CN102241772B - 抗体与诊断试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了针对一种肿瘤抑制蛋白特定区域的新抗体。以抗体为基础，本发明还提供了用来区分乳腺癌或卵巢癌具体类型的诊断方法和试剂。

Description

抗体与诊断试剂盒
技术领域
本发明主要涉及诊断试剂以及利用试剂盒诊断疾病的方法，特别是利用抗体及包含抗体的试剂盒诊断遗传性的乳腺癌和卵巢癌。
技术背景
乳腺癌是女性人群中发病率最高的恶性肿瘤。在美国，每年有超过二十万的女性被诊断患有乳腺癌，在欧洲和中国，每年确诊患有乳腺癌的人数也都在这一水平之上，全世界每年死于乳腺癌的人数超过五十万。然而，如果能够尽早诊断发现，乳腺癌病情的预后发展还是相当令人乐观的。例如，在第IV期才得到诊断的乳腺癌患者只有约20％能够活到5年之后，而在第I期就确诊的患者几乎能百分之百地活到5年之后。相比之下，尽管卵巢癌的发病几率小得多，但它却是致死率最高的癌症之一，确诊后能生存5年以上患者少于50％。但是这很大程度上是由于卵巢癌不能得到及时的诊断所致，因为高达75％的卵巢癌病例是在癌组织已经扩散后才被诊断出来的。
大约有10％的乳腺癌和卵巢癌是由遗传性的BRCA1和BRCA2基因突变引发的。携带有这些突变基因的女性在70岁之前得乳腺癌或卵巢癌的几率分别可高达85％和55％。在最近的十年里，发达国家已经能够对女性BRCA1和BRCA2突变基因的携带者进行乳腺癌和卵巢癌的易感性基因检测。一旦发现有这类突变基因，就需要加强病情的日常监测(包括乳房X光片、核磁共振、CA-125筛查等)，以期能够尽早诊断是否有恶性肿瘤发生，从而使病情有良好的预后发展。另外，伴随有BRCA1和BRCA2基因突变的肿瘤与其他肿瘤有着十分不同的表现型，特别地，能引起DNA损伤的化学治疗(如铂类抗癌药物)以及放射治疗方法对前者有很好的效果，但微管蛋白抑制剂(如紫杉醇类)则对其没有很显著的效果。此外，人们正在研发一类新的特异性针对BRCA1和BRCA2基因缺陷型癌症的药物——PARP抑制剂，而这类药物的使用通常要求先对病人进行BRCA1和BRCA2基因突变的检测。
现行的BRCA1和BRCA2基因的遗传检测通常是在分子水平上对基因组DNA进行复杂的分析，需要投入大量的劳力，成本很高。这样的高成本对于发展中国家来说几乎是无法克服的壁垒，而技术的复杂性也使得普通医院的实验室都不能进行这种检测。
相比之下，基于抗体的BRCA基因突变检测技术是一种更为廉价的方法。美国专利编号为5,965,377的技术发明就提供了一种这样的方法：利用BRCA1或BRCA2蛋白N端和C端的特异性抗体检测BRCA蛋白是否存在截断变异，抗体不能与C末端特异性结合就表明蛋白质存在截断突变。然而，这种检测方法的特异性和灵敏度都不高。Kashima等人研究了家族性卵巢癌(Jpn.J.Cancer Res.，91：399-409(2000))，利用对BRCA1蛋白的免疫组化染色检验了这种方法，他们发现有时候在肿瘤样品包含突变时C末端抗体也会着色，我们不得不进一步仔细考察抗体着色的亚细胞定位才能据此确定BRCA1基因变异的状态。因而，现行的检测方法尚未能满足我们所期望的高精确度和低成本的要求。
发明内容
本发明通过构建新的特异性抗体为BRCA1变异的检测提供了一种更加简易方便的方法。这种方法有着精确度高，操作简易以及成本低的特点。特别地，本发明提供并利用一种独立抗体，能够选择性地与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应。这种抗体对于检测BRCA1基因的第11个外显子突变尤其有效。将这种抗体与人类BRCA1蛋白的C端抗体联合使用，就构成了能够检测乳腺癌或卵巢癌肿瘤样品中几乎所有类型的BRCA1蛋白截断变异的诊断试剂盒。
在一般的实施方案中，这种抗体能选择性地与含有如序列编号1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽发生免疫反应。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1(SEQ ID NO：1)中至少6个连续氨基酸的抗原免疫动物所得到的。在优选的实施方案中，这种抗体为单克隆抗体。另外，本发明还包括用来产生这种抗体的动物以及杂交瘤细胞。
