CN107422125A - 与肌层浸润性膀胱癌相关的尿液蛋白质标志物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及膀胱癌，尤其是肌层浸润膀胱癌的诊断和预后。具体地，本公开涉及使用CYR61蛋白对肌层浸润膀胱癌进行诊断和预后的方法和用途以及相关的试剂盒。本发明还涉及将CYR61蛋白与MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白组合来诊断肌层浸润膀胱癌，以及相关的方法、用途和试剂盒。

Description

与肌层浸润性膀胱癌相关的尿液蛋白质标志物
发明领域
本公开涉及膀胱癌，尤其是肌层浸润膀胱癌的诊断和预后。具体地，本公开涉及使用CYR61蛋白来诊断肌层浸润膀胱癌的方法、用途和相关的试剂盒。本发明还涉及将CYR61蛋白与MMP2蛋白、VEGFC蛋白和/或VEGF蛋白组合用来诊断肌层浸润膀胱癌，以及相关的方法、用途和试剂盒。
发明背景
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。膀胱癌占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。膀胱癌的90％以上为尿路上皮癌。首诊时约70％左右的膀胱癌为非肌层浸润性癌，组织病理学分期Ta、T1；25％为肌层浸润性癌，组织病理学分期T2～T4；5％的病例已经发生肿瘤远处转移，因此临床上对于初诊的膀胱癌主要将其分为非肌层浸润性癌和肌层浸润性膀胱癌两大类型。
非肌层浸润和肌层浸润性膀胱癌两者的治疗方式和预后存在明显差异。非肌层浸润膀胱癌的治疗以经尿道膀胱肿瘤电切术为主，而肌层浸润性膀胱癌则需要进行新辅助化疗联合根治性全膀胱切除或根治性全膀胱切除。目前一些肌层浸润性膀胱癌病例因术前无法评估肿瘤是否侵及肌层而进行了经尿道肿瘤电切术，影响后续治疗及肿瘤预后。因此，在手术前准确判断肿瘤是否发生肌层浸润，对膀胱癌的治疗方案选择以及预后判断至关重要。
临床术前判断膀胱癌是否发生肌层浸润主要依靠MRI等影像学检查及膀胱镜联合组织病理活检。然而，影像诊断结果很大程度上依赖于临床医生的个人经验，膀胱镜活检也极易受肿瘤大小和活检取材深度的影响。此外，CT或MRI对于T3b、T4期以及有淋巴结和远处转移的膀胱癌有较强分辨能力，但是对于T2～T3a期的肌层浸润性膀胱癌，诊断极为困难，同时影像学方法也受到患者憋尿的多少、炎症反应及周围组织的干扰；其中CT对膀胱癌分期的准确率为40～60％，MRI为73～86％[1-6]。此外，有报道总结，膀胱镜检查对肌层浸润性膀胱癌的误诊率高达50％[7]。所以影像学检查及膀胱镜联合组织病理活检对于鉴别膀胱癌是否侵犯肌层仍存在较高的误诊率。
近几年，人们利用蛋白质组技术找出了一些膀胱癌相关的肿瘤标志物，如BLCA、Reg-1、角蛋白10、MMP2、MMP9、纤连蛋白(Fibronectin)等，并且特异性核基质蛋白22(nuclear matrix protein 22，NMP-22)等分子标志物被批准上市用于膀胱癌的辅助诊断[8-14]。但是，这些标志物临床应用范围比较局限，主要用于膀胱癌的筛查诊断，并非用于鉴别肌层浸润性膀胱癌，并且敏感性和特异度不高，故在实际临床工作中应用得并不广泛[15]。
由于膀胱癌的发生发展是众多分子事件共同作用的结果，而肌层非浸润与肌层浸润性膀胱癌存在明显不同的分子改变[16]。随着医学生物学理论与技术的发展，利用肿瘤分子标志物对膀胱癌进行分子分期或分子分型，已经成为辅助膀胱癌术前诊断的研究热点。
因此，鉴定出对膀胱癌，尤其是肌层浸润性膀胱癌的诊断和预后有用的蛋白质标志物是非常重要的。
发明内容
本发明人发现，多种尿中蛋白质的含量高低，单独或组合地，能有效诊断肌层浸润性膀胱癌，或者将肌层浸润性膀胱癌与非肌层浸润性膀胱癌进行区分。这些蛋白质因此可作为诊断肌层浸润性膀胱癌的有效生物标志物。
因此，本发明的一个方面在于，提供了诊断受试者中肌层浸润性膀胱癌的方法。该方法包括至少两步骤：(i)测定怀疑患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中所述生物标志物的表达含量；及(ii)根据该生物标志物的表达含量，评估该受试者是否患有肌层浸润性膀胱癌，其中如果与未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中该生物标志物的表达含量或预确定的阈值相比，该生物标志物的表达含量增加则表示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌。在一个具体的实施方案中，所述生物标志物是CYR61蛋白。
