PT93619A - Anticorpos para a proteinacodificada pelo gene de retinoblastoma e suas aplicacoes - Google Patents

Description

RESEARCH DEVELOPMENT FOUNDATION "ANTICORPOS PARA A PROTEÍNA CODIFICADA PELO GENE DE RETI- NOBLASTOMA E SUAS APLICAÇÕES"

ÂMBITO DA PRESENTE INVENÇÃO O âmbito da presente invenção refere-se à detecção de células de tumores, anticorpos para as prote^ nas codificadas pelo gene do retinoblastoma (RB1), métodos para a detecção da proteína RBl em tumores, métodos para diagnosticar a progressão do tumor numa diversidade de tipos de tumores e de tipos de células que não possuem o gene do retinoblastoma.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

Sabe-se que em determinados tipos de carcinomas o desenvolvimento do tumor pode resultar do desmascaramento de um ou mais genes recessivos "supressores de tumor", por mutação. Dois carcinomas da infância, o re tinoblastoma e o tumor de Wilm, são os protótipos deste tipo de carcinoma. O retinoblastoma é uma doença ocular maligna rara, que ocorre com uma frequência de, aproxima- damente# um em 20 000 nascituros vivos. 0 retinoblastoma surge quer como uma doença hereditária quer como uma doen ça esporádica# sendo cerca de 40% dos casos hereditários. Estudos citogénicos identificaram a região cromossómica envolvida no retinoblastoma# como sendo a região 13ql4. Recentemente, efectuou-se a clonagem e sequenciação do ge ne do retinoblastoma (RBl). Em pelo menos 40% dos retino-blastomas primários# existe uma clara anomalia estrutural de RB1, incluindo os tipos de anomalia as eliminações do gene completo# eliminações internas mais pequenas# trans-locações e mutações de ponto. Clinicamente# os pacientes que sobrevivem ao retinoblastoma encontram-se numa situação de maior risco de contraírem outros tipos específicos de tumores primários# predominantemente# osteossarcomas# mas menos frequentemente fibrossarcomas e possivelmente melanomas. Para além disso, os membros da família não afe_ç tados desenvolvem outros tipos de carcinomas com mais fre quência do que seria esperado e estes carcinomas podem ser de diversos tipos. A análise do ADN a partir de elementos secundários de pacientes com retinoblastoma demons trou claramente a existência de anomalias em ambos os ale los do gene RB1. Para além disso, o ADN isolado a partir de fibrossarcomas e de osteossarcomas de pacientes sem qualquer história de retinoblastoma também demonstrou a eliminação do gene RBl. Deste modo# a perda de função do gene RBl pode desempenhar uma função geral na oncogénese humana.

Também se associou a perda de função do

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Y gene RB1 com retinoblastomas, osteossarcomas, fibrossarco mas, carcinomas âa mama, do ovário, da bexiga, do pulmão, da cerviz, e com os sarcomas de tecidos moles. Também se detectaram anomalias estruturais em 13% dos carcinomas pri mários de células pequenas do pulmão (SCLC) e em 18% das linhas de células SCLC. Verificou-se, de um modo mais significativo, a perda de mARN RBl em 60% das linhas SCLC; 0 SCLC, tal como o retinoblastoma, é um tumor de origem neuro-endócrina. Também se detectaram frequentes aberrações do gene RBl no carcinoma primário da mama. 0 envolvi mento do gene RBl em dois tipos de tumores que apresentavam propriedades fenotípicas de diferenciação neuro-endócrina, pode ser significativo.

Os carcinomas da mama, não são, todavia, de origem neuro-endócrina, mas podem apresentar uma forte tendência familiar, em algumas familias que apresentam um componente genético muito forte. Embora seja evidente que mães de crianças com osteossarcoma e sarcoma de tecidos moles apresentem uma elevada proporção de carcinomas da mama, não existe evidência directa de qualquer associação entre o carcinoma da mama e o retinoblastoma.

Deduziu-se a estrutura do produto do gene RBl (a proteína RBl), a partir da análise sequencial do cADN de RBl. A sequência de transcrição mais longa, codifica uma proteína de 928 aminoácidos. Utilizando anti-so-ros contra um E-RB tríptico, imunoprecipitou-se uma proteína de fusão de peso molecular aparente compreendido en

tre 110 000 e 114 000 daltons. A proteína de fusão RB é uma fosfoproteína. Os anti-soros preparados contra os oli-gopéptidos de síntese ou péptidos bacterianos expressos, imunoprecipitaram uma proteína de aproximadamente 105 KDalton que se crê ser a forma nativa da proteína de RB1. A sequência de cADN que codifica a proteí^ na RB1 (indicada na Figura 1) revela a presença de uma fai^ xa de aminoácidos na proteína, desde a posição 609 até à 515 (7RSPKKK), que é uma reminiscência do sinal de trans-locação nuclear que se descobriu no grande antígeno T de SV40 e no grande antígeno do polioma. Isto implica, que a proteína RB seja uma proteína nuclear. Detectou-se a proteína RB1 por coloração imunológica e por localização sub celular por fraccionamento dos componentes celulares no núcleo e na fracção nuclear, respectivamente.

Obteve-se a detecção de alterações no gene de RB1 anteriormente expostas, utilizando sondas de ADN e ensaios de hibridação do ADN. Tais técnicas são, ge ralmente, do conhecimento do especialista e encontram-se descritas de um modo específico no pedido de patente de invenção norte-americana Série Ns 07/312 777, depositado em 31 de Outubro de 1988. A utilização de técnicas de hibridação do ADN para detecção das aberrações dos genes é de sensibili dade limitada, uma vez que a presença de células individuais com deficiência do gene RBl não podem ser detectadas nas preparações de ADN utilizadas para se levar a efeito 5 as técnicas de hibridação do ADN. Para além disso# os ensaios de hibridação levam tempo e, deste modo# a detecção da presença ou ausência do gene RB1 por técnicas de hibri dação do ADN são posteriormente impedidas pela quantidade de tempo necessário para se obterem resultados.

