KR0175658B1 - 망막아종 유전자 생성물에 대한 항체 및 이를 포함하는 진단제 - Google Patents

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Description

망막아종 유전자 생성물에 대한 항체 및 이를 포함하는 진단제

제1도는 RB1 단백질을 암호화하는 cDNA 서열을 도시한다.

제2도는 폴리클로날 항혈청 RB-AB20 및 이로부터 정제된 IgG 분획에 의한 표지된 RB1 단백질의 침전을 도시한다.

제3a 및 3b도는 모노클로날 항체 RB-MAB20 으로 RB1 양성 세포주(SW613) 및 음성 세포주(MDA-MB468)의 면역조직화학적 염색을 도시한다.

제4a 내지 4c도는 사람 유방 조직내에서 RB1 단백질의 면역조직화학적 염색을 도시한다.

본 발명은 종양세포 검출방법, 망막아종 유전자(RB1)에 의해 암호화되는 단백질에 대한 항체, 종양 중의 RB1 단백질을 검출하는 방법, 다양한 유형의 종양 유형 및 망막아종 유전자가 결여된 세포 유형에서 종양 진행의 진단방법에 관한 분야에 관한 것이다.

특정 유형의 암에 있어서 종양 발생은 돌연변이에 의해 하나 이상의 열성 종양 억제 인자 유전자가 드러난 결과 때문으로 간주된다. 두가지 유아 암, 망막아종 및 윌름씨 종양은 이러한 유형의 암에 대한 원형이다. 망막아종은 신생아 20,000명중 약 한명꼴의 빈도로 발생하는 희귀한 악성 안(ocular)종양이다. 망막아종은 유전적이고 특발성 질환으로서 발생하는데, 약 40%의 경우가 유전성이다. 세포유전학적 연구는 망막아종과 관련된 염색체 영역을 13q14로서 동정한다. 최근 망막아종 유전자(RB1)가 클로닝되고 서열화되었다. 최소한 40%의 원발성 망막아종에는 RB1에 대한 명백한 구조적 이상이 있고, 이 비정상의 유형에는 전체 유전자의 결실, 소규모의 내부적 결실, 전위 및 점 돌연변이를 포함한다.

임상적으로 망막아종을 극복한 환자는 다른 특이형의 원발성 종양, 주로 골육종, 덜 빈번하게는 섬유육종 및 가능하게는 흑색종을 발병시킬 위험이 상당히 높다. 또한, 영향을 받지 않은 가족구성원은 예상보다 빈번하게 다른 암에 거리며, 이때 이들 암은 다양한 유형을 나타낼 수 있다. 망막아종 환자로부터 수득한 제2원발성 종양의 DNA 분석은 RB1 유전자의 양쪽 대립형질에서 명백한 비정상을 보여준다. 더우기, 망막아종에 걸린적이 없는 환자의 섬유육종 및 골육종으로부터 분리한 DNA는 RB1 유전자의 결실을 나타낸다. 따라서, RB1 유전자의 기능 상실은 사람의 종양 발생에 총체적 역활을 한다.

또한 RB1 유전자의 기능 상실은 망막아종, 골육종, 섬유육종, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 경부암 및 연조직 육종과 연관되어 있다. 또한 구조적 비정상은 원발성 미소세포 폐암종(SCLC)의 13% 및 SCLC 세포주의 18% 중에서 검출된다. 더욱 중요하게는, RB1 mRNA의 상실은 SCLC 주의 60% 중에서 관찰된다. 망막아종과 마찬가지로, SCLC는 신경 내분비 기원의 종양이다. 또한, 빈번한 RB1 유전자의 변이는 원발성 유방암에서 검출할 수 있다. 신경내분비 분화의 표현형 특성을 나타내는 두 개의 종양 유형내에서의 RB1 유전자의 관련은 중요하다. 그러나 유방암은 신경내분비 기원은 아니지만, 이들은 매우 강한 유전성 성분을 나타내는 계통과 함께 강한 가계적 경향을 나타낼 수 있다. 골육종 및 연조직 육종을 갖는 아동의 모친은 높은 비율의 유방암을 나타낸다는 증거가 있긴 하지만, 유방암과 망막아종 사이의 연관에 관한 직접적 증거는 없다.

RB1 유전자 생성물(RB1 단백질)의 구조는 RB1 cDNA의 서열 분석을 통해 유추 되었다. 가장 긴 RB1 판독 프레임(reading frame)은 928개 아미노산의 단백질을 암호화한다. 트립 E-RB 융합 단백질에 대한 항혈청을 사용하여, 겉보기 분자량이 110,000 내지 114,000달톤인 단백질을 면역침전시킨다. RB 융합 단백질은 인 단백질이다. 합성 올리고펩타이드 또는 세균적으로 발현된 펩타이드에 대해 제조된 항혈청은 Rb1 단백질의 천연형으로 간주되는 약 105킬로 달톤의 단백질을 면역침전시킨다.

RB1 단백질을 암호화하는 cDNA 서열(제1도)은 부위 609 내지 615에서 (VRSPKKK) 단백질의 아미노산이 배열되어 있음이 밝혀졌는데, 이것은 SV40 거대 T 항원 및 폴리오마 거대 T 항원 중에서 발견되는 핵 전위 신호를 연상시킨다. 이는 RB 단백질이 핵단백질임을 시사한다. RB1 단백질은 면역염색 및 핵과 핵 분획물 중의 세포 성분의 분별에 의한 아-세포 위치 측정에 의해 각각 검출된다.

