CN102732608B - 一种诊断肝癌的标记物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测肝癌的标志物及其应用。具体地，本发明提供了细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)在制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。研究表明，CYP17A1在肝癌组织中的表达量高于其癌旁正常组织，且CYP17A1在肝癌患者血清中的含量显著高于正常人群。因此，CYP17A1可作为肝癌的诊断(尤其是血清学诊断)的标志物。本发明还提供了相应的检测方法和试剂盒。本发明方法和试剂盒具有很好的血清检测效果。

Description

一种诊断肝癌的标记物及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及一种诊断肝癌的标记物及其用途。

背景技术

细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(cytochrome P450，family17，subfamily A，polypeptide1，简称为“CYP17A1”)。该蛋白亦称为17alpha羟化酶/17，20碳链裂解酶，属于细胞色素P450酶系(细胞色素P450c17α酶)，由508个氨基酸组成。

CYP17A1蛋白主要定位在内质网上，具有类固醇17alpha单加氧酶，17alpha羟化酶及17，20裂解酶活性。它是类固醇类激素合成通路中的一个关键酶。参与包括黄体酮、盐皮质激素、糖(肾上腺)皮质激素、雄激素、雌激素等物质的生成。CYP17A1基因的突变伴随着非依赖型类固醇17alpha羟化酶缺陷、17alpha羟化酶及17、20裂解酶双缺陷、假两性畸形、肾上腺增生等。该基因敲除的小鼠模型具有胚胎致死性(Bair SR；Mellon SH，Deletion of the mouseP450c17 gene causes early embryonic lethality.，Mol Cell Biol 2004)。其在性激素合成通路中的作用主要是将孕烯醇酮和黄体酮转化成17-OH羟基化的形式，进而分别生成脱氢表雄酮(DHEA)和雄烯二酮，最后分别生成雌、雄激素(Chung et al.，1987；Kagimoto et al.，1988；Van Den Akker et al.，2002)。

目前关于CYP17A1的研究主要集中在肾上腺及生殖腺中的酶催化活性及其在胆固醇和类固醇合成代谢中的功能。未见CYP17A1与肝癌相关的报道。

肝癌是我国常见的一种恶性肿瘤，位居肿瘤发生率的第三位，死亡率的第二位。原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见肝癌类型。

中国的肝癌患者占全世界发病率的54％，男性较女性更易发病。目前肝癌患者的5年生存率不到5％。全世界每年大约有549000名患者死于此，且其发病率有逐年上升的趋势(来自WHO死亡率数据库)。因此，加大对肝癌的防治力度对降低死亡率具有重要意义。

目前肝癌的诊断主要依靠影像学检查、肝穿刺组织学检查以及实验室检查。影像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的局限性。肝硬化基础上肝内再生结节和发育不良的结节等良性病变较为常见，与肝癌的影像学特征有一定的重叠，放射学检查对肝内小的良恶性病变鉴别仍很困难。与肝脏病理对比，CT诊断肝癌的敏感度较低。有创的组织病理学检查是诊断肝癌的主要方法，即使是很好的细针穿刺仍因取材有限而有较高的假阴性率，并且有使肿瘤扩散和针道种植的危险。因此，临床仍需要高度敏感的血清肝癌特异标志物来鉴别肝脏良恶性病变，或在高危人群进行随访提高肝癌的早期诊断率。

肝癌的早期诊断是提高患者生存率的一项最重要因素。目前在临床使用的肝癌血清诊断标记物主要是甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)，但其敏感性只有40％～65％，特异性76％～96％。虽然甲胎蛋白在肝癌的诊断中起了积极的作用，但其敏感性和特异性还不令人满意，而且在新发病例中AFP阴性比例在不断增加。

因此，寻找新的具有诊断或联合诊断价值的肝癌血清标志物是当务之急，也是HCC早发现早治疗的关键。因此，提供在肝癌组织和血清中特异高表达的基因或蛋白质具有重要的诊断和治疗意义，本领域迫切需要开发可用于检测或判断肝癌的血清特异标志物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于检测或判断肝癌的血清特异标志物及其用途。

在本发明第一方面，提供了一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的基因、mRNA、cDNA、或蛋白的用途，它被用作检测肝癌的标志物；或用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。更佳地，所述的检测是血清检测。

在另一优选例中，所述的试剂包括抗体、引物、探针、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在本发明第二方面，提供了细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)或其特异性抗体的用途，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。更佳地，所述的检测是血清检测。

在本发明第三方面，提供了一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含：

(a)抗细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的抗体；和/或

(b)特异性扩增CYP17A1 mRNA或CYP17A1 cDNA的引物或引物对。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌。

在另一优选例中，所述的抗CYP17A1蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明第四方面，提供了一种检测肝癌的方法，该方法包括：

a)准备受试者测试样品；

b)检测测试样品中细胞色素p450家族17亚家族A多肽1基因(CYP17A1)的表达量，并将表达量检测结果与参比值进行比较，其中CYP17A1的表达量高于参比值表明受试者患有肝癌，或患肝癌的几率高于正常人群。

在另一优选例中，所述测试样品为组织样品、血液样品、血清样品或体液样品。

在另一优选例中，所述参比值为非肝癌样品中CYP17A1的表达量。

在另一优选例中，所述检测步骤b包括检测CYP17A1mRNA的量，或CYP17A1cDNA的量；和/或检测CYP17A1蛋白的量。

在另一优选例中，所述检测步骤b包括通过RT-PCR或PCR方法进行检测。

在另一优选例中，所述的检测步骤b包括使用抗CYP17A1蛋白的抗体进行检测。

在另一优选例中，检测步骤b通过酶联免疫反应法(ELISA法)或时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)实现。

