CN107118274A - 人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用 - Google Patents

人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用 Download PDF

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Abstract

人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊断抗体试剂中的应用：1）设计一对多肽：多肽1：Cys‑LDLETL‑T/V‑P(4‑hydroxy)‑YIPMDG‑NH2；多肽2：Cys‑LDLETLAPYIPMDG‑NH2；2）多肽合成：3)抗原制备；4）基础免疫和加强免疫；5）抗体纯化：两步多肽层析柱亲和纯化；6）浓缩；7）抗体鉴定：证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。本发明含有特点位点突变和特定位点后修饰蛋白质的特异性抗体、制备及应用，能够实现人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的规模化生产。

Description

人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法及其在制备诊 断抗体试剂中的应用
技术领域
本发明专利涉及一种蛋白质的抗体制备及应用方法，具体涉及到一种人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法及其在制备红细胞增多症及特定肿瘤诊断抗体试剂中的应用。
技术背景
缺氧诱导因子（HIFs）是一种转录因子，能控制细胞响应氧后产生的很多生物学功能，包括能量代谢以及特定红血细胞的生成、发育。其功能一旦失调，导致肿瘤形成、癌症发展及浸润。HIFs表达量的增加被发现在肿瘤细胞中存在，并以独特的方式调控肿瘤细胞能量的生成。
涉及控制细胞能量代谢过程有两条途径：一种是糖酵解途径，另一种是氧化磷酸化途径。当肿瘤细胞处于低氧的微环境时，低氧刺激细胞内的HIF大量表达，使胞内的氧化磷酸化途径受抑，而糖酵解途径增强（图1）。 而当处于氧充足的微环境下，HIFα亚基发生羟基化，羟基化的HIF与肿瘤抑制蛋白（VHL）结合，启动HIF泛素化降解，细胞主要能量经过氧化磷酸化途径（图2）。
HIFs能控制特定红血细胞的生成，红细胞增多引发红细胞增多症（polycythemia）。红细胞增多症以红细胞数目、血红蛋白、红细胞压积和血液总容量显著地超过正常水平为特点，可分为原发性与继发性两大类。原发性发病率与遗传因素关系较大，其中家族性良性红细胞增多症为常染色体遗传性疾病，有不同的外显性。继发性的主要是由组织缺氧所引起的。
科学家发现两例罕见的嗜铬细胞瘤和副神经节瘤患者的肿瘤细胞中的HIF2α发生了突变（Zhengping Zhuang etal., N Engl J Med. 2012 September 6; 367(10): 922–930）。科学家发现突变型HIF2a基因生成的蛋白相比于标准的基因形式的蛋白，其被降解代谢的速度明显减慢，导致其在细胞中稳定性与半寿期增加并在细胞中累积，从而导致红细胞生成增多。更具体讲，是由于HIF2a蛋白位点A530突变成T或V，导致了P531的羟基化异常，从而其代谢速度被减速（图3）。
科学家的实验证实了16例此类患者中，有11例发生了相同的突变，另2例发生了不同的但类似的突变。更多例不同原因的红细胞增多症患者的HIFs突变现象，以及在一些如白血病等癌症组织发生类似的突变现象，提示了HIFs的突变可能存在于多种类型癌症中，因此HIFs突变在多种癌症患者及不同的红细胞增多症的患者中具有普筛的意义。这些研究发现将帮助阐明一些癌症细胞的新陈代谢机制，有助于研究如何阻碍肿瘤生长等课题，为诊断与治疗肿瘤与红细胞过度生成相关的疾病提供了新方案。
基于人缺氧诱导因子HIF2a蛋白的重要功能，市场上已有人HIF2a的抗体产品。但是，这些产品测定的是普通人HIF2a蛋白水平，具体讲，这些产品只能测定人HIF2a蛋白的总量，或只能对人HIF2a蛋白存在性做定性分析。因无法对A530突变及P531羟基化后修饰的人HIF2a做定性与定量分析，故无法应用于由此机制引发的红细胞增多症患者及肿瘤病变类型的诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法。本发明还将提供人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体在制备由人HIF2a蛋白经A530突变与P531羟基化引起的红细胞增多症及肿瘤类型的诊断抗体试剂中的应用方法。本发明能够克服现有技术中的HIF2a抗体产品只能测定人HIF2a蛋白的总量，或只能对人HIF2a蛋白存在性做定性分析，无法对A530突变及P531羟基化后修饰的人HIF2a做定性与定量分析等不足。本发明制备的抗体，可以针对性识别特定位点A530突变后且引发P531羟基化后修饰人HIF2a蛋白，故能针对性应用于由此机制引发的红细胞增多症患者及肿瘤病变类型的诊断。
完成上述发明任务的技术方案是，一种人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）多肽设计：设计一对多肽序列，分别为：
