CN108727500A

CN108727500A - 鼠抗人idh1 r132h突变蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途

Info

Publication number: CN108727500A
Application number: CN201810412913.2A
Authority: CN
Inventors: 高源远; 李军; 李沛祥; 李雪; 方洁羽; 朱禹宣
Original assignee: Nanjing Keno Rice Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Keno Rice Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2018-11-02

Abstract

本发明公开了一种鼠抗人IDH1 R132H突变蛋白的单克隆抗体，特异性高、表现稳定且效价高，可用于检测恶性肿瘤中IDH1 R132H突变蛋白，具有一定的医学基础研究价值。本发明还涉及上述单克隆抗体在制备用于检测IDH1 R132H突变蛋白的免疫组化检测工具中的应用。本发明建立基于IDH1 R132H单克隆抗体的免疫组织化学技术，用于恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的辅助诊断、治疗方案选择和预后。鉴于免疫组化方法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展，免疫组化方法可作为临床工作中IDH1 R132H基因突变的首选检测方法。

Description

鼠抗人IDH1 R132H突变蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途

技术领域

本发明涉及免疫学领域，特别涉及一种鼠抗人IDH1 R132H突变蛋白的单克隆抗体，以及该抗体的免疫组化用途。

背景技术

异柠檬酸脱氢酶1（Isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）全长1245bp，编码414个氨基酸，属于NADP依赖型β脱羧脱氢酶家族成员，是三羧酸循环中的关键限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸（α-KG）和二氧化碳（CO₂），为细胞新陈代谢提供能量和生物合成前体物质。IDH1突变是继发性胶质瘤诊断和预后的标志物，其中R132H最常见，占90%以上。IDH1-R132基因突变主要发生在世界卫生组织（WHO）Ⅱ-Ⅳ级的弥漫性星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、间变型少突胶质细胞瘤、间变型少突-星形细胞瘤和胶质母细胞瘤。R132是IDH1活性中心的必需氨基酸之一，由IDH1突变基因编码翻译而成的IDH1蛋白酶不仅数量减少，而且还破坏了该酶的亲和力，并与野生型IDH1竞争底物，形成二聚体，从而抑制野生型IDH1活性，使其催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-KG和NADPH的量显著减少，导致细胞内还原产物降低，削弱了细胞内修复氧化应激所致DNA损伤的能力，同时还可导致细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）含量增加，从而激活HIF信号通路，最终促进肿瘤生长。神经胶质瘤呈浸润性生长，与正常脑组织界限不清，仅靠手术难以治愈，并且由于血脑屏障等因素的影响，化疗药物和一般抗肿瘤的中药治疗效果也不尽理想，脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。研究报道IDH1 R132H突变型胶质瘤患者对化疗更敏感，生存期更长。因此，如何发现有效的胶质瘤诊治分子靶点就显得尤为重要，相关分子靶点的发现将对胶质瘤的预后预测以及对化疗药物的反应性等具有重要的科学意义和临床应用价值。

临床研究发现mIDH1 R132H分子标志物具有较高的特异性和敏感性，可用于反应性胶质增生与低级别胶质瘤的鉴别诊断。在急性髓系白血病中，IDH1 R132H也是一种经常发生的突变类型。目前，国内外研发的IDH1 R132H抗体稀少，特异性和亲和力方面均有待提高，因此亟待研发新的性能优异的抗IDH1 R132H单克隆抗体，填补国内本行业的空白，降低治疗费用，减轻病人负担。本发明研制出一种特异性高、表现稳定且效价高的抗IDH1 R132H突变蛋白的特异性单克隆抗体，可用于恶性肿瘤中IDH1 R132H突变蛋白的表达水平研究，疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究，具有一定的医学基础研究价值。本发明采用免疫组化（IHC）方法，建立基于所述IDH1 R132H单克隆抗体的免疫组织化学技术，用于恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的辅助诊断、治疗方案选择和预后。鉴于免疫组化方法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展，免疫组化方法可作为临床工作中IDH1 R132H基因突变的首选检测方法。

发明内容

基于以上所述的现有技术现状，本发明的目的为提供一种特异性好、表现稳定且效价高的抗IDH1 R132H突变蛋白的单克隆抗体，并建立基于所述IDH1 R132H单克隆抗体的免疫组织化学技术。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明所述IDH1 R132H单克隆抗体的制备方法如下：

（1）免疫源的制备：根据IDH1基因（BC012846）序列信息，订购合成携带R132H基因突变，且N末端带BSA序列（提高多肽的免疫原性）的人类IDH-R132H多肽（加拿大应用生物材料有限公司，Applied Biological Materials Inc.），用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。

（2）单抗的筛选与制备：采用上述合成的IDH1 R132H多肽免疫BALB/c 小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0 细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，使用IDH1 R132H多肽预铺的96孔板采用ELISA 法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗IDH1 R132H特异性抗体的杂交瘤细胞株；制备小鼠腹水，通过protein A 柱层析纯化IDH1 R132H单抗。通过免疫组化实验（结果见图1和图2）验证该单抗的灵敏度和特异性。