在另一优选例中，所述抗CYP17A1蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体(如抗血清)。

在另一优选例中，其特征在于，所述方法还包括评估测试样品中其他肝癌标记物的表达。

在另一优选例中，所述的其他肝癌标记物包括：甲胎蛋白AFP、甲胎蛋白异质体AFP-L3、血清岩藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、异常凝血酶原DCP、谷氨酰胺转移酶酶II(GGT II)或组合。

在另一优选例中，所述方法还包括评估测试样品中甲胎蛋白(AFP)的表达。

在本发明的第五方面，提供了一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)或其特异性抗体的用途，它们被用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的CYP17A1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述诊断试剂是单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂是蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与CYP17A1多核苷酸(mRNA或DNA)特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗CYP17A1的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的血清检测是ELISA法、或双抗夹心时间分辨免疫荧光法(TRFIA法)。

在本发明的第六方面，提供了一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有CYP17A1蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于血清检测或血清诊断肝癌。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的血清CYP17A1浓度≥70ng/ml(较佳地≥80ng/ml，更佳地≥90ng/ml，最佳地≥100ng/ml)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。

在另一优选例中，所述的CYP17A1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述肝癌包括肝细胞肝癌，尤其是原发性肝细胞肝癌。

在另一优选例中，所述的CYP17A1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明的第七方面，提供了一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有特异性扩增CYP17A1 mRNA或cDNA的特异性引物；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于通过定量检测CYP17A1的表达量来判断患肝癌的几率。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的CYP17A1 mRNA的量与一般人群中CYP17A1 mRNA的量之比≥1.5(较佳地≥2.0，更佳地≥2.5)，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。

在本发明的第八方面，提供了一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的用途，它被用作血清检测肝癌的标志物。

在本发明的第九方面，提供了一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1(CYP17A1蛋白)的拮抗剂的用途，它被用于制备抑制肝癌细胞生长的药物。

在另一优选例中，所述的拮抗剂包括针对CYP17A1的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。

在本发明的第十方面，提供了一种体外检测肝组织中CYP17A1mRNA的表达是否异常的方法，包括以下步骤：

A、用特异性CYP17A1的引物，作定量PCR检测，测定待测肝组织中CYP17A1mRNA的数值；

B、将步骤A测得的CYP17A1的数值与正常肝组织中的CYP17A1的数值进行比较，如测得的数值高于正常值，则表示被检测肝组织中CYP17A1的表达异常。

在本发明第十一方面，提供了一种体外检测肝组织中CYP17A1蛋白的表达是否异常的方法，包括以下步骤：

A、用特异性抗CYP17A1的抗体检测待测肝组织中CYP17A1蛋白的数量；

B、将步骤A测得的CYP17A1的数量与正常肝组织中的CYP17A1的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示被检测肝组织中CYP17A1的表达异常。

在本发明的第十二方面，提供了一种体外检测血清中CYP17A1蛋白的含量是否异常的方法，包括以下步骤：

A、用特异性抗CYP17A1的抗体检测待测血请中CYP17A1蛋白的量；

B、将步骤A测得的CYP17A1蛋白的量与正常人血清中的CYP17A1的量进行比较，如测得的蛋白量高于正常值，则表示被检测血清中CYP17A1的含量异常。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.CYP17A1mRNA在33对肝癌及癌旁组织样本中的差异表达结果，图中T代表肝癌组织，N代表癌旁组织。

图2.免疫印迹(Western  blot)法检测CYP17A1蛋白在肝癌及癌旁组织样本中的表达。图中T代表肝癌组织，N代表癌旁组织。β-actin表示β-肌动蛋白，被用作内参。

图3.免疫组化分析CYP17A1蛋白在肝癌患者的肝癌及相应的癌旁组织样本中的表达，图中所示为其中的1对组化样品代表性图片，放大倍数，200倍；标尺，100μm。

图4.组织芯片检测CYP17A1蛋白在肝癌患者的肝癌及对应的癌旁组织样本中的差异表达。A，CYP17A1蛋白在组织芯片中的免疫组化染色。左图为一对肝癌及癌旁代表性芯片点。右图是这对芯片点的局部放大图，放大倍数，200倍；图中标尺，100μm。B为CYP17A1蛋白在87对肝癌及癌旁样品中表达的差异比较。图中T代表肝癌组织，N代表癌旁组织。

图5.CYP17A1蛋白在正常人血清及肝癌病人血清中的含量以及作为肝癌血清学标志物的诊断价值分析。A.酶联免疫反应(ELISA)测定CYP17A1蛋白在正常人血清及肝癌病人血清中的含量，正常人(Heal thy)代表正常人血清，HCC代表肝癌病人血清。B.ROC曲线分析CYP17A1作为肝癌血清学诊断标志物的价值。曲线所包围的面积越大，判断其价值就越高。

图6显示了CYP17A1在不同分化程度的HCC中的表达。图中T表示肝癌组织样本，N表示相对应的癌旁正常组织。

图7A显示了测定CYP17A1血液含量的酶联免疫吸附实验(ELISA)原理。羊抗人的CYP17A1多抗为捕获抗体(Capture antibody)，兔抗人的CYP17A1多抗为检测抗体(Detection antibody)。

