CN110028585A - 兔抗人trk蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种兔抗人TRK蛋白的单克隆抗体，能够特异性地识别细胞表达的TRK和/或TRK融合蛋白，表现稳定且效价高，与细胞内其它蛋白无交叉反应，具有一定的医学基础研究价值。本发明还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测TRK和/或TRK融合蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明采用免疫组织化学的方法检测肿瘤细胞TRK和/或TRK蛋白，主要包括肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、结肠癌、软组织肉瘤、唾液腺、婴儿纤维肉瘤、阑尾癌、乳腺癌、胆管癌、胰腺癌等，为能否使用TRK激酶抑制剂进行治疗提供有力的科学参考，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。

Description

兔抗人TRK蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种兔抗人TRK蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。
背景技术
原肌球蛋白相关激酶(Tropomyosin-related kinase，TRK)是一类神经生长因子受体，参与调节细胞通讯和肿瘤生长，而NTRK是编码TRK的基因。基因NTRK包含NTRK1、NTRK2和NTRK3，分别负责编码TRK家族蛋白TRKA、TRKB和TRKC的合成。TRK家族蛋白都有一个同源保守的结构区域，该结构区域包括5个细胞外结构域、1个跨膜结构域和1个细胞内的激酶结构域。在胞外5个结构域中，结构域1和3为半胱氨酸富集区，结构域2为亮氨酸富集区，结构域4和5都是类似免疫球蛋白的结构，其中结构域5为配体特异性识别的位点。随着研究的深入，越来越多的证据表明TRK激酶与肿瘤发生发展密切相关。TRK可作为原癌基因在肿瘤的恶性转化、转移及存活信号中发挥重要作用。TRK激酶的异常活化机制与多数酪氨酸激酶类似，二聚化导致TRK激酶自磷酸化，被激活后活性显著上升，从而激活下游PI3K/AKT、STAT3、RAS/MAPK/ERK和PLC-γ等信号级联通路。TRK激酶信号通路的改变，包括基因融合、蛋白过度表达或单核苷酸改变，已经被发现是许多肿瘤的致病原因，特别是NTRK基因的融合，常直接导致TRK系列蛋白高度表达，为目前最明确的致癌原因。因此，研制出一种特异性高、表现稳定的TRK抗体，用于检测肿瘤细胞NTRK和/或NTRK融合基因的表达，对于后续能否使用TRK基因抑制剂进行治疗具有重要意义。
最近，美国FDA批准药物Vitrakvi上市，Vitrakvi用于治疗携带NTRK基因融合的成人和儿童，局部晚期或转移性实体瘤患者，成为第一个正式批准上市的口服TRK激酶抑制药物，同时也是第一个与肿瘤类型无关的“广谱”抗癌药(该药物尚未被批准在国内上市，需一段审批时间)。而由于该基因抑制药物刚刚上市，国内目前尚没有自主研发的TRK抗体，国际范围内商业化的TRK抗体也很稀少，并且目前也仅应用于基础研究领域，特异性和亲和力方面均有待提高，因此亟待研发新的性能优异的抗TRK单克隆抗体，填补国内本行业的空白，降低治疗费用，减轻病人负担。本发明成功研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的兔源TRK蛋白的单克隆抗体，可用于检测肿瘤细胞NTRK和/或NTRK融合基因的表达水平(可识别TRKA、TRKB和TRKC三种亚型)，具有一定的医学基础研究价值。本发明采用免疫组织化学方法(IHC)检测肿瘤细胞TRK和/或TRK融合蛋白，主要包括肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、结肠癌、软组织肉瘤、唾液腺、婴儿纤维肉瘤、阑尾癌、乳腺癌、胆管癌、胰腺癌等，为判断能否使用TRK激酶抑制剂进行治疗提供有力的科学参考，有效降低治疗费用，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗TRK蛋白的单克隆抗体，及该抗体在制备用于检测TRK和/或TRK融合蛋白的免疫组织化学检测工具中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性结合人TRK和/或TRK融合蛋白的单克隆抗体。
本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：
(1)免疫源的制备：根据NTRK基因三个亚型NTRK1(NM_002529.3)、NTRK2(NM_001018064.2)和NTRK3(NM_001012338.2)的序列信息，订购合成N末端带BSA序列(提高多肽的免疫原性)的人类通用TRK多肽(加拿大应用生物材料有限公司，Applied BiologicalMaterials Inc.)，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。
(2)免疫前采血：选取纯种新西兰白兔(New Zealand white rabbit)，酒精擦拭兔耳部，取耳缘静脉血液为免疫前血样。
(3)单抗的筛选与制备：采用合成的N末端带BSA序列的人类TRK通用多肽免疫纯种新西兰白兔，取兔耳缘静脉血采用酶联免疫吸附实验(ELISA)测试血清中TRK抗体滴度。对阳性动物血清制备外周血单核细胞悬液，应用荧光标记的上述多肽抗原进行染色，采用流式细胞仪选取TRK抗体阳性表达的单个细胞加入到96孔中。对各个上述选取的单个细胞采用RT-PCR扩增兔抗体轻、重链。由同一细胞获得的配套轻、重链扩增产物分别克隆到相应的表达载体。Sanger测序并进行序列功能分析后，选择具有有效抗体生成功能的载体质粒转染293T细胞。收集细胞培养液应用ELISA和Western Blot(结果见图1)筛选阳性抗体克隆。进一步通过protein A柱层析纯化TRK单抗。通过免疫组化实验(结果见图2)验证该单抗的灵敏度和特异性。
本发明的另一个目的在于提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测TRK和/或TRK融合蛋白的免疫组化工具中的应用。
所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。
本发明还提供了应用上述单克隆抗体在制备用于检测多种实体肿瘤中TRK和/或TRK融合蛋白的应用。由于NTRK基因的融合为目前最明确的致癌原因，TRK激酶抑制剂为肿瘤治疗的有效靶点，因此检测NTRK和/或NTRK融合基因在肿瘤细胞的表达对于能否选择TRK激酶抑制剂进行治疗具有重要的指导意义。
以使用Leica的免疫组化自动染色机BondMax为例，应用该TRK单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：
(1)使用机器自带的IHC protocol F，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至DAB显色前；