同时，本发明提供一种上述单克隆抗体在制备用于检测IDH1 R132H蛋白的免疫组化工具中的应用。

所述免疫检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。

本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于检测恶性肿瘤的免疫组化用途。由于IDH1 R132H是继发性胶质瘤诊断和预后的标志物，且在急性髓系白血病中，IDH1 R132H也是一种经常发生的突变类型。因此检测IDH1 R132H在肿瘤细胞表面的表达，对于分析机体恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的诊断、治疗方案以及对化疗药物的反应性具有重要的指导作用。

以使用Leica的免疫组化自动染色机BondMax为例，应用该IDH1 R132H单克隆抗体进行免疫组化染色的条件为：

（1）使用机器自带的IHC protocol F，将过氧化物酶封闭步骤由使用一抗前移至DAB显色前；

（2）抗体使用终浓度为1.0μg/ml，室温孵育30min；

（3）抗原修复使用pH 9.0 的抗原修复液（ER2），100℃ 加热孵育30min。

使用其他IHC自动染色机或进行手工染色时，请参照上述条件进行。

本发明所述的特异性单抗，可与IDH1 R132H突变蛋白特异结合，同时建立了基于该单克隆抗体的免疫组织化学技术，可用于恶性肿瘤，主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病的辅助诊断、治疗方案选择和预后。鉴于免疫组化方法操作简单，收费较低，绝大部分病理实验室均可以开展，免疫组化方法可作为临床工作中IDH1 R132H基因突变的首选检测方法。

附图说明

图1为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测染色图。其中A为IDH1 R132H突变基因高表达（阳性）的星形胶质细胞系染色图，B为无IDH1 R132H突变基因高表达（阴性）的星形胶质细胞系染色图。

图2为以本发明单克隆抗体为一抗，免疫组化法检测星形胶质细胞瘤中IDH1R132H突变蛋白的表达染色图。

具体实施方式

本发明公开一种特异性好、表现稳定且效价高的抗IDH1 R132H突变蛋白的单克隆抗体，以及检测肿瘤细胞IDH1 R132H突变蛋白的免疫组化用途。本领域技术人员可参考本文内容进行适当改进以实现和应用本发明的技术，但是类似的替换和改动应视为包括在本发明。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1 抗IDH1 R132H单克隆抗体的制备

一、免疫源的制备：根据IDH1基因（BC012846）序列信息，订购合成携带R132H基因突变，且N末端带BSA序列（提高多肽的免疫原性）的人类IDH-R132H多肽，用于免疫实验动物和ELISA筛选阳性克隆。

二、单抗的筛选与制备

1、动物免疫：上述合成的IDH1 R132H多肽以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。

2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的SP2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％ PEG（pH 8.0）1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50ml，分装到3.5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37℃、5％ CO₂恒温培养箱中进行培养。

3、筛选和克隆：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述IDH1 R132H多肽进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。

4、腹水单抗的制备与纯化：10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×10⁶/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，protein A柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。

以本发明单克隆抗体为一抗，对IDH1 R132H突变基因高表达的星形胶质细胞系及对应的无高表达细胞系进行免疫细胞染色，其结果如图1所示，由图可见：该抗体特异性染色IDH1 R132H高表达细胞（阳性），而对无高表达的细胞不染色（阴性）。

实施例2 以本发明单克隆抗体为一抗的免疫组化实验

1、分别取24种不同类型的癌组织取样制作组织芯片，使用Leica RM2235型组织切片机进行切片，切片厚度为4μm；

2、使用Leica BondMax免疫组化自动染色机对本发明抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用脱蜡溶液（Leica）洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2（ER2，Leica），100℃孵育30min。一抗使用本发明抗体，采用抗体稀释液（Leica）稀释到终浓度为1.0μg/ml，150μl。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗（Leica）150μl，室温孵育8min。使用多聚物检测液（Leica）150μl，室温孵育8min。使用内源性过氧化物酶封闭液150μl室温孵育5min。使用DAB显色液（Leica）150μl，室温孵育10min。苏木素复染，室温孵育5min；

3、脱水和透明：去离子水清洗1min，95％乙醇1min，100％乙醇2min x 2次，二甲苯2minx 3次，中性树胶封片；

4、镜检，结果：部分肿瘤显示阳性染色，包括脑神经星形胶质瘤等，部分肿瘤显示阴性无IDH1 R132H染色。其中星形胶质瘤组织染色如图2所示，可见明显细胞浆染色。染色模式正确，信号较强，未见明显非特异染色。

实施例3 本发明单克隆抗体的特异性检测

应用本发明抗体采用ELISA检测无关抗原预铺的96孔板（Her-2），结果为阴性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应理解，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些等价形式也应视为本发明的保护范围。

