PL219093B1 - Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji - Google Patents

Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji

Info

Publication number
PL219093B1
PL219093B1 PL392311A PL39231103A PL219093B1 PL 219093 B1 PL219093 B1 PL 219093B1 PL 392311 A PL392311 A PL 392311A PL 39231103 A PL39231103 A PL 39231103A PL 219093 B1 PL219093 B1 PL 219093B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleic acid
tumor
associated antigen
antibody
cells
Prior art date
Application number
PL392311A
Other languages
English (en)
Other versions
PL392311A1 (pl
Inventor
Ugur Sahin
Ozlem Tureci
Michael Koslowski
Original Assignee
Ganymed Pharmaceuticals Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ganymed Pharmaceuticals Ag filed Critical Ganymed Pharmaceuticals Ag
Publication of PL392311A1 publication Critical patent/PL392311A1/pl
Publication of PL219093B1 publication Critical patent/PL219093B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji.
Pomimo interdyscyplinarnego podejścia i obszernego stosowania klasycznych procedur leczniczych, nowotwory nadal należą do głównych przyczyn śmierci. Ostatnio koncepcje terapeutyczne zmierzają w kierunku włączania układu immunologicznego pacjenta do ogólnej koncepcji terapeutycznej, przez zastosowanie szczepionek nowotworu powstałych w drodze rekombinacji oraz innych środków, takich jak terapia przeciwciałami. Wstępnym wymaganiem do osiągnięcia sukcesu przy stosowaniu takiej strategii jest rozpoznanie przez układ immunologiczny pacjenta, którego efektorowe funkcje mają być interwencyjnie podwyższane, specyficznych dla nowotworu lub związanych z nowotworem antygenów lub epitopów. Biologicznie, komórki nowotworowe różnią się zasadniczo od niezłośliwych komórek od których pochodzą. Te różnice są spowodowane zmianami genetycznymi nabywanymi w czasie rozwoju guza i skutkują, między innymi, tworzeniem się w komórkach nowotworowych także jakościowo i ilościowo zmienionych struktur molekularnych. Tego rodzaju związane z nowotworem struktury, że są rozpoznawane przez specyficzny układ immunologiczny gospodarza posiadającego nowotwór, są określane jako związane z nowotworem antygeny. Specyficzne rozpoznawanie związanych z nowotworem antygenów obejmuje mechanizmy komórkowe i humoralne, które są dwiema funkcjonalnie połączonymi jednostkami: limfocyty T CD4+ i CD8+ rozpoznają przetworzone antygeny prezentowane na cząsteczkach MHC (główny kompleks zgodności tkankowej) odpowiednio klasy II i I, podczas gdy limfocyty B wytwarzają krążące cząsteczki przeciwciała, które bezpośrednio wiążą się do nieprzetworzonych antygenów. Potencjalnie kliniczne znaczenie lecznicze antygenów związanych z nowotworem wynika z faktu, że rozpoznawanie antygenów na komórkach nowotworowych przez układ immunologiczny prowadzi do zainicjowania cytotoksycznych mechanizmów efektorowych i w obecności komórek pomocniczych T może powodować eliminację komórek rakowych (Pardoll, Nat. Med. 4:525-31, 1998). Zgodnie z tym, głównym celem immunologii nowotworowej jest molekularne zdefiniowanie tych struktur. Molekularna natura tych antygenów pozostawała zagadkowa od długiego czasu. Dopiero po odkryciu odpowiednich technik klonowania stało się możliwe systematyczne przeglądanie bibliotek ekspresji cDNA nowotworów, ze względu na związane z nowotworem antygeny, poprzez analizowanie struktur docelowych cytotoksycznych limfocytów (CTL) (van der Bruggen i wsp., Science 254:1643-7, 1991) lub przy użyciu jako sond, krążących przeciwciał (Sahin i wsp., Curr Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997). Dotychczas, biblioteki ekspresji cDNA otrzymywano ze świeżej tkanki nowotworu i w odpowiednich układach zachodziła rekombinacyjna ekspresja białek. W celu klonowania odpowiednich antygenów, używano izolowanych od pacjentów immunoefektorów, mianowicie klonów CTL ze specyficznymi dla nowotworu wzorcami lizy lub krążących autoprzeciwciał.