在另一个方面，本发明提供了用于对患有膀胱癌的受试者确定膀胱癌的病理分期类型或进行预后的方法。该方法包括至少两步骤：(i)测定患有膀胱癌的受试者中所述生物标志物的表达含量；及(ii)根据该生物标志物的表达含量，评估该受试者是否患有肌层浸润性膀胱癌，其中如果与患有非肌层浸润性膀胱癌的受试者中该生物标志物的表达含量或预确定的阈值相比，该生物标志物的表达含量增加则表示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌。
当对受试者进行预后时，如果评估受试者患有肌层浸润性膀胱癌，则可以进行新辅助化疗联合根治性全膀胱切除或根治性全膀胱切除；如果评估受试者不患有肌层浸润性膀胱癌，即患有的是非肌层浸润膀胱癌，则治疗可以以经尿道膀胱肿瘤电切术为主。
本发明还提供了监测受试者中的膀胱癌的进展的方法。所述监测包括至少两步骤：(i)测定患有膀胱癌的受试者中所述生物标志物的表达含量；及(ii)将该生物标志物的表达含量与该受试者中之前的表达含量相比较，从而评估该受试者是否进展为肌层浸润性膀胱癌。如果在较晚取得的样品中生物标志物的表达含量高于较早取得的样品时，表示该受试者的膀胱癌已进展为肌层浸润性膀胱癌。
上述方法中使用的生物标志物可以是选自下组的四种蛋白质之一或其任意组合：CYR61蛋白、MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白。在一个实施方案中，所述生物标志物是上述四种蛋白质中的任意两种。在另一个实施方案中，所述生物标志物是CYR61蛋白和选自MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白的任一种。在又一个实施方案中，所述生物标志物是上述所有四种蛋白质。在本发明的方法中，评估的特异性和准确性随着标志物数量的增加而改善。
本发明还提供了CYR61在制备用于在受试者中诊断肌层浸润性膀胱癌的试剂盒中的用途。所述诊断包括以下步骤：(a)测定怀疑患有肌层浸润性膀胱癌的受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是否患有肌层浸润性膀胱癌。
本发明还提供了CYR61蛋白在制备用于在患有膀胱癌的受试者中确定膀胱癌的病理分期类型的试剂盒中的用途。所述对病理分期类型的确定包括以下步骤：(a)测定所述受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是患有肌层浸润性膀胱癌还是非肌层浸润性膀胱癌。
本发明还提供了CYR61蛋白在制备对患有膀胱癌的受试者进行预后的试剂盒中的用途。所述预后包括以下步骤：(a)测定所述受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是患有肌层浸润性膀胱癌还是非肌层浸润性膀胱癌。
在一个方面，所述评估包括将所测定的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中CYR61蛋白的表达含量或预确定的阈值进行比较，所测定的表达含量增加指示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌。
在进一步的实施方案中，所述评估还包括：(a)进一步测定来自所述受试者的尿液样品中选自下组的任一种或多种标志物的表达含量：MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白；(b)将所述受试者中的所述标志物的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中的相应标志物的表达含量或预确定的阈值相比较，其中如果所述MMP2蛋白、VEGFC蛋白或VEGF蛋白的表达含量增加则将所述受试者鉴定为患有肌层浸润性膀胱癌。
本发明中对蛋白标志物的表达含量的测定可通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)、表面等离子体共振、微阵列、或Western免疫印迹进行。在一个具体的实施方案中，所述测定通过ELISA进行。
本发明更进一步提供试剂盒用于前述方法的使用。本发明的试剂盒可包含1、2、3或4种具有不同特异性免疫反应性的抗体。所述抗体可与(i)CYR61蛋白、(ii)MMP2蛋白、(iii)VEGFC蛋白、或(iv)VEGF蛋白的任一种特异性结合。在一实施方案中，该试剂盒仅包含与CYR61蛋白特异性结合的抗体，以实施前述之任一种方法。在另一实施方案中，该试剂盒包含与上述所有4种蛋白分别特异性结合的抗体，以实施前述之任一种方法。在又一实施方案中，该试剂盒包含与CYR61蛋白和选自MMP2蛋白、VEGFC蛋白、或VEGF蛋白的任一种特异性结合的抗体。因此，该试剂盒可以包含上述抗体或基本上由上述抗体所组成。另外，所述试剂盒还可以包含用于检测所述抗体和所述蛋白标志物之间形成的复合物的试剂。