Até à data# não existe nenhum método sensível# específico e rápido para detecção das aberrações do gene RB1 em especímenes de tecido de tumor. Um tal método é desejável# no sentido de auxiliar a verificar a presença ou ausência de um gene RB1 funcional e# desse mo do# ter-se acesso ao prognóstico de pacientes com tumor de retinoblastoma# assim como a decisão de um regimem de tratamento.

RESUMO DA PRESENTE INVENÇÃO

Um dos objectivos da presente invenção consiste em proporcionar um método sensível para a detecção de tumores que possuem um gene de retinoblastoma alte rado. Um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um anticorpo policlonal para a detecção do produto proteico do gene de retinoblastoma (proteína de RB1). Um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um anticorpo monoclonal para detecção da pro teína RBl. Um outro objectivo da presente invenção consis te em proporcionar um hibridoma que produza anticorpos mo noclonais para a proteína de RBl.

Um outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um método adicional para a deter minação do grau e da fase de uma diversidade de tumores seleccionados no grupo que compreende retinoblastomas, os teossarcomas/ fibrossarcomas, carcinomas da mama, do ovário, da bexiga, dos pulmões, da cerviz e sarcomas de teci dos moles. Todos estes tumores apresentaram sub-populações de células que se encontravam associadas com alterações ou deficiências do gene do retinoblastoma. & ainda um dos objectivos da presente invenção proporcionar um critério adicional para a determinação do grau e da fase de uma diversidade de tumores e, desse modo, auxiliar a estabelecer um prognóstico e o futuro regimem de tratamento para o paciente com o tumor.

Assim, para se atingirem os objectivos precedentes, proporciona-se, de acordo com um dos aspectos da presente invenção, um anticorpo policlonal que se liga à proteína RBl. Também se proporciona um anticorpo monoclonal que é produzido por um hibridoma murino sendo o referido anticorpo especificamente imuno-reactivo com a proteína RBl.

Num outro aspecto, proporciona-se um méto do de detecção de proteína RBl que compreende os passos de preparação de secções de tecido a partir de tecidos tu morais, incubando os anticorpos (monoclonais ou policlo-nais) com as referidas secções tecidulares para formar um complexo anticorpo-antigeno e detectar a formação do complexo antigeno-anticorpo assim formado.

Um outro aspecto da presente invenção pro porciona um método para se detectarem sub-populações de células que se encontram associadas a tumores tais como os osteossarcomas, fibrossarcomas, melanomas, carcinomas da mama, do ovário, da bexiga, do pulmão, da cerviz e sar comas de tecidos moles e um método para diagnosticar e de terminar o prognóstico nos indivíduos que têm esses tumores. 0 método envolve a biópsia do tumor, a preparação das secções de tecido a partir da biópsia do tecido tumo-ral, a incubação das secções de tecidos preparados com an ticorpos policlonais ou monoclonais de RB1 da presente in vencão para permitir que o anticorpo se ligue especifica-mente ao tecido e que se forme um complexo anticorpo-anti geno e a detecção da formação do complexo anticorpo-anti-geno. A presente invenção é útil na detecção de uma ampla variedade de tumores que possuam um defeito no produto genético do retinoblastoma (proteína RB1) e para o estabelecimento do prognóstico e futuro regimem de tratamento dos pacientes com tumores. h partir da descrição que se segue, serão ainda evidentes outros objectivos, caracteristicas e vantagens dos aspectos presentemente preferenciais da presen te invenção, apresentados para os objectivos da descrição quando considerados em conjunto cora os desenhos em anexo. 8

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Entender-se-à, mais facilmente a presente invenção a partir da leitura da descrição que se segue e por referência aos desenhos em anexo que formam parte dela· A Figura 1 indica as sequências do cADN de RB1 incluindo parte da sequência genómica imediata 5' de cADW. Define-se o resto A no codão ATG como a posição 1. Os aminoácidos da sequência de transcrição mais longa indicam-se abaixo das sequências de código. A Figura 2 demonstra a precipitação de uma proteína RB1 marcada, pelo anti-soro policlonal RB-AB20 e a fracção IgG purificada de RB-AB20. A Figura 3 demonstra a coloração imuno--histoquímica de uma linha de células RB1 positivas (SW613) e uma linha de células RB1 negativas (MDA-MB468) com o anticorpo monoclonal RB-MAB20. A Figura 4 indica a detecção imuno-histo-química da proteína RB1 no tecido da mama humana. Todas as amplificaçães foram de 250 vezes·

Os desenhos não estão necessariamente ã escala e determinadas características da presente invenção podem estar exageradas na escala ou indicadas de forma esquemática para maior clareza e concisão.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Será evidente para o especialista na ma- 9 téria que se poderão efectuar diversas substituições e mo dificações na presente invenção, sem sair do âmbito ce espirito da presente invenção.

Os antígenos são compostos capazes de des poletar uma resposta imunológica e a comcomitante produção de anticorpos que reagem e se ligam ao antígeno alvo com alguma especificidade. São conhecidas pelo especialista na matéria as sondas de anticorpos específicas para antígenos tais como os virus ou seus determinantes específicos péptidos e proteínas derivadas de uma diversidade de fontes, radicais de hidratos de carbono e uma grande varieda de de biopolímeros. Os métodos gerais para a preparação destes anticorpos também são do conhecimento do especialista nesta matéria.