多肽1：Cys-LDLETL-T/V-P(4-hydroxy)-YIPMDG-NH2；
多肽2：Cys-LDLETLAPYIPMDG-NH2；
说明:
a.两条多肽序列均为14aa肽，对应人类HIF2a蛋白位置为aa524-537。人类HIF2a蛋白信息如图4所示。实际应用中，多肽序列在长度上可以小范围缩小或增加。
b.多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。在实际操作中，也可以将Cys添加在多肽C端。
c.多肽1中，T/V为混合苏氨酸和缬氨酸，两者各占50%，对应HIF2a A530位点突变类型A530T或A530V。P(4-hydroxy)为4-羟基化脯氨酸，对应HIF2a P531 4-羟基化。多肽2为正常野生型多肽。G-NH2为末端酰胺化的甘氨酸。实际应用中，末端氨基酸也可以不加修饰。多肽与HIF2a蛋白对应关系如图5所示。
2）多肽合成：多肽纯度≥85%，分子量正确。通常在免疫实验中，对多肽纯度的要求可以降低至70%。
3) 抗原制备：将多肽1与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物。KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys（半胱氨酸）与多肽1相联接。
4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测。收集经ELISA检测阳性的兔子血清。
5）抗体纯化：
a. 制备一对亲和层析柱：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1与多肽2分别通过Cys偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶(sulfolink-Gel)上，制备一对亲和层析柱。
b.纯化：血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤。处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时。用10mM PBSpH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸(glycine) pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液。收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH。再将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。穿透液即含有纯化目标抗体。
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上。可根据各种应用的需要调制相应浓度。
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经间接酶联免疫法（ELISA）、斑点杂交法（Dot-Blot）法、免疫印迹法（WB）鉴定，证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将多肽1与多肽2分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原，以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。经间接ELISA检测，证明目标抗体1：1000倍稀释后，对多肽1的反应数值大于多肽2的反应数值10倍以上，目标抗体对多肽1有极强反应，对多肽2反应极弱可怱略。结果如图6所示。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽1与多肽2与BSA的偶联物作为检测抗原。经Dot-Blot法检测，证明目标抗体只对多肽1有特异反应，对多肽2无反应。结果如图7所示。
c. 免疫印迹法（WB）：采用转染A530V突变型HIF2a基因的人A549细胞与正常野生型人A549细胞的裂解液经免疫印迹法（WB）检测，证明目标抗体只对A530V突变型HIF2a蛋白有反应，与野生型HIF2a蛋白无反应。结果如图8所示。
本发明工艺流程图如图8所示。
完成本申请第二个发明任务的技术方案是：上述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体在制备红细胞增多症及肿瘤诊断抗体试剂的应用。
上述特异性抗体在制备红细胞增多症及肿瘤诊断抗体试剂的应用方法如下：
A 夹心酶联免疫法（ELISA）
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，再选取HIF2a普通抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体。可以对红细胞增多症及肿瘤相关细胞或组织的裂解液、细胞培养物，及患者血样等样品进行夹心ELISA检测。
B 免疫印迹法（WB）
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，可以对红细胞增多症及肿瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法（WB）检测。