W ostatnich latach, przy użyciu tych metod, określono wielorakie antygeny w różnych nowotworach. Jednakże sondy używane do identyfikacji antygenów w klasycznych metodach zilustrowanych powyżej, są immunoefektorami (krążące autoprzeciwciała lub klony CTL) od pacjentów mających zazwyczaj zaawansowanego raka. Wiele danych wskazuje, że nowotwory mogą prowadzić do rozwoju tolerancji i nie reagowania (stan anergiczny) komórek T oraz że w przebiegu choroby szczególnie tamte specyficzności, które mogą powodować efektywne immunologiczne rozpoznawanie są tracone z immunoefektorowego repertuaru. Aktualne badania pacjentów nie dostarczyły jeszcze mocnych dowodów rzeczywistego działania poprzednio znalezionych i używanych, związanych z nowotworem antygenów. W związku z tym, nie można wykluczyć, że białka wywołujące spontaniczną odpowiedź immunologiczną są źle wybranymi strukturami docelowymi.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie docelowych struktur do diagnozy i terapii raka.
Zgodnie z wynalazkiem, ten cel jest osiągany przez przedmiot zastrzeżeń. Zgodnie z wynalazkiem, poszukiwano strategii identyfikacji i dostarczania antygenów, których ekspresja zachodzi w powiązaniu z nowotworem oraz kodujących je kwasów nukleinowych. Ta strategia jest oparta na fakcie, że poszczególne geny, których ekspresja zachodzi w sposób specyficzny dla narządu, np. wyłącznie w tkance okrężnicy, płuc lub nerek, są reaktywowane w komórkach nowotworowych innych tkanek
PL 219 093 B1 w ektopowy i zabroniony sposób. Najpierw, zastosowanie metod eksploracji danych (ang. data mining) daje tak kompletną jak to możliwe listę wszystkich znanych, narządo-specyficznych genów. Są one następnie oceniane ze względu na odchylenia od normy w ich aktywacji w różnych nowotworach, poprzez analizę ekspresji przy użyciu specyficznego RT-PCR. Eksploracja danych jest znaną metodą identyfikowania związanych z nowotworem genów. Jednak w konwencjonalnych strategiach transkryptomy bibliotek normalnych tkanek są zwykle elektronicznie wybierane z bibliotek tkanek nowotworowych przy założeniu, że pozostające geny są specyficzne dla nowotworów (Schmitt i wsp., Nucleic Acids Res. 28:4251-60, 1999; Vasmatzis i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:300-4, 1998; Scheurle i wsp., Cancer Res. 60: 4037-43, 2000).
Koncepcja wynalazku, która okazała się znacznie bardziej satysfakcjonująca, jest oparta na używaniu eksploracji danych do elektronicznej ekstrakcji wszystkich narządowo specyficznych genów i późniejszej ocenie tych genów ze względu na ekspresję w nowotworach.
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna zawierająca jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z:
(i) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do związanego z nowotworem antygenu, (iv) antysensownego kwasu nukleinowego, który specyficznie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen, (v) komórki gospodarza, z ekspresją związanego z nowotworem antygenu lub jego części, i (vi) izolowanego kompleksu pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią i cząsteczki HLA, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów antygenu związanego z nowotworem, przy czym wspominany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119.
(b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
W kompozycji według wynalazku kwas nukleinowy, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, może być obecny w wektorze ekspresyjnym. Korzystnie ten wymieniony kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
W innym korzystnym rozwiązaniu kompozycji według wynalazku komórka gospodarza wydziela związany z nowotworem antygen lub jego część, oraz korzystnie dodatkowo w komórce gospodarza może zachodzić ekspresja cząsteczki HLA, która wiąże się do związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Bardziej korzystnie ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części zachodzi metodą rekombinacji, lub w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA zachodzi endogennie.
W innym korzystnej realizacji wynalazku komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, a bardziej korzystnie komórka prezentująca antygen jest komórką dendrytyczną lub makrofagiem. Komórka gospodarza w pewnych zastosowaniach wynalazku korzystnie jest komórką nieproliferacyjną.