另一方面，本发明也提供了这种抗体用途，用于制备诊断试剂盒以检测病人肿瘤样品中BRCA1的截断突变。在优选的实施方案中，本发明提供了使用：(1)本发明中的抗体，(2)选择性与人类BRCA1蛋白N端发生免疫反应的抗体，以及(3)选择性与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体，用于制备诊断BRCA1基因截断突变的试剂盒，特别是针对乳腺癌或卵巢癌的肿瘤样品。
本发明的试剂盒同时还提供独立分装的容器，其中包含：(1)针对人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽的C端的特异性抗体，以及(2)选择性与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体。在一些优选方案中，试剂盒还包含能够选择性与人类BRCA2蛋白C端发生免疫反应的抗体。另外，本发明的试剂盒还可以同时包含与人类BRCA1蛋白N端特异发生免疫反应的抗体和/或与人类BRCA2蛋白N端特异发生免疫反应的抗体。
除了以上所述之外，本发明还提供了检测肿瘤样品中BRCA1蛋白截断突变的方法，包括：(1)用本发明中特异性地针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体与肿瘤样品接触，并测定其与样品的结合情况；以及(2)用选择性地与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体与肿瘤样品接触，并测定其与样品的结合状况。在这种检测操作方法下，如果样品中的BRCA1蛋白与针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体和针对BRCA1蛋白C端的抗体这两种抗体都不结合，就表明样品中BRCA1基因在第11个外显子的上游区域发生了截断突变。如果检测到肿瘤样品中BRCA1蛋白和针对BRCA1蛋白C端的抗体的结合能力减弱或不能结合，但却和针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体正常结合，就表明BRCA1基因在第11个外显子的下游区域发生了截断突变。如果检测到样品中的BRCA1蛋白与针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体结合能力减弱或缺失，但却与针对BRCA1蛋白C端的抗体正常结合，就表明第11个外显子区域发生了截断突变。而如果针对BRCA1基因第11个外显子编码的多肽片段C端的抗体和针对BRCA1蛋白C端的抗体都与样品正常结合，则表明BRCA1基因没有发生截断突变。
前面已经提到的和其他还没有提及的本发明的优点和特征，以及它们所实现的方式，都将在下面的发明详述中给予清楚地说明。另外，发明详述中还将结合具体例子阐释优选及典型的实施方案。
附图说明
图1是用不同的BRCA1抗体进行免疫反应试验的示意图，据此可以判定造成蛋白截断的BRCA1基因的突变位点所在；
图2是杂交瘤细胞克隆BZ-98的上清液对MCF-7细胞裂解物进行的蛋白质印迹检测(Western Blot)的图象。
具体实施方式
本发明利用一种新设计的特异性抗体对BRCA1蛋白的截断突变进行检测，具有精确度高，操作简易和成本低的特点。新设计的抗体能够特异性地与人类BRCA1基因第11外显子编码的多肽片段的C端发生免疫反应，即该抗体能够识别从该多肽链C末端起300个氨基酸残基之内的表位(以下简称这抗体为“第11外显子抗体”)。在优选的实施方案中，这一表位定位在距多肽链C末端200个或100个氨基酸残基之内的位点。最优的情况是，这一抗体特异性地与第11外显子编码的多肽链C端50个氨基酸残基顺序发生免疫反应，也就是说，这种抗体能选择性地与含有如序列编号1(SEQ ID NO：1)所示氨基酸序列的多肽发生免疫反应。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1(SEQ ID NO：1)中至少6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个连续氨基酸残基的抗原免疫动物所得到的。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1(SEQ ID NO：1)中至少6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个连续氨基酸残基的抗原免疫动物所得到的，并且其在免疫细胞化学染色试验中对MCF-7细胞染色至少是对UWB1.289细胞染色强度的5到10倍以上。