상기 논의된 RB1 유전자 중의 변형의 검출은 DNA 탐침 및 DNA 하이브리드화 검정을 사용하여 이루어진다. 이러한 기술은 일반적으로 당해분야의 숙련가들에게 공지되어 있고 1988년 10월 31일 출원된 계류중인 미합중국 특허원 제07/312,777호에 상세하게 기술되어 있다.

유전자 변이를 검출하기 위한 DNA 하이브리드화 기술의 이용은, RB1 유전자가 결여된 개개의 세포의 존재를 DNA 하이브리드화 기술을 수행하기 위해 사용되는 DNA 제조물 중에서 검출할 수 없기 때문에 그것의 감도에 제한된다. 또한, DNA 하이브리드화 검정은 시간이 걸리므로, DNA 하이브리드화 기술에 의한 RB1 유전자 유무의 검출은 결과를 수득하는데 필요한 시간의 길이에 의해 좀더 방해받는다.

현재까지, 종양 조직 표본 중의 RB1 유전자 변이를 검출하기 위한 민감하고 특이적이며 신속한 방법은 입수용이하지 않았다. 이와 같은 방법은 치료법의 결정에서 뿐 아니라, 작용성 RB1 유전자의 유무 확인에 의한 망막아종 종양 환자의 예후 판단을 돕는데 바람직하다.

본 발명의 목적은 변형된 망막아종 유전자를 지닌 종양을 검출하기 위한 민감한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 망막아종 유전자의 단백질 생성물(RB1 단백질)을 검출하기 위한 폴리클로날 항체를 제공하는 것이다. RB1 단백질의 검출을 위한 모노클로날 항체를 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다. 본 발명의 추가적 목적은 RB1 단백질에 대한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 망막아종, 골육종, 섬유육종, 유방, 난소, 방광, 폐, 경부의 암 및 연조직육종으로 이루어진 그룹에서 선택된 다양한 종양의 정도 및 단계를 측정하기 위한 추가적 방법을 제공하는 것이다. 이들 모든 종양은 변형 되거나 불완전한 망막아종 유전자와 관련된 아집단 세포를 나타낸다.

본 발명의 또다른 목적은 다양한 종양의 정도 및 단계를 결정하기 위한 부가적 기준을 제공함으로써, 종양 환자에 대한 예후 및 향후 치료법의 판단을 돕는 것이다.

따라서, 상기 목적을 달성하는데 있어서, 본 발명의 한 국면에 따라 RB1 단백질에 결합하는 폴리클로날 항체가 제공된다. 모노클로날 항체가 또한 제공되는데 이는 쥐의 하이브리도마에 의해 제조되며, 여기서 항체는 RB1 단백질과 특이적 면역-반응성이다.

또다른 양태에 있어, RB1 단백질 검출방법은 종양 조직으로부터의 조직 단편을 제조하고 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)를 상기 제조된 조직 단편과 함께 배양하여 항체-항원 복합체를 형성하며 이와 같이 형성된 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계로 이루어져 제공된다.

본 발명의 또다른 양태는 골육종, 섬유육종, 흑색종, 유방, 난소, 방광, 폐, 경부의 암 및 연조직 육종과 같은 종양과 관련된 아집단 세포를 검출하기 위한 방법 및 그러한 종양을 갖는 개인의 예후를 진단하고 결정하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 종양을 생검하고, 생검한 조양조직으로부터 조직단편을 제조하며, 제조된 조직단편을 본 발명의 RB1 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 함께 배양해 항체를 조직에 특이적으로 결합시켜 항체-항원 복합체 형성을 허용하고, 항체-항원 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함한다.

본 발명은 망막아종 유전자 생성물(RB1 단백질)이 변형된 매우 다양한 종양을 검출하고 종양 환자의 예후 및 향후 치료법을 판단하는데 있어 유용하다.

다른 또다른 목적, 특색 및 이점은 첨부된 도면과 관련될 때 기술의 목적으로 주어진, 본 발명의 현재의 바람직한 양태의 하기 서술로부터 명백해진다. 본 발명은 하기 명세서 및 그 일부를 이루는 참조로서 인용된 하기 도면으로부터 더욱 쉽게 이해될 것이다.

제1도는 cDNA의 5'에 인접한 게놈 서열의 일부를 포함하는 RB1 cDNA 서열을 나타낸다. ATG 코돈 중의 A 잔기는 위치 1로 정의된다. 최장 판독 프레임의 아미노산이 각각의 암호화 서열 하위에 나타난다.

제2도는 폴리클로날 항혈청 RB-AB20 및 RB-AB20으로부터 정제된 IgG 분획에 의해 표지된 RB1 단백질의 침전을 도시하고 있다.

제3도는 RB1 양성 세포주(SW613) 및 RB1 음성 세포주(MDA-MB468)를 모노클로날 항체 RB-MAB20으로 면역 조직화학적으로 염색한 것이다.

제4도는 사람의 유방 조직 중의 RB1 단백질의 면역 조직화학적 검출을 도시한다. 모두 250배 확대이다.