Zgodnie z wynalazkiem w korzystnym wykonaniu kompozycji farmaceutycznej, przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym, ewentualnie jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym, lub też również korzystnie przeciwciało jest fragmentem przeciwciała naturalnego. Przeciwciało takie może być korzystnie sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że antysensowny kwas nukleinowy zawiera sekwencję 6-50 przylegających do siebie nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen.
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku charakteryzuje się korzystnie również tym, że związany z nowotworem antygen lub jego część dostarczana przez tę farmaceutyczną kompozycję wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, w których zachodzi ekspresja nieprawidłowej ilości tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części, przy czym wiązanie to powoduje cytolityczną reakcję i/lub indukuje uwalnianie cytokin.
PL 219 093 B1
Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku może korzystnie zawierać ponadto farmaceutycznie akceptowalny nośnik i/lub adiuwant, którym to adiuwantem jest saponina, GM-CSF, CpG, cytokina lub chemokina.
Według wynalazku kompozycja farmaceutyczna zdefiniowana powyżej, może być użyta do stosowania w leczeniu choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu. Chorobą tą może być rak, w tym rak przełyku, rak oskrzeli, nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, nowotwór żołądka, nowotwór trzustki, nowotwór ucha, nosa i jamy gardłowej (ENT), rak komórek nerki, lub rak szyjki macicy, rak okrężnicy lub rak gruczołu piersiowego.
W korzystnym rozwiązaniu zastosowania kompozycji farmaceutycznej według wynalazku związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przedmiotem wynalazku jest także czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik ten jest do:
(i) wykrywania kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen, i/lub (ii) wykrywania związanego z nowotworem antygen i/lub (iii) wykrywania przeciwciała związanego z nowotworem antygenu, i/lub (iv) wykrywania cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T, które są specyficzne dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części zawierającej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu w biologicznej próbce izolowanej od pacjenta z tym związanym z nowotworem antygenem mającym sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Wspomniane wykrywanie według wynalazku korzystnie obejmuje:
(i) kontaktowanie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen, z związanym z nowotworem antygenem, z przeciwciałem lub z cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T, i (ii) wykrywanie tworzenia się kompleksu między czynnikiem i kwasem nukleinowym, związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią, przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T. Wykrywanie to korzystnie jest przyrównywane do wykrywania w porównywalnej prawidłowej biologicznej próbce. Choroba wykrywana czynnikiem według wynalazku charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i w którym wykrywanie obejmuje wykrycie dwóch lub więcej kwasów nukleinowych kodujących te dwa lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów, wykrywanie wspomnianych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów, wykrywanie dwóch lub więcej przeciwciał wiążących się do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub wykrywanie dwóch lub więcej cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T specyficznych dla tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów. Kwas nukleinowy jest według wynalazku wykrywany przy użyciu sondy polinukleotydowej, która hybrydyzuje specyficznie z tym kwasem nukleinowym, przy czym korzystnie sonda polinukleotydowa zawiera sekwencję 6-50 przylegających do siebie nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen. Także korzystnie kwas nukleinowy jest wykrywany poprzez selektywną amplifikację tego kwasu nukleinowego.
Czynnik według wynalazku charakteryzuje się tym, że związany z nowotworem antygen lub jego część, aby mogły być wykryte są w postaci kompleksu z cząsteczką MHC, gdzie korzystnie tą cząsteczką MHC jest cząsteczka HLA.
Według wynalazku związany z nowotworem antygen jest wykrywany przy użyciu przeciwciała wiążącego się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu. Przeciwciało jest wykrywane przy zastosowaniu białka lub peptydu wiążącego się specyficznie do tego przeciwciała. W korzystnym rozwiązaniu sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko, lub peptyd lub komórka są znakowane
PL 219 093 B1 w sposób pozwalający na wykrycie, przy czym wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
Czynnik według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że próbka zawiera płyn ustrojowy i/lub tkankę. Również korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym. Bardziej korzystnie przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym, lub ewentualnie przeciwciało jest fragmentem przeciwciała naturalnego. Wykrywaną poprzez czynnik według wynalazku chorobą jest rak.