De um modo resumido, podem preparar-se os anticorpos policlonais por imunização de um animal hospedeiro com uma sequência peptidica codificada pelo gene RB1. De um modo preferencial, o antígeno é constitáido por uma sequência peptidica localizada ou próxima da extremidade C hidrófila da proteína RB1. Administra-se o antígeno ao hospedeiro por via subcutânea, com intervalo de uma se mana, seguido de uma dose de reforço um mês depois da ultima dose semanal. A seguir, recolhe-se o soro do hospedei ro e armazena-se até posterior utilização. Pode utilizar--se, directamente, o anti-soro policlonal RB1 nos procedimentos imuno-histoquímicos da presente invenção. De um modo alternativo, pode efectuar-se a precipitação dos anticorpos RB1 a partir do soro, por procedimentos que são do - lo -conhecimento do especialista e utilizarem-se numa forma mais concentrada ou, em alternativa, podem purificar-se os anticorpos RB1 por técnicas de afinidade e utilizarem--se nesta forma purificada. Pode, também, marcar-se os an ticorpos pafca detecção de acordo com técnicas conhecidas pelo especialista e expostas adiante. A fusão de células de mieloma e de células de baço a partir de doadores imunizados revelou-se um método bem sucedido para a derivação de anticorpos homogéneos. Deste modo, desenvolveram-se linhas de células contínuas de células de hibridoma geneticamente estáveis capazes de produzir grandes quantidades de anticorpos mono-clonais contra diversos antígenos. De acordo com a patente de invenção norte-americana N2 4 172 124, de Koprowski e outros, podem produzir-se anticorpos que demonstram uma especificidade para tumores malignos, por híbridos de células somáticas entre células de mieloma com deficiência de hipoxantina-fosforibosil-transferase e células de baço ou linfáticas derivadas de um animal previamente munido com células de tumor. Também, de acordo com a patente de invenção norte-americana N2 4 196 265, de Koprowski e outros, se desenvolveram linhas de células contínuas de híbridos de células de fusão geneticamente estáveis, capazes de produzir grandes quantidades de anticorpos contra vírus específicos e seus determinantes antigénicos.

Também se podem empregar tais técnicas de fusão celular para proporcionar um fornecimento fidedigno e normalizado de anticorpos anti-RBl. De acordo com a pre sente invenção, obtêm-se linhas de células de hibridorna continuas, que expressam o anticorpo anti-RBl, por imunização de um animal com uma sequência peptídica correspondente à sequência de aminoácidos de ou próxima da extremidade C hidrófila do gene RB1, de preferência a uma sequência de síntese seleccionada no grupo constituído pelos péptidos P2, P3, P4 ou P5 de RBl, indicados na Figura 1, formando células híbridas fundidas entre células produtoras de anticorpos provenientes do animal imunizado e célu las de mieloma, clonagem dos híbridos e selecção dos clo-nes que exprimem o anticorpo RBl. De um modo mais específico, injecta-se num rato ou noutro animal antígeno RBl purificado e, depois, fundem-se as células produtoras de anticorpos do baço do animal com um tipo carcinomatoso de células de murganho ou de células de mieloma. As células híbridas assim formadas, produzem a molécula de anticorpo anti-RBl da sua célula de baço progenitora e desenvolve--se e divide-se continuamente tal como a célula de mieloma sua progenitora. Seleccionou-se o clone de células pro dutoras de tais anticorpos e desenvolveram-se como uma li nha continua de células a partir das quais se recolheu grandes quantidades de anticorpo anti-RBl. A seguir, discute-se um clone desta natureza, designado por RB1-MABP2*

De um modo alternativo, podem injectar-se as células híbridas do clone num animal histocompatível, onde estas proliferam, produzindo níveis elevados de an- ticorpo anti-RBl que se pode recuperar a partir do fluido ascítico do animal.

Assim, a presente invenção torna possível um fornecimento normalizado e fidedigno do anticorpo anti -RB1, numa escala relativamente grande, para utilização na detecção imuno-histoquímica da proteína de expressão RB1 ou, em alternativa, a ausência de expressão de proteí_ na RB1 numa amostra de tumor em que a ausência de proteína se encontra associada com um tipo, grau ou estádio par ticular do tumor. Podem, também marcar-se os anticorpos monoclonais assim preparados, de acordo com procedimentos que são do conhecimento do especialista na matéria.

Constituem marcadores detectáveis qualquer material que possua uma propriedade física ou química de-tectável. Tais marcadores detectáveis têm sido bem desenvolvidos no âmbito dos ensaios imunológicos e, geralmente, qualquer dos marcadores utilizáveis nesses métodos se pode aplicar à presente invenção. São particularmente úteis os grupos enzimáticamente activos, tais como os enzimas (tais como, por exemplo/ a fosfatase alcalina e as peroxidases) (ver Clin. Chem., 22 (1976) 1243), substractos enzimáti-cos (ver memória descritiva da patente de invenção britânica N2 1,548,741), co-enzimas (ver patente de invenção norte-americana N2 4,230,797 e 4,238,565), e inibidores enzimáticos (ver patente de invenção norte-americana N2 4,134,792); grupos fluorescentes (ver Clin. Chem.. 25 (1979) 353); cromóforos; grupos luminescentes tais como os quemiluminescentes e os bioluminescentes (ver Clin, Chem., 25 (1979) 512); e radio-isótopos.