C 免疫组化法（IHC）
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，可以对红细胞增多症及肿瘤相关细胞或组织进行免疫组化法（IHC）检测。
D 免疫沉淀法（IP）
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，可以对红细胞增多症及肿瘤相关细胞或组织，患者血样进行免疫沉淀法（IP）检测。
E 免疫荧光法（IF）
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，可以对红细胞增多症及肿瘤相关细胞或组织，患者血样进行免疫荧光法（IF）检测。
F 流式细胞术（FCM）
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，通过流式细胞术（FCM），可以对红细胞增多症及肿瘤相关细胞或组织，患者血样进行检测。
本发明是一种同时含有特点位点突变和特定位点后修饰的蛋白质的特异性抗体的制备及应用方法。本发明的制备方法产生的抗体，在红细胞增多症及肿瘤中有科研或诊断的重要用途。具体可以通过免疫学检测的手段，如酶联免疫法（ELISA）、免疫印迹法（WB）、免疫组化法（IHC）等方法将本发明抗体进行应用。
人HIF2a的普通抗体产品只能测定人HIF2a蛋白水平，测定的是人HIF2a蛋白的总量，或只能对人HIF2a蛋白本身做定性分析，无法对A530突变后及P531羟基化后修饰的人HIF2a蛋白做定性与定量分析，故无法应用于由此机制引发的红细胞增多症患者及肿瘤病变类型。本发明制备的抗体，可以特异性地识别特定位点A530突变且P531羟基化的人HIF2a蛋白，故能针对性应用于由此机制引发的红细胞增多症患者及肿瘤病变类型的诊断。
表1：ELISA结果显示目标抗体只对多肽1有极强特异反应，对多肽2反应极弱忽略。
本发明的工艺步骤经过严格生产程序与鉴定程序的标准化，可以应用于规模化工业生产。
附图说明
图1显示肿瘤细胞处于低氧的微环境时，低氧刺激细胞内的HIF大量表达，使胞内的氧化磷酸化途径受抑，而糖酵解途径增强；
图2显示处于氧充足的微环境下，HIFα亚基发生羟基化，羟基化的HIF与肿瘤抑制蛋白（VHL）结合，启动HIF泛素化降解，细胞主要能量经过氧化磷酸化途径；
图3显示HIF2a蛋白位点A530突变成T或V，导致P531的羟基化异常，从而其代谢速度被减速；
图4为人类HIF2a蛋白信息图；
图5为多肽与HIF2a蛋白对应关系示意图；
图6 Dot-Blot结果显示目标抗体只对多肽1有特异反应，对多肽2无反应；
图7 WB结果显示目标抗体只对A530V突变型HIF2a蛋白有反应，与野生型HIF2a蛋白无反应；
图8为本发明工艺流程图。
具体实施方式
本发明可以应用于单克隆抗体的制备，具体实施方式为：
实施例1，人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备方法。步骤如下：
A、人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体的制备：
1）多肽设计：设计一对多肽序列，分别为：
多肽1：Cys-LDLETL-T/V-P(4-hydroxy)-YIPMDG-NH2；
多肽2：Cys-LDLETLAPYIPMDG-NH2；
a.两条多肽序列均为14aa肽，对应人类HIF2a蛋白位置为aa524-537。人类HIF2a蛋白信息如图4所示。实际应用中，多肽序列在长度上可以小范围缩小或增加。
b.多肽序列在N端人为添加一个Cys（半胱氨酸）用于抗原偶联。在实际操作中，也可以将Cys添加在多肽C端。
c.多肽1中，T/V为混合苏氨酸和缬氨酸，两者各占50%，对应HIF2a A530位点突变类型A530T或A530V。P(4-hydroxy)为4-羟基化脯氨酸，对应HIF2a P531 4-羟基化。多肽2为正常野生型多肽。G-NH2为末端酰胺化的甘氨酸。实际应用中，末端氨基酸也可以不加修饰。多肽与HIF2a蛋白对应关系如图5所示。
2）多肽合成：多肽纯度≥85%，分子量正确。通常在免疫实验中，对多肽纯度的要求可以降低至70%。
3) 抗原制备：将多肽1与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物。KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物（SMCC）双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys（半胱氨酸）与多肽1相联接。
4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测。收集经ELISA检测阳性的兔子血清。
5）抗体纯化：
a. 制备一对亲和层析柱：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1与多肽2分别通过Cys偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶(sulfolink-Gel)上,制备一对亲和层析柱。
b.纯化：血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤。处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时。用10mM PBSpH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸(glycine) pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液。收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH。再将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤可以重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全。穿透液即含有纯化目标抗体。
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上。可根据各种应用的需要调制相应浓度。
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经间接酶联免疫法（ELISA）、斑点杂交法（Dot-Blot）法、免疫印迹法（WB）鉴定，证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将多肽1与多肽2分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原，以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板。经间接ELISA检测，证明目标抗体1：1000倍稀释后，对多肽1的反应数值大于多肽2的反应数值10倍以上，目标抗体对多肽1有极强反应，对多肽2反应极弱可怱略。结果如图6所示。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽1与多肽2与BSA的偶联物作为检测抗原。经Dot-Blot法检测，证明目标抗体只对多肽1有特异反应，对多肽2无反应。结果如图7所示。
c. 免疫印迹法（WB）：采用转染A530V突变型HIF2a基因的人A549细胞与正常野生型人A549细胞的裂解液经免疫印迹法（WB）检测，证明目标抗体只对A530V突变型HIF2a蛋白有反应，与野生型HIF2a蛋白无反应。结果如图8所示。
本发明工艺流程图如图8所示。
B、免疫；通常选用BALB/c小鼠以10μg/只的剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经3天，取血样，对血清进行ELISA检测。
C、细胞融合：取经ELISA检测阳性血清的小鼠，取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP20进行融合，制备杂交瘤细胞。
D、选择培养：将杂交瘤细胞用96孔板铺板培养，再加选择培养基进行选择培养。
E、筛选克隆：对杂交瘤细胞进行筛选，使杂交瘤细胞克隆化，形成单克隆细胞株。
F、单克隆抗体的鉴定：
a. 间接酶联免疫法（ELISA）：将多肽1与多肽2分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原。单克隆抗体采用间接ELISA检测，对多肽1有反应，对多肽2无反应的抗体即为目标抗体。
b．斑点杂交法（Dot-Blot）：采用多肽1与多肽2与BSA的偶联物作为检测抗原。单克隆抗体经Dot-Blot法检测，对多肽1有反应，对多肽2无反应的抗体即为目标抗体。
本发明专利制备产生的抗体，采用但不限于以下多种免疫学检测方法进行应用。结果可以用于定性或定量实验，用于科研或诊断用途。
1)夹心酶联免疫法（ELISA）
采用本发明专利制备产生的抗体，再选取HIF2a普通抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体。可以对红细胞增多症患者及肿瘤相关细胞或组织的裂解液，或细胞培养物，血样等样品进行夹心ELISA检测。
2) 免疫印迹法（WB）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以对红细胞增多症患者及肿瘤相关细胞或组织的裂解液，表达蛋白等样品进行免疫印迹法（WB）检测。
3) 免疫组化法（IHC）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以对红细胞增多症患者及肿瘤相关细胞或组织进行免疫组化法（IHC）检测。
4) 免疫沉淀法（IP）
采用本发明专利制备产生的抗体，可以对红细胞增多症患者及肿瘤相关细胞或组织，患者血样进行免疫沉淀法（IP）检测。
5) 免疫荧光法（IF）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，可以对红细胞增多症患者及肿瘤相关细胞或组织，患者血样进行免疫荧光法（IF）检测。
6) 流式细胞术（FCM）
采用本发明专利制备产生的抗体，通过流式细胞术（FCM），可以对红细胞增多症患者及肿瘤相关细胞或组织，患者血样进行检测。

Claims (7)

1.一种人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）多肽设计：设计一对多肽序列，分别为：
多肽1：Cys-LDLETL-T/V-P(4-hydroxy)-YIPMDG-NH2；
多肽2：Cys-LDLETLAPYIPMDG-NH2；
2）多肽合成：多肽纯度≥70%；