도면은 일정한 비율로 만들 필요는 없고 본 발명의 특정 성질은 명확성 및 간결성의 측면에서 도식적 형태로 확대시키거나 도식형으로 도시될 수 있다.

당해 분야의 전문가에게는 다양한 치환 및 변형이 본 발명의 영역 및 정신을 벗어남없이 본 명세서에 기술된 발명에 대해 만들어질 수 있음이 매우 명백하다.

항원이란 면역반응을 유도해낼 수 있는 화합물이고 몇몇 특이성으로 표적항원과 결합하고 반응하는 항체를 부수적으로 생성시킨다. 바이러스 또는 이의 특이적 결정소, 다양한 공급원으로부터 유도된 펩타이드 및 단백질, 탄수화물 잔기 및 다양한 생중합체와 같은 항원에 대해 특이적인 항체 탐침은 당해분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 이와 같은 항체의 제조를 위한 일반적 방법도 또한 당해분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.

간단하게, 폴리클로날 항체는 RB1 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드 서열로 동물숙주를 면역화시킴으로서 제조될 수 있다. 바람직하게는, 항원은 RB1 단백질의 친수성 C-말단에 또는 C-말단 근처에 위치한 펩타이드 서열이다. 항원은 숙주에게 1주일 간격으로 피하내 투여되고 최종 투여 주 이후 1개월은 부스터 투여량으로 투여된다. 이어서, 숙주로부터 혈청을 수거하여 차기 사용시까지 저장해둔다. RB1 폴리클로날 항혈청은 본 발명의 면역조직화학적 방법중에 직접 사용될 수 있다. 다른 방도로서, RB1 항체는 당해분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 혈청으로부터 침전될 수 있고 더욱 농축된 형태로 사용되며, 또는 다른 방도로서, RB1 항체는 친화성 기술에 의해 정제되어져 이 정제된 형태로 사용된다. 항체는 또한 당해분야의 숙련가들에게 공지되고 하기에 좀더 기술된 기법에 의해 검출되도록 표지될 수 있다.

면역화된 공여체로부터의 비장세포와 골수종 세포 사이의 융합은 균질한 항체를 유도해내는 성공적인 방법으로 나타났다. 따라서, 다양한 항원에 대해 다량의 모노클로날 항체를 제조할 수 있는 유전학적으로 안정한 하이브리도마 세포의 연속적인 세포주가 개발되었다. 코프로우스키 등의 (koprowski et al.) 미합중국 특허 제4,172,124호에 따르면, 악성 종양에 특이성을 나타내는 항체는, 히포크산틴포스포리보실트란스페라제가 결여된 골수종 세포와 미리 종양 세포가 도입된 동물로부터 유도해낸 비장 또는 임파 세포 사이의 체세포 하이브리드에 의해 제조될 수 있다. 또한, 코프로우스키 등의 미합중국 특허 제4,196,265호에 의해 특정 바이러스 및 이의 항원 결정소에 대한 다량의 모노클로날 항체를 제조할 수 있는 유전학적으로 안정한 융합된 세포 하이브리드의 연속적 세포주가 개발되었다.

이와 같은 세포 융합 기술은 또한 항-RB1 항체를 확실하고 표준적으로 제공 하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 항-RB1 항체를 발현시키는 신규한 연속적 하이브리도마 세포주는 동물을 RB1 유전자 생성물의 친수성 C-말단에 또는 C-말단 근처의 아미노산 서열에 해당하는, 바람직하게는 제1도에 도시된 P2, P3, P4, 또는 P5 RB1 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 합성 서열에 해당하는 펩타이드 서열로 면역화시키고, 면역화된 동물로부터의 항체-생성 세포와 골수종 세포 사이에 융합된 하이브리드 세포를 형성시켜, 하이브리드를 클로닝시킨 뒤 항-RB1 항체를 발현시키는 클론을 선별함으로써 수득한다. 더욱 특이적으로는, 마우스 또는 다른 동물에 정제된 RB1 항원을 주입하고 동물의 비장내 항체 생성 세포를 암종 유형의 마우스 세포 또는 골수종 세포와 융합시킨다. 이와 같이 형성된 하이브리드 세포는 그의 모 비장세포의 항-RB1 항체 분자를 생성시키고 지속적으로 생장해 이의 모 골수종 세포처럼 분열한다. 이같은 항체를 생성하는 세포의 클론을 선별하여 다량의 항-RB1 항체가 수거되는 연속적 세포주로서 성장시킨다. RB1-MABP₂로 지정된 이같은 클론이 하기에 좀더 논의되고 있다.

다른 방편으로, 클로날 하이브리드 세포는 조직친화성 동물 내로 주입되어 그곳에서 증식하여 동물의 복수액으로부터 회수될 수 있는 고수준의 항-RB1 항체를 생성시킨다.

따라서, 본 발명은 RB1 단백질 발현, 또는 다른 한편으로는, 단백질의 부재가 특정 유형의 종양, 이의 정도 또는 단계와 관련된 종양 표본에서의 RB1 단백질 발현의 부재의 면역조직화학적으로 검출하는데 사용하기 위한 비교적 대규모의 확실하고 표준적인 항-RB1 항체 공급원을 이용할 수 있게 한다. 이와 같이 제조된 모노클로날 항체는 또한 당해분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 표지될 수 있다.