依照本发明的方法，利用抗体对病人的肿瘤样品进行免疫测定就能够检测出BRCA1蛋白的截断突变。对使用的免疫测定方法没有特殊要求，只要是能够检测抗体与肿瘤样品中BRCA1蛋白的结合情况即可。比如，合适的免疫测定方法包括：酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹(Western blot)、免疫荧光测定(immunofluorescence assay)、免疫细胞化学(immunocytochemistry)、免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)，以及上述方法的改良形式。用于检测的合适的肿瘤样品可以是手术样品、活组织检查样品、肿瘤组织的FFPE样品，以及从病人身上取得的细胞或其培养液。为方便起见，我们可以利用肿瘤组织使用免疫组织化学的方法测定。
检测中可以至少使用两种抗体：(1)上已述及的所设计的特异性抗体，即能选择性与人类BRCA1基因的第11外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应的抗体(简称“第11外显子抗体”)，(2)选择性与人类BRCA1蛋白的C端免疫反应的抗体(简称“BRCA1 C端抗体”)。选择性与人类BRCA1蛋白的C端发生免疫反应的抗体(“BRCA1 C端抗体”)的识别表位位于BRCA1蛋白质从C端起300个氨基酸残基之内。适用的BRCA1 C端抗体可以是现有文献中报道的GLK-2单克隆抗体。见Kashima et al.，Jpn.J.Cancer Res.91(4)：399(2000)。
检测病人的肿瘤样品中是否含有BRCA1蛋白的截断突变的过程至少包含以下几个操作步骤：(1)用以上所述的“第11外显子抗体”，即能选择性与人类BRCA1基因的第11外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应的抗体，与肿瘤样品接触反应，并测定其与肿瘤样品的结合情况；(2)用选择性与人类BRCA1蛋白的C端发生免疫反应的“BRCA1 C端抗体”与肿瘤样品接触反应，并测定其与肿瘤样品的结合情况。在这种检测操作方法下，同时检测到第11外显子抗体和BRCA1 C端抗体与样品中BRCA1蛋白结合减弱或者不能结合，就表明样品中BRCA1基因在第11个外显子的上游区域发生了截断突变；检测到BRCA1 C端抗体与样品中BRCA1蛋白结合减弱或不能结合，而第11外显子抗体正常结合，就表明样品中BRCA1基因在第11个外显子的下游区域发生了截断突变。检测到第11外显子抗体与样品中BRCA1蛋白结合减弱或缺失，而C端抗体与样品正常结合，就表明在第11个外显子区域发生了截断突变。而如果第11外显子抗体和C端抗体与样品中BRCA1蛋白的结合都正常，则表明样品中BRCA1基因没有发生对应的蛋白的截断突变。可能的情况，也是优选的情况是，整个操作步骤还将包含另一步，即用能够特异性与人类BRCA1蛋白的N端发生免疫反应的抗体(简称“BRCA1 N端抗体”)与肿瘤样品接触反应，并测定其与肿瘤样品的结合情况。N端抗体与肿瘤样品的结合情况可以作为阳性对照。当然，某些样品中，由于BRCA1蛋白降解，N端抗体也可能显现不与样品结合。选择性与人类BRCA1蛋白的N端发生免疫反应的抗体(简称“BRCA1 N端抗体”)，其识别表位在BRCA1蛋白质从N端起300个氨基酸残基之内；适用的BRCA1 N端抗体可以是现有文献中报道的Ab-2或MS-13单克隆抗体，可以从Calbiochem/Merch Chemicals(Darmstadt，Germany)买到。这一抗体的特异结合部位在BRCA1蛋白N端1-300氨基酸顺序内。见Frazer et al.，British Journal of Cancer 88，1263-1270(2003).对以上操作方法总结如下面的表1所示：
表1
从表1中可以看到，利用这些抗体就能简便地检测出肿瘤样品中BRCA1基因的变异状况。特别地，如果检测到BRCA1 C端抗体和第11外显子抗体中只要有一种不能与样品中的BRCA1蛋白正常结合，就说明样品中BRCA1蛋白发生了截断突变，尤其是当BRCA1 N端抗体与样品中BRCA1蛋白结合正常时。