图7B显示了ELISA测定所用标准曲线。通过将CYP17A1蛋白标准品倍比稀释成不同浓度梯度(0pg/ml，156.25pg/ml，312.5pg/ml，625pg/ml，1250pg/ml，2500pg/ml，5000pg/ml，7500pg/ml，10000pg/ml)，测定其OD值，以制作标准曲线。

图8显示了ELISA方法测定的CYP17A1在212例不同人群的血清样本中的表达。

图9显示了CYP17A1蛋白在AFP阴性及AFP阳性肝癌患者血清样本中的含量及分析。样本包括AFP阴性(AFP-)样本45例，AFP阳性(AFP+)样本70例和健康样本30例。

图10显示了ROC曲线比较分析CYP17A1与AFP应用于肝癌诊断的灵敏度和特异度。

图11显示了CYP17A1与AFP在肝癌血清样本中的表达情况，表明CYP17A1在肝癌病人血清中的高表达比率大于AFP。图中，以CYP17A1浓度34.5ng/ml，AFP浓度20ng/ml为临界值。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，CYP17A1在肝癌组织高表达且在正常肝脏组织中低表达，因此可用作肝癌标志物。此外，肝癌细胞中还产生分泌性CYP17A1进入血液，因此血清中CYP17A1浓度与检测对象患肝癌的几率呈正相关。因此，血清CYP17A1可以作为检测肝癌的标志物。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过高通量的基因表达谱芯片筛选技术，发现CYP17A1基因在肝癌中高表。然后对33对临床肝癌及癌旁组织样本中CYP17A1mRNA的表达量进行检测，采用定量RT-PCR实验检测结果表明，CYP17A1mRNA在肝癌中表达较癌旁高2倍以上的有23对，其高表达的比例约为70％(23/33)[图1，实施例1]。

本发明人进一步用免疫印迹实验(Western blotting)检测了60对肝癌及癌旁组织样本中CYP17A1蛋白的表达水平，结果证明CYP17A1蛋白在44对样品中上调表达，其比例约为73％(44/60)[图2，实施例3]。

本发明人又采用免疫组化实验检测了5对肝癌和癌旁组织样本，结果表明在5对组化样品中，其在肝癌组织中的表达均明显高于相应的癌旁组织[图3，实施例4]。

本发明人还对含有87对肝癌和癌旁组织样本的组织芯片进行免疫组化实验检测，结果证明，CYP17A1蛋白在肝癌组织中的表达高于癌旁组织的有58对，比例约为66.7％(58/87)[图4，实施例5]。

上述结果表明，在肝癌的临床组织样本中，CYP17A1mRNA和CYP17A1蛋白在肝癌中高表达。

此外，本发明人还利用酶联免疫技术，检测了CYP17A1在人血清中的表达。结果显示CYP17A1在肝癌病人血清中的表达显著高于正常人[图5，实施例6]。

CYP17A1蛋白在正常人(n＝30例)血清中的平均含量为25.5ng/ml，在肝癌病人(n＝115例)血清中的平均含量为115ng/ml。统计分析表明，CYP17A1蛋白在肝癌病人血清中的高表达具有显著差异(P＜0.001)。

根据CYP17A1在正常人血清中含量的95％置信区间，以CYP17A1浓度34.5ng/ml为临界值(Cut-off Point)时，其检测灵敏度和特异度分别可以达到为86.1％和70％。ROC曲线分析，其结果如图5B所示，图中ROC曲线下的面积越大表明诊断价值越高，CYP17A1的ROC曲线面积为0.889，显著大于参考曲线面积0.5(P＜0.001)，表明CYP17A1作为肝癌的血清学分子标志物，具有很好的诊断价值。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，Cdna，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

参比值

如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较CYP17A1蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

非肝癌样品

如本文所用，术语“非肝癌样品”包括但不限于未患有肝癌的人群，肝癌患者的非肝癌组织。

CYP17A1蛋白和基因

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“CYP17A1蛋白”、“CYP17A1多肽”或“细胞色素p450家族17亚家族A多肽1”可互换使用，都指具有细胞色素p450家族17亚家族A多肽1氨基酸序列(NCBI蛋白序列号：NP_000093或SEQ IDNO.：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的CYP17A1蛋白。此外，该术语还包括全长的CYP17A1及其片段。本发明所指的CYP17A1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

在本发明中，术语“CYP17A1基因”、“CYP17A1多核苷酸”或“细胞色素p450家族17亚家族A多肽1基因”可互换使用，都指具有人CYP17A1核苷酸序列的核酸序列。CYP17A1基因全长7003bp(NCBI GenBank登录号为NC_000010.10)，其转录产物mRNA序列全长1895bp(NCBI GenBank登录号为NM_000102或如SEQ ID NO.：1所示)。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了CYP17A1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的CYP17A1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的CYP17A1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人CYP17A1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，CYP17A1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含CYP17A1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗CYP17A1的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人CYP17A1多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CYP17A1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CYP17A1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人CYP17A1蛋白的分子，也包括那些并不影响人CYP17A1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人CYP17A1基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人CYP17A1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人CYP17A1蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies  and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人CYP17A1蛋白功能的抗体以及不影响人CYP17A1蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人CYP17A1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人CYP17A1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人CYP17A1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是血清样本)中的人CYP17A1蛋白。