Os marcadores radiactivos detectáveis vul garmente utilizados incluem, mas não se limitam a 32 , 14_

Jr L* 125j, 3^. e 35g. Detectam-se as sondas biotiniladas apás hibridação utilizando conjugados de avidina/estreptavidi-na, compostos fluorescentes, enzimáticos ou de ouro coloi. dal. Também se podem marcar os anticorpos com outros compostos fluorescentes, com derivados fluorescentes imuno-detectáveis ou análogos de biotina. Também se podem utili zar procedimentos imuno-citoquímicos de fluorescência in-directa.

No sentido de se detectar a formação de complexos antígeno-anticorpo, utiliza-se um marcador detec tável. Pode ligar-se directamente o marcador detectável (ou molécula de referência) à molécula de anticorpo anti--RBl antes da incubação com o tecido alvo.

Em alternativa, pode incubar-se o anticor po RBl não marcado com o tecido alvo e detectar-se o complexo antígeno-anticorpo pela adição de um segundo anticorpo marcado de modo detectável, que se liga ao anticorpo RBl complexado com o antígeno RBl do tecido.

Pode determinar-se, directamente, a presença ou ausência de proteína RBl nas células específicas de uma amostra de tecido de tumor, utilizando uma molécula de referência que pode ser visualmente detectada, ou 14 indirectamente, utilizando uma molécula de referência tal como urr marcador radioactivo e fazendo a sobreposição da auto-radiografia desenvolvida numa representação visual da secção de tecido. Depois pode contar-se as células de tumor positivas e negativas para determinar o número de células tumorais que exprimem a proteína RB1.

Numa variante da presente invenção utiliza-se um anticorpo policlonal que se liga a proteína RB1.

Prepararam-se os anticorpos policloaais para a proteína RB1 (RB1- AB20), por imunização de coelhos com sequências peptidicas que correspondem à parte hidrófila da proteína RB1 localizada ou perto da extremidade C da sequência deduzida das sequências de cADN de RBl humano, conforme indicado na Figura 1. Num aspecto preferên ciai, prepara-se um péptido de síntese (daqui em diante designado por "PS") que corresponde a 23 restos de amino-écidos.

Também se sintetizaram três outras seguên cias peptidicas dos péptidos RBl de síntese, designadas, conforme se segues P2: hN2- Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys-Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr-Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys. P3: KN2“ Cys-Arg-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly-Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile-Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp, P4: HN2» Cys-Glu-Glu-Ile-Tyr-Leu-Lys-Asp-Lys-Asp-leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp- 15

Lys, e P5: HNg- Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys.

Adicionou-se um resto de cisteína à extremidade N de cada um dos péptidos para o acoplamento. Assim, o radical cisteína da extremidade N não faz parte da sequência da proteína RB1.

Podem utilizar-se os anticorpos policlo-nais e monoclonais para se detectar a presença, ou a ausência ou alterações da proteína RB1. Numa variante, um método para a detecção da proteína RB1 compreende os passos de preparação de secções de tecidos a partir de biópsias de tecidos de tumor, incubação dos anticorpos monoclonais e policlonais com as secções de tecido preparados para formar complexos anticorpo-antígeno e, assim, se detectar a formação do complexo antígeno-anticorpo.

Numa outra variante da presente invenção podem identificar-se sub-populações de células com deficiência da proteína RB1 em tecidos de tumor utilizando o procedimento imuno-histoquímico anteriormente descrito.

Dado que as células de tumores nos estádios avançados da doença apresentam mais defeitos na proteína do retinoblastoma, pode utilizar-se o método para diagnosticar o estádio das células do tumor, assim como para se fazer o prognóstico para os indivíduos que possuem os referidos tumores. 16

As decisões usuais quanto ao tratamento de indivíduos baseiam-se, frequentemente em parâmetros específicos de prognóstico. Os principais factores de prognóstico para o cranco da mama, por exemplo, incluem a pre sença ou ausência de tumor nos nódulos axilares e a presen ça ou ausência de receptores hormonais nas células do tumor. Outros factores de prognóstico muitas vezes associados à recidiva da doença e sobrevivência global dos pacien tes incluem a extensão da lesão primária e a fase da doença a diagnosticar. Slamon postulou que a amplificação do gene HER-2/neu possuia um valor de prognóstico superior, (permitindo a previsão do tempo global de sobrevivência e do tempo de recidiva nos pacientes com cancro da mama) a qualquer outro critério convencionalmente utilizado com excepçao de envolvimento de nódulos linfáticos / Science 235 (1987) 1777.

Pode utilizar-se o método da presente in venção para se estabelecer o estádio e o grau de uma grande variedade de tumores. Por exemplo, descobriu-se o defei to nos retinoblastomas, osteossarcomas, fibrossarcoraas,car cinomas da mama, do ovário, bexiga, pulmão, cerviz e nos sarcomas de tecidos moles. Todos estes tumores possuiam de feitos no gene RB ao nível do ADH e alguns apresentavam sub-populações de células que se encontravam associadas com alterações ou defeitos do gene do retinoblastoma. Assim, pode utilizar-se a ausência de proteína detectável de RB1 como um critério de identificação nestes tumores. Dado - 17 que o grau de perda de expressão da proteína KB1 aumenta com o aumento no grau do tumor, conforme se identificou por outros métodos convencionais nos tumores da mama, a presente invenção proporciona um critério adicional para a determinação do grau e estádio de tal tumor. Este método proporcionará um critério adicional para a determinação do prognóstico e futuro curso de tratamento dos pacientes com tumores.