如图1所示，正常细胞里，BRCA1基因主要有相关的两种表达产物：一种产物是BRCA1蛋白的全长形式(图1中的产物“A”)，另一种则删去了第11个外显子编码的氨基酸序列(图1中的产物“B”)。如果肿瘤样品中的BRCA1基因正常表达而没有截断突变的蛋白，这两种产物都将表达，那么上述的抗体就能够与这两种产物或与其中一种产物结合，于是在FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品的IHC检测中就会呈现阳性着色。
从图1中还可以看到，如果截断突变(如读码框移位、无义突变)发生在BRCA1基因的第11个外显子下游，那么“C端BRCA1抗体”既不能与产物A结合也不能与产物B结合，“BRCA1 N端抗体”既能与产物A结合也能与产物B结合，而“第11外显子抗体”只能结合产物A。因此，在FFPE组织样品的IHC检测中，“BRCA1 C端抗体”的染色结果将呈阴性，而另外两种抗体染色结果为阳性。
如果截断突变发生在BRCA1基因的第11外显子的上游，那么在产物A和B中都没有“BRCA1 C端抗体”和“第11外显子抗体”的结合表位。结果是在FFPE组织样品的IHC检测中，这两种抗体染色结果都为阴性，而只有“BRCA1 N端抗体”染色结果可能仍然呈阳性。
图1还说明，如果肿瘤样品的截断突变(读码框移位或无义突变)发生在BRCA1基因的第11个外显子区域，由于能与产物B结合，“BRCA1 C端抗体”在FFPE组织样品的IHC检测中仍然是阳性结果；“BRCA1 N端抗体”与产物A和B都能结合，因而染色结果为阳性；而加入“第11外显子抗体”后我们就能发现第11个外显子区域的突变，因为“第11外显子抗体”与第11个外显子编码的多肽片段的C端发生免疫反应，而如果第11外显子发生突变，产物A和B中都没有这一片段，于是“第11外显子抗体”的染色结果就会是阴性，从而表明第11外显子区域发生了截断突变。
在优选的实施方案中，进一步地，还要用能选择性与人类BRCA2蛋白C端发生免疫反应的抗体(“BRCA2 C端抗体”)与同一病人的肿瘤样品接触反应，并测定其与肿瘤样品的结合情况。还有可能的是，用能够选择性地与人类BRCA2蛋白N端发生免疫反应的抗体(“BRCA2 N端抗体”)与该病人的肿瘤样品接触反应，测定其结合情况。“BRCA2 N端抗体”可以识别BRCA2蛋白从N末端起300个氨基酸残基范围内的表位；“BRCA2 C端抗体”可以识别BRCA2蛋白从C末端起300个氨基酸残基范围内的表位。如果“BRCA2 C端抗体”与肿瘤样品的结合减弱或缺失，则表明检测出了BRCA2基因发生了截断突变，尤其是当BRCA2 N端抗体”的结合正常时。适用的BRCA2 N端抗体和BRCA2 C端抗体及其上述检测BRCA2截断突变的使用方法在Watson et al.，J.Clin.Oncol.，27：3894-3900(2009)和PCT/US1998/005618中已经披露。
在优选实施方案中，本发明用免疫组织化学(IHC)方法或者它的改良形式对肿瘤样品(如福尔马林固定石蜡包埋组织切片FFPE)进行分析检测。用IHC方法分析时，首先要从肿瘤组织中切下若干薄片(厚度约为4-40微米)制成FFPE切片；然后是对这些FFPE切片进行抗原恢复的步骤，在这一步中可以用热诱导的表位恢复(HIER)或是蛋白水解诱导的表位恢复(PIER)，目的是破坏在福尔马林固定时形成的蛋白交联，从而暴露出隐藏的抗原位点；接着，在加入第一种抗体之前需要对FFPE样品进行封闭处理，以减少之后检测中出现背景着色。例如，常规的血清就可以用来封闭，避免抗体的非特异性结合，而如果在后面的IHC分析中要用到过氧化酶，则还需要用过氧化氢对样品进行预处理以消除内源的过氧化酶活性。封闭步骤之后，就可以加入上述的五种抗体之一作为初级抗体(一抗)，再加入有标记的次级抗体(二抗)与初级抗体反应。本发明的检测方法中，可以分别取不同的FFPE样品，以上述的五种抗体中的一种作为初级抗体；也可以将两种或多种初级抗体加到同一份FFPE样品中同时进行免疫组化染色。
因此，利用上述抗体，我们就能检测到BRCA1和BRCA2基因中的截断突变。而导致遗传性的乳腺癌和卵巢癌的BRCA1和BRCA2突变绝大多数都是这种截断突变。通过IHC分析方法，用抗体对病人的肿瘤样品进行检测，就能确定出那些携带有遗传性的BRCA1/2突变的乳腺癌或卵巢癌病人。于是就能对这些病人制订出最佳的治疗方法例如优先选用PARP抑制剂或铂类抗癌药物，或者采取适当的措施以预防乳腺癌或卵巢癌的再次发生。另外，还可以对与病人有血缘关系的亲人进行检测，诊断出他们之中是否有乳腺癌或卵巢癌的易感者，这样就可以及早对这些突变基因携带者采取预防性措施。
免疫组织化学(IHC)方法只是实施本发明的一种方法。熟悉本专业的人士很显然地会意识到很多其它免疫分析方法都可以利用。比如，酶联免疫吸附测定(ELISA)就可以用于肿瘤组织(特别是新鲜或冷冻组织)样品，定量地或定性地检测上述抗体与样品中的BRCA1和BRCA2蛋白的免疫结合。ELISA的操作方法业内专业人员已经熟知，在此不加赘述。
另一方面，本发明还提供了一种新的纯化的抗体，能够选择性地与含有如序列编号1，或2，或3，或4(SEQ ID NOs：1，2，3，4)所示的氨基酸序列的多肽发生特异性免疫反应。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1，或2，或3，或4中至少6个连续氨基酸残基顺序的抗原免疫动物所得到的。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1或2，或3，或4(SEQ ID NO：1，2，3或4)中至少6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个连续氨基酸残基顺序的抗原免疫动物所得到的。在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1或2，或3，或4(SEQ ID NO：1，2，3或4)中至少6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个连续氨基酸残基顺序的抗原免疫动物所得到的，并且其在免疫细胞化学染色试验中对MCF-7细胞染色至少是对UWB1.289细胞染色强度的5到10倍以上，最好不对UWB1.289细胞结合或染色。BRCA1基因的第11个外显子编码BRCA1蛋白的第225到第1365个氨基酸，优选的方案是，本发明中的新抗体能选择性与BRCA1基因第11个外显子编码的多肽的最后50个氨基酸(或其中的一部分)，也就是BRCA1蛋白的第1316-1365个氨基酸或其中的一部分，发生特异免疫反应。也就是，在优选情况下，本发明中的新抗体识别的表位在第1316-1365号氨基酸范围内。更好的情况是，本发明中新抗体识别的表位在序列编号2或序列编号3或4所示的氨基酸序列范围内。
本发明中的抗体既可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。对于熟练的技术人员来说，产生这种抗体的方法都是很常用的，可以使用任何一项合适的技术。比如，可以利用化学合成或是重组合成的方法生产一段含有如序列编号1，或2，或3，或4，或是它们的一部分(含有序列中的6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个以上连续氨基酸残基)的肽段。这段多肽便可以用来作为免疫动物(比如小鼠、兔子、山羊)的抗原，再从受免疫的动物中取得血清并检测它是否对BRCA1蛋白的抗原肽段或全蛋白(纯化的形式或是存在与细胞或组织中)有免疫反应作用。如果想要得到单克隆抗体，可以用能够分泌抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再从中筛选出能产生我们所需抗体的细胞。也可以从杂交瘤细胞中克隆出编码上述抗体的基因，然后将此基因在一细胞株中重组表达。相应地，本发明也提供了能够产生上述的抗体(即可以与含有如序列编号1，或2，或3、或4所示的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的单克隆抗体)的细胞(可以是杂交瘤细胞或者重组表达的细胞株)。根据杂交瘤细胞的来源，这种抗体可以是小鼠或者兔子来源的单克隆抗体。
另外，本发明也提供了产生发明中所述的抗体的方法，包括培养能够产生这种抗体(即可以与含有如序列编号1，或2，或3所示的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的单克隆抗体)的杂交瘤细胞或者重组表达的细胞株，再从杂交瘤细胞或者重组表达的细胞株的培养液中分离纯化出这种抗体。具体地说，这种制备抗体的方法包括：1、提供一种能够产生和释放本发明的上述抗体的杂交瘤细胞或动物(小鼠或兔子)，2、培养这种杂交瘤细胞或者重组表达的细胞株或动物，3、收集杂交瘤细胞或者重组表达的细胞株培养液或动物血清，4、从杂交瘤细胞或者重组表达的细胞株培养液或动物血清中纯化上述可以与含有如序列编号1，或2，或3、或4所示的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的抗体。
从上面论述中还可以看到，这种新的抗体能够特异性地与人类BRCA1基因第11个外显子编码的多肽C端发生免疫反应，因而对于检测BRCA1基因的第11外显子突变造成的蛋白截断突变尤其有效。
这种抗体分别与“N端抗体”(特异性与BRCA1蛋白的N端反应的抗体)或“C端抗体”(特异性与BRCA1蛋白的C端反应的抗体)结合使用，就构成了诊断试剂盒，能从乳腺癌或卵巢癌肿瘤样品中检测出几乎所有类型的蛋白截断变异。
相应地，另一方面，本发明还提供了使用上述“第11外显子抗体”的用途，即用这种“第11外显子抗体”(能选择性与BRCA1基因的第11外显子编码的多肽C端免疫反应的抗体)制备诊断试剂盒，以确定病人样品中的BRCA1基因突变状况。在其中一种实施方案中，制备诊断试剂盒中包括以下两种抗体：(1)上述“第11外显子抗体”，(2)特异性与人类BRCA1蛋白的C端免疫反应的抗体(“C端抗体”)，以制备出诊断BRCA1基因截断突变状况的试剂盒，尤其是针对乳腺癌或卵巢癌的肿瘤样品。在优选实施方案中，制备诊断试剂盒中包括以下三种抗体：(1)上述“第11外显子抗体”，(2)特异性与人类BRCA1蛋白的N端免疫反应的抗体(“N端抗体”)，以及(3)特异性与人类BRCA1蛋白的C端免疫反应的抗体(“C端抗体”)，以制备出诊断BRCA1基因突变状况的试剂盒，尤其是针对乳腺癌或卵巢癌的肿瘤样品。在优选的实施方案中，本发明中的新抗体，即上面所说的能够选择性与含有序列编号1，或2，或3或4的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的抗体(包括所述各种具体优选实施方案中的新抗体)，将作为“第11外显子抗体”使用。
除此之外，本发明还提供一种试剂盒，其中包含：(1)选择性与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应的抗体(“第11外显子抗体”)，以及(2)选择性与人类BRCA1蛋白C端发生免疫反应的抗体(“C端抗体”)。优选情况下，试剂盒将进一步包括(3)选择性与人类BRCA2蛋白C端发生免疫反应的抗体(“BRCA2 C端抗体”)。另外，本发明的试剂盒还可以包含(4)与人类BRCA1蛋白N端特异发生免疫反应的抗体(“BRCA1N端抗体”)和/或(5)与人类BRCA2蛋白N端特异发生免疫反应的抗体(“BRCA2 N端抗体”)。在优选实施方案中，本发明中的新抗体，即上面所说的能够选择性与含有序列编号1，或2，或3或4的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的抗体(包括所述各种具体优选实施方案中的新抗体)，将在试剂盒中作为“第11外显子抗体”使用。
在优选实施方案中，试剂盒还可以包括以下的一种或多种抗体：(1)选择性与人类雌激素受体(ER)发生免疫反应的抗体，(2)选择性与人类孕酮受体(PR)发生免疫反应的抗体，以及(3)选择性与人类Her2/neu发生免疫反应的抗体。
这里所说的试剂盒可以用于各种免疫学检测方法，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹(Western blot)、免疫荧光测定(immunofluorescence assay)、免疫细胞化学(immunocytochemistry)、免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)等等。在一个优选实施方案中，这里所说的试剂盒是用于ELISA，因此还包含一些用于ELISA的辅助试剂。在另一个优选实施方案中，这个试剂盒是用于IHC分析的试剂盒，因此还会含有IHC检测中用到的其他试剂，包括：抗原恢复溶液，一种或多种封闭试剂，以及一种或多种次级抗体(二抗)，等等。因此，在一个实施方案中，一个用于IHC分析的试剂盒可以包含下面的成份(各项可以都分装在独立的容器中)：
(1)选择性与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应的抗体(“第11外显子抗体”)，优选的情况是能够选择性与含有如序列编号1，或2，或3或4的氨基酸序列的多肽免疫反应的抗体；在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1或2，或3，或4(SEQ ID NO：1，2，3或4)中至少6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个连续氨基酸残基的抗原免疫动物所得到的，并且其在免疫细胞化学染色试验中对MCF-7细胞染色至少是对UWB1.289细胞染色强度的5到10倍以上，最好不对UWB1.289细胞结合或染色；