Czynnik według wynalazku charakteryzuje się tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przedmiotem wynalazku jest także czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to czynnik jest czynnikiem do monitorowania próbki od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzenie zachorowania na tę chorobę, ze względu na jeden lub więcej parametrów wybranych z grupy składającej się z:
(i) ilość kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen, (ii) ilość związanego z nowotworem antygenu, (iii) ilość przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu, i (iv) ilość cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC, przy czym ten związany z nowotworem antygen ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Korzystnie oznacza się parametr(y) w pierwszej próbce, w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim punkcie czasowym i w którym przebieg choroby jest oznaczany przez porównanie dwóch próbek. Choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i w którym monitorowanie zawiera monitorowanie:
(i) ilości dwóch lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują wspomniane dwa lub więcej różne związane z nowotworem antygeny, (ii) ilości tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów, (iii) ilości dwóch lub więcej przeciwciał, które wiążą się do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i/lub (iv) ilości dwóch lub więcej cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla kompleksów pomiędzy wspomnianymi dwoma lub więcej różnymi związanymi z nowotworem antygenami lub ich częściami zawierającymi co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów i cząsteczkami MHC.
Zgodnie z powyżej opisanym czynnikiem według wynalazku ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana przy użyciu sondy polinukleotydowej, która hybrydyzuje specyficznie z tym kwasem nukleinowym, przy czym korzystnie polinukleotydowa sonda zawiera 6-50 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego ten związany z nowotworem antygen.
Ilość kwasu nukleinowego jest korzystnie monitorowana poprzez selektywne powielanie tego kwasu nukleinowego.
Również korzystnie, ilość związanego z nowotworem antygenu jest monitorowana przy użyciu przeciwciała wiążącego się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu, ewentualnie ilość przeciwciał jest monitorowana przy użyciu białka lub peptydu wiążącego się specyficznie do przeciwciała.
Według wynalazku także ilość cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T jest monitorowana przy użyciu komórek prezentujących kompleks pomiędzy związanym z nowotworem antygenem i cząsteczką MHC.
PL 219 093 B1
Według wynalazku sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie, przy czym wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym. Zgodnie z wynalazkiem w zakresie opisanego powyżej czynnika do zastosowania w sposobie diagnozowania próbka zawiera płyn ustrojowy i/lub tkankę.
W przypadku gdy oznaczana przez czynnik według wynalazku ilość związanego z nowotworem antygenu jest monitorowana przy użyciu przeciwciała, przeciwciało to korzystnie jest przeciwciałem monoklonalnym, ewentualnie może być przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym, lub ewentualnie może być fragmentem naturalnego przeciwciała. Chorobą jest korzystnie rak.
Czynnik według wynalazku charakteryzuje się tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przedmiotem wynalazku jest także cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T do zastosowania w sposobie leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym te cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T otrzymuje się sposobem obejmującym etapy takie że:
(i) pobiera się próbkę zawierającą immunoreaktywne komórki od tego pacjenta, i (ii) kontaktuje się tę próbkę z komórką gospodarza z ekspresją tego związanego z nowotworem antygenu lub jego częścią w warunkach które sprzyjają wytwarzaniu cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, skierowanych przeciw temu związanemu z nowotworem antygenowi lub jego części i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje ponadto takie etapy, że:
wprowadza się cytolityczne lub wydzielające cytokiny komórki T pacjentowi w ilości odpowiedniej do przeprowadzenia lizy komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego części przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów tego związanego z nowotworem antygenu, mającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
W wymienionej komórce gospodarza cząsteczka HLA wiążąca się do związanego z nowotworem antygenu, ulega ekspresji metodą rekombinacji, korzystnie w komórce gospodarza endogennie zachodzi ekspresja cząsteczki HLA wiążącej się do związanego z nowotworem antygenu lub do jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu. Chorobą jest korzystnie rak.
Cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T według wynalazku charakteryzują się tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przedmiotem wynalazku jest również komórka gospodarza lub jej wyciąg do zastosowania w sposobie leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym wspomniane komórki gospodarza lub ich wyciąg otrzymuje się w sposobie obejmującym takie etapy, że:
(i) identyfikuje się kwas nukleinowy, którego ekspresja zachodzi w komórkach związanych z tą chorobą, przy czym ten kwas nukleinowy wybrany jest z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), (ii) transfekowania komórki gospodarza tym kwasem nukleinowym lub jego częścią, (iii) hodowania transfekowanej komórki gospodarza w celu ekspresji tego kwasu nukleinowego i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje wprowadzenie komórek gospodarza lub ich ekstraktu pacjentowi w ilości odpowiedniej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na komórki pacjenta związane z chorobą.
PL 219 093 B1
Powyższy sposób obejmuje ponadto identyfikowanie cząsteczki MHC prezentującej związany z nowotworem antygen lub jego część zawierającą co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu, z komórką gospodarza w której zachodzi ekspresja zidentyfikowanej cząsteczki MHC i prezentującej związany z nowotworem antygen lub jego część. Odpowiedź immunologiczna obejmuje odpowiedź komórki B lub odpowiedź komórki T.
Według wynalazku odpowiedź immunologiczna jest odpowiedzią komórki T, obejmującą wytwarzanie cytolitycznych komórek T lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla komórek gospodarza prezentujących związany z nowotworem antygen lub jego część lub specyficzne dla komórek pacjenta, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
Komórka gospodarza lub jej wyciąg według wynalazku korzystnie charakteryzuje się tym, że komórki gospodarza są nieproliferacyjne, oraz że korzystnie chorobą jest rak.
Komórka gospodarza lub jej wyciąg według wynalazku charakteryzuje się ponadto tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137. Przedmiotem wynalazku są również komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu do zastosowania w sposobie leczenia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, które to komórki otrzymuje się sposobem obejmującym takie etapy że:
(i) identyfikuje się komórki od pacjenta, u którego zachodzi ekspresja nieprawidłowych ilości związanego z nowotworem antygenu (ii) izoluje się próbkę tych komórek, i (iii) hoduje się te komórki; i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje takie etapy, że wprowadza się te komórki do pacjenta w ilości odpowiedniej do wyzwolenia odpowiedzi immunologicznej na te komórki, przy czym wspomniany związany z nowotworem antygen mający sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, jest wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu do zastosowania w sposobie leczenia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, według wynalazku, korzystnie chorobą leczoną jest rak. Związany z nowotworem antygen korzystnie zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przedmiotem wynalazku jest także kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającego się z SEQ ID Nr: 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Przedmiotem wynalazku jest również kwas nukleinowy, który koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, która zawiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano powyżej. W korzystnej realizacji wynalazku ta cząsteczka zrekombinowanego DNA jest wektorem, bardziej korzystnie jest wektorem wirusowym lub bakteriofagiem.
Cząsteczka zrekombinowanego DNA według wynalazku zawiera ponadto sekwencję kontrolną ekspresji, która kontroluje ekspresję kwasu nukleinowego lub region promotorowy który pochodzi z sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119. Wymienione sekwencje kontrolne ekspresji są homologiczne lub heterologiczne w stosunku do kwasu nukleinowego.
PL 219 093 B1
Komórka gospodarza, według wynalazku zawiera kwas nukleinowy zdefiniowany powyżej lub zrekombinowaną cząsteczkę DNA jak również zdefiniowano powyżej.
Komórka gospodarza według wynalazku korzystnie zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA.
Przedmiotem wynalazku jest także białko lub polipeptyd, które są kodowane przez kwas nukleinowy jak zdefiniowano powyżej.
Przedmiotem wynalazku jest również białko lub polipeptyd, które zawierają sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Wynalazek dotyczy także przeciwciała, które wiąże się specyficznie do białka lub do polipeptydu, lub związanego z nowotworem antygenu, przy czym białko lub polipeptyd lub związany z nowotworem antygen kodowane są przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Przeciwciało według wynalazku jeśli jest sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym jest do zastosowania w sposobie leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby charakteryzującej się nieprawidłową ekspresją związanego nowotworem antygenu, gdzie wspomniany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który wybrany jest z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Korzystnie białko, polipeptyd lub związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Korzystnie jest także jeśli przeciwciało według powyżej opisanego wynalazku jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała.