3) 抗原制备：将多肽1与KLH偶联，偶联物作为抗原用于免疫动物；KLH使用琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物双功能偶联剂预先活化成KLH-SMCC，通过Cys与多肽1相联接；
4）免疫：选用新西兰兔，每只兔子以300μg剂量进行基础免疫，以后每隔21天进行一次加强免疫，在经过三次加强免疫后，再经7天，取血样，对血清进行ELISA检测；收集经ELISA检测阳性的兔子血清；
5）抗体纯化；
6）浓缩：将纯化好的穿透液浓缩成特定浓度目标抗体浓液，通常1mg/ml以上；
7）抗体鉴定：制备的目标抗体经间接酶联免疫法、斑点杂交法法、免疫印迹法鉴定，证明抗体只对同时有A530突变与P531羟基化特征的HIF2a有特异反应，对野生型HIF2a无反应。
2.根据权利要求1所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤1）所述的两条多肽有以下特征：
a.两条多肽序列均为14aa肽，对应人类HIF2a蛋白位置为aa524-537；
b.多肽序列在N端人为添加一个半胱氨酸用于抗原偶联；或将Cys添加在多肽C端；
c.多肽1中，T/V为混合苏氨酸和缬氨酸，两者各占50%，对应HIF2a A530位点突变类型A530T或A530V；P(4-hydroxy)为4-羟基化脯氨酸，对应HIF2a P531 4-羟基化；多肽2为正常野生型多肽；G-NH2为末端酰胺化的甘氨酸；或者，G-NH2末端氨基酸不加修饰。
3.根据权利要求1所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的多肽纯度≥85%。
4.根据权利要求1所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤5）所述抗体纯化的具体操作如下：
a. 制备一对亲和层析柱：多肽与胶的剂量按2mg：2mg，将多肽1与多肽2分别通过Cys偶联在预先活化好的巯基琼脂糖凝胶上，制备一对亲和层析柱；
b. 纯化：血清按10：1体积比例加入1 M Tris·HCl pH7.5 缓冲液调节pH值，再用0.45μm膜过滤；处理过血清再与多肽1偶联的层析柱室温下混匀反应2小时；用10mM PBS pH7.4清洗层析柱后，再用100 mM 甘氨酸pH2.8缓冲液洗脱，收集OD280≥0.2部分洗脱液；收集液立即用 1M Tris·HCl pH7.5缓冲液调节pH；再将收集液与多肽2偶联的层析柱室温下混匀反应2小时，收集穿透液，此步骤重复1到3次，直至穿透液被多肽2抗原吸收完全；穿透液即含有纯化目标抗体。
5.根据权利要求1-4之一所述的人缺氧诱导因子HIF2a特异性抗体的制备方法，其特征在于，步骤7）所述抗体鉴定的检测方法如下：
a. 间接酶联免疫法：将多肽1与多肽2分别偶联BSA，偶联物作为检测抗原，以5μg/ml，每孔100μl包被96孔板；经间接ELISA检测，证明目标抗体1：1000倍稀释后，对多肽1的反应数值大于多肽2的反应数值10倍以上，目标抗体对多肽1有极强反应，对多肽2反应极弱可怱略；
b．斑点杂交法：采用多肽1与多肽2与BSA的偶联物作为检测抗原；经Dot-Blot法检测，证明目标抗体只对多肽1有特异反应，对多肽2无反应；
c. 免疫印迹法：采用转染A530V突变型HIF2a基因的人A549细胞与正常野生型人A549细胞的裂解液经免疫印迹法检测，证明目标抗体只对A530V突变型HIF2a蛋白有反应，与野生型HIF2a蛋白无反应。
6.权利要求1所述的特异性抗体在制备红细胞增多症及肿瘤诊断抗体试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的特异性抗体在制备红细胞增多症及肿瘤诊断抗体试剂中的应用，其特征在于，所述的应用为以下方法之一：
A 夹心酶联免疫法，
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，再选取HIF2a普通抗体进行配对，形成一对夹心ELISA抗体；对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织的裂解液，以及细胞培养物，患者血样等样品进行夹心ELISA检测；
B 免疫印迹法，
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织的裂解液，重组蛋白等样品进行免疫印迹法检测；
C 免疫组化法，
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织进行免疫组化法检测；
D 免疫沉淀法，
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织，患者血样进行免疫沉淀法检测；
E 免疫荧光法，
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，通过直接荧光标记，或通过荧光标记二抗法，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织，患者血样进行免疫荧光法检测；
F 流式细胞术，
所述人缺氧诱导因子HIF2a(A530突变及P531羟基化)特异性抗体，通过流式细胞术，对红细胞增多症及肿瘤抗相关细胞或组织，患者血样进行检测。
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