检测方法

利用CYP17A1存在于血清中，且与肝癌密切相关这一特点，本发明还提供了检测或判断肝癌的方法，尤其是血清学检测方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测血清CYP17A1的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。

检测试剂盒

基于CYP17A1与肝癌的相关性，即CYP17A1在肝癌组织中高表达并且在肝癌病人血清中含量高，因此CYP17A1可以作为肝癌的一种血清诊断标志物。

本发明还提供了一种检测肝癌的试剂盒，它含有本发明的抗CYP17A1的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段；或者含有特异性扩增CYP17A1的mRNA或cDNA的引物。

在另一优选例中，本发明还提供了CYP17A1的诊断试剂盒，包括：CYP17A1mRNA诊断试剂盒[实施例2]或CYP17A1酶联免疫(ELISA)检测试剂盒[实施例7]。

本发明的人肝癌血清学诊断试剂盒，已完成实验上百例，阳性率为约70％。

用本发明的人肝癌的血清学诊断试剂盒检测为阳性的对象，其肝癌的几率明显高于正常人群或一般肝癌患者。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的CYP17A1的拮抗剂，以及药学上可接受的载体。所述的药物组合物可用于抑制肝癌细胞的生长。

在本发明中，所述的拮抗剂包括针对CYP17A1的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。此外，所述的拮抗剂还包括可以降低CYP17A1表达或活性的小分子化合物。

通常，可将CYP17A1拮抗剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于抑制肝癌细胞的生长。此外，还可与其他肿瘤治疗剂联用。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的CYP17A1拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的CYP17A1拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

(1)肝癌作为病死率最高的恶性肿瘤之一，早发现早治疗是提高病人存活率的最有效手段。由于目前肝癌早期诊断的血清标记物稀少，发现癌变病人大多为晚期。CYP17A1是本发明人首次发现的一个肝癌血清标志物，可应用于肝癌的早期诊断。

(2)提供了一种新的通过血清标志物检测和判断肝癌的方法，有助于早期检测或辅助检测肝癌，从而有助于尽早确诊并采取相应治疗措施。

(3)血清检测方法更方便快速，更容易为病人接受。

(4)本发明还提供了CYP17A1应用于肝癌诊断的检测方法和试剂盒，为CYP17A1的具体实施提供了可靠保证。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1、荧光定量RT-PCR检测CYP17A1mRNA在人肝癌组织样本中的表达

检测材料及其制备：选取33例肝癌患者的肝癌及其癌旁组织的新鲜样本，保存在液氮中。采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)，按照说明书推荐的方法制备各组织样本的总RNA，逆转录制备cDNA模板。

设计合成CYP17A1荧光定量PCR引物，以及用作内参的GAPDH引物：

CYP17A1上游引物序列为：5’-TTCGTATGGGCACCAAGACT-3’[SEQ IDNO.：3]；

CYP17A1下游引物序列为：5’-GTTGTTGGACGCGATGTCTA-3’[SEQ IDNO.：4]；

GAPDH上游引物序列为：5’-GTTCGACAGTCAGCCGCATC-3’[SEQ ID NO.：5]；

GAPDH下游引物序列为：5’-GGAATTTGCCATGGGTGGA-3’[SEQ ID NO.：6]；

操作方法：在20μl反应体系中，依次加入1μl cDNA模板(来自于待测的组织样本)，10μl SYBR Master Mix(购自Applied Biosystems公司)，上游和下游引物(10μM)各1μl，最后补加去离子水至20μl。然后按如下条件进行PCR反应：测定CYP17A1的PCR反应条件为95℃10分钟预变性，之后进行40个循环，每循环包括95℃20秒，60℃20秒，72℃25秒。测定GAPDH的反应条件相同。所用的PCR仪器为Applied Biosystems公司的7500fast荧光定量PCR仪，并采用该公司提供的定量分析软件对结果进行分析。

结果：

如附图1所示，在检测的33对肝癌及癌旁组织样本中，CYP17A1mRNA在肝癌中表达较癌旁高2倍以上的有23对，其比例约为70％。因此，CYP17A1mRNA在肝癌中显著高表达(p＜0.001)。

实施例2、CYP17A1mRNA检测试剂盒的制备

如实施例1所述，CYP17A1mRNA的高表达与肝癌疾病密切相关，据此可制备CYP17A1mRNA检测试剂盒。

该试剂盒含有：

试剂1，浓度为100μM的CYP17A1上游引物。

试剂2，浓度为100μM的CYP17A1下游引物。

试剂3，2×PCR反应液，包括Taq DNA聚合酶，dNTP，镁离子，SYBR荧光染料。该试剂可从Applied Biosystems公司购置。

试剂4，无核酶水。

试剂5，内参GAPDH引物对，浓度各为100μM。

操作说明：(步骤)

(1)待测样品的制备，从待测样品中提取mRNA，并反转录为cDNA。可使用常规方法或试剂盒(如TRIzol RNA抽提试剂盒)。

(2)按如下体系配制PCR反应液：

cDNA模板，0.5-2μl

试剂1，1μl(终浓度0.5μM/μl)

试剂2，1μl(终浓度0.5μM/μl)

试剂3，10μl

试剂4，补足20μl

注：同时在同等条件下按相同体系配制内参对照GAPDH PCR反应液。

(3)PCR反应在荧光定量PCR仪上进行，PCR反应条件可根据需要调整，建议条件为95℃10分钟预变性，之后进行40个循环，每循环包括95℃20秒，60℃20秒，72℃25秒。