Przedmiotem wynalazku jest również przeciwciało, które wiąże się selektywnie do kompleksu:
(i) białka lub polipeptydu lub jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów tego białka lub polipeptydu i (ii) cząsteczki MHC, do której wiąże się białko lub polipeptyd lub jego część, z przeciwciałem, które nie wiąże się do samego (i) lub (ii) i to białko lub polipeptyd kodowane są przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
Wspomniane w wynalazku białko lub polipeptyd, korzystnie zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
Przeciwciało, według wynalazku korzystnie jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała.
Przedmiotem wynalazku jest także produkt sprzęgania przeciwciała jak zdefiniowano powyżej i czynnika terapeutycznego lub diagnostycznego, przy czym również korzystnie czynnik terapeutyczny lub diagnostyczny jest toksyną.
Przedmiotem wynalazku jest także zestaw do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji związanego z nowotworem antygenu, który charakteryzuje się tym, że zestaw zawiera czynniki do detekcji:
(i) kwasu nukleinowego kodującego ten związany z nowotworem antygen, (ii) związanego z nowotworem antygenu lub jego części,
PL 219 093 B1 (iii) przeciwciała, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu, i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki MHC, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów tego związanego z nowotworem antygenu mającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
(a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ostrych warunkach hybrydyzacji, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
W zestawie według wynalazku czynniki do wykrywania kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen są cząsteczkami kwasu nukleinowego do selektywnej amplifikacji tego kwasu nukleinowego.
Również korzystnie w zestawie według wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego do selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego zawierają sekwencję 6-50 przylegających do siebie nukleotydów kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen.
Wynalazek ogólnie dotyczy zatem strategii identyfikowania genów specyficznych tkankowo, ulegających ekspresji w zróżnicowany sposób w nowotworach. Ta strategia łączy eksplorację danych publicznych bibliotek sekwencji („in silco) z następującymi po tym oceniającymi badaniami laboratoryjno-doświadczalnymi („wet bench”).
Strategię tą oparto na dwóch różnych bioinformatycznych skryptach pozwalających identyfikować nowe geny nowotworowe. Były one poprzednio sklasyfikowane jako narządowo słabo specyficzne. Odkrycie, że te geny są nieprawidłowo aktywowane w komórkach nowotworowych pozwala, żeby wyznaczyć im istotnie nową jakość z funkcjonalnymi następstwami. Zgodnie z wynalazkiem, te związane z nowotworem geny i kodowane genetyczne produkty były identyfikowane i dostarczane niezależnie od immunogenicznego działania.
Związane z nowotworem antygeny zidentyfikowane według wynalazku mają sekwencję aminokwasów zakodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 7-8, 117 i 119, jego część lub pochodną, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ściśle kontrolowanych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), oraz (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c). W preferowanej postaci, związany z nowotworem antygen zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, ma sekwencję aminokwasów kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 7-8, 117 i 119. W kolejnej preferowanej postaci, związany z nowotworem antygen, zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, ma sekwencję aminokwasów kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 111-116 i 137, jego część lub pochodną.
Ogólnie niniejszy wynalazek dotyczy użycia do terapii i diagnozy związanych z nowotworem antygenów, zidentyfikowanych zgodnie z wynalazkiem lub ich części lub pochodnych, kodujących je kwasów nukleinowych lub kwasów nukleinowych skierowanych przeciwko tym kodującym kwasom nukleinowym lub przeciwciał skierowanych przeciwko związanym z nowotworem antygenom, zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem lub ich częściom lub pochodnym. Te zastosowania do diagnozy, terapii i kontroli postępu, mogą odnosić się do poszczególnych, ale także mogą odnosić się do kombinacji dwóch lub więcej tych antygenów, funkcjonalnych fragmentów, kwasów nukleinowych, przeciwciał etc, w pewnej postaci także w kombinacji z innymi związanymi z nowotworem genami i antygenami.
Chorobami preferowanymi do terapii i/lub diagnozy są te, w których jeden lub więcej związanych z nowotworem antygenów zidentyfikowanych zgodnie z wynalazkiem ulega selektywnej ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji.