Tendo-se já descrito a presente invenção de um modo geral, pode obter-se uma melhor compreensão por referência aos exemplos específicos que se seguem. Estes exemplos apresentam-se a titulo ilustrativo e não devem de modo algum ser considerados com limitativos do âmbito da presente invenção, salvo indicação em contrário.

Exemplo 1

Produção do Anticorpo RB1

Prepararam-se os anticorpos policlonais, imunizando individualmente coelhos fêmeas da Nova Zelândia com um dos péptidos de RB1, P2, P3, P4 ou P5. Inocularam--se os ratos com injecção de reforço com intervalos de 2 semanas e utilizou-se o soro recolhido como fonte de anticorpos. Utilizou-se um anti-soro RB1-AB20, lançado contra o péptido P5 para procedimentos de coloração imunológica posteriores, conforme descrito no Exemplo 2. 0 anticorpo RB1 -AB20 é do sub-tipo IgG. O anti-soro RB1-AB20 precipitou a proteína RB1 a partir de células marcadas com 32p, 18 conforme se indica na Figura 2, pista 1. A fracção IgG do anti-soro policlonal, purificada de acordo com técnicas convencionais, também precipitou a proteína RB1, conforme se indica na Figura 2, pista 2.

Os hibridomas da presente invenção prepa raram-se, conforme se segue, Injectaram-se, directamente no baço de ratos Balb/c 200 mg do péptido em questão dissolvidos em PBS. Sacrificaram-se os animais imunizados três dias mais tarde e recolheram-se as células do baço. Mistu-raram-se as células do baço (10 ), durante 2 minutos com as células NS-l(lO ) de mieloma de rato em 0,8 ml de polie tilenoglicol (PEG 4000) a 50%. Após 1 minuto de repouso, efectuou-se a suspensão das células em 70ml de meio HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) contendo soro de feto de vitela a 20%. Depois colocaram-se as células em placas de cultura de 96 cavidades e incubaram-se a 37° C numa atmosfera de CO2 humidificada. Efectuou-se o rastreio das co lónias de hibridoma positivas de acordo com a técnica ELISA utilizando os antígenos imunizantes para detectar as células de hibridoma produtoras de anticorpos. Colocaram-se as colónias positivas ao ELISA em diluições em série e repetiu-se o ensaio ELISA. Após diversos ciclos, injectaram-se as linhas de células positivas do hibridoma intraperitoneal mente em ratos Balb/c e desenvolveram-se como fluido ascl-tico. Utilizou-se o fluido ascxtico como uma fonte de hibridoma. Descobriu-se que diversas linhas de células, incluindo uma que se designou por RBl-MAbP2, produziam anticorpos RB1 e eram úteis para coloração imuno-histoquímica 19 de tecidos de tumor. Conservaram-se as linhas de células de hibridoma em azoto líquido.

Depositou-se a linha de células de hibri doma que se designou por RBl-MAbP2 na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md., USA, com o Número de De pósito HB10093 a 31 de Março de 1989. Os depósitos encontram-se disponíveis# de acordo com as leis que regulamentam as patentes e regulamentos dos Estados Unidos e dos outros países nos quais se depositou o presente pedido de patente de invenção. A disponibilidade de um depósito não constitui uma autorização para pôr em prática a invenção do presente pedido de patente ou em desrespeito por qualquer patente emitida a partir dele ou de qualquer divisão ou continuação da presente invenção.

Exemplo 2

Localização Imuno-histoquímica da Proteína RB1 A correlação entre a presença ou ausência de proteína RB1 e a presença ou ausência do gene RB1 foi demonstrada utilizando os anticorpos RB1 da presente invenção. Cultivaram-se, durante 48 horas, em meio RPMI 1640 enriquecido com soro de feto de vitela a 20% e uma so lução de penicilina/estreptomicina a 1%, células de uma cul tura de tecidos, incluindo as linhas de células SW613, uma linha de células positivas de tumor da mama e MDA-MB468, uma linha de células de tumor da mama negativas ao gene RB1. Enxaguaram-se as células, duas vezes, com PBS frio.

Fixaram-se as células com ácido acético a 5% e etanol a 95%, durante 6 minutos a 4o C.

Após ter-se lavado duas vezes em PBS frio, bloquearam-se as ligações não específicas, incubando as cé lulas em PBS contendo soro normal de cavalo a 1%, BSA a 3% e Triton-X-100 a 0.2%. Depois, enxaguaram-se as células fixadas, com PBS frio e incubaram-se com sobrenadante espe cífico de RB1-FAB P2 diluído em PBS (1:10), durante 1 hora a 37° C. Depois, lavaram-se as células sequencialmente, com PBS frio, com PBS contendo Triton-X.-100 a 1% e, finalmente, com PBS.

Visualizou-se a ligação específica do anticorpo RB1 ãs células, incubando as células com o anticorpo anti-IgG de rato biotinilado (diluído a 1:200 em PBS) durante 1 hora a 37° C. Após ter-se lavado três vezes as células com PBS frio, incubaram-se as células com o reagen te ABC (Complexo Avidinasbiotina), a 37°C, durante 30 mínu tos lavaram-se com PBS frio e, depois, incubaram-se com so lução DAB (tetracloreto de 3-3'-diamino-benzidina) recente, à temperatura ambiente, durante 4 minutos. Preparou-se a solução DAB, dissolvendo 6 mg de DAB em 10 ml de Tris/HCl 0,05 M, a pH 7,6, contendo azida de sódio a 0,3% e 0,03% de peróxido de hidrogénio. Depois, lavaram-se as células com água destilada e analisaram—se ao microscópio as células que se tingiram. Nas Figuras 3a e 3b indicam-se os resultados. O anticorpo policlonal RBl-MAb20 corou todas as células da linha de células SW613 que se sabia serem posi- 21 tivas ao gene RB1 (Figura 3A). Não se detectou a formação de qualquer complexo antígeno-anticorpo na cultura d.e célu las da linha de células MDA-MB468 negativas em relação a RB.