(4)分析实验结果，并与正常对照组织样品进行比较，CYP17A1mRNA表达量高于正常对照2倍或2倍以上的为异常。

实施例3、免疫印迹(Western blot)检测CYP17A1蛋白在人肝癌组织样本中的表达

检测材料及其制备：选取60例肝癌患者的肝癌及其癌旁组织的新鲜样本，置于液氮中并快速研磨成组织碎片。将组织碎片溶于适量RIPA裂解缓冲液中(50mM Tris·HCl pH 7.4，150mM NaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)，0.1％SDS；1ml RIPA/0.1g组织样品)，冰上放置30min，15000转/min、4℃条件下离心20min。取上清液，利用BCA蛋白质定量检测试剂盒(购自上海生工生物有限公司)进行总蛋白定量并分装成50μg每份，-80℃保存备用。

操作方法：各取50μg蛋白质样品进行12％SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝跑至胶的最底层时，用Bio-Rad公司的转膜仪将蛋白转至硝酸纤维素膜(购自Amersham Biosciences公司)上，5％脱脂牛奶室温封闭1小时后，一抗使用兔抗人CYP17A1多克隆抗体(购自Proteintech公司，1∶1000稀释)4℃孵育过夜。孵育结束后，用TBST(50mM Tris，150mM NaCl，0.05％Tween 20，用HCI调节pH到7.6)洗膜三次，每次10min。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(购自Santa Cruz公司，1∶2000稀释)，室温孵育1小时。TBST洗膜三次，每次10分钟，最后用ECL化学发光试剂(购自Pierce公司)显色，X-光片曝光检测蛋白条带。同时采用β-actin作为等量上样对照(β-actin单抗购自sigma公司，1∶2000稀释)。

结果：

在检测的60对肝癌及癌旁组织蛋白样本，CYP17A1在44对样品中上调表达，其比例约为73％。因此，CYP17A1蛋白在肝癌组织中存在显著高表达(P＜0.001)，该结果与其mRNA在肝癌组织中的上调表达比例(70％)基本一致。图2显示CYP17A1在8对肝癌组织样本高表达。

实施例4、免疫组化分析CYP17A1蛋白在人肝癌组织中的表达

检测材料及其制备：选取5例肝癌患者的肝癌及相应的癌旁组织样本，4％多聚甲醛4℃条件下固定1小时或过夜。PBS缓冲液浸洗三次，每次10min至1小时。结束后，将样品置于30％、50％乙醇中各30min，最后4℃保存于70％乙醇中，完成固定。制备组织切片时，将固定好的样品先经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，然后在52-54℃条件下进行石蜡包埋，切片机切片，切片厚4-10μm，贴于多聚赖氨酸处理过的干净载玻片上，34℃烤片过夜，之后收集于载片盒中，4℃密封保存。

操作方法：取制备好的组织切片，首先进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，然后加入0.3％过氧化氢37℃孵育20分钟，去内源性过氧化物酶；切片浸于PH6.0柠檬酸缓冲液中，微波进行抗原修复15分钟，自然冷却；PBS浸洗，5分钟×3次；加入兔抗人CYP17A1多抗(购自Proteintech公司，1∶200稀释)，37℃反应1小时后4℃孵育过夜；PBS浸洗，5分钟×3次；加入HRP标记的羊抗兔即用型二抗(购自Dako公司)，37℃反应1小时；PBS浸洗，5分钟×3次；DAB底物溶液(购自Dako公司)显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

结果：

如附图3所示，CYP17A1蛋白主要定位于细胞质中，并呈弥散性分布。在检测的5对组化样品中，其在肝癌组织中的表达均明显高于相应的癌旁组织。图3所示为其中的1对组化样品代表性图片，图中棕黄色越深，表明CYP17A1蛋白表达越强。

实施例5、采用组织芯片检测CYP17A1蛋白在人肝癌组织样本中的表达

检测材料：为了进一步证实CYP17A1蛋白在临床人肝癌组织中的高表达并扩大检测规模，本实施例采用了200点肝癌组织芯片(购自上海生物芯片公司)进行免疫组化分析。该芯片包含了87例肝癌患者的肝癌及相应的癌旁组织，13例非肝癌患者的癌及相应的癌旁组织(包括3对胆管细胞癌及对应的癌旁组织，6对腺癌及对应的癌旁组织，3对血管瘤及对应的癌旁组织，1对鳞状细胞癌及对应的癌旁组织)。

操作方法：免疫组化采用标准化的程序进行，由芯片公司完成。一抗采用兔抗人CYP17A1多克隆抗体(购自Proteintech公司)，(HRP)标记的羊抗兔抗体为二抗(购自Santa Cruz公司。CYP17A1蛋白在组织芯片中的表达结果由两位病理学家分别独立进行分析。组织芯片分析主要根据二个指标，染色细胞百分比(0-100％)，以及染色强度(采用0-3级系统：0，无染色；1，弱染色；2，中度染色；3，强阳性染色)。综合评估两个指标，得出免疫染色评分结果(免疫染色评分等于染色细胞百分与染色强度相乘)。

结果：

如图4A所示，左图是CYP17A1在一对肝癌及其癌旁组织芯片点中表达的代表性图片，右图是该芯片点的局部放大图(放大倍数为200倍)。图中显示CYP17A1蛋白在肝癌组织中高表达，主要定位于细胞质中，并呈弥散性分布。图4B所示CYP17A1蛋白在每对肝癌(T)及对应癌旁组织(N)中的表达差异，T/N＞1为肝癌中高表达；T/N＜1为肝癌中低表达，T/N＝1为表达无差异。