(2)抗体使用终浓度为1.0μg/ml，室温孵育30min；
(3)抗原修复使用pH 9.0的抗原修复液(ER2)，100℃加热孵育30min。
使用其他IHC自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。
本发明所述针对TRK的特异性单抗，可与TRK和/或TRK融合蛋白特异结合，提高了实验的特异性和可靠性，并建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，主要用于对肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、结肠癌、软组织肉瘤、唾液腺、婴儿纤维肉瘤、阑尾癌、乳腺癌、胆管癌、胰腺癌等肿瘤的辅助诊断，为判断能否使用TRK激酶抑制剂进行免疫治疗提供有力的科学参考。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为本发明单克隆抗体的Western Blot结果：上样样品为分别转染NTRK1、NTRK2和NTRK3基因的293T细胞裂解液，由左向右依次为：1-3泳道为筛选的TRK单克隆样本分别检测NTRK1、NTRK2和NTRK3转染细胞裂解液样本，4-6泳道为使用β-Actin抗体检测上述样本的阳性对照的结果，7-9泳道为无一抗阴性对照的结果。
图2为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测两例非小细胞肺癌组织中TRK蛋白的表达染色图，其中图A为阳性，图B为阴性。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1抗TRK单克隆抗体的制备
一、免疫源的制备：根据NTRK基因三个亚型NTRK1(NM_002529.3)、NTRK2(NM_001018064.2)和NTRK3(NM_001012338.2)的序列信息，订购合成N末端带BSA序列的人类TRK通用多肽，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。
二、免疫前采血：选取纯种新西兰白兔，取耳缘静脉血液为免疫前血样。
三、单抗的筛选与制备
1、动物免疫：上述合成的的N末端带BSA序列的人类TRK通用多肽与等体积的弗氏完全佐剂充分混合，制备完全乳化的免疫源，采用皮下注射方法初次免疫纯种新西兰白兔，免疫剂量为500μg/只。两周后，进行第二次免疫，使用不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为500μg/只。两周后，取兔耳缘静脉血用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清效价，根据结果确定是否加强免疫。
2、筛选和克隆：一周后，取兔耳缘静脉血液制备外周血单核细胞悬液，TRK多肽抗原采用Alexa Fluor 488 NHS-Ester标记，应用荧光标记的多肽抗原进行染色，使用流式细胞技术(FACS)将单个抗体生成细胞分别打入预加有反转录反应试剂10μl的96孔板中，进行RT-PCR反应扩增兔抗体轻、重链。由同一细胞获得的配套轻、重链扩增产物分别克隆到相应的表达载体。Sanger测序并进行序列功能分析后，选择具有有效抗体生成功能的载体质粒转染293T细胞。收集细胞培养液进行抗体克隆筛选。采用ELISA和Western Blot(结果见图1)筛选阳性抗体克隆。标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。
3、单抗的制备与纯化：收集ELISA阳性的细胞培养液20ml进行proteinA柱层析纯化，纯化后的单抗先进行浓度测定，后分装、冻存在-20℃。
实施例2以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验
1、分别取24种不同类型的癌组织取样制作组织芯片，使用Leica RM2235型组织切片机进行切片，切片厚度为4μm；
2、使用Leica BondMax免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用脱蜡溶液(Leica)洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2(ER2，Leica)，100℃孵育30min。一抗使用本发明抗体，采用抗体稀释液(Leica)稀释到终浓度为1.0μg/ml，150μl。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗(Leica)150μl，室温孵育8min。使用多聚物检测液(Leica)150μl，室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用DAB显色液(Leica)150μl，室温孵育10min。苏木素复染，室温孵育5min；
3、脱水和透明：去离子水清洗1min，95％乙醇1min，100％乙醇2min x 2次，二甲苯2min x 3次，中性树胶封片；
4、镜检，结果：仅两例肿瘤显示阳性染色，分别为一例非小细胞肺癌和一例甲状腺癌，其他组织均为阴性。其中非小细胞肺癌组织染色如图2所示，一例样本(A)可见明显肿瘤细胞浆染色。染色模式正确，信号较强，未见明显非特异染色，另一例样本为阴性染色。
实施例3本发明单克隆抗体的特异性检测
应用本发明抗体检测未经转染的293T细胞未见任何阳性条带。
应用本发明抗体采用ELISA检测无关抗原预铺的96孔板(Her-2)，结果为阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种兔抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人TRK和/或TRK融合蛋白。
2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于检测TRK和/或TRK融合蛋白的免疫组化检测工具中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该免疫组化检测工具可以用于辅助治疗方案选择、肿瘤的预后判断及医学基础研究。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，辅助治疗方案选择可用于包括肺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、胃肠癌、结肠癌、软组织肉瘤、唾液腺、婴儿纤维肉瘤、阑尾癌、乳腺癌、胆管癌、胰腺癌等相关肿瘤。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医学基础研究可用于对NTRK和/或NTRK融合基因在不同肿瘤细胞的表达水平，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究。
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