Também se verificou a capacidade dos anticorpos da presente invenção para detectar a ausência ou a presença de expressão da proteína RBl nos tecidos do tumor da mama. Podem utilizar-se os procedimentos de coloração nas secções de tecido preparados de acordo com numerosas técnicas convencionais que são do conhecimento do espe cialista. Pode utilizar-se, por exemplo, os procedimentos de coloração imunológica utilizados para detectar a presen ça ou a ausência de proteína RBl no tecido da mama, sobre secções de parafina ou secções congeladas. Desparafinizam--se e hidratam-se as secções de tecidos embebidas em parafina por contacto sequêncial com xileno, durante 5 minutos, duas mudanças de etanol a 100%, durante 5 minutos, cada uma etanol a 70%, durante 5 minutos e etanol a 50%. Depois enxaguam- se durante 5 minutos em PBS. Depois, incubam-se os cortes durante 30 minutos com PBS contendo soro normal de cabra a 10%. Então, incubam-se as secções durante a noite, a 4o C, com o anticorpo RBl diluido a 1:80 em PBS. Após la vagem das secções de tecido, durante 10 minutos em tampão, incubam-se durante 60 minutos com uma solução do segundo anticorpo biotinilado. O segundo anticorpo é um anticorpo dirigido contra a IgG do rato. A utilizarão de um marcador detectável no segundo anticorpo permite a utilização de um 22

lavagem das secções de tecido, durante 10 minutos em tampão, incubam-se durante 30 minutos com o reagente ABC. De pois de se lavarem as secções durante 10 minutos em PBS, incubam-se durante 10-20 minutos em solução de substrato de peróxidase (DAB). Após lavagem das secções de tecido, durante 5 minutos em água, contra-coram-se com haemalum de Mayer e raontam-se antes da análise microscópica.

Numa variante preferida, cortaram-se num crióstato a -20° C as secções (6-8 /im) congelados de biópsias de tecido da mama e fixaram-se posteriormente com acetona, durante dois minutos, à temperatura ambiente, se guindo-se-lhe o tratamento com periodato-lisina-paraformal deído, a pH 7,4, durante 8 minutos a 4o C. Após bloqueio das ligações não específicas com soro de suíno não imunizado (diluido a 1:5 em solução salina de tampão fosfato, a pH 7,2; PBS) durante dez minutos, incubaram-se as secções de tecido com RBl-Ab2G (diluido a 1:100 em PBS), durante 60 minutos à temperatura ambiente e, depois, enxagua ram-se. Aplicou-se, então o anti-soro biotinilado de anti--imunoglobulina do coelho desenvolvido no suíno, seguido do complexo avidina-biotina-peroxidase. Localizou-se a pe-roxidase utilizando a reacção diaminobenzidina-peróxido de hidrogénio. Contra-coraram-se os núcleos com haemalum de Mayer. S evidente que os métodos de fixação podem variar sem afectar o âmbito e os conceitos da presente 23 invenção. Pode utilizar-se qualquer método de fixação, des de que seja adequado para conservar a proteína RB1 in situ e permitir a entrada do anticorpo RB1 para o sitio da proteína RB1. Também é necessário que o procedimento de fixação não interfira com a ligação, do anticorpo ao antígeno RB1.

Exemplo 3

Correlação entre o Grau e Estádio do Carcinoma da Mama e o Decréscimo da Detecção da Proteína RB1. 0 principal problema na interpretação dos dados da sonda de ADN que se obtêm utilizando biópsias de tumor reside na heterogeneidade das amostras tecidula-res utilizadas. Embora seja possível obter uma indicação da percentagem de células de tumor numa biópsia, de acordo com análises histológicas normalizadas, é difícil ter-se a certeza da proporção das células de tumor na amostra uti lizada para a preparação do ADN, A maioria das amostras es tudadas possuiam menos de 50% de células de tumor, compreendendo a parte restante células do estroma, linfócitos e outras. A eliminação de um alelo de RB1 em 50% das células do tumor pode por isso originar apenas uma redução global do sinal de hibridação de 12,5%. Por isso, é possível que uma proporção de biópsias de tumor com este nível de perda RB1 não seja divisada pela análise com a sonda de ADN, devido ás limitaçSes técnicas. A detecção imuno-histoquímica, utilizan- do os anticorpos RB1 da presente invenção nas secções de tecido de tumor proporcionam um ensaio mais sensível da presença ou ausência de proteína RB1. A coloração dos teci dos da mama, incluindo tecido da mama normal, fibroquistos benignos da mama e amostras de fibroadenoma utilizando o anticorpo RB1-Ab20 demonstraram coloração uniforme de todas as células epiteliais da mama com predominância da coloração do núcleo. A Figura 4a mostra o diagrama de coloração do núcleo e do citoplasma do epitélio do lóbulo mamário normal (seta aberta). As células mioepiteliais e as células do estroma não reagem com RB1-Ab20 e, por isso, parecem negativas (seta fechada). A localização nuclear da proteína RB1 é consistente com as descobertas de uma faixa de aminoácidos (PKKK ou Pro-Lys-Lys-Lys) característicos do sinal de localização nuclear descoberto nas proteínas nucleares tais como o grande antígeno T SV40. Assim, todas as células epiteliais da mama exprimem normalmente RB1 para proporcionar níveis claramente detectáveis de proteína.