검출가능한 표지는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 어떠한 물질도 될 수 있다. 이와 같은 검출가능 표지는 면역검정 분야에서 개발이 잘 되어 왔고 일반적으로 이같은 방법에 있어 유용한 대부분의 어떠한 표지도 본 발명에 적용될 수 있다. 특히 유용한 것은 효소(예: 알칼린 포스파타제 및 퍼옥시다제) [참조 : Clin. Chem., 22 : 1243 (1976)], 효소 기질[참조 : 영국 특허원 제1,548,741호], 조효소(참조 : 미합중국 특허 제4,230,797 및 4,238,565호) 및 효소억제제(참조 : 미합중국 특허 제4,134,792)와 같은 효소적 활성 그룹; 형광체[참조 : Clin. Chem., 25 : 353 (1979)], 발색단; 화학발광제 및 생 발광제 같은 발광제[참조 : Clin. Chem., 25 : 512 (1979); 및 방사성 동위원소들이다. 보편적으로 사용되는 검출가능 방사성 표지는³²P,¹⁴C,¹²⁵I,³H 및³⁵S를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비오틴화된 탐침은 아비딘/스트렙트아비딘, 형광체, 효소성 또는 콜로이드성골드 포합체를 사용하여 하이브리드화 한 후 검출된다. 항체도 또한 다른 형광성 화합물, 면역검출되는 형광성 유도체 또는 비오틴 유사체로 표지될 수 있다. 간접적 형광성 면역세포화학적 방법이 또한 사용될 수 있다.

항원-항체 복합체의 형성을 검출하기 위하여, 검출 가능한 표지가 사용된다. 검출가능 표지(또는 리포터 문자)는 표적 조직과 배양하기에 앞서 항-RB1 항체 분자로 직접 부착될 수 있다. 다른 방편으로, 비표지된 RB1 항체는 표적 조직 및 RB1 조직 항원과 복합된 RB1 항체에 결합한 검출가능하게 표지된 두 번째 항체의 첨가에 의해 검출되는 항원-항체 복합체와 함께 배양될 수 있다.

종양조직 표본의 특정세포 중의 RB1 단백질의 유무는, 직접적으로는 가시적으로 검출될 수 있는 리포터 분자를 사용하거나, 간접적으로는 방사능 표지물 같은 리포터 분자를 사용하여 시각적으로 표현된 조직단편 상에서 현상된 방사선 사진을 인화함으로서 결정할 수 있다. 그런 다음 RB1 양성 및 음성 종양 세포수를 계수해 RB1 단백질을 발현시키는 종양 세포의 수를 결정한다.

본 발명의 하나의 양태는 RB1 단백질에 결합하는 폴리클로날 항체를 이용하는 것이다. RB1 단백질에 대한 폴리클로날 항체(RB1-AB20)는, 제1도에 도시된 바와 같은 사람의 RB1 cDNA 서열로부터 유래된 단백질 서열의 C-말단에 또는 C-말단 근처에 위치한 RB1 단백질의 친수성 부위에 상응하는 펩타이드 서열로 토끼를 면여화시킴으로서 제조된다. 바람직한 양태에 있어, 23개 아미노산 잔기에 상응하는 합성 펩타이드(이후 P5로 명명)가 제조된다.

세 개의 다른 펩타이드 서열 또한 합성된다. 합성 RB1 펩타이드의 아미노산 서열은 하기와 같이 지정된다.

P2 : HN₂-Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys-Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr-Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys.

P3 : HN₂-Cys-Arg-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly-Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile-Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp.

P4 : HN₂-Cys-Glu-Glu- Ile-Tyr-Leu-Lys-Asp-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp-Lys 및

P5 : HN₂-Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys.

시스테인 잔기는 커플링 목적을 위해 각각의 펩타이드 N-말단에 가한다. 따라서 N-말단 시스테인 잔기는 RB1 단백질 서열의 일부가 아니다.

폴리클로날 및 모노클로날 항체는 RB1 단백질의 유무 또는 변형을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 양태에 있어, RB1 단백질을 검출하기 위한 방법은, 종양 조직 생검으로부터 조직단편을 제조하고, 제조된 조직단편과 함께 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 배양하여 항체-항원 복합체를 형성한 뒤 항원-항체 복합체의 형성을 검출하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 또다른 양태에 있어 RB1 단백질이 결여된 아집단 세포는 상술한 면역조직 화학법을 사용하여 종양 조직내에서 확인할 수 있다.

질환의 진행 단계에서의 종양세포가 망막아종 단백질 결함을 좀더 나타내기 때문에, 상기 방법은 언급한 종양에 걸린 개인에 대한 예후 뿐 아니라 종양세포의 단계를 진단하기 위해 사용될 수 있다.

개인을 위한 통상의 치료 결정은 빈번하게, 특정 예후 변수에 기준한다. 예를 들어, 유방암에 있어서 주요한 예후 인자는 겨드랑이 결절 중 종양의 유무 및 종양세포 중의 호르몬 수용체의 유무를 포함한다. 종종 질환 재발 및 전반적인 환자 생존과 관련된 다른 예후 인자는 1차 병변의 크기, 진단 시점의 질환의 단계를 포함한다. 슬라몬은 HER-2/neu 유전자 증폭이, 임파절과 관련된 것을 제외하고는 다른 어떠한 통사으이 사용기준에서보다 유방암(slamon) 환자의 총생존시간 및 재발까지의 시간 양자의 대한 예언체로서 더 높은 예후치를 가짐을 가정했다[참조문헌 : Science 235 : 177 (1987)].

