CN108794630A - 鼠抗人tim3蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鼠抗人TIM3蛋白的单克隆抗体，能够特异性地识别TIM3蛋白在免疫细胞及肿瘤细胞表面的表达，表现稳定且效价高。本发明还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明首次应用免疫组化方法检测TIM3蛋白，为非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌等肿瘤以及脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病的临床诊断和治疗方案提供科学参考。首次发现不同杂交瘤细胞产生的单克隆抗体可以识别同一抗原不同修饰状态的TIM3蛋白，利用这一发现可以对TIM3单克隆抗体进行有目的地筛选，具有基础医学研究价值。

Description

鼠抗人TIM3蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种鼠抗人TIM3蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。

背景技术

T细胞免疫球蛋白及粘蛋白域3(T cell immunoglobulin domain and mucindomain protein 3，TIM3)是2001年在研究哮喘易感基因的研究中被发现的免疫检查点分子，是Tim家族成员之一，其蛋白结构包括免疫球蛋白样(IgV)区、黏蛋白(mucin)区、跨膜区和胞内区。TIM3在Th1、Tcl、Treg以及NK、树突状细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞和淋巴管内皮细胞均组成性或诱导性表达，而这些细胞是构成肿瘤微环境的主要成分，因此该分子在肿瘤免疫中的作用备受重视。一方面，Th1上的TIM3受其配体半乳糖凝集素-9(Gal-9)激活，提供T细胞负性信号，T细胞逐渐失能成为耗竭性T细胞。耗竭的T细胞逐渐失去增殖能力，同时也逐渐丧失分泌多种细胞因子如IL-2、TNF-α和IFN-γ等的能力。阻断T细胞TIM3信号通路，可有效恢复免疫系统杀伤肿瘤细胞的功能，从而抑制肿瘤生长。另一方面，新近发现高迁移率族蛋白B-1(HMGB-1)和CEACAM-1同样可以作为TIM3的天然配体。TIM3在肿瘤浸润的树突状细胞表面高表达，竞争结合肿瘤细胞碎裂时释放在间质中的HMGB-1，从而抑制抗肿瘤免疫反应。TIM3在抗肿瘤免疫及癌症发展的不同层次发挥重要作用，但遗憾的是目前国内外没有任何一个通过注册的可用于临床体外诊断(In Vitro Diagnostics，IVD)用的TIM3抗体。本发明研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的抗TIM3蛋白的单克隆抗体，可用于多种实体肿瘤中TIM3蛋白的检测。值得一提的是，在制备本发明研制的TIM3单克隆抗体时，首次发现不同杂交瘤细胞产生的单克隆抗体可以识别同一抗原不同修饰状态的TIM3蛋白，利用这一发现可以对TIM3单克隆抗体进行筛选，有目的地获得对于特定研究目标，或用于临床诊断和治疗等特殊性能的单克隆抗体。进一步，该发现将有助于分析TIM3蛋白的修饰与其细胞内位置、功能的联系，对TIM3蛋白不同修饰状态的特异性识别在基础研究领域具有重要的研究价值。

在众多激活抗肿瘤免疫的有效策略中，免疫检查点阻断疗法是研究的热门问题之一。近年来，TIM3作为一种新的免疫检查点分子在不同疾病的检测诊断中的研究越来越多，所采用的方法主要是实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹实验(Western Blot)和免疫组化实验(IHC)，其中IHC方法有特异性强、敏感性高、定位准确、形态与功能相结合等优点而备受重视。本发明采用IHC方法，首次建立基于所述TIM3单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于对非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌或相关肿瘤，以及包括脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病的辅助诊断和治疗方案选择。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗TIM3蛋白的单克隆抗体，及该抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫检测工具中的应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性结合TIM3蛋白的单克隆抗体。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：

(1)重组表达载体的构建：根据TIM3基因的ORF全序列(Uniprot-Q8TDQ0)，订购基因合成获得TIM3全序列(TIM3核苷酸序列和氨基酸序列分别见序列表)，基因两侧分别引入限制性内切酶位点NheI和XhoI，插入表达载体pDB-His-GST和pDB-His-MBP(加拿大应用生物材料有限公司，Applied Biological Materials Inc.)，构建TIM3重组表达质粒(T3-pDB-GST和T3-pDB-MBP)。前者T3-pDB-GST用以免疫实验动物，后者T3-pDB-MBP用以ELISA筛选阳性克隆。

(2)TIM3重组蛋白的表达与纯化：将T3-pDB-GST重组表达质粒转化BL21 DE3 Star感受态细胞，裂解细胞后离心取上清，Nickel柱纯化，获得纯化的TIM3重组蛋白；

(3)单抗的筛选与制备：采用上述纯化的T3-pDB-GST重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，使用T3-pDB-MBP预铺的96孔板采用ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗TIM3特异性抗体的杂交瘤细胞株；制备小鼠腹水，通过protein A柱层析纯化TIM3单抗。分别通过免疫组化实验(结果见图1)和Western Blot(结果见图2)验证该单抗的灵敏度和特异性。

本发明的另一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫组化工具中的应用。

所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测多种实体肿瘤中的应用。由于TIM3蛋白的异常表达或扩增与人类多种恶性肿瘤有关，因此使用本发明单克隆抗体检测细胞中TIM3蛋白的表达或扩增状况，可用于辅助诊断TIM3相关性肿瘤。更主要的是，TIM3在免疫细胞中的高表达将导致机体抗肿瘤免疫功能下降，因此检测TIM3在免疫细胞表面的表达对于分析机体抗肿瘤反应和选择适当的免疫检查点抑制剂治疗具有重要的指导作用。

以使用Leica的免疫组化自动染色机BondMax为例，应用该TIM3单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：

(1)使用机器自带的IHC protocol F，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至DAB显色前；

(2)抗体使用终浓度为0.2μg/ml，室温孵育30min；

(3)抗原修复使用pH 9.0的抗原修复液(ER2)，100℃加热孵育20min。

使用其他IHC自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。

本发明所述针对TIM3的特异性单抗，可与TIM3蛋白特异结合，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于对非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌或相关肿瘤，以及包括脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病的辅助诊断和治疗方案选择。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测肺癌组织中TIM3蛋白的表达染色图；

图2为本发明单克隆抗体的Western Blot结果：两个泳道的上样样品均为同一转染TIM3基因的CHO-K1细胞裂解液，由左向右依次为使用本发明TIM3单克隆抗体检测的结果和使用β-Actin抗体检测的阳性对照的结果。

图3为应用TIM3抗体的12个不同单克隆检测同一细胞裂解物的Western Blot结果：1、3-8号克隆显示两条谱带，大小分别约为30kD和50kD；2号克隆显示单一谱带，大小约为30kD；9-12号克隆显示单一谱带，大小约为50kD；+ve为阳性对照；-ve为阴性对照。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1抗TIM3单克隆抗体的制备

一、TIM3重组表达质粒的构建

根据uniprot报道的TIM3基因(Uniprot-Q8TDQ0)，订购基因合成获得TIM3基因的全序列，并在序列两端分别引入酶切位点NheI和XhoI，进而分别克隆入表达载体pDB-His-GST和pDB-His-MBP质粒，建立T3-pDB-GST和T3-pDB-MBP重组表达质粒，分别用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。

二、TIM3重组蛋白的表达与纯化

1、转化BL21 DE3 Star感受态细胞

使用上述构建的T3-pDB-GST和T3-pDB-MBP质粒分别转化到BL21 DE3 Star感受态细胞，预培养获得250ml细菌液，进一步将预培养液加入6L含卡那霉素(Kanamycin)的LB培养液中，37℃培养至OD值达0.8，使用0.5mM的IPTG诱导表达，培养4h。

2、裂解细胞

离心获得细胞沉淀后，以溶液A(20mM磷酸钠，pH 8.0，500mM氯化钠溶液)重悬细胞，超声破碎1min x 6次。3000g/min离心15min沉淀细胞碎片，收集上清用于下一步纯化。

3、Nickel柱层析纯化

以孔径为0.45μm，直径为33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清，随后转入15ml管。加入10ml溶液A与样本混合准备过柱纯化。Nickel树脂反复颠倒混匀后，取3ml加入柱中，用溶液A清洗并平衡3次，静置使树脂自然沉积。加入样品，收集首次流出液。用溶液A清洗柱子5次，加入5倍体积预先配置的洗脱液(溶液A中加入250mM咪唑)。静置1min后收集洗脱液。

4.透析

由步骤3洗脱的样本采用1×PBS溶液透析，分两次完成透析，共用4L透析液。

三、单抗的筛选与制备

1、动物免疫：上述经过纯化的T3-pDB-GST重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的SP2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1∶5-1∶10混合，滴加37℃的50％PEG(pH 8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述纯化的T3-pDB-MBP重组蛋白进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，proteinA柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。

以本发明单克隆抗体为一抗，对经过TIM3基因转染的CHO-K1细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色，其结果如图2所示，由图可见：该抗体成功检测TIM3基因，并呈现单一条带。