Das 77 amostras de carcinoma examinadas por análise de ADH, quanto à organização de RB1, efectuou--se sobre 56 a análise imuno-histoquímica, descrita no Exemplo 2. Em 40 destas amostras de carcinoma, todas as cé lulas de tumor mostraram reactividade nuclear, com pequena variação na intensidade de coloração. A Figura 4b demonstra um diagrama de coloração característico desses carcinomas em que essencialmente todas as células do núcleo rea gem (seta) com variações menores na intensidade de coloração. As células do estroma (S), em redor, não apresentam qualquer evidência de reactividade com o anticorpo RBl-20. Nos restantes 16 carcinomas existem proporções variáveis de células de tumor não coradas. Onze, indicaram possuir uma alteração no gene RBl (ver Quadro 1), atingindo, na amostra de tumor com a perda de RBl mais marcada, uma proporção de células de tumor coradas inferior a 5% (410Ca, ver Figura 4c) e, noutro caso, cerca de 95% de células re-activas. Na Figura 4c, o diagrama de coloração de uma secção de tumor do paciente 410 demonstra que um pequeno grupo de células de tumor reagem com o anticorpo RBl (seta) enquanto as restantes células são negativas. Esta era a principal área de coloração no carcinoma. Na maioria dos carcinomas não se encontra ainda esclarecida a relação entre a proporção de células de tumor tingidas e o nível de perda ou de rearranjo de RBl. A distribuição de núcleos não reactivos apresentavam-se como pequenos grupos ou ilhas de células de tumor (isto é, em cacho), ou como células disseminadas através do tumor. 0 último diagrama predominava nos tumores que apresentavam perda de reactividade mínima.

Apenas um carcinoma (602Ca) com uma clara alteração de RBl não apresentou perda de reactividade a RB1-Ab20. A análise do ADN deste tumor revelou uma eliminação utilizando uma sonda de ADN RBl e um rearranjo (utilizando uma segunda sonda de ADN RBl). Isto parece signi- 26 ficar que, provavelmente, as duas alterações envolviam o mesmo alelo, permitindo a geração de uma proteína RB1 normal , pelo alelo normal.

Em 5 amostras em que não existiam alterações detectáveis do gene RB1, existiam células de tumor na amostra que não tinham proteína RB1 detectável, isto é, não se coravam. Em 4 destes casos, 5% ou menos do número total de células de tumor no corte negativas à proteína RBl (ver Quadrol). Estas amostras originam uma percentagem de tumores com pelo menos algumas células negativas para expressão de RBl de 29%. 27

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Estádio de doença desconhecida, mas positiva em rela-não aos gânglios. 0 paciente tinha uma história anterior de carcinoma da mama (ambas as mamas).

Tomados em conjunto, os dados obtidos na expressão de RB1 nas células primárias do tumor da mama indicam que não só sao detectáveis as perdas de ADR RB1 nas células do tumor, como também a perda de função, conforme se mediu pela expressão da proteína RB1. Para além disso, a utilização do anticorpo RB1 para detectar a proteína RB1 com secções de tecido demonstrou que a detecção da perda de função de RB1 é mais frequente do que a detecção da sua alteração genética. Por este motivo, nesta situação, a coloração pelo anticorpo RB1 de cortes de tecido é de grande valor.

Utilizando os anticorpos da presente in- 30

venção, correlaciona-se as alterações do gene RB1 e a fun ção do gene com um tipo especial de tumor, bem como o grau e o estádio do tumor. Observou-se uma eliminação detectá-vel do gene apenas no tumor de grau I (um carcinoma tubular) e nos tumores que não se encontram na fase I. Geralmente, a frequência das alterações genéticas de RB1 aumentam com a fraca diferenciação do tumor e com o grau de di_s seminação (Quadro 2). De modo idêntico, a perda de expres são da proteína RB1 nas células de tumor também relacionadas com tumores mais avançados, não tão bem diferenciados, (Quadro 2). Apesar de nem a alteração do gene nem a perda de expressão da proteína RB1 se correlacionarem com um fraco prognóstico a curto prazo (menos de 24 meses), uma vez que a alteração ou eliminação do gene RB1 se correlaciona com uma doença em fase avançada, pode observar--se uma correlação com um intervalo isento de doença ou uma sobrevivência de cinco anos, quando se dispõe de dados de acompanhamento a longo prazo. 31

Quadro 2

Distribuição da frequência de perda de expressão quando comparada com uma grelha histopatológica ou com a dissemi nação da doença.

Percentagem de Percentagem de tumores com tumores com perda

Grau^ genes alterados de expressão I 10 (n=lO) 0 (n=5) II 17 (n=30) 19 (n=21) III 32 (n=25) 48 (n=23) 2 Estádio - 1 0 (n=9) 11 (n=9) 2 33 (n=15) 46 (n=13) 3 29 Cn=7) 80 (n=5) 4 50 (n=2) 50 (n=2)

Os tumores de grau I são os que se encontram melhor diferenciados e os de grau III os que se encontram menos diferenciados. Uma doença encontra-se no es tádio I se apenas existe um tumor localizado; no estádio 2, se já está presente um tumor e já se detecta o envolvimento dos gânglios linfáticos. 0 estádio 3 indica a presen ça de um grande tumor com lesão da pele (invasão local) e o estádio 4 da doença abrange um tumor e as suas metásta-•ses mais distantes,'

Os dados aqui referidos, indicam que a per - 32 - *

da da função RB1 é mais importante na progressão do carci noma da mama humana. A evidência, a partir de pacientes com retinoblastoma, osteossarcoraa e fibrossarcoma indica que a perda de função do gene é de crucial importância pa ra a génese do tumor. 0 especialista verificará que a presente invenção se encontra bem adaptada para se poder realizar os seus objectivos e para se atingirem as finalidades e vantagens mencionadas, bem como as que lhe são inerentes. Os anticorpos, métodos, procedimentos e técnicas aqui desi critos são apresentados como representativos dos aspectos preferênciais ou que se pretende sirvam como Exemplo e que não devem ser entendidos, de modo algum, como limitações ao âmbito da presente invenção. 0 especialista verificará que se podem efectuar alterações á. presente invenção que se encontram integradas no espírito da mesma, ou definidas no âmbito das reinvindicações em anexo.