본 발명의 방법은 매우 다양한 종양의 단계 및 정도를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 결함이 망막아종, 골육종, 섬유육종, 유방, 난소, 방광, 폐, 경부의 암 및 연조직 육종 중에 발견된다. 이들 모든 종양은 DNA 수준에서 RB 유전자 결함이 있고 어떤 것은 변형되거나 결함이 있는 망막아종 유전자와 연관된 아집단 세포를 나타낸다. 따라서, 검출가능한 RB1 단백질의 부재는 이들 종양에 있어서 하나의 확인 기준으로서 사용될 수 있다. RB1 단백질 발현의 손실 정도는 유방암에서의 다른 통상의 방법에 의해 확인되는 바와 같이 종양의 정도가 증가함에 따라 증가하기 때문에, 본 발명은 이러한 종양의 정도 및 단계를 결정하는데 있어서 또다른 기준을 제공한다. 이 방법은 종양 환자를 위한 예후 및 향후의 치료법을 결정하기 위한 추가의 기준을 제공할 것이다.

이제까지 본 발명을 일반적으로 기술했으므로, 하기 특정 실시예를 참조로 더욱 완전한 이해를 얻을 수 있다. 본 실시예는 예시의 목적으로만 제시되었을뿐 특별히 언급하지 않는한 제한의 의도는 없다.

[실시예 1]

RB1 항체 제조

폴리클로날 항체는 개개의 뉴질랜드산 암토끼를 RB1 펩타이드인 P₂, P₃, P₄또는 P₅중 하나로 면역시킴으로서 제조된다. 토끼를 2주 간격으로 추가접종하여 수집된 혈청을 항체의 공급원으로서 사용한다. 펩타이드 P₅에 대해서 생성된 항혈청 RB1-AB20 항체는 IgG 아유형이다. RB1-AB20 항혈청은, 제2도의 라인 1에서 나타나는 바와 같이³²P로 표지된 세포로부터 RB1 단백질을 침전시킨다. 통상의 기술에 의해 정제된 폴리클로날 항혈청의 IgG 분획 또한, 제2도의 라인 2에 나타난 바와 같이 RB1 단백질을 침전시킨다.

본 발명의 하이브리도마는 하기에서와 같이 제조된다. Balb/c 마우스에 PBS 중에 용해시킨 실험 펩타이드 200mg을 비장내로 직접 주입시킨다. 면역화된 동물을 3일 후 참수시켜 비장세포를 회수한다. 비장세포(10⁸)를 50% 폴리에틸렌 글리콜(PEG 4000) 0.8ml 중의 마우스 골수종 NS-1 세포(10⁷)와 2분 동안 혼합한다. 교반되지 않게 1분 동안 정지시킨 후, 세포를 20% 태송아지 혈청을 함유한 HAT(히포크산틴-아미노프테린-티미딘) 배지 70ml 중에 재현탁시킨다. 그런 다음 세포를 96개월 배양 디쉬에 도말시키고 습 CO₂대기 중에서 37℃에서 배양시킨다. 양성 하이브리도마 콜로니를 RB1 항체 생성 하이브리도마 세포를 검출하기 위해 면역화 항원을 사용한 ELISA 기술에 의해 스크리닝한다. Elisa 양성 콜로니는 연속 희석물에 도말시키고 Elisa 시험을 반복한다. 여러 주기 후, 양성 하이브리도마 세포주를 Balb/c 마우스내로 복막내 주입시켜 복수액으로서 성장시킨다. 복수액은 하이브리도마의 공급원으로서 사용된다. RB1-MAbP₂로 지정된 것을 포함한 여러 세포주가 RB1 항체를 생성시켜 종양조직의 면역조직화학적 염색에 대해 유용함이 밝혀졌다. 하이브리도마 세포주는 액체 질소내에서 보존된다.

RB1-MAbP₂로 명명된 하이브리도마 세포주는 기탁기관[American Type Culture Collection(ATCC). Rockville. Md., U.S.A]에 1989년 3월 31일 기탁번호 제 HB10093호로 기탁되었다. 기탁물은 미합중국 및 본원에 상응하는 출원이 출원된 미합중국 이외의 국가의 특허법 및 규칙에 따라 입수용이하다. 본 발명에 대해 허여된 특허를 훼손하거나 또는 본 출원을 분할 또는 연속 출원하여 기탁물을 용이하게 입수할 수 있다는 것은 본 출원의 발명을 실행할 수 있는 허가를 얻는 것은 아니다.

[실시예 2]

RB1 단백질의 면역조직화학적 위치측정

RB1 단백질의 유무 및 RB1 유전자 유무의 상호관련성은 본 발명의 RB1 항체를 사용하여 설명할 수 있다. RB1 유전자 양성 유방암 세포주인 세포주 SW613 및 RB1 유전자 음성 유방암 세포주인 MDA-MB 468을 포함하는 조직배양세포를 20% 태송아지 혈청 및 0.1% 페니실린/스트렙토마이신 용액을 보충한 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 배양시킨다. 세포를 냉 PBS로 2회 세정한다. 세포를 95% 에탄올 중의 5% 아세트산으로 4℃에서 6분 동안 고정시킨다.