实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验

1、分别取24种不同类型的癌组织取样制作组织芯片，使用Leica RM2235型组织切片机进行切片，切片厚度为4μm；

2、使用Leica BondMax免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用Leica的脱蜡溶液洗3遍。抗原修复采用Leica的抗原修复液2(ER2)，100℃孵育20min。一抗使用本发明抗体，采用Leica的抗体稀释液稀释到终浓度为0.2μg/ml。150μl抗体室温孵育30min。使用Leica的二抗(Secondary Antibody)150μl，室温孵育8min。使用Leica的多聚物检测液150μl，室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用Leica的DAB显色液150μl，室温孵育10min。苏木素反染，室温孵育5min；

3、脱水和透明：去离子水清洗1min，95％乙醇1min，100％乙醇2min x 2次，二甲苯2min x 3次，中性树胶封片；

4、镜检，结果：部分肿瘤显示阳性染色，包括肺癌、肾癌、卵巢癌、食管癌、肝癌等，部分肿瘤显示阴性无TIM3染色。其中肺癌组织染色如图1所示，可见明显细胞膜染色，染色细胞包括部分肿瘤浸润淋巴细胞及部分肿瘤细胞。染色模式正确，信号较强，未见明显非特异染色。

实施例3本发明单克隆抗体的特异性检测

应用本发明抗体检测未经转染的CHO-K1细胞未见任何阳性条带。

应用本发明抗体采用ELISA检测无关抗原预铺的96孔板(Her-2)，结果为阴性。

实施例4本发明抗体检测TIM3蛋白修饰状态的多样性

在对本发明抗体单克隆的筛选过程中，根据ELISA和IHC检测的结果，我们对12个单克隆进行了检测目标蛋白特异性的分析。

1、检测样本准备：应用携带TIM3全长的质粒pLenti-T3-GFP(加拿大应用生物材料有限公司，Applied Biological Materials Inc.)转染CHO-K1细胞，转染3天后将细胞倍比稀释植入96孔板，通过嘌呤霉素(Puromycin)筛选阳性转染细胞，药物浓度为30μg/ml。筛选4周后获得TIM3高表达稳定细胞系。使用1x细胞裂解液(加拿大应用生物材料有限公司，Applied Biological Materials Inc.)获得细胞裂解物用于Western Blot检测。

2、将200μl上述细胞裂解物加样到2孔型的预制SDS-PAGE凝胶，按照常规条件进行Western Blot电泳和转移。将转移后的膜切割为14条，每条约4-5mm宽，其中12条分别与12个TIM3备选单克隆抗体孵育杂交，剩余2条分别为阳性对照(和β-Actin抗体孵育杂交)和阴性对照(只加孵化液不加抗体)。按照常规步骤显色获得Western Blot结果如图3所示，应用TIM3抗体的12个不同单克隆检测同一细胞裂解物的Western Blot共发现3种谱带组合：7个克隆(1、3-8号)显示两条谱带，大小分别约为30kD和50kD；1个克隆(2号)显示单一谱带，大小约为30kD；4个克隆(9-12号)显示单一谱带，大小约为50kD。由于不同克隆检测的是同一细胞裂解物，因此不同谱带组合反映出不同的TIM3单克隆可以识别TIM3抗原不同修饰状态的TIM3蛋白。TIM3蛋白的理论分子量为30kD，故2号克隆主要检测未加修饰的TIM3蛋白；大量TIM3蛋白存在翻译后修饰的形态，包括糖基化、磷酸化和形成二硫键，修饰后的TIM3蛋白分子量明显增加，故9-12号克隆特异性检测具有修饰状态的TIM3蛋白；剩余7个克隆可能识别抗原表位(Epitope)在修饰区域外，从而可以检测出所有形态的TIM3蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若于改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种鼠抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人TIM3蛋白。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测TIM3蛋白的免疫组化检测工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测TIM3蛋白的内容包括不同修饰状态的TIM3蛋白。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该免疫组化检测工具可以用于临床诊断与辅助治疗方案选择及医学基础研究。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，来源于同一TIM3抗原的不同TIM3单克隆抗体，可以特异性地识别具有不同修饰状态的TIM3蛋白，据此可以获得对于特定研究目标，或用于临床诊断和治疗等有特殊性能的单克隆抗体。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，来源于同一TIM3抗原的不同TIM3单克隆抗体对不同修饰状态的TIM3的特异性识别特性，有助于分析TIM3蛋白的修饰与其细胞内位置、功能的联系。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的临床诊断与辅助治疗方案选择可用于包括非小细胞肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、黑色素瘤、结肠癌、食管癌或相关肿瘤，以及包括脓毒血症、系统性红斑狼疮或相关感染和自身免疫性疾病。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的医学基础研究可用于对TIM3在不同免疫细胞、肿瘤细胞表达水平、与疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究及TIM3调节机体免疫功能的机理研究。