Claims (18)

1. -33- REIVINDI CAÇÕES 1. - Anticorpo, caracterizado pelo facto de possuir afinidade de ligação especifica ao produto da proteína RB^ do gene de retinoblastoma.
2. 2, - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ser um anticorpo policlo-nal.
3. 3.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ser um anticorpo monoclo-nal. -34-
4. 4. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo facto de ser preparado por imunização de um animal hospedeiro com um péptido localizado no ou próximo do c-terminal da sequência da proteína RB^.
5. 5. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza-do pelo facto de a sequência do referido péptido ser seleccionada de entre o grupo constituído por: H^- Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys-Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr-Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys, HN2- Cys-Arg-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly-Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile-Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp, HN2*· Cys-Glu-Glu-Ile-Tyr-Leu-Lys-Asp-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp-Lys, e HN2" Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Arg-Asp-Ile-Glu-Gly-Ser-Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys.
6. 6. - Hibridoma murino, caracterizado pelo facto de produzir um anticorpo monoclonal especificamente imuno-reactivo com a proteína RB^.
7. 7. - Hibridoma de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de produzir um anticorpo monoclonal possuindo afinidade de ligação específica para uma sequência peptídica seleccionada de entre o grupo constituído por: II

   H^- Cys-Arg-Met-Gln-Lys-Gln-Lys-Met-Asn-Asp-Ser-Met-Asp-Thr-Ser-Asn-Lys-Glu-Glu-Lys, HN2- Cys-Arg-Thr-Pro-Arg-Arg-Gly-Gln-Asp-Arg-Ser-Ala-Arg-Ile-Ala-Lys-Gln-Leu-Glu-Asp-Asp, Cys-Glu-Glu-Ile-Tyr-Leu-Lys-Asp-Lys-Asp-Leu-Asp-Ala-Arg-Leu-Phe-Leu-Asp-His-Asp-Ly s, e ΗΝ2“ Cys-Lys-Pro-Leu-Lys-Lys-Leu-Phe-Arg-Asp-lle-Glu-Gly-Ser-Asp-Glu-Ala-Asp-Gly-Ser-Lys.
8. 8. - Hibridoma de acordo com a reivindicação 7, caracteriza-do pelo facto de o referido anticorpo ser RB^-MABp2 .
9. 9. - Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de ser produzido pelo hibridoma de acordo com a reivindicação 7.
10. 10.- Método para a detecção da ausência da proteína RB^ em células de tumor, caracterizado pelo facto: de se prepararem secções de tecido a partir de um tumor? de se incubar o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 inclusive, ou 8 com as referidas secções de tecido preparadas; e de se detectar a ausência de ligação específica do refe rido anticorpo às secções de tecido.
11. 11.- Método para a detecção de subpopulações de células de- -36- -36-

    ficientes na proteína RB^, caracterizado pelo facto: de se prepararem secções de tecido a partir de tumores; de se incubar o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5 inclusive, ou 8 com as referidas secções de tecido preparadas; e de se detectar a ligação específica do referido anticorpo às referidas secções de tecido.
12. 12. - Método de prognosticar pacientes de cancro, caracterizado pelo facto de se determinar o número de células de tumor deficientes em proteína RB^ pelo método de acordo com a reivindicação 11.
13. 13. - Método de prognosticar pacientes de cancro, caracterizado pelo facto: de se prepararem secções de tecido a partir de tumor do referido paciente; de se incubar o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 5 inclusive, ou 8 com as referidas secções de tecido preparadas; de se detectar a ligação específica do referido anticorpo às referidas secções de tecido; e de se determinar o número de células deficientes em proteína RB^. 14.- -37-
14. 14, - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo' facto de os referidos tecidos serem provenientes de tumores seleccionados a partir do grupo constituído por carcinoma da mama, carcinoma do ovário, carcinoma da bexiga, carcinoma do pulmão, carcinoma da cervix e sarcoma do tecido liso.
15. 15, - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de os referidos tecidos serem provenientes de tumores seleccionados a partir do grupo constituído por carcinoma da mama, carcinoma do ovário, carcinoma da bexiga, carcinoma do pulmão, carcinoma da cervix e sarcoma do tecido liso.
16. 16, - Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de os referidos tumores serem seleccionados de entre o grupo constituído por retinoblastoma, osteossarcoma ou fibros-sarcoma.
17. 17. - Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de os referidos tumores serem seleccionados a partir do grupo constituído por retinoblastoma, osteossarcoma ou fibros-sarcoma.
18. 18. “ Método para a diagnose ou prognose de um paciente de cancro, caracterizado pelo facto: de se fazer a biópsia de um tumor; 38 38

    de se prepararem secções de tecido a partir do referido tecido de tumor; de se incubar o anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5 inclusive, ou 8 com as referidas secções de tecido preparadas para formar um comple xo anticorpo-antigene; e de se detectar o complexo anticorpo-antigene formado, Lisboa, 30 de Março de 1990 O Agsife Oficial da Prcprtcicde Industria!