냉 PBS 중에서 2회 세척한 후, 비-특이적 결합은 세포를 1% 정상 말의 혈청, 3% BSA 및 0.2% 트리톤 x-100을 함유하는 PBS와 함께 배양시킴으로써 차단된다. 그런 다음 고정된 세포를 냉 PBS로 세정시켜 PBS 중에 희석된 특이적 RB1-MABP 상증액(1 : 10)과 함께 37C에서 1시간 동안 배양한다. 그런 다음 세포를 냉 PBS, 1% 트리톤 x-100 함유 PBS, 최종적으로는 PBS로 연속적으로 세척한다.

RB1 항체의 세포로의 특이적 결합은 세포를 비오틴화된 항-마우스 IgG 항체(PBS 중에 1 : 200 으로 희석된)와 함께 37℃에서 한시간 동안 배양시킴으로서 가시화 된다. 세포를 냉 PBS로 3회 세척한 후, 세포를 ABC 시약(아비딘 : 비오틴 복합체 avidin : biotin complex)과 함께 37℃에서 30분 동안 배양시킨 후 냉 PBS로 세척한 뒤 새롭게 제조된 DAB(3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드) 용액과 함께 실온에서 4분 동안 배양시킨다. DAB 용액은, 0.3% 나트륨 아지드 및 과산화수소 0.03%를 함유하는, 0.05M 트리스-HCl (pH 7.6) 10ml 중에 DAB 6mg을 용해시킴으로서 제조된다. 그런 다음 세포를 증류수로 세척하고 염색된 세포를 현미경 검경에 의해 분석한다. 그 결과는 제3a도 및 제3b도에 도시되어 있다. 폴리클로날 항체 RB1-MAb20은 RB1 유전자에 대해 양성으로 공지된 SW613 세포주의 모든 세포를 염색시킨다(제3a도). 항원-항체 복합체 형성은 RB 음성 세포주 MDA-MB468의 배양된 세포 중에서는 검출되지 않는다(제3b도).

유방암 조직내의 RB1 단백질의 발현 부재를 검출하기 위한 본 발명의 RB1 항체의 능력이 또한 시험되었다. 염색 과정은, 당해분야의 숙련가들에게 공지된 어떠한 통상 기술에 의해 제조된 조직단편을 이용할 수 있다. 예를 들어, 유방조직내 RB1 단백질 유무를 검출하기 위해 사용된 면역염색 방법은 파라핀 단편 또는 냉동 단편을 사용하여 수행될 수 있다. 파라핀 삽입된 조직 단편은 크실렌을 5분 동안 접촉시키고, 각각 100% 에탄올을 5분간 2회 교환하고, 70% 에탄올을 5분 동안 및 50% 에탄올을 연속적으로 접촉시킴으로서 탈파라핀화하고 수화시킨다. 그런 다음 이들을 PBS 중에서 5분 동안 세정한다. 그후 단편을 PBS 함유 10% 정상 염소 혈청과 30분 동안 배양시킨다. 그런 다음 단편을 PBS 중에 1 : 80 으로 희석된 RB1 항체와 함께 4C에서 밤새 배양시킨다. 조직단편을 완충용액 중에서 10분 동안 세척한 후, 희석된 비오틴화된 2차 항체 용액과 함께 60분 동안 배양시킨다. 2차 항체는 마우스 lgG에서 유도된 항체이다. 2차 항체상의 검출가능한 표지의 사용은 조직화학적 방법중에 비표지된 RB1 항체의 사용을 허용한다. 조직단편을 완충용액중에서 10분 동안 세척한 후, 단편을 ABC 시약과 함께 30분간 배양시킨다. 조직단편을 PBS 중에서 10분 동안 세척시킨 후, 단편을 퍼옥시다제 기질 용액중(DAB)에서 10 내지 20분 동안 배양시킨다. 조직단편을 수중에서 5분 동안 세척한 후, 마이어 헤말람(Mayer's haemalum)으로 대조염색하면 현미경 분석에 앞서 일어난다.

하나의 바람직한 양태에 있어, 유방 조직 생검 냉동 단편(6 내지 8㎛)을 -20℃의 저온조 장치 내에서 절단하고 아세톤 중에서 2분 동안 실온에서 후-고정시킨 뒤 페리오데이트-리신-파라포름알데히드(pH 7.4)로 4℃에서 8분 동안 처리한다. 비-면역 돼지 혈청(인산염 완중액 염수 중에 1 : 5로 희석됨, pH 7.2; PBS)으로의 비특이적 결합을 10분간 차단시킨 후, 조직 단편을 RB1-Ab20(PBS로 1 : 100 희석)과 함께 60분 동안 실온에서 배양시킨 후, 세정한다. 그런 다음, 비오틴화된 돼지의 항-토끼 면역 글로불린 항혈청을 적용시킨 뒤, 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합제를 적용시킨다. 퍼옥시다제는 디아미노 벤지딘-과산화수소 반응을 사용하여 위치측정 된다. 핵이 마이어 헤말람으로 명료하게 대조-염색된다.

본 발명의 영역 또는 개념에 영향을 주지 않고 고정화 방법이 다양할 수 있음은 명백하다. 어떠한 고정화 방법도 동일 반응계의 RB1 단백질을 보존하기에 적합하다면 사용될 수 있고 RB1 단백질 부위로 RB1 항체의 도입을 허용한다. 고정화 방법이 또한 RB1 항체의 RB1 항원으로의 결합을 방해하지 않아야만 한다.

[실시예 3]

유방암의 정도 및 단계와 RB1 단백질의 감소된 검출과의 상호관계

종양 생검을 사용하여 수득한 DNA 탐침 자료를 해석하는데 있어 주요문제는 사용된 조직표본의 이질성이다. 표준 조직학적 분석에 의한 생검중 종양 세포 %의 지적이 가능한 반면, DNA 제조를 위해 사용된 표본내에서 종양 세포의 비를 확실히 하기가 어렵다. 연구된 대부분의 표본은 50% 이하의 종양세포를 가지고 나머지는 간질 세포, 임파구 및 그 이외의 것으로 이루어진다. 따라서 종양세포 50% 중의 하나의 RB1 대립형질의 결실은 전체 하이브리드화 신호에 있어서 12.5% 만의 감소를 나타낸다. 따라서 이러한 수준의 RB1 상실된 종양 생검의 비율은 기술의 한계로 인해 DNA 탐침 분석에 의해 간과될 수 있다.

종양 조직 단편내에서 본 발명의 RB1 항체를 사용한 면역조직화학적 검출은 RB1 단백질 유무의 보다 민감한 검정을 제공한다. 정상 유방, 양성 섬유 낭유포 유방 및 섬유선종 표본을 포함하는 유방조직을 항체 RB1-Ab20을 사용하여 염색하면 특히 핵 염색이 현저하게 나타나며 유방내 모든 상피세포의 균질한 염색이 나타난다. 제4a도는 정상 유방 소엽의 상피에 있어서의 핵 및 세포질 염색 패턴이다(흰색 화살표). 근상피세포 및 간질 세포는 RB1-Ab20과 반응하지 않아 음성으로 나타난다(검정색 화살표). RB1 단백질의 핵 위치 측정은 SV40 거대 T 항원 같은 핵 단백질 중에서 발견되는 특징적 핵 위치 측정 신호인 일련의 아미노산(PKKK 또는 Pro-Lys-Lys-Lys-) 배열이 나타나는 것과 일치한다. 따라서, 모든 유방 상피세포는 정상적으로 RB1을 발현시켜 명백하게 검출될 수 있는 수준의 단백질을 제공한다.

RB1 구조체에 대한 DNA 분석에 의해 조사된 77개 암종 표본 중에서 실시예 2에서 기술한 바와 같은 면역 조직화학적 분석을 56개에 대해 실시한다. 이들 암종 표본 중 40개에서, 모든 종양세포가 염색강도에서는 야간의 변화를 나타내면서 핵 반응성을 나타낸다. 제4b도는 필수적으로 모든 종양세포 핵이(화살표) 염색강도에 있어 적은 변이로 반응하는 암종의 전형적인 염색 패턴을 도시한다. 주변의 간질 세포(S)는 RB1-20 항체와의 반응성의 어떠한 증거도 나타내지 않는다. 나머지 16개 암종 표본에서는, 비염색된 종양세포의 다양한 비율이 나타난다. 이 중 11개는 RB1 유전자에 대한 변이를 나타내고(표 1), 염색된 종양세포의 비율은 RB1이 가장 현저히 상실된 종양 표본(410Ca, 제4c도)에서는 5% 이하로부터 이외의 경우에서는 95% 세포 반응성의 범위를 나타낸다. 제4c도에서, 환자 410으로부터 취한 종양 단편의 염색 패턴은 소그룹의 종양세포가 RB1 항체와 반응(화살표)하는 반면 나머지 종양세포는 음성임을 도시한다. 이것이 암종에서의 염색의 주영역이다. 대부분의 암종에 있어 염색된 종양세포의 비와 RB1에 대한 상실 또는 재배열의 수준 사이에는 명백한 관련이 없다. 비반응성 핵의 분포는 종양 세포의 소그룹이거나 섬(예, 덩어리)으로서, 또는 종양 전체를 통해 흩어진 세포로서 나타난다. 후자 패턴이 반응성이 최소한의 손실을 보이는 종양에 있어 우세하다.

RB1에 대해 뚜렷한 변이를 보이는 하나의 암종(602 Ca)에서만 RB1-Ab20에 대한 반응성의 상실의 증거를 나타내지 않는다. 이 종양으로부터의 DNA 분석은 RB1 DNA 탐침을 사용한 결실 및 재배열(두번째 RB1 DNA 탐침을 사용하여) 둘다를 나타낸다. 따라서 이같은 두 변이는 정상 대립형질로부터 정상 RB1 단백질의 생성을 허용하는 동일 대립형질을 포함하는 것 같다.

RB1 유전자에 대한 검출가능한 변이가 없는 5개 표본 중에는, 검출가능한 RB1 단백질이 결여된, 즉 비염색된 표본내에 종양세포가 있다. 이중 4개에서는, 단편 내 종양세포 총수의 5% 이하가 비염색되지만 한 경우에 있어서는, 세포의 50%가 RB1 단백질에 대해 음성이다(표 1). 이 표본은 RB1 발현에 음성인 적어도 어느 정도의 세포를 지닌 종양의 %를 29%로 나타낸다.

달리 명시하지 않는한 모든 표본은 침윤성 관상암이다.

Tub, 관상암(tubular carcinoma).

지시된 것을 제외하고 모든 표본은 정상 RB1 게놈 구조를 나타낸다.

-, RB1 결실 : R, RB1의 재배열.

이 컬럼의 숫자들은 RB1-특이적 항체와 반응하는 단편내 종양세포의 %를 나타낸다.

질환의 단계는 공지되어 있지 않았으나 결절(node)도 관련되지 않는다.

질환 단계는 공지되어 있지 않으나 결절-양성이다.

환자는 이전에 유방암(양쪽 유방)이 있었다.

이와 같은 사실로부터, 원발성 유방암 세포 내의 RB1 발현에 대해 수득된 자료는, 종양세포에서 RB1 DNA의 검출가능한 손실 뿐 아니라 RB1 단백질 발현에 의해 측정된 기능의 손실 또한 있음을 보여준다. 또한, 조직단편내에서 RB1 단백질을 검출하기 위한 RB1 항체의 사용은, RB1 기능에 있어서의 손실의 검출이 검출 가능한 유전자 변이의 손실보다 더 빈번함을 보여준다. 따라서 이런 상황에서의 조직 단편의 RB1 항체 염색은 매우 가치있다.

본 발명의 항체를 이용함으로써, RB1 유전자 및 유전자 기능에 대한 변이는 종양의 정도 및 단계 뿐 아니라 특정 종양 유형과도 상호관계가 있다. 검출가능한 유전자 결실은 등급 1 종양(관상암) 하나에서만 관찰되었고 단계 1 종양에서는 관찰되지않는다. 일반적으로, RB1에 대한 유전 변화의 빈도는 종양의 분화가 적을수록, 확산의 정도에 따라 증가한다(표 2). 마찬가지로 종양세포내의 RB1 단백질 발현의 손실은 또한 보다 더 진행된, 분화가 덜 된 종양과 상호관계가 있다(표 2). RB1 유전자의 변이 또는 결실이 진행된 질환과 관계있기 때문에, 비록 유전자 변이 또는 RB1 단백질 발현의 상실이 단기간(24개월 미만) 예후와 상호관계가 없음에도 불구하고, 질환 없는 간격 또는 5년 생존과의 상호관계는 장기간 수집된 자료를 이용할 때 명백해진다.

등급 Ⅰ 종양이 최대이고, 등급 Ⅲ 종양이 최소, 즉 분화된 종양이다. 위치 측정된 종양만이 제조될 때는 질환은 단계 1이고, 만일 종양이 존재하고 국부 임파절이 포함되면 단계 2이다. 단계 3은 피부 계목(국부적 침투)을 갖는 거대종양의 존재를 지시하고 단계 4 질환은 종양과 더불어 전이를 나타내는 단계이다.

본 명세서에 보고된 자료는, RB1 기능의 상실이 사람 유방암 진행에 있어 중요함을 지적한다. 망막아종, 골율종 및 섬유육종 환자로부터의 증거는, 유전자 기능의 상실이 종양 생성에 있어 매우 중요함을 지적해준다.

당해 분야의 숙련가라면 본 발명을 응용하도록 쉽게 인식해 대상물로 실행하여 고유성질 뿐 아니라 언급한 결과 및 이점을 수득할 것이다. 본 명세서에 기술한 항체, 방법, 절차 및 기술은 바람직한 양태의 표현으로서 제시되거나 또는 사례적으로 의도되었고 본 발명의 영역을 제한할 의도는 아니다. 이의 변화 및 다른 용도는 당해 분야의 숙련가에게 나타날 수 있으며 본 발명의 개념내에 포함되거나 첨부된 특허청구범위의 영역에 의해 제한된다.

Claims (7)

1. 망막아종(RB1) 유전자에 의해 암호화되는 RB1 단백질의 펩타이드 부위 Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys에 대해 유도되는 모노클로날 항체.
2. 망막아종 유전자에 의해 암호화되는 RB1 단백질의 펩타이드 부위 Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-Asp-Glu-Ala-Asp-Gly0Ser-Lys에 대해 유도되는 모노클로날 항체를 생성하는, ATCC에 HB10093의 기탁번호로 기탁된 쥐의 하이브리도마 RB1-MabP2.
3. 제2항의 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체 RB1-Mab20.
4. 제1항 또는 제3항의 항체 또는 제2항의 하이브리도마를 포함하는 종양의 진단 및 진행 예후를 예측하기 위한 키트.
5. 제4항에 있어서, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 경부암 및 연조직 육종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 예후를 예측하기 위한 키트.
6. 제4항에 있어서, 망막아종, 골육종 및 섬유육종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종양 예후를 예측하기 위한 키트.
7. 제1항 또는 제3항의 항체 또는 제2항의 하이브리도마를 포함하는,세포내 RB1 단백질 결핍을 검출하기 위한 키트.

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