在芯片的87对肝癌组织样本中，CYP17A1蛋白在肝癌组织中的表达高于癌旁组织的有58对，其比例约为66.7％。统计分析表明，CYP17A1蛋白在肝癌中显著高表达(P＜0.001)。

实施例6、酶联免疫反应(ELISA)测定CYP17A1蛋白在肝癌病人血清及正常健康人血清中的含量

检测材料及其制备：收集30例正常健康人及115例肝癌患者血液样品，这些样品均来自东方肝胆外科医院。将血液样品室温静置2小时，使其自然凝固，2500转/min、4℃条件下离心20min。仔细收集上清，如收集过程中出现沉淀，应再次离心。所得上清液即为血清样品，分装后置于-80℃保存。

操作方法：按1∶400比例稀释羊抗人CYP17A1多抗(购于Santa Cruz公司，捕获抗体)于1×ELISA包被液(购于KPL公司)中，100μl/孔加到酶标板(购于上海吉泰公司)中，室温孵育1小时；弃去孔内液体，甩干；每孔加1×BSA封闭液(购于KPL公司)300μl，室温封闭10分钟；弃去孔内液体，甩干；将待测血清样品按1∶100比例稀释于1×BSA封闭液中，100μl/孔加到酶标板中，室温孵育1小时或4℃过夜；弃去孔内液体，甩干，1×ELISA洗涤液(购于KPL公司)洗板5次，大约400μl/每孔，每次浸泡1-2分钟；按1∶2000比例稀释兔抗人CYP17A1多抗(购于Proteintech公司，检测抗体)于1×BSA封闭液中，100μl/孔加到酶标板中，室温孵育1小时；弃去孔内液体，甩干，重复如上洗板步骤；按1∶3000比例稀释辣根酶标记的羊抗兔二抗(购于Proteintech公司)于1×BSA封闭液中，100μl/孔加到酶标板中，室温孵育1小时；弃去孔内液体，甩干，重复如上洗板步骤；每孔加ABTS底物溶液(购于KPL公司)100μl，避光显色10分钟；每孔加终止溶液(购于KPL公司)100μl，终止反应；立即用酶标仪在405nm波长测量各孔的光密度(O.D.值)。同时，将CYP17A1重组蛋白标准品(购于Proteintech公司)按如下浓度梯度稀释：0pg/ml，156.25pg/ml，312.5pg/ml，625pg/ml，1250pg/ml，2500pg/ml，5000pg/ml，10000pg/ml，与待测血清样品一起在同等条件下测定O.D.值，以制作标准曲线。

结果：

如图5A所示，CYP17A1蛋白在正常人(n＝30)血清中的平均含量为25.5ng/ml；在肝癌病人(n＝115)血清中的平均含量为115ng/ml。统计分析表明，CYP17A1蛋白在肝癌病人血清中的含量显著高于其在正常人血清中的含量(P＜0.001)。

对CYP17A1在正常人血清及肝癌病人血清中的表达水平进行ROC曲线分析，其结果如图5B所示，图中ROC曲线下的面积越大表明诊断价值越高，CYP17A1的ROC曲线面积为0.889，显著大于参考曲线面积0.5(P＜0.001)，表明CYP17A1作为肝癌的血清学分子标志物，具有很好的诊断价值。根据CYP17A1在正常人血清中含量的95％置信区间，以CYP17A1浓度34.5ng/ml为临界值(Cut-off Point)时，其检测灵敏度和特异度分别可以达到为86.1％和70％。

实施例7、CYP17A1酶联免疫(ELISA)检测试剂盒的制备

如实施例6所述，CYP17A1蛋白可以分泌到肝癌病人的血清中，并且其在肝癌病人血清中的含量显著高于正常人血清中的含量。统计分析结果表明，以其浓度34.5ng/ml为判断临界值时，其检测误差最小，灵敏度和特异度最好。据此可制备其ELISA检测试剂盒。

该试剂盒含有：

96孔酶标板一块，

试剂A，羊抗人CYP17A1多克隆，临用前做1∶400倍稀释。

试剂B，兔抗人CYP17A1多抗，临用前做1∶2000倍稀释。

试剂C，辣根酶标记的羊抗兔二抗，临用前做1∶3000倍稀释。

试剂D，人CYP17A1重组蛋白标准品，浓度为1mg/ml(0.1ml体积)。

其他任选试剂，包括ELISA包被液，ELISA封闭液，ELISA洗涤液，ELISA显色液，ELISA终止液。

操作说明：(步骤)

(1)制备待测血清样品，全血标本于室温静置2小时后，2500转/min离心20分钟，取上清暂置于4℃待测，或-80℃保存。

(2)取酶标板一块，设置好标准品孔、待测样品孔及对照孔后，每孔加试剂A 100μl，室温孵育1小时。

(3)弃去孔内液体，甩干；每孔加ELISA封闭液300μl，室温封闭10分钟。

(4)将待测血清样品均按1∶100比例稀释于ELISA封闭液中，100μl/孔加到酶标板中，室温孵育1小时或4℃过夜；同时将试剂D按如下浓度梯度稀释：0pg/ml，156.25pg/ml，312.5pg/ml，625pg/ml，1250pg/ml，2500pg/ml，5000pg/ml，10000pg/ml，与待测血清样品一起按同样步骤测定O.D.值，以制作标准曲线。