本发明之一或多个实施方案的详细说明如下所述。本发明之其它特征或优点将由后附的附图及数个实施方案的详细说明以及后附的权利要求书而清楚了解。
附图简述
从下文描述和所附权利要求书，结合所附图，本公开的前述特征和其它特征将变得更为明显。应理解这些附图仅描绘了依照本公开的数个实施方案且不意图视为限制其范围，将部分地，经由所附图的使用更特定并详细地描述本公开。
图1显示了与非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)患者相比，肌层浸润性膀胱癌(MIBC)患者的术前尿中的CYR61的含量更高。
图2显示了将患者术前尿中的CYR61含量用于鉴别诊断肌层浸润性膀胱癌的诊断效能分析。
图3显示了与非肌层浸润性膀胱癌患者相比，肌层浸润性膀胱癌患者术前尿中的MMP2、VEGFC、VEGF蛋白的含量更高。
图4显示了将患者术前尿中的CYR61、VEGF、VEGFC、MMP2含量用于鉴别诊断肌层浸润性膀胱癌的诊断效能分析。
图5显示了将患者术前尿中的CYR61、VEGF、VEGFC、MMP2含量的组合用于鉴别诊断肌层浸润性膀胱癌的诊断效能分析。
发明详述
除非上下文另外明确指出，一般按照本领域中通常的含义来使用本发明的术语，在有冲突的情况下，将以本申请的描述为准。
本发明人鉴定出尿液中的多种与肌层浸润性膀胱癌相关的生物标志物蛋白，其由下列4种蛋白质及其片段中的一种或多种所组成：(i)CYR61蛋白(Genbank登录号：NC_018912)、(ii)MMP2蛋白(Genbank登录号：NG_008989)、(iii)VEGFC蛋白(Genbank登录号：NG_034216)、或(iv)VEGF蛋白(Genbank登录号：NW_003119426)。
蛋白富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，简称CYR61蛋白)，其编码基因位于1p22.3，是一个由381个氨基酸组成的细胞外基质蛋白，为CCN家族成员之一。近年来的一些研究发现，不同类型的肿瘤中CYR61的表达水平不同，功能也不相同。例如，CYR61在乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、肝细胞肝癌等肿瘤中过表达，促进肿瘤生长、转移，同时促进肿瘤血管生成，有类似于癌基因的作用。然而，在另外一些肿瘤(如肺癌、子宫内膜癌)中，CYR61的表达量降低，其表达可以介导肿瘤细胞的凋亡并抑制其生长，起到类似抑癌基因发挥抗肿瘤的作用。目前，国内外尚无膀胱癌中CYR61的相关报道。
如本文中使用的，基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase，简称为MMP2蛋白)是一类结构中含Zn2+和Ca2+的蛋白水解酶类，主要降解基底膜Ⅳ型胶原和变性的间质胶原(明胶)。MMP2在膀胱尿路上皮癌中的表达强度随浸润深度而增加，并与膀胱尿路上皮癌的分级高低呈正相关，提示在膀胱尿路上皮癌的进展和分化过程中，肿瘤分化程度越低，肿瘤细胞分泌MMP2越多，其浸润和转移的能力也越强。
如本文中使用的，血管内皮生长因子C(vascular endothelial growthfactor，简称为VEGF-C蛋白)是一种特异性的血管、淋巴管内皮细胞调节因子，其通过内皮细胞表面的特异性受体VEGFR-2和VEGFR-3发挥作用，共同促进肿瘤血管、淋巴管的生成、增生或扩张，从而促进恶性肿瘤的侵袭和转移。VEGF-C参与膀胱癌淋巴管的生成，与肿瘤的分期、血管浸润以及淋巴结转移等密切相关。
如本文中使用的，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，简称为VEGF蛋白)由肿瘤细胞或宿主的非内皮细胞分泌的内皮细胞有丝分裂原，是有力的促血管生成因子。VEGF家族成员包括：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E和胎盘生长因子。VEGF的表达随膀胱癌的分级和分期增加而升高，且表达高者术后复发率高，提示VEGF的表达与膀胱肿瘤的恶性程度和复发密切相关，其阳性可作为膀胱癌早期复发及预后的指标。
在一个实施方案中，试剂盒包含与VEGF蛋白特异性结合的抗体，其针对的是VEGF蛋白家族的共同序列，而与VEGFC蛋白特异性结合的抗体针对的是VEGFC蛋白的独有序列。
如本文中使用的，“预确定的阈值”通过以术后病理为金标准，以接受者操作特征(receiver-operating characteristic；ROC)分析法产生ROC曲线来分析术前尿中的CYR61含量鉴别肌层浸润性膀胱癌，选择灵敏度(sensitivity)+特异度(specificity)为最大值时对应的术前尿中CYR61含量得到的阈值。超过该阈值即提示该患者可能患有肌层浸润性膀胱癌。