(2)选择性与人类BRCA1蛋白的C端发生免疫反应的抗体(“C端抗体”)；
(3)选择性与人类BRCA2蛋白的C端发生免疫反应的抗体(“BRCA2C端抗体”)；
(4)选择性与人类雌激素受体(ER)发生免疫反应的抗体；
(5)选择性与人类孕酮激素受体(PR)发生免疫反应的抗体；
(6)选择性与人类Her2/neu发生免疫反应的抗体；以及还可以含有IHC检测中用到的其他试剂，包括：抗原恢复溶液，一种或多种封闭试剂，以及一种或多种次级抗体(二抗)，等等，还有一份或多份使用IHC试剂盒的说明书。
在另一个实施方案中，一个用于IHC分析的试剂盒可以包含下面的成份(各项可以都分装在独立的容器中)：
(1)选择性与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的多肽片段C端发生免疫反应的抗体(“第11外显子抗体”)，优选的情况是能够选择性与含有如序列编号1，或2，或3或4的氨基酸序列的多肽免疫反应的抗体；在优选的实施方案中，这种抗体是用含有序列编号1或2，或3，或4(SEQ ID NO：1，2，3或4)中至少6个，7个，8个，9个，10个，11个，12个，15个，17个或20个连续氨基酸残基的抗原免疫动物所得到的，并且其在免疫细胞化学染色试验中对MCF-7细胞染色至少是对UWB1.289细胞染色强度的5到10倍以上，最好不对UWB1.289细胞结合或染色；
(2)选择性与人类BRCA1蛋白的C端发生免疫反应的抗体(“C端抗体”)；
(3)选择性与人类BRCA1蛋白的N端发生免疫反应的抗体(“N端抗体”)；
(4)选择性与人类BRCA2蛋白的C端发生免疫反应的抗体(“BRCA2 C端抗体”)；
(5)选择性与人类BRCA2蛋白的N端发生免疫反应的抗体(“BRCA2 N端抗体”)；
(6)选择性与人类雌激素受体(ER)发生免疫反应的抗体；
(7)选择性与人类孕酮激素受体(PR)发生免疫反应的抗体；
(8)选择性与人类Her2/neu发生免疫反应的抗体；以及还可以含有IHC检测中用到的其他试剂，包括：抗原恢复溶液，一种或多种封闭试剂，以及一种或多种次级抗体(二抗)，等等，还有一份或多份使用IHC试剂盒的说明书。
该试剂盒最显著的优点在于：它使一个普通的诊断实验室利用这些种抗体进行IHC检测成为了可能，也让医生们可以根据检测结果全面而又精细地划分出特定病人的乳腺癌症状况及类别。该试剂盒的IHC检测可以给医生及病人提供的信息包括：(1)病人所得的乳腺癌是否是遗传性的，(2)病人是否有很高的可能性发生二次乳腺癌或卵巢癌，(3)与病人有血缘关系的亲人是否有需要进行BRCA1和BRCA2基因的突变检测，(4)PARP抑制剂、引起DNA损伤的化疗药物(如铂类药物，丝裂霉素C和蒽环类药物)以及放射治疗对病人的癌症疗效的预测，(5)抗雌激素药物(比如它莫西芬)是否可以对病人使用(依据ER/PR IHC检测的结果)，以及(6)曲妥珠单抗(赫赛汀)是否可以对病人使用(依据Her2/neu IHC检测的结果)。因此，这是迄今为止能提供最为全面的诊断信息的有关乳腺癌的诊断试剂盒，医生和病人可以据此最好地了解病人的癌症病情，选择最合适的治疗方法，以及对病人甚至其家人采取适当的预防措施。
实施例一
为制备能够选择性地与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的肽段C端发生免疫反应的抗体(第11外显子抗体)，我们首先合成了序列为TGLEENNQEEQSMDSNL(如序列编号3所示)的多肽，然后将这段多肽连接到钥孔戚血篮素(KLH)上，用来免疫小鼠。接着，将受免疫小鼠的抗血清分别进行酶联免疫检测(ELISA)和MCF-7细胞的蛋白质印迹检测(WesternBlot)。再利用MCF-7细胞和肿瘤样品细胞的免疫组织化学测定(IHC)对小鼠血清进行筛选，得到最优的抗血清，将其对应的小鼠做脾脏切割以及杂交瘤细胞的制备。不同杂交瘤细胞系的上清液分别通过以下筛选：细胞样品的蛋白质印迹，在第11外显子处有突变的乳腺癌病人组织样品的IHC检测，以及没有BRCA1基因突变的乳腺癌病人组织样品的IHC检测。最终依据以下标准筛选得到的最优细胞系：在酶联免疫测定中有高滴定量，清晰的蛋白质印迹结果，及对于乳腺癌/卵巢癌细胞或组织样品可以检测出在第11外显子处有没有发生突变的明显差异。进一步地，我们利用亲和技术将这种细胞系的上清液纯化。理论上说，理想的抗体应该能识别220KD的BRCA1全长蛋白和150KD的BRCA1-IRIS蛋白而不能识别110KD的第11外显子缺失的BRCA1蛋白，图2是显示用杂交瘤细胞克隆BZ-98的上清液对MCF-7细胞裂解物进行的蛋白质印迹检测(Western Blot)，结果正好与此相符。