<110>南京基诺米医疗科技有限公司

<120>鼠抗人IDH1 R132H突变蛋白单克隆抗体制备及其免疫组化用途

<210> 1

<211>1245

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ORIGIN

1 ATGTCCAAAA AAATCAGTGG CGGTTCTGTG GTAGAGATGC AAGGAGATGA AATGACACGA

61 ATCATTTGGG AATTGATTAA AGAGAAACTC ATTTTTCCCT ACGTGGAATT GGATCTACAT

121 AGCTATGATT TAGGCATAGA GAATCGTGAT GCCACCAACG ACCAAGTCAC CAAGGATGCT

181 GCAGAAGCTA TAAAGAAGCA TAATGTTGGC GTCAAATGTG CCACTATCAC TCCTGATGAG

241 AAGAGGGTTG AGGAGTTCAA GTTGAAACAA ATGTGGAAAT CACCAAATGG CACCATACGA

301 AATATTCTGG GTGGCACGGT CTTCAGAGAA GCCATTATCT GCAAAAATAT CCCCCGGCTT

361 GTGAGTGGAT GGGTAAAACC TATCATCATA GGTCGTCATG CTTATGGGGA TCAATACAGA

421 GCAACTGATT TTGTTGTTCC TGGGCCTGGA AAAGTAGAGA TAACCTACAC ACCAAGTGAC

481 GGAACCCAAA AGGTGACATA CCTGGTACAT AACTTTGAAG AAGGTGGTGG TGTTGCCATG

541 GGGATGTATA ATCAAGATAA GTCAATTGAA GATTTTGCAC ACAGTTCCTT CCAAATGGCT

601 CTGTCTAAGG GTTGGCCTTT GTATCTGAGC ACCAAAAACA CTATTCTGAA GAAATATGAT

661 GGGCGTTTTA AAGACATCTT TCAGGAGATA TATGACAAGC AGTACAAGTC CCAGTTTGAA

721 GCTCAAAAGA TCTGGTATGA GCATAGGCTC ATCGACGACA TGGTGGCCCA AGCTATGAAA

781 TCAGAGGGAG GCTTCATCTG GGCCTGTAAA AACTATGATG GTGACGTGCA GTCGGACTCT

841 GTGGCCCAAG GGTATGGCTC TCTCGGCATG ATGACCAGCG TGCTGGTTTG TCCAGATGGC

901 AAGACAGTAG AAGCAGAGGC TGCCCACGGG ACTGTAACCC GTCACTACCG CATGTACCAG

961 AAAGGACAGG AGACGTCCAC CAATCCCATT GCTTCCATTT TTGCCTGGAC CAGAGGGTTA

1021 GCCCACAGAG CAAAGCTTGA TAACAATAAA GAGCTTGCCT TCTTTGCAAA TGCTTTGGAA

1081 GAAGTCTCTA TTGAGACAAT TGAGGCTGGC TTCATGACCA AGGACTTGGC TGCTTGCATT

1141 AAAGGTTTAC CCAATGTGCA ACGTTCTGAC TACTTGAATA CATTTGAGTT CATGGATAAA

1201 CTTGGAGAAA ACTTGAAGAT CAAACTAGCT CAGGCCAAAC TTTAA

//

<210> 2

<211>414

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

ORIGIN

1 MSKKISGGSV VEMQGDEMTR IIWELIKEKL IFPYVELDLH SYDLGIENRD ATNDQVTKDA

61 AEAIKKHNVG VKCATITPDE KRVEEFKLKQ MWKSPNGTIR NILGGTVFRE AIICKNIPRL

121 VSGWVKPIII GHHAYGDQYR ATDFVVPGPG KVEITYTPSD GTQKVTYLVH NFEEGGGVAM

181 GMYNQDKSIE DFAHSSFQMA LSKGWPLYLS TKNTILKKYD GRFKDIFQEI YDKQYKSQFE

241 AQKIWYEHRL IDDMVAQAMK SEGGFIWACK NYDGDVQSDS VAQGYGSLGM MTSVLVCPDG

301 KTVEAEAAHG TVTRHYRMYQ KGQETSTNPI ASIFAWTRGL AHRAKLDNNK ELAFFANALE

361 EVSIETIEAG FMTKDLAACI KGLPNVQRSD YLNTFEFMDK LGENLKIKLA QAKL

//

Claims

1. 一种鼠抗人单克隆抗体，其特征在于能够特异性结合人IDH1 R132H突变蛋白。

2. 权利要求1所述的单克隆抗体在制备用于特异性检测IDH1 R132H突变蛋白的免疫组化检测工具中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫组化检测工具为试剂、试剂盒、芯片或试纸条。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该免疫组化检测工具可以用于医学基础研究及对恶性肿瘤的诊断治疗方案的选择和预后具有重要的临床预测价值。

5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医学基础研究可用于对IDH1R132H突变在不同肿瘤细胞表达水平，与疾病发生、进展、预后相关的病理生理研究及机理研究。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的恶性肿瘤主要包括神经胶质瘤和急性髓系白血病。