下列描述为获得所述预确定的阈值的一个例示过程：(1)测定患者的尿液中用作生物标志物的蛋白质分子的表达含量；(2)对该蛋白表达含量值进行适当分析，基于灵敏度和特异性来确定每种生物标志物或其组合的阈值。
任何由上述所产生的模式可经由接受者操作特征(ROC)分析法产生ROC曲线，评估其诊断价值。在ROC分析中理想的多变量模式(multivariable model)将可得到最大的曲线下面积(Area under Curve,AUC)。该模式具体可见实施例1-3。
根据本发明的一些方面，在进行ELISA检测时可使用与(i)CYR61蛋白、(ii)MMP2蛋白、(iii)VEGFC蛋白、或(iv)VEGF蛋白的任一种具有特异性免疫反应性或特异性结合的分离的抗体。如本文中使用的，“分离的抗体”大体上为不含有天然相关分子的抗体。更特定地说，在该抗体的制备中，天然相关分子最多占干重的20％，则该抗体被认为是“分离的抗体”。纯度可以任何适当方法测量，例如：柱层析法、聚丙烯酰胺胶电泳法及高效液相层析法(HPLC)。
本发明的试剂盒可包括结合于相同抗原的两种不同抗体。所述抗体可自然发生或以基因工程产生(例如：单链抗体、嵌合抗体、或人源化抗体)。本发明试剂盒所含的抗体可获自商业贩售(例如来自商品化试剂盒)，或者可由本领域已知的常规方法制造(例如：参考Harlow and Lane,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York.)。为了制造上列生物标记的抗体，该生物标记(marker)可视需要连接于携带蛋白(例如：KLH)，并与佐剂混合，注射于宿主动物。动物体内产生的抗体之后可经亲和性层析法纯化。通常使用的宿主动物包括兔、小鼠、豚鼠、及大鼠。可用以增加免疫反应的多种佐剂根据宿主种类而选择，可包括弗氏佐剂(Freund’sadjuvant)(完全及不完全)；矿物胶，例如氢氧化铝、CpG；表面活性物质，例如溶血卵磷脂(lysolecithin)、多聚醇(Pluronic polyols)、聚阴离子(polyanions)、肽、油乳化剂、匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)及二硝基酚(dinitrophenol)。
单克隆抗体，亦即同质抗体分子群体，可使用标准的杂交瘤技术制造(例如：参考Kohler等(1975)Nature 256,495；Kohler等(1976)Eur.J.Immunol.6,511；Kohler等(1976)Eur J Immunol 6,292；和Hammerling等(1981)Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.)。特别是，单克隆抗体可获自培养连续细胞系而生产抗体分子的任何技术，如Kohler等(1975)Nature 256,495及美国专利号4,376,110所述；以人B-细胞的杂交瘤技术生产者，如Kosbor等(1983)Immunol Today 4,72；Cole等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,2026；以EBV-杂交瘤生产者，如Cole等(1983)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96。前述抗体可为任何免疫球蛋白族群，包括IgG,IgM,IgE,IgA,IgD及其任何的亚类(subclass)。生产本发明的单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培养。由于杂交瘤具有在体内生产高效价的单克隆抗体的能力，为特别有效的生产方法。
而且，抗体片段可由已知方法产生。例如该片段可包含F(ab)’2片段，可由抗体分子经胃蛋白酶作用而产生，及Fab片段，可由还原F(ab)’2片段的二硫键而产生，但不限于此。
本发明提供的方法也可根据一般方法应用于实验室动物，以研究膀胱癌。此述“实验室动物”为通常用于动物试验的脊椎动物，例如：小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、及非人的灵长类动物。
相信本领域技术人员基于前述之说明可利用本发明至最大程度。以下之特定实施例因此仅为说明，不以任何方式限制本文的公开。所有此处引述之公开信息在此并入作为参考。
实施例
通过以下具体实施例对本发明进行更详细的说明，但其仅用于例示目的而不意图限制本发明的范围。
实施例1：测定术前尿中CYR61的含量能以较高的灵敏度和特异度鉴别肌层浸润性膀胱癌
样品收集和处理
招募104例膀胱癌患者，其中23名患者患有肌层浸润性癌，81名患者患有非肌层浸润性癌(Ta期30例，T1期51例)。采集来自上述受试者的术前尿液样品，无肉眼可见血尿。尿上清液中蛋白浓度受饮水、代谢等多种因素的影响，故而需要选择合适的尿蛋白内参对检测的目的蛋白浓度进行均一化处理。肌酐(Creatinine)是肌肉在体内代谢的产物，在饮食和肾功能正常的情况下，尿液中的肌酐含量相对稳定，故本研究选用肌酐作为内参。
通过ELISA测定尿上清中肌酐的浓度
(1)试剂准备：所有的试剂在使用前都须恢复室温，肌酐标准品使用去离子水2倍稀释，最高浓度为20mg/dl。将苦味酸配置为碱性苦味酸，如苦味酸中有沉淀可30℃加热使沉淀溶解。每板使用12.5ml苦味酸+2.5ml NaOH，充分混匀，室温保存待用。
(2)检测步骤：所有试剂取出恢复室温，按2倍梯度稀释标准品；样本稀释20倍，10μl样本原液+190μl H2O充分混匀；每孔加入50μl的样本稀释液或标准品，并记录样本排列顺序；每孔加入100μl苦味酸，室温孵育30min。酶标仪490nm读取光密度值(Optical Density，OD)。
(3)采用酶联免疫吸附法(ELISA)在104例膀胱癌术前尿上清中测得尿肌酐的含量如下：Ta期病例平均值为4.329mg/dl(95％CI:3.860-4.798mg/dl)；T1期病例平均值为4.420mg/dl(95％CI:3.859-4.982mg/dl)；T2～4期病例平均值为3.918mg/dl(95％CI:3.437-4.399mg/dl)。方差分析结果显示，不同病理分期的膀胱癌患者尿上清中肌酐含量无明显差别(p＝0.753)。
通过ELISA测定尿上清中CYR61的浓度
尿上清样本收集后，分装小样保存，Elisa检测前，冰上融化。轻振荡混匀，1000g，4℃离心3min。使用RD ELISA人Cyr61/CCN1DuoSet试剂盒(货号：DY4055,R&D)，按照相应Elisa检测试剂盒说明书进行操作。先期试剂准备如下：清洗缓冲液：0.05％TWEEN 20于PBS PH7.2-7.4中；试剂稀释剂：1％BSA于PBS PH7.2-7.4中，0.2μm膜过滤；底物溶液：1:1的A试剂(H2O2)+B试剂(tetramethybenzidine，四甲基联苯胺)；终止溶液：2N H2SO4。
(1)包板：用PBS稀释捕捉抗体(1:180)成工作液浓度，向96孔板中加入稀释的抗体，每孔100μl，立即用密封膜封闭96孔板，室温孵育过夜；自动洗板机洗板3次(400μl清洗缓冲液PBST)，于干净白纸上96孔板倒置吸干；每孔加300μl试剂稀释剂BSA封闭，室温孵育2h；再次洗板3次，倒置吸干，包被完毕，待用。
(2)抗体及标准蛋白准备：捕捉抗体和检测抗体均来自RD ELISA人Cyr61/CCN1DuoSet试剂盒(货号：DY4055,R&D)。捕捉抗体(用1.0ml PBS(细胞级)溶解捕捉抗体至720μg/ml，2-8℃保存60天，-20℃至-70℃保存，单次冻融可保存6个月。工作液浓度为4.0μg/ml，稀释比1:180；检测抗体用1.0ml试剂稀释剂溶解检测抗体至18μg/ml，2-8℃保存60天，-20℃至-70℃保存，单次冻融可保存6个月。工作液浓度为100ng/ml，稀释比1：180；标准(用0.5ml试剂稀释剂溶解标准重组蛋白至320ng/ml，静止15min，稀释前稍涡旋，分装，-70℃可保存2月。两倍梯度稀释，稀释7个梯度，最高浓度为2000pg/ml)。链霉亲合素偶联辣根过氧化物酶即链霉亲合素-HRP 1.0ml，2-8℃可保存6个月。
(3)检测：每孔加入100μl的样本或标准品，密封膜封板，室温孵育两小时；洗板3次，倒置吸干；每孔加入100μl检测抗体，新密封膜封板，室温孵育两小时；洗板3次，倒置吸干；按照标签上标注的稀释比(1/200)，用BSA稀释链霉亲合素-HRP，每孔加入100μl的稀释液，密封膜封闭96孔板；室温避光孵育20min；洗板3次，倒置吸干；每孔加入100μl底物溶液(1:1A+B)，室温避光孵育20min；每孔加入50μl终止溶液浓硫酸，轻弹混匀充分。酶标仪450nm波长，检测光密度值(Optical Density，OD)。
统计学分析
将ELISA测得的尿上清中CYR61的浓度相对于内参肌酐的浓度进行标准化转换CYR61浓度/肌酐浓度，从而得到每一个单位的肌酐对应CYR61蛋白的量。由此，得到总计104名患者中CYR61蛋白的平均含量是5.53ng/mg(95％CI:4.47-6.59ng/mg)，中位数4.32ng/mg，范围1.38～37.30ng/mg。使用非参数检验，当p<0.05时为统计学上具显著性，肌层浸润性癌患者和非浸润性癌患者的术前尿中CYR61的含量情况如下表1所示。
表1：
如图1所示，肌层浸润性癌患者尿上清CYR61的含量显著高于非肌层浸润性癌。如图2所示，接受者工作特征(ROC)曲线分析以尿上清CYR61区分浸润性癌和非浸润性癌，曲线下面积为0.883(95％CI:0.804-0.962)，p<0.001。测定该ROC曲线的阈值(cut off)值为4.596ng/mg，此时区分肌层浸润性膀胱癌和非肌层浸润性膀胱癌的灵敏度为72.7％，特异度为86.0％。
实施例2：CYR61含量的测定在鉴别肌层浸润性膀胱癌上优于常规影像学检查
对实施例1中招募的104名患者中有CT或MRI影像学资料的62名患者进行进一步分析。使用术前尿上清中CYR61蛋白的含量的阈值值4.596ng/mg来鉴定入组影像分析的62例膀胱癌，结果如下。
准确区分了15/17例浸润性癌和35/45例非浸润性癌，灵敏度为77.8％，特异度为88.2％。相比之下，通过影像学CT或MRI判别，其灵敏度为64.7％，特异度为88.9％。以约登指数(Youdon Index)为指标，可以发现尿上清中CYR61鉴别肌层浸润性效能的诊断效能高于CT或MRI。
实施例3：将CYR61含量与尿中另外三种蛋白MMP2、VEGFC和VEGF联合检测可进一步提高鉴别肌层浸润性膀胱癌的能力
测定尿中MMP2、VEGFC以及VEGF蛋白的含量
尿上清中MMP2蛋白的ELISA检测
(1)包板：捕捉抗体和检测抗体均来自RD ELISA人MMP-2DuoSet试剂盒(货号：DY902,R&D)。用PBS稀释捕捉抗体(1:180)成工作液浓度，向96孔板中加入稀释的抗体，每孔100μl，立即用密封膜封闭96孔板，室温孵育过夜；自动洗板机洗板3次(400μl清洗缓冲液PBST)，于干净白纸上96孔板倒置吸干；每孔300μl试剂稀释剂(BSA)封闭，室温孵育2h；再次洗板3次，倒置吸干，包被完毕，待用。
(2)抗体及标准蛋白准备：捕捉抗体用1.0ml PBS(细胞级)溶解捕捉抗体至360μg/ml，2-8℃保存60天，-20℃至-70℃保存，单次冻融可保存6个月。工作液浓度为2.0μg/ml，用PBS稀释，稀释比，1：180；检测抗体用1.0ml试剂稀释剂溶解检测抗体至90μg/ml，2-8℃保存60天，-20℃至-70℃保存，单次冻融可保存6个月。工作液浓度为500ng/ml，用试剂稀释剂稀释，稀释比，1:180；Standard用0.5ml试剂稀释剂溶解standard重组蛋白至1920ng/ml，静止15min，稀释前稍涡旋，分装，-70℃可保存2月。两倍梯度稀释，稀释7个梯度，最高浓度为20ng/ml；链霉亲合素-HRP：1.0ml链霉亲合素偶联辣根过氧化物酶，2-8℃可保存6个月。
(3)检测：每孔加入100μl的样本或标准品，密封膜封板，室温孵育两小时；洗板3次，倒置吸干；每孔加入100μl检测抗体，新密封膜封板，室温孵育两小时；洗板3次，倒置吸干；按照标签上标注的稀释比(1/200)，用BSA稀释链霉亲合素-HRP，每孔加入100μl的稀释液，密封膜封闭96孔板；室温避光孵育20min；洗板3次，倒置吸干；每孔加入100μl底物溶液(1:1A+B)，室温避光孵育20min；每孔加入50μl终止溶液(浓硫酸)，轻弹混匀充分。酶标仪450nm波长，检测OD值。
尿上清中VEGF蛋白的ELISA检测
(1)捕捉抗体和检测抗体均来自RD ELISA人VEGF DuoSet试剂盒(货号：DY293B,R&D)。包板步骤同MMP2蛋白的ELISA检测的包板步骤。
(2)抗体及标准蛋白准备捕捉抗体(用1.0ml PBS(细胞级)溶解捕捉抗体至180μg/ml，2-8℃保存60天，-20℃至-70℃保存，单次冻融可保存6个月。工作液浓度为1.0μg/ml，用PBS稀释，稀释比，1：180)。检测抗体用1.0ml试剂稀释剂溶解检测抗体至18μg/ml，2-8℃保存60天，-20℃至-70℃保存，单次冻融可保存6个月。工作液浓度为100ng/ml，用试剂稀释剂(BSA)稀释(稀释比，1:180)。Standard：用0.5ml试剂稀释剂(BSA)溶解standard重组蛋白至120ng/ml，静止15mins，稀释前稍涡旋，分装，-70℃可保存2月。两倍梯度稀释，稀释7个梯度，最高浓度为2000pg/ml(1:60稀释)。
(3)检测步骤同MMP2蛋白的ELISA检测的检测步骤。
尿上清中VEGFC蛋白的ELISA检测
所有的试剂在使用前都须恢复室温，准备如下试剂：清洗缓冲液(如有结晶沉淀，恢复至室温，轻震混匀至完全溶解，用去离子水将20ml清洗缓冲液浓缩液稀释至500ml)、底物溶液(使用前15min A液、B液等体积混合，注意避光，每孔需要加入200μl)、Assay diluent RD1W(缓冲蛋白)、CalibratorDliuent RD6U Concentrate(如有沉淀，须混匀。用去离子水2倍稀释。提前一天配制，使用完即弃)。VEGFC标准蛋白(加入1ml去离子水，将VEGFC标准蛋白溶解成70,000pg/ml的原液，充分混匀。在稀释前须充分混匀。可按照2倍稀释/5倍稀释)。捕捉抗体和检测抗体均来自人VEGF-C Quantikine ELISA试剂盒(货号：DVEC00,R&D)。
检测步骤：每孔加入100μl的Assay diluent RD1W(缓冲蛋白)、50μl的标准蛋白或样本，密封膜盖住，500rpm±50rpm震荡孵育2h。洗板4次，倒置吸干；每孔加入200μl的VEGF-Conjugate，用新密封膜盖住，震荡孵育2h。洗板4次，倒置吸干；加入200μl底物溶液，避光室温孵育30min；加入50μl的终止溶液，震荡混匀。酶标仪450nm波长，检测OD值。
ELISA数据处理
标准蛋白平行检测2个重复孔，所有样本平行检测三个重复孔。排除离群点后，取重复孔的平均数计OD值。按照标准蛋白浓度及所测OD值绘制标准曲线，标准曲线相关系数R>0.90为合格。按照标准曲线所得到的回归方程，利用样本OD值计算所测样本的蛋白浓度。
统计学分析
如实施例1中所述，经过内参肌酐进行均一化处理。如下表2和图3中所示的，对于这3种蛋白质，尿上清中含量在肌层浸润性膀胱癌患者均显著高于非浸润性癌患者。
表2
浸润性癌患者 非浸润性癌患者 P值
MMP2含量(ng/mg) 155.608±197.249 45.692±50.321 <0.001
VEGFC含量(ng/mg) 12.406±4.755 9.106±5.423 ＝0.001
VEGF含量(ng/mg) 11.572±31.125 1.581±3.133 ＝0.034
当将CYR61与上述3种蛋白的任一种或多种组合时，灵敏度和特异度都有进一步的提高(见图5)。当将所有4种蛋白联合时，灵敏度最高达87.9％，特异度为86.4％。
表3
虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。
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Claims (22)

1.富半胱氨酸蛋白61(CYR61)在制备用于在受试者中诊断肌层浸润性膀胱癌的试剂盒中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述诊断包括以下步骤：
(a)测定怀疑患有肌层浸润性膀胱癌的受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和
(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是否患有肌层浸润性膀胱癌。
3.权利要求1的用途，其中所述评估包括将所测定的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中CYR61蛋白的表达含量或预确定的阈值进行比较，所测定的表达含量增加指示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌。
4.CYR61蛋白在制备用于在患有膀胱癌的受试者中确定膀胱癌的病理分期类型的试剂盒中的用途。
5.权利要求4的用途，其中对病理分期类型的确定包括以下步骤：
(a)测定所述受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和
(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是患有肌层浸润性膀胱癌还是非肌层浸润性膀胱癌。
6.权利要求5的用途，其中所述评估包括将所测定的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中CYR61蛋白的表达含量或预确定的阈值进行比较，若所测定的表达含量增加则指示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌，否则指示该受试者患有非肌层浸润性膀胱癌。
7.CYR61蛋白在制备对患有膀胱癌的受试者进行预后的试剂盒中的用途。
8.权利要求7的用途，其中所述预后包括以下步骤：
(a)测定所述受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和
(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是患有肌层浸润性膀胱癌还是非肌层浸润性膀胱癌。
9.权利要求8的用途，其中所述评估包括将所测定的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中CYR61蛋白的表达含量或预确定的阈值进行比较，若所测定的表达含量增加则指示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌，否则指示该受试者患有非肌层浸润性膀胱癌。
10.权利要求2、5或8中任一项的用途，其中所述评估还包括：
(a)进一步测定来自所述受试者的尿液样品中选自下组的任一种或多种标志物的表达含量：MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白；和
(b)将所述受试者中的所述标志物的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中的相应标志物的表达含量或预确定的阈值相比较，其中如果所述MMP2蛋白、VEGFC蛋白或VEGF蛋白的表达含量增加则将所述受试者鉴定为患有肌层浸润性膀胱癌。
11.权利要求2、5或8中任一项的用途，其中所述测定是通过ELISA、表面等离子体共振、微阵列、或Western免疫印迹进行的。
12.权利要求3、6或9中任一项的用途，其中通过接受者操作特征(ROC)曲线获得所述预确定的阈值。
13.权利要求1-12中任一项的用途，其中所述受试者为人。
14.一种诊断受试者中的肌层浸润性膀胱癌的方法，所述方法包括：
(a)测定怀疑患有肌层浸润性膀胱癌的受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和
(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是否患有肌层浸润性膀胱癌。
15.一种用于对患有膀胱癌的受试者确定膀胱癌的病理分期类型或进行预后的方法，所述方法包括：
(a)测定所述受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和
(b)根据CYR61蛋白的表达含量，评估该受试者是患有肌层浸润性膀胱癌还是非肌层浸润性膀胱癌。
16.权利要求14或15的方法，其中所述评估包括将所测定的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中CYR61蛋白的表达含量或预确定的阈值进行比较，若所测定的表达含量增加则指示该受试者患有肌层浸润性膀胱癌。
17.权利要求16的方法，其中所述评估还包括：
(a)进一步测定来自所述受试者的尿液样品中选自下组的任一种或多种标志物的表达含量：MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白；和
(b)将所述受试者中的所述标志物的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中的相应标志物的表达含量或预确定的阈值相比较，其中如果所述MMP2蛋白、VEGFC蛋白或VEGF蛋白的表达含量增加则将所述受试者鉴定为患有肌层浸润性膀胱癌。
18.一种用于实施在受试者中诊断肌层浸润性膀胱癌的方法的试剂盒，所述方法包括：
(a)评估来自所述受试者的尿液样品中CYR61蛋白的表达含量；和
(b)将所述受试者中的CYR61蛋白的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中的CYR61蛋白的表达含量或预确定的阈值相比较，其中与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中的CYR61蛋白表达含量或预确定的阈值相比，所述CYR61蛋白的含量增加则将所述受试者鉴定为患有肌层浸润性膀胱癌，
其中所述试剂盒包含与所述CYR61蛋白具有特异性免疫反应性的抗体和用于检测所述抗体和CYR61蛋白之间形成的复合物的试剂。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述与CYR61蛋白具有特异性免疫反应性的抗体是与CYR61蛋白特异性结合的抗体。
20.权利要求18或19的试剂盒，其中所述方法还包括：
(a)进一步测定来自所述受试者的尿液样品中选自下组的任一种或多种标志物的表达含量：MMP2蛋白、VEGFC蛋白和VEGF蛋白；和
(b)将所述受试者中的所述标志物的表达含量与已知未患有肌层浸润性膀胱癌的受试者中的相应标志物的表达含量或预确定的阈值相比较，其中如果所述MMP2蛋白、VEGFC蛋白或VEGF蛋白的表达含量增加则将所述受试者鉴定为患有肌层浸润性膀胱癌，
其中所述试剂盒包含与MMP2蛋白、VEGFC蛋白或VEGF蛋白中的任一种或多种具有特异性免疫反应性的抗体和用于检测所述抗体和所述标志物之间形成的复合物的试剂。
21.权利要求18-20中任一项的试剂盒，其包含与CYR61蛋白和选自MMP2蛋白、VEGFC蛋白或VEGF蛋白的至少一种具有特异性免疫反应性的抗体。
22.权利要求18-21中任一项的试剂盒，其中所述抗体为完整的免疫球蛋白分子或其抗原结合片段。
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