实施例二
用克隆单抗BZ-98对第十一外显子无突变的SKOV-3细胞系和第十一外显子有突变的细胞株UWB1.289进行免疫荧光标记试验，具体地说，将细胞培养于24孔板，PBS洗3次之后，用4％多聚甲醛室温固定20分，冲洗之后，37°破膜30分。用PBS洗3次之后用3％BSA封闭30分，然后加入BZ-98作为一抗4°过夜。接下来用PBS洗3次，加入用1％BSA稀释的FITC荧光二抗室温30分钟。PBS洗3次之后，加入Hoechst 33258染10min，然后以PBS洗3次后进行镜检。结果是BZ-98能够标记SKOV-3细胞而不能标记UWB1.289细胞。
实施例三
用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养MCF-7和HCC1937细胞。用含有3％胎牛血清的50％RPMI-1640+50％MEGM培养基培养UWB1.289细胞。所有细胞都在37℃，含有95％空气和5％二氧化碳的湿润环境中培养。打散细胞，再用100g转速离心收集细胞，接着，用10ml PBS清洗细胞两次，用含有2％福尔马林的PBS固定48小时。然后用PBS洗一次，重悬于含有2％琼脂糖的PBS溶液，以标准方法包埋于石蜡中，制备得到4μm的石蜡截面切片。
在免疫细胞化学分析之前，切片首先要在二甲苯中脱石蜡，再通过梯度乙醇脱水。每个切片都要用1％的双氧水处理20分钟，再用血清封闭20分钟，然后在密闭的容器中，用以下几种初级抗体之一与切片4℃过夜孵育：(1)Dako(Glostrup，丹麦)的GLK-2，以1∶10000稀释；(2)Merck Chemicals(Darmstadt，德国)的MS-13，1∶10稀释；以及(3)实例1中制备的BZ-98抗体(能选择性与人类BRCA1基因的第11个外显子编码的肽段C端发生免疫反应的抗体)，1∶50稀释。然后用缓冲液清洗切片，再用辣根过氧化酶标记的聚合体检测系统(DAKOEnvision Plus，Dual Link)进行免疫组织化学染色。作为对照，在上述免疫组化染色之前可以用50倍过量的抗原肽段或对照肽段与各初级抗体进行预孵育，作为肽段封闭效果的测试。
结果是，MS-13可以将三种细胞都染色；GLK-2可以对MCF-7和UWB1.289细胞染色，而不对HCC1937细胞染色；BZ-98可以对MCF-7和HCC1937细胞染色，而不对UWB1.289细胞染色。
实施例四
用BZ-98对肿瘤样品进行免疫组织化学试验。从一个用dHPLC和DNA测序结合的方法检测出在BRCA1基因第11外显子中含截断突变的乳腺癌病人取得FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)乳腺癌肿瘤组织样品，又从一个在BRCA1基因没有发生突变的乳腺癌病人取得FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)乳腺癌肿瘤组织样品。按类似于实施例三的方法处理组织样品，并用BZ-98抗体作一级抗体进行IHC试验，结果是在BRCA1基因第11外显子中含截断突变的乳腺癌病人的样品中染色阴性，在野生型BRCA1基因的病人的样品中染色阳性，表明BZ-98抗体能够检测出BRCA1基因第11外显子中含有截断突变。
尽管为了更好地理解本发明，在前文中已经通过图解和具体例子给予了本发明的详细说明，但是在所附的权利要求范围之内，本发明还会有适当的变化和改进。

Claims (1)

1.一种经纯化的能够选择性与如序列编号1或2所示的氨基酸序列的多肽发生免疫反应的抗体联合一种选择性与人类BRCA1蛋白的C端发生免疫反应的C端抗体以及一种能够选择性与人类BRCA1蛋白的N端发生免疫反应的抗体在制备可以检测出样品中BRCA1基因第11个外显子区域或其上游或其下游是否存在截断突变的检测试剂盒中的应用。
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