(5)弃去孔内液体，甩干，ELISA洗涤液洗板5次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。

(6)每孔加试剂B 100μl，室温孵育1小时。

(7)弃去孔内液体，甩干，ELISA洗涤液洗板5次，方法同步骤5。

(8)每孔加试剂C 100μl，室温孵育1小时。

(9)弃去孔内液体，甩干，ELISA洗涤液洗板5次，方法同步骤5。

(10)每孔加ELISA显色液100μl，室温避光反应10分钟。

(11)每孔加ELISA终止液100μl，终止反应；立即用酶标仪在405nm波长测量各孔的光密度(0.D.值)

(12)绘制标准曲线，计算样品浓度。以34.5ng/ml为临界值进行分析，大于或等于该临界值判断为肝癌血清样品。小于该临界值判断为正常样品。

实施例8

检测肝癌的试剂盒

制备一用于血清学检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)第一容器，以及位于容器内的特异性针对CYP17A1的以下抗体：羊抗人CYP17A1多抗(可购自Santa Cruz公司，捕获抗体)；

(b)以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌；以及

(c)任选的第二容器，以及位于容器内的检测抗体：兔抗人CYP17A1多抗(可购自Proteintech公司，检测抗体)

用上述检测试剂盒，通过ELISA法定量检测了未知血清样本(145例，其中115例为HCC患者样本)中CYP17A1的含量。

结果表明，当阳性阈值取70ng/ml时，评定81例肝癌样本为CYP17A1阳性，阳性率约70％；

实施例9

CYP17A1蛋白的表达强度与肝癌分化程度有相关性

在本实施例中，进一步分析CYP17A1蛋白在肝癌中的表达与临床病理参数的相关性。

结果如Table 1所示，CYP17A1的表达与年龄、性别未发现有相关性，但是其表达与组织分级显著相关(P＝0.036)。其中G1为分化程度较好的肝细胞肝癌(HCC)，G2为中度分化HCC，G3为分化较差HCC。通过统计分析，我们发现CYP17A1强表达在分化较好的HCC(G1)中占55％，在G2或G3中分别为27％或20％。这表明CYP17A1的表达可能与肝癌的恶性程度有关。CYP17A1在不同分化程度的HCC中的表达见图6。

表1 CYP17A1表达与临床病理参数的相关性

*P值用卡方检验(Chi-square test)计算，P＜0.05视为显著。

实施例10

ELISA检测CYP17A1在肝癌病人血清中的高表达

1.酶联免疫吸附实验(ELISA)设计方案

采用羊抗人的CYP17A1多抗为捕获抗体(Capture antibody)，兔抗人的CYP17多抗为检测抗体(Detection antibody)。捕获抗体主要作用于CYP17A1蛋白的N-端，检测抗体主要作用于CYP17A1蛋白的C-端。将重组的人全长CYP17A1蛋白作为标准参照品，制作ELISA测定所用标准曲线。通过将CYP17A1蛋白标准品倍比稀释成不同浓度梯度(0pg/ml，156.25pg/ml，312.5pg/ml，625pg/ml，1250pg/ml，2500pg/ml，5000pg/ml，7500pg/ml，10000pg/m1)，测定其OD值，以制作标准曲线。由标准曲线可见，该ELISA系统具有较好的灵敏度和准确性。R²，相关系数的平方，其值越接近1，表明曲线的准确度越高。(图7A和7B)

2.测定CYP17A1蛋白在肝癌、乙肝、肝硬化及肺癌患者血清中的含量及分析。

利用上述的ELISA系统，共测定了CYP17A1在212例不同人群血清样本中的表达，其中包括115例肝癌患者(HCC)血清样本，30例正常人(Healthy)血清样本，40例乙肝病人(HBV)血清样本，17例肝硬化病人(Cirrhosis)血清样本，10例肺癌(Lung cancer)血清样本。

如图8所示，其中CYP17A1在各种不同人群血清中的含量均用中位数表示。其在正常人群中的含量为25.5ng/ml(变化范围0-65.2ng/ml)，HBV中的含量为57.7ng/ml(变化范围1.3-116ng/ml)，Cirrhosis中的含量为39.2ng/ml(变化范围8.9-83.7ng/ml)，Lung cancer中的含量为22.9ng/ml(变化范围0.05-37.5ng/ml)。而其在HCC病人中的含量为115.1ng/ml(变化范围0-407.5ng/ml)，统计分析表明，CYP17A1在肝癌血清样本中的含量显著高于其他非肝癌血清样本(***，P＜0.001)。

实施例11

CYP17A1蛋白在AFP阴性及AFP阳性肝癌患者血清样本中的含量及分析

以临床常用的20ng/ml为AFP的临界值，CYP17A1在AFP阴性肝癌血清样本中的含量为119.9ng/ml(变化范围0-279.3ng/ml)，AFP阳性肝癌血清样本中的含量为111.2ng/ml(变化范围0-407.5ng/ml)。

统计分析表明，CYP17A1在AFP阴性或阳性肝癌患者中都呈高表达，均显著高于其在正常人的含量(25.5ng/ml，变化范围0-65.2ng/ml，P＜0.001)(图9)。

值得注意的是，CYP17A1在AFP阴性肝癌血清样本中亦存在高表达，说明CYP17A1可以补充AFP阴性肝癌的检出率，在临床诊断上有其特殊的价值。

实施例12

CYP17A1与AFP肝癌诊断试剂的比较

进一步分析了CYP17A1蛋白用于肝癌诊断的灵敏度和特异度等指标，并与现有的肝癌诊断标志物AFP进行了比较。通过ROC曲线分析它们在区分肝癌患者和正常人群时的灵敏度和特异度。

结果如图10A所示，在区分肝癌病人和正常人时，以34.5ng/ml为临界值，CYP17A1的AUC(ROC曲线下的面积，值越大，判断价值越高)为0.89，对应的灵敏度和特异度分别可以达到86％和70％，正确率为83％；而在同样的样本中，AFP的AUC为0.73，对应的灵敏度和特异度分别为61％和67％，正确率为62％。CYP17A1显著优于AFP(P＜0.001)。两者联合可以进一步提高灵敏度和特异度至90％和70％，正确率为86％，AUC则可以增加到0.92。

另外，如图10B所示，在区分临床I-II级早期肝癌病人(early HCC)和正常人时，以34.5ng/ml为临界值，CYP17A1的AUC为0.82，对应的灵敏度和特异度分别可以达到75％和67％，正确率为80％；而在同样的样本中，AFP的AUC为0.60，对应的灵敏度和特异度分别为45％和65％，正确率为57％。CYP17A1显著优于AFP(P＜0.001)。两者联合可以进一步提高灵敏度和特异度至75％和97％，正确率为88％，AUC则可以增加到0.85。

实施例13

CYP17A1与AFP在肝癌血清样本中的表达分析

以CYP17A1浓度34.5ng/ml，AFP浓度20ng/ml为临界值：两种标志物在肝癌血清中的表达情况如图11所示。样本1-39号，CYP17A1高于临界值，AFP处于正常范围，其比例为33.9％；样本40-45号，CYP17A1和AFP均处于正常范围，其比例为5.2％；样本46-55号，CYP17A1处于正常范围，AFP高于临界值，其比例为8.7％；样本56-115，CYP17A1和AFP均高于临界值，其比例为52.2％。

该结果表明，CYP17A1在肝癌病人血清中的高表达比率大于AFP，CYP17A1的肝癌检出率显著优于现有的肝癌诊断标志物AFP(P＜0.001)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CYP17A1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还联合检测其他肝癌标记物的表达，

其中，所述的其他肝癌标记物包括：甲胎蛋白AFP、甲胎蛋白异质体AFP-L3、血清岩藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、异常凝血酶原DCP、谷氨酰胺转移酶酶II或组合。

4.一种用于检测肝癌的血清诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有CYP17A1蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于血清检测或血清诊断肝癌。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的CYP17A1蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌包括肝细胞肝癌。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的肝癌是原发性肝细胞肝癌。

8.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还用于联合检测其他肝癌标记物的表达，

其中，所述的其他肝癌标记物包括：甲胎蛋白AFP、甲胎蛋白异质体AFP-L3、血清岩藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、异常凝血酶原DCP、谷氨酰胺转移酶酶II或组合。

9.一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白的mRNA、cDNA、或蛋白的用途，其特征在于，它被用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒。

10.细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备检测肝癌的诊断试剂或试剂盒。

11.一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含：

(a)抗细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白的抗体；和/或

(b)特异性扩增CYP17A1mRNA或CYP17A1cDNA的引物或引物对。

12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断肝癌。

13.一种用于检测肝癌的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有特异性扩增CYP17A1mRNA或cDNA的特异性引物；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于通过定量检测CYP17A1的表达量来判断患肝癌的几率。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的CYP17A1mRNA的量与一般人群中CYP17A1mRNA的量之比≥1.5，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。

15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的CYP17A1mRNA的量与一般人群中CYP17A1mRNA的量之比≥2.0，则该对象发生肝癌的几率大于正常人群。

16.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还用于联合检测其他肝癌标记物的表达，

其中，所述的其他肝癌标记物包括：甲胎蛋白AFP、甲胎蛋白异质体AFP-L3、血清岩藻糖苷酶AFU、硫酸肝素蛋白多糖3GPC3、异常凝血酶原DCP、谷氨酰胺转移酶酶II或组合。

17.一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白的用途，其特征在于，它被用于制备血清检测肝癌的试剂或试剂盒，并且在试剂或试剂盒中将CYP17A1蛋白用作血清检测肝癌的标志物。

18.一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白或其特异性抗体的用途，其特征在于，它与选自下组的一种或多种标记物或其相对应的特异性抗体联合用于制备血清检测肝癌的诊断试剂或试剂盒，

a）甲胎蛋白AFP，

b）甲胎蛋白异质体AFP-L3，

c）血清岩藻糖苷酶AFU，

d）硫酸肝素蛋白多糖3GPC3，

e）异常凝血酶原DCP，和

f）谷氨酰胺转移酶酶II。

19.一种细胞色素p450家族17亚家族A多肽1即CYP17A1蛋白的mRNA、cDNA、或蛋白的用途，其特征在于，它与选自下组的一种或多种标记物的mRNA、cDNA、或蛋白联合用于制备检测肝癌的试剂或试剂盒，

a）甲胎蛋白AFP，

b）甲胎蛋白异质体AFP-L3，

c）血清岩藻糖苷酶AFU，

d）硫酸肝素蛋白多糖3GPC3，

e）异常凝血酶原DCP，和

f）谷氨酰胺转移酶酶II。