊断抗体试剂的应用
CA2287545A1 (en) Ma family polypeptides and anti-ma antibodies
CN116375856A (zh) 一种抗Tau蛋白的单克隆抗体1A5-47H7和基于其的产品以及应用
KR102189893B1 (ko) bPAG1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
US7094551B2 (en) Immunoassays, assay methods, antibodies and method of creating antibodies for detecting FGF-23
US20220144912A1 (en) Leptin immunogens, hybridoma cells, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies and use thereof
AU634961B2 (en) Detection, quantitation and classification of ras proteins in body fluids and tissues
JPWO2009044561A1 (ja) 抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体
US6200764B1 (en) Detection, quantitation and classification of ras proteins in body fluids and tissues
US7148332B2 (en) High affinity monoclonal antibody for recognizing the estrogen receptor (ER) and method for creating the antibody
JP5553603B2 (ja) 新規肝癌マーカー
CN111334480A (zh) 一种分泌抗Aβ1-42单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
JP3568198B2 (ja) 異常プリオンタンパク質の検出方法
CN117024586B (zh) 一种抗体组合物及应用于检测血液中ykl-40浓度的方法
CN116143931B (zh) 一种抗人IgM抗体及其制备方法和用途
US7569675B2 (en) High affinity monoclonal antibody for recognizing the progesterone receptor (PR) and method for creating the antibody
WO2020218121A1 (ja) 癌を検出する方法および検出試薬
CN107118274A (zh) 人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用
JP5231954B2 (ja) アルブミン測定試薬
KR100996486B1 (ko) 인체 무등(ｍｕｄｅｎｇ) 단백질에 대한 단일클론 항체
CN117304314A (zh) Aqp4抗体及其应用
CN117106074A (zh) 抗狂犬病毒糖蛋白抗体或其片段及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171003

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication