CN1046759A

CN1046759A - 成视网膜细胞瘤基因产物抗体及其用途

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Publication number: CN1046759A
Application number: CN90101899A
Authority: CN
Inventors: 袁凯峰; 安妮·唐
Original assignee: RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION
Current assignee: RESEARCH DEVELOPMENT FOUDATION; Research Development Foundation
Priority date: 1989-03-31
Filing date: 1990-03-31
Publication date: 1990-11-07
Also published as: CA2013544A1; IL93941A; IL93941A0; NO901461D0; EP0390530B1; KR900013987A; AU638238B2; JPH04193900A; KR0175658B1; AU5246190A; IE901179L; ATE122723T1; NO179328C; DE69019410D1; PT93619A; FI901618A0; NO901461L; IE63277B1; NZ233147A; DE69019410T2

Abstract

本发明公开了一种通过测定在肿瘤中成视网膜细胞瘤基因产物存在与否而决定对癌症患者预测的方法，并提供了能专一性地与成视网膜细胞瘤蛋白的亲水C端结合的抗体。

Description

本发明涉及肿瘤细胞检测领域，由成视网膜细胞瘤基因（RB1）编码的蛋白的抗体，检测肿瘤中RB1蛋白的方法，及在成视网膜细胞瘤基因有缺陷的不同肿瘤及细胞中诊断肿瘤发展的方法。

在某些癌中的肿瘤发展被认为是突变引起一个或多个隐性肿瘤抑制基因暴露的结果。两种儿童患的癌即成视网膜细胞瘤及维尔姆斯瘤为这类癌的原型。成视网膜细胞瘤是一种少见的眼癌，发生频率约为20，000成活出生儿中一个。成视网膜细胞瘤以遗传病和散发病两种状态出现，其中大约40%的病例是遗传性的。细胞遗传学的研究表明涉及成视网膜细胞瘤的染色体区域为13q 14。最近成视网膜细胞瘤基因（RB1）已被克隆及测序。在至少40%的初级成视网膜细胞瘤中，RB1有明显的结构异常，异常的类型包括整个基因的缺失，更小一点的内缺失，易位及点突变。

临床上，成视网膜瘤存活病人有显著增加的危险得其它特定的原发肿瘤，主要是骨肉瘤，更少发生的为纤维肉瘤，也可能为黑色素瘤。另外，未受影响的家族成员比预期的更常得其它癌，这些癌可为各种各样类型。成视网膜细胞瘤患者的DNA二级结构分析表明RB1基因的两个等位基因均有明显的异常。而且，从无成视网膜细胞瘤历史的纤维肉瘤及骨肉瘤患者分离得的DNA也表明有RB1基因的缺失。因此，RB1基因功能的丧失可能在人类癌形成中有全面的作用。

RB1基因功能的丧失与成视网膜细胞瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤、乳房癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌及软组织肉瘤有关。在13%初级小细胞肺癌（SCLC），及在18% SCLC细胞系中也已检测到结构异常。更显著的是，在60% SCLC细胞系中，没发现有RB1 mRNA。SCLC与成视网膜细胞瘤相似，也是一种神经内分泌源生的肿瘤。在初始的乳房癌中，也已常检测到RB1基因的畸变。在两种肿瘤类型中包含RB1基因表现出的神经内分泌分化的表型性质可能是有意义的。虽然乳房癌不是神经内分泌起源，但它们也可表现强烈的家族倾向，有些家族显示出一种很强烈的遗传组分。有证据表明，患骨肉瘤和软组织肉瘤的儿童的母亲患乳房癌的可能性更高，但没有直接的证据表明乳房癌与成视网膜细胞瘤有任何联系。

RB1基因产物（RB1蛋白质）的结构已从RB1 cDNA序列分析推得。RB1最长的阅读框架编码一个928氨基酸的蛋白质。在对trypE-RB融合蛋白的抗血清中，一具有明显的110，000到114，000道尔顿的分子量的蛋白质发生免疫沉淀。此RB融合蛋白为磷蛋白。由合成寡肽或细菌表达的多肽制备的抗血清与约105千道尔顿的蛋白质发生免疫沉淀反应，此蛋白质被认为是RB1蛋白质的天然形。

为RB1蛋白质编码的cDNA顺序（在图1中显示）揭示了蛋白质中609-615位点处存在一段伸长氨基酸（VRSPKKK），它让人想起SV40与多瘤病毒（Polyoma）的大T抗原中发现的核易位信号。这暗示RB蛋白质为核蛋白。依次通过免疫染色法，及通过对应核及核部分的细胞组分的分级分离及亚细胞定位，已检测到RB1蛋白。

运用DNA探针和DNA杂交分析，可获得以上所述RB1基因中改良的检测。这种技术对本技术领域普通人员是已知的，在同期的美国专利，其申请日为1988年10月31日，申请号为07/312，777中已专门描述。

由于用来进行DNA杂交技术的DNA制剂中是否存在在RB1基因中有缺陷的单个细胞，是不能检测到的，因此用DNA杂交技术检测基因畸变受到它的敏感性局限。另外，DNA杂交测试很费时间，因此，用DNA杂交技术检测RB1基因的存在与否为获得结果所需的时间所妨碍。

直到现在，还没有一种在肿瘤组织样本中检测RB1基因畸变的灵敏、专一且快速的方法。我们需要这种方法，以获知功能性RB1基因的存在与否，这样可估测成视网膜细胞瘤患者的预后情况，及决定治疗方案。

本发明的一个目的是提供一灵敏的方法，来检测成视网膜细胞瘤基因有改变的肿瘤。本发明的另一个目的是提供多克隆抗体用以检测成视网膜细胞瘤基因的蛋白产物（RB1蛋白）。本发明的一个进一步目的在于提供检测RB1蛋白的单克隆抗体。本发明的附加目的是提供产RB1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤。

本发明的进一步目的在于提供一种另外的方法测定从由成视网膜细胞瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，乳房癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，子宫颈癌，及软组织肉瘤构成的组中选出肿瘤的各种级别和时期。所有这些肿瘤均显示与改变的或有缺陷的成视网膜细胞瘤有联系的细胞的亚群。

本发明的进一步目的在于提供附加的标准，以确定各种肿瘤的级别和时期，因而可帮助估测肿瘤患者的预后及将来的治疗方案。

为达到前述的目的，依据本发明的一个方面，发明人提供一种与RB1蛋白结合的多克隆抗体。也提供一种单克隆抗体，它是由鼠杂交瘤产生的，与RB1蛋白有专一的免疫反应。

在另一实施例中，提供了检测RB1蛋白的一个方法，它的步骤包括：从肿瘤组织制备组织切片，将所述切片与抗体（多克隆的或是单克隆的）一起孵育，形成抗体-抗原复合物，检测形成的抗原-抗体复合物的组成。

本发明的另一个实施例提供检测与肿瘤有关的细胞亚群的方法，肿瘤可以是骨肉瘤，纤维肉瘤，黑色素瘤，乳房癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌，子宫颈癌及软组织肉瘤，还提供诊断及测定患这些肿瘤的个人的预后情况。此方法包含对肿瘤进行活组织检查，从活组织检查肿瘤组织中制备组织切片，将制备的组织切片与本发明的RB1单克隆或多克隆抗体一起孵育，使抗体与组织专一性结合，形成抗体-抗原复合物，检测抗体-抗原复合物的组分。

本发明在检测成视网膜细胞瘤基因产物（RB1蛋白）有缺陷的各种肿瘤，及估测肿瘤患者的预后及未来治疗方案上很有用处。

在本发明以下的优先实施例的描述中，将说明本发明的其它的目的，特征和优越性，实施例与附图结合一起，用以公开本发明。

根据以下的文本及参考附图，可更易理解本发明，下面是对附图的简要描述。

图1显示RB1 cDNA顺序，包含紧接5′cDNA的部分基因组顺序。ATG密码示中的A残基被定为位点1。在每个编码顺序下显示最长阅读框架的氨基酸。

图2证明用多克隆抗血清RB-AB20和从RB-AB20纯化的IgG分部与标记的RB1蛋白沉淀反应。

图3证明用单克隆抗体RB-MAB20对RB1阳性细胞系（SW613）和RB1阴性细胞系（MDA-MB468）的免疫组织化学染色。

图4显示用免疫组织化学法检测人乳房组织中的RB1蛋白。所有图片放大X250。

附图不必以比例画出，为清晰和精确起见而用图解形式或比例画可能会夸大本发明的某些特征。

对于本技术领域的一般技术人员来说，很清楚地能看到，在不违背本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明做各种替代和修饰工作。

抗原为化合物，能引起一种免疫应答关系，并伴随产生能以某些专一性与靶抗原反应并结合的抗体。抗体探针抗诸如病毒或其特定决定簇的抗原是专一的，这是本技术领域的那些熟练人员是熟知的，这些抗原来自于不同来源的多肽和蛋白质，碳水化合物部分及各种生物高聚物，制备这种抗体的一般方法对本技术领域的熟练技术人员也是熟知的。

简要地说，可以通过用由RB1基因编码的肽序列免疫接种在一种动物宿主上以获得多克隆抗体。更好的是，抗原是位于或靠近RB1蛋白亲水c端的肽序列，每周给宿主皮下注射抗原，在一个月后用加强剂量。随后，从宿主收集血清，贮存以供以后用。RB1多克隆抗血清可直接用于本发明的免疫组织化学步骤中。可供选择地，可据本技术领域的熟练技术人员知道的方法将RB1抗体从血清中沉淀下来，以更浓缩的状态应用，或者，可通过亲合技术纯化抗体，以纯净的形态应用。抗体也可用本技术领域的熟练工作人员所知的方法加以易检测的标记，这在下面进一步讨论。

来自免疫供体的骨髓瘤细胞和脾细胞之间的融合已证明是衍生同源抗体的成功的方法。因此，发展了遗传上稳定的杂交瘤细胞的连续细胞系，能产生对抗各种抗原的大量单克隆抗体。根据Koprowski等人的美国专利第4，172，124号，可由体细胞杂种生产对恶性肿瘤有特异性的抗体，这些杂种体细胞是通过先前已接触肿瘤细胞的动物衍生的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺损骨髓瘤细胞与脾或淋巴细胞。同样，根据Koprowski等人的美国专利第4，196，265号，已开发了遗传上稳定的融合细胞杂种的连续细胞系，该细胞系能生产对抗特定病毒及它们抗原决定簇的大量单克隆抗体。

这种细胞融合技术也可用于提供可靠且标准的抗RB1抗体供应品。根据本发明，采用肽序列免疫动物获得表达抗RB1抗体的新颖连续杂交瘤细胞系，这些肽序列对应于在或邻近RB1基因产物亲水c端的氨基酸序列，偏爱从图1中显示的P2、P3、P4或P5 RB1肽构成的组中选出的合成序列;从免疫动物来的产抗体细胞与骨髓瘤细胞之间形成融合杂种细胞;克隆杂种细胞和选择表达抗RB1抗体的克隆。更特定的是，将纯化的RB1抗原注射入鼠或其它动物中，然后将动物脾的产抗体细胞与鼠的癌细胞或骨髓瘤细胞融合。这样形成的杂种细胞产生其脾细胞亲代的抗RB1抗体分子，并象其亲代骨髓细胞一样，连续生长及分裂。选择产这种抗体的细胞克隆，象连续的细胞系一般生长，从其中可收获大量抗RB1抗体。下面进一步讨论被命为RB1-MABP₂的这样一个克隆。

换一种方法，可将克隆杂种细胞注射入组织相容性动物，在那儿细胞增殖，所产的高水平的抗RB1抗体，可在动物腹水中获得。

因此，本发明可得到相当大规模的抗RB1抗体的可靠且标准的供应品，用于免疫组织化学检测RB1蛋白的表达，或换一种方法，在肿瘤样本中无RB1蛋白表达，而无此蛋白是与特定类型肿瘤及其级别和时期有联系的。所制备的单克隆抗体也可用本技术领域的熟练技术人员熟知的方法标记。

能检出的标记可以是具有可检出的物理或化学性质的任何物质。在免疫测试领域，已发展了许多此种可检出的标记，且一般来说，任何在此方法中有用的标记都可用于本发明。尤其有用的是酶学上活性基因，如酶（例如碱性磷酸酯酶，及过氧化物酶）（参见Clin Chem.，22∶1243（1976））;酶底物（参见British Pat Spec 1，548，741）;辅酶（参见美国专利第4，230，797及4，238，565号）;及酶抑制剂（参见美国专利第4，134，792号）;荧光剂（参见Clin Chem.，25∶353（1979））;生色基因;发光剂像化学发光剂及生物发光剂（参见Clin Chem.，25∶512（1979））;及放射性同位素。常用的可检出的放射性标记包括，但不局限于³²P，¹⁴C，¹²⁵I，³H及³⁵S。在用抗生物素蛋白/streptavidin，荧光，酶学的或胶态的金结合物杂交后，检测生物素化的探针。抗体还可用其它荧光化合物，免疫可检测的荧光衍生物或生物素类似物来标记。还可利用间接荧光免疫细胞化学实验步骤。

为检测抗原-抗体复合物的形成，利用一种可检出的标记。可在与靶组织一起孵育前，将可检出标记（或报告分子）直接接到抗RB1抗体分子上，另一种方法，将未标记RB1抗体与靶组织一起孵育，加入第二个，可检出标记的抗体来检测抗原-抗体复合物，该抗体与已复合RB1组织抗原的RB1抗体结合。

用肉眼可检出的报告分子可直接测定肿瘤组织样本中特定细胞中RB1蛋白存在与否，或者间接地用报告分子如放射性标记，和在组织切片的可见部分上重叠显现的放射自显影测其存在与否。然后可计数有及无RB1的肿瘤细胞，以确定表达RB1蛋白的肿瘤细胞数。

本发明的一个实施例应用一与RB1蛋白结合的多克隆抗体。用对应于由图1显示的从人RB1 cDNA顺序推出的在蛋白顺序的c端或其附近的RB1蛋白的亲水部分的序列的肽对兔子免疫接种，从而制备抗RB1蛋白的多克隆抗体（RB1-AB20）。在一优先实施例中，制备对应于23个氨基酸残基的合成肽（此后命名为“P5”）。

还合成另外三个肽序列。合成的RB1肽的氨基酸顺序如以下标示：

P2：HN₂-Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys-

Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr-

Ser-Asn-Lys-Gln-Glu-Lys

P3：HN₂-Cys-Ary-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly-

Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile-

Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp

P4：HN₂-Cys-Glu-Glu-Ile-Tyr-Leu-Lys-

Asp-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg-

Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp-Lys

及

P5：HN₂-Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-

Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-

Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys

为了连结给每个肽的N端加上半胱氨酸残基，因此N端半胱氨酸部分不属RB1顺序部分。

多克隆及单克隆的抗体可用来检测RB1蛋白的存在与否，有否改变。在一实施例中，检测RB1蛋白的方法包括以下步骤：从肿瘤组织活组织检查中制备组织切片，将单克隆或多克隆抗体与制备的组织切片一起孵育，形成抗体-抗原复合物，然后检测抗原-抗体复合物的形成。

在本发明的另一个实施例中，用以上所述的免疫组织化学方法检测肿瘤组织中RB1蛋白有缺损的细胞亚群。

因为越是处在疾病的进展时期，肿瘤细胞显示越多的成视网膜细胞瘤蛋白缺损，所以，可用此方法来诊断肿瘤细胞所处的时期，还可用来预测患该肿瘤的病人的预后情况。

现在对病人的治疗方案经常是根据特定的预后参数来决定的。例如，对乳房癌的主要预后因子包括在腋下结中肿瘤的有或无，在肿瘤细胞中激素受体的有或无。其它预后因子常与疾病复发及所有病人存活率包括诊断时初次损害的大小及疾病所处的时期有关。Slamon提出HER-2/neu基因扩增，作为乳房癌病人中总的存活时间及复发时间的预测因子比任何传统标准除淋巴结以外具有更大的预后价值。（Science 235∶177（1987））。

本发明的方法可被用来估测多种肿瘤的时期和级别。例如，在成视网膜细胞瘤，骨肉瘤，纤维肉瘤，乳房癌、孵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌及软组织肉瘤中均发现缺陷。所有这些肿瘤均有在DNA水平上RB基因的缺损，有些还表现有改变或缺损的成视网膜细胞瘤基因有联系的细胞亚群。因此，可将在这些肿瘤中可检测的RB1蛋白缺失作为一个鉴别指标。因为在乳房癌中，发现随着用其它传统方法测出的肿癌级别的渐进，缺失RB1蛋白表达的程度也加重，所以，本发明提供了决定这种肿瘤的级别和时期的一个进一步指标。此方法将为决定肿癌患者的预后及未来治疗方案提供附加的指标。

经过上面对本发明的一段描述，再参考下面特定的实施例将使人们更全面地理解本发明。这些实施例是用来阐述而不是限制本发明的，除非特别指明。

实施例1：生产RB1抗体

通过用RB1肽，P2、P3、P4或P5中的一个免疫接种新西兰母兔个体来制备多克隆抗体。兔子每二周加强接种，收集血清作为抗体源。由P5肽引起的抗血清RB1-AB20，用在随后实施例2中所描述的免疫染色步骤中。RB1-AB20抗体是IgG亚型。RB1-AB20抗血清将如图2第1行中显示的³²P标记细胞的RB1蛋白沉淀下来。通过传统技术纯化的多克隆抗血清的IgG部分，也能将如图2第2行中所示蛋白沉淀下来。

根据以下方法制备本发明的杂交瘤。将200毫克溶于PBS的目的肽直接注射入Balb/c鼠的脾中。三天后杀死免疫动物，收集脾细胞。在0.8毫升50%聚乙二醇（PEG4000）中，将脾细胞（10⁸）与鼠骨髓瘤NS-1细胞（10⁷）混合2分钟。不搅动静置1分钟后，在含20%胎牛血清的70毫升HAT（次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶）介质中，再次悬浮细胞。然后将细胞放入96孔培养皿中，在37℃潮湿37℃潮湿CO₂气氛下孵育。通过ELISA技术，用免疫抗原检测产抗体的杂交瘤细胞来筛选阳性杂交瘤克隆，将Elisa阳性克隆连续稀释铺平板，重复Elisa测试方法。在几次重复后，将阳性杂交瘤细胞系注入Balb/c鼠的腹膜内，以腹水形式生长。腹水作为杂交瘤的来源。发现有几种细胞系，包括命名为RB1-MAb P2的，能生产RB1抗体，并且可用来对肿瘤组织进行免疫组织化学染色。杂交瘤细胞系保存在液氮中。

被命名为RB1-MAb P2的杂交瘤细胞系于1989年3月31日保存于美国典型培养保藏中心（ATCC），（Rockville，Md.，U.S.A.），保存号为HB10093。根据美国及此相应专利申请的其它国家的专利法和细则，此保藏物对公众是可以提供的。可得到保藏物并不提供以废除本专利申请及其分支或延续为目的的实施以许可。

实施例2：RB1蛋白的免疫组织化学法定位

用本发明的RB1抗体揭示了RB1蛋白的有无与RB1基因的有无的相关性。组织培养细胞，包括细胞系SW613，一种RB1基因阳性乳房肿瘤细胞系，及MDA-MB468，一种RB1基因阴性乳房肿瘤细胞系，在加有20%胎牛血清及0.1%青霉素/链霉素溶液的RPMⅠ1640培养基中培养48小时。细胞用冷PBS冲洗二次，在4℃在含5%乙酸的95%乙醇中固定6分钟。

用冷PBS洗二次后，通过用含1%普通马血清，3%BSA及0.2% Triton x-100的PBS孵育细胞，阻断非特定的结合。固定的细胞然后用冷PBS冲洗，于37℃，在用PBS稀释（1∶10）的特定RBI-MABP2上清液中孵育1小时。接着细胞按序用冷PBS，含1%Triton x-100的PBS，及最后PBS洗。

通过将生物素化的抗鼠IgG抗体（在PBS中以1∶200稀释）与细胞一起于37℃孵育1小时，可观察到RB1抗体细胞特定性结合。用冷PBS洗三次，将细胞于37℃用ABC（抗生物素蛋白：生物素复合物）试剂孵育30分钟，用冷PBS洗，于室温用新制备的DAB（3，3′-二氨基联苯胺四氢氯化物）溶液孵育4分钟。将6毫克DAB溶于10毫升含0.3%叠氮化钠和0.03%过氧化氢的pH为7.6，0.05M Tris-HCl溶液，制备DAB溶液。细胞然后用蒸馏水洗，用显微镜测定分析染色细胞，结果在图3A和3B中显示。多克隆抗体RB1-MAb20染色所有对RB1基因已知为阳性的SW613细胞系的细胞（图3a）。在RB1为阴性细胞系MDA-MB468的培养细胞中，没有发现有抗原-抗体复合物的形成（图3b）。

还测试了本发明的RB1体检测在乳房肿瘤组织中缺乏RB1蛋白表达的能力。染色步骤可用在由任意一个本技术领域熟练技术人员所知道的传统方法制备的组织切片上。例如，用来检测在乳房组织中RB1蛋白有或无的免疫染色步骤可用于石蜡切片或冻冻切片上。石蜡包埋的组织切片通过依次接触二甲苯5分钟，100%乙醇每次5分钟共二次，70%乙醇5分钟及50%乙醇来脱蜡及脱水。然后它们在PBS中漂洗5分钟。切片然后在含10%普通山羊血清的PBS中孵育30分钟，接着在4℃与以1∶80用PBS稀释的RB1抗体孵育过夜。在缓冲液中洗组织切片10分钟，它们与稀释的生物素化的第二个抗体溶液孵育60分钟。第二抗体是直接抗鼠IgG的抗体。在第二抗体上用可检测的标记允许在组织化学步骤中使用未标记RB1抗体。组织切片在缓冲液中洗10分钟后，与ABC试剂孵育30分钟。组织切片在PBS中洗10分钟后，在过氧化酶底物溶液（DAB）中孵育10-20分钟，组织切片在水中洗5分钟后，在镜检前用Mayer′s haemalum对组织切片复染色。

在一优先实施例中，在-20℃恒冷切片机中得乳房活组织冰冻切片（6-8μm），室温下将切片在丙酮中后固定2分钟，接着用pH为7.4的高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛在4℃处理8分钟。在用非免疫猪血清（以1∶5在磷酸缓冲性盐中稀释，pH为7.2;PBS）阻断非特定结合处理10分钟后，组织切片在室温与RB1-Ab20（以1∶100在PBS中稀释）一起孵育60分钟，然后冲洗。然后用生物素化的猪抗兔免疫球蛋白抗血清，接着是抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物。用二氨基联苯胺-过氧化氢反应来定位过氧化物酶。核用Mayer′s Haemalum短暂地复染。

很明显，在不影响本发明的范围及思想情况下，可对固定方法作改变。适合在原位保护RB1蛋白的任何固定方法可被采用并且允许RB1抗体进入到RB1蛋白的位点，而且，固定步骤还必须是不干扰RB1抗体与RB1抗原结合的。

实施例3 乳房癌级别和时期与检测的RB1蛋白

减少之间的相关性

解释用肿瘤活组织检查得到的DNA探针资料的主要问题在于所用的组织样品的异质性。虽然可以通过标准组织学分析得到在活组织检查中肿瘤细胞的百分数，但是，很难确定在用来制备DNA的样品中肿瘤细胞的比例。不多数所测的样品中的肿瘤细胞少于50%，其余组成部分为基质细胞，淋巴细胞及其它。在50%肿瘤细胞中缺失一个RB1等位基因结果仅引起12.5%杂交信号的总的减少。因此，由于此技术的限制通过DNA探针分析可能忽略在此种水平缺失RB1的肿瘤活组织的比例。

用本发明的RB1抗体在肿瘤组织切片中作免疫组织化学检测，提供了检测RB1蛋白存在与否的更灵敏的方法。在乳房组织中，包括正常乳房组织，良性纤维囊性乳房组织及纤维腺瘤乳房组织样品中用RB1-Ab20抗体染色，显示在乳房组织中所有上皮细胞一致的染色，主要是核染色。图4a显示正常乳房小叶上皮细胞核及细胞质的染色图型（空心箭头）。肌上皮细胞及基质细胞不与RB1-MAb20反应，因此表现为阴性（实心的箭头）。RB1蛋白的核定位与在如象SV40大T抗原核蛋白中发现的核定位信号即一段氨基酸（PKKK或Pro-Lys-Lys-Lys）的特征发现是一致的。因此，所有乳房上皮细胞正常地表达RB1，给出清晰地可检测蛋白质的水平。

在用DNA分析检测77个癌样品中的RB1组织结构时，如实施例2所述的免疫组织化学分析方法用在56个样品上。在这些癌细胞样品中的40个，所有的肿瘤细胞表现出核反应性，在染色强度上略有差别。图4b显示了这些癌的一个典型染色图型，其中基本上所有肿瘤细胞核都有反应（箭头），在染色强度上略有差别。在其质细胞（s）周围，没有与RB1-20抗体反应的痕迹。在剩下的16个癌样品中，有不同比例的未染色肿癌细胞。其中11个显示RB1基因有改变（见表1），在肿瘤样品中染色肿瘤细胞比例范围从低于5%，其中缺乏RB1最明显（410Ca，见图4c），到另一个场合大约95%细胞有反应。在图4c中，病人410的肿瘤切片的染色图型显示少数的肿瘤细胞群与RB1抗体反应（箭头），而其余的肿瘤细胞均呈阴性。这是在癌中染色的主要领域。在大多数癌中，染色的肿瘤细胞比例与RB1缺失及重排的水平之间没有清楚的关系。未反应核的分布可以是肿瘤细胞小群式或岛式（即成簇的），或是细胞散布于整个肿瘤中。在这些肿瘤中占主要地位的后面一种图型显示反应力丧失量最小。

仅有一种具明显RB1改变的瘤（602Ca）没显示丧失同RB1-Ab20的反应力。来自此肿瘤的DNA分析表明使用一个RB1 DNA探针的一个缺失和一个重排（使用一个第二RB1 DNA探针）。看来这二个改变涉及同一个等位基因，使得正常的等位基因可以产生正常的RB1蛋白是可信的。

在5个无RB1基因可测得改变的样品中，在样品中存在缺少可检测的RB1蛋白的肿瘤细胞，即未染色的。其中4个在切片中肿瘤细胞总数的5%或更少未被染色，但另一个有50%的细胞对RB1蛋白是阴性的（见表1）。这些样品使肿瘤中至少有部分对RB1产物为阴性的细胞的百分数达到29%。

表1

患乳房癌且可证明RB1基因改变或缺少表达的病人的详细情况

病人号¹级别时期 RB1基因表达细胞的百分数³

改变²

317 Ⅲ 3 - 95

346 Ⅲ 4 - 60

357 Ⅲ 2 - 95

360 Ⅱ 2 - 50

370 Ⅲ nk - nk

283 Ⅲ 2 - 60

388 Ⅲ 3 - 75

395 Ⅲ 1 - 50

410 Ⅲ 2 - 5

424 Ⅱ 2 - 85

432 nk nk - 70

434 Ⅱ 2 - 95

446 Ⅲ 3 - 95

510 Ⅲ 3 - 25

601 Ⅲ nk⁴- 95

602 Ⅲ ＊ R 100

622 Ⅲ nk⁵R 50

628 Ⅱ nk⁵- 25

FY Ⅱ nk⁴- nk

FW（tub） Ⅰ nk - nk

1.所有样品为浸润管的癌除非另外注明。Tub，为管形癌。

2.所有样品表现正常的RB1基因组组织结构除非那些指明的。-，RB1缺失;R，RB1重排。

3.此栏中的数字表明切片中与RB1专一性抗体反应的肿瘤细胞的百分数。

4.不知道疾病的时期，但不涉及结。

5.不知道疾病的时期，但是结是阳性的。

＊具乳房癌病史的病人（两个乳房）。

综上所述，在初级乳房肿瘤细胞中所得的RB1表达的数据表明在肿瘤细胞中不仅有RB1 DNA的可检出的缺失，而且通过测量RB1蛋白的表达发现有功能的丧失。另外，在组织切片中用RB1抗体探测RB1蛋白表明与测得基因改变变相比，更常测到RB1功能的丧失。因此在此种情况下用RB1抗体来染色是很有价值的。

用本发明的抗体，将RB1基因和基因功能的改变与特定肿瘤类型，及肿瘤的级别和时期联系起来。仅在一个Ⅰ级肿瘤（一种管状癌）中观察到现有一个可检测的基因缺失，在时期Ⅰ肿瘤中没有发现这现象。一般来说，RB1遗传改变频度随着肿瘤分化变差及扩散的程度而增加（见表2）。同样在肿瘤细胞中RB1蛋白质表达的丧失也与更进展的，分化更差的肿瘤有关（见表2）。虽然基因改变和RB1蛋白表达的丧失均与短时间（少于24个月）的预测无关，因为RB1基因的改变与缺失与进展的疫病有关，获得长时间跟踪的数据后，与无疫病间隔或五年生存率的关系可能更清楚。

表2

与组织病理级别或与疫病扩散相比的表达丧失频度的分布。

级别1 带改变基因的带丧失表达的肿瘤

肿瘤的百分数的百分数

Ⅰ 10（n＝10） 0（n＝5）

Ⅱ 17（n＝30） 19（n＝21）

Ⅲ 32（n＝25） 48（n＝23）

时期²

1 0（n＝9） 11（n＝9）

2 33（n＝15） 46（n＝13）

3 29（n＝7） 80（n＝5）

4 50（n＝2） 50（n＝2）

级别Ⅰ肿瘤是分化最好的，程度Ⅲ是分化最差的。如果仅发现一个局限于局部的肿瘤，那么疾病处于时期Ⅰ;如果有肿瘤存在，且在淋巴结中发现，那么是时期2。时期3表明有大肿瘤存在，且有皮肤栓（局部侵染），时期4，有肿瘤且伴有远处转移瘤。

这里报导的数据表明在人乳房癌进展中，RB1功能的丧失是很重要的。从成视网膜细胞瘤，骨肉瘤及纤维肉瘤病人中得的数据表明，此基因功能的丧失对肿瘤的发生是非常重要的。

全个本技术领域的熟练技术人员能容易鉴别本发明，且进行实验并提到所提到的结果和优点，还有此中所包含的内在结果。以上所述的抗体、方法、步骤和技术是作为较佳实施例的代表，或用来举例，并不是用来限制本发明的范围的。对本领域熟练技术人员来说，可据本发明的实质精神或附属权项所述范围对本发明作改变及用作他用。

Claims

1、一种抗体，其特征在于它有与成视网膜细胞瘤基因的产物RB1蛋白专一性结合的亲和力。

2、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体为多克隆抗体。

3、根据权利要求1所述的抗体，其特征在于该抗体是单克隆抗体。

4、权利要求1所述抗体的生产方法，其特征在于它是通过位于在或靠近RB1蛋白顺序的C端的肽免疫接种宿主动物而产生的。

5、根据权利要求4所述的抗体，其特征在于该肽是从下列几组中选出的

HN₂-Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys-

Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr-

Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys，

HN₂-Cys-Arg-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly

Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile

Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp，

HN₂-Cys-Glu-Glu-Ile-Tyr-Leu-Lys

Asp-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg

Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp-Lys，

及

HN₂-Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-

Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-

Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys

6、一种鼠杂交瘤，其特征在于它能产生与RB1蛋白有专一免疫活性的单克隆抗体。

7、根据权利要求6所述的鼠杂交瘤，其特征在于它产生对一种肽顺序有专一结合亲和力的单克隆抗体，

该肽顺序是从下列组中选出的：

HN₂-Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys

Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr

Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys，

HN₂-Cys-Arg-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly

Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile

Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp，

HN₂-Cys-Glu-Glu-Ile-Tyr-Leu-Lys

Asp-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg

Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp-Lys，

及

HN₂-Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-

Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-

Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys

8、根据权利要求7所述的杂交瘤，其特征在于它所产的抗体为RB1-MABp2。

9、一种单克隆抗体，其特征在于它是由权利要求7所述的杂交瘤产生的。

10、一种检测肿瘤细胞中缺乏RB1蛋白的方法，其特征在于它是由以下步骤组成的：从肿瘤中制备组织切片;将包含权利要求1-5或8中的任何抗体与所制备的组织切片一起孵育;及检测所述抗体缺乏与所述组织切片专一性结合的现象。

11、一种检测缺乏RB1蛋白的细胞亚群的方法，其特征在于它是由以下步骤组成的：从肿瘤中制备组织切片;将包含权利要求1-5，或8中任何抗体与所制备的组织切片一起孵育;及检测所述抗体与所述组织切片专一性结合的现象。

12、一种估计癌证患者预后的方法，其特征在于它包含通过权利要求11所述的方法测定缺失RB1蛋白的肿瘤细胞数。

13、一种估计癌证患者预后的方法，其特征在于它包含以下步骤：从所述患者的肿瘤中制备组织切片;将包含权利要求1-5，或8中的任何抗体与所述制备的组织切片一起孵育;检测所述抗体与所述组织切片的专一性结合;胶检测缺失RB1蛋白的细胞数。

14、根据权利要求12所述的方法，其特征在于所说的组织是从由乳房癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌和软组织肉瘤组成的组中选出的。

15、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所说的组织是从由乳房癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、子宫颈癌和软组织肉瘤组成的组中选出的。

16、根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述肿瘤选自由成视网膜细胞瘤，骨肉瘤或纤维肉瘤构成的组。

17、根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述肿瘤选自由成视网膜细胞瘤，骨肉瘤或纤维肉瘤构成的组。

18、一种给癌症患者诊断和预后诊断的方法，其特征在于它是由下列步骤组成：作肿瘤活组织检查;从所述肿瘤组织中制备组织切片;将包插权利要求1-5或8中的任何抗体与所述组织切片一起孵育形成抗体-抗原复合物;及检测形成的抗体-抗原复合物。