Wynalazek dotyczy także kwasów nukleinowych i produktów genetycznych, których ekspresja zachodzi w powiązaniu z komórką nowotworu.
W dalszej kolejności wynalazek odnosi się do produktów genetycznych, tj. kwasów nukleinowych i białek lub peptydów wytwarzanych przez alternatywne składanie RNA znanych genów (warianty składania) lub zmienioną translację przy użyciu alternatywnych otwartych ramek odczytu. W tym aspekcie wynalazek dotyczy kwasów nukleinowych, które zawierają sekwencję kwasów nukleinowych
PL 219 093 B1 wybraną z grupy składającej się z sekwencji zgodnej z SEQ ID Nr: 3-5 listy sekwencji. Ponadto, w tym aspekcie, wynalazek dotyczy białek lub peptydów, które zawierają sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z listy sekwencji zgodnej z Nr: 10 i 12-14 listy sekwencji. Będące przedmiotem wynalazku warianty składania mogą być użyte zgodnie z wynalazkiem jako cele diagnozy i terapii chorób nowotworowych.
W szczególności wynalazek dotyczy sekwencji aminokwasów zgodnej z listą sekwencji SEQ ID Nr: 10, która jest kodowana przez alternatywną otwartą ramkę odczytu zidentyfikowaną zgodnie z wynalazkiem i różni się od poprzednio opisanej sekwencji białka (SEQ ID Nr: 9) dodatkowymi 85 aminokwasami na N końcu białka.
Bardzo odmienne mechanizmy mogą powodować, że wytwarzane są warianty składania, na przykład:
- używanie zmiennych miejsc inicjacji transkrypcji,
- używanie dodatkowych eksonów,
- całkowite lub niecałkowite składanie poza jednym lub dwoma lub więcej eksonami,
- zmienione regulatorowe sekwencje składania poprzez mutację (delecja lub wytwarzanie nowych sekwencji donor/akceptor),
- niecałkowita eliminacja sekwencji intronu.
Alternatywne składanie genu powoduje zmienioną sekwencję transkryptu (wariant składania). Translacja wariantu składania w regionie jego zmienionej sekwencji daje w wyniku zmienione białko, którego struktura i działanie może różnić się wyraźnie od oryginalnego białka. Związane z nowotworem warianty składania mogą wytwarzać związane z nowotworem transkrypty i związane z nowotworem białka/antygeny. Mogą być one używane jako molekularne wskaźniki zarówno do wykrywania komórek nowotworu jak i do terapeutycznego atakowania nowotworu. Wykrywanie komórek nowotworowych, np. we krwi, surowicy, szpiku kostnym, płynie z płukania oskrzeli, wydzielinach ciała i próbkach pobranych w wyniku biopsji, może być przeprowadzane zgodnie z wynalazkiem, na przykład po ekstrakcji kwasów nukleinowych, przy użyciu powielania PCR ze specyficznymi dla wariantu składania oligonukleotydami. W szczególności, pary starterów są właściwe, kiedy oligonukleotydy, przynajmniej jeden z nich, wiążą się w ściśle kontrolowanych warunkach do regionu wariantu składania, który jest związany z nowotworem. Zgodnie z wynalazkiem, do takiego celu odpowiednie są oligonukleotydy opisane w przykładach, w szczególności oligonukleotydy, które mają lub zawierają sekwencję wybraną z listy sekwencji SEQ ID Nr: 34-36, 39, 40 oraz 107-110. Zgodnie z wynalazkiem, wszystkie zależne od sekwencji systemy wykrywania są właściwe do wykrywania. Na przykład, są nimi oprócz PCR, chip genowy/systemy mikromacierzy, Northern blot, test ochrony przed RNazą (ang. RNAse protection assays) (RDA) i inne. We wszystkich systemach detekcji, wspólną cechą jest, że są one oparte na specyficznej hybrydyzacji z przynajmniej jedną sekwencją kwasu nukleinowego specyficzną dla wariantu składania. Jednakże, zgodnie z wynalazkiem komórki nowotworowe mogą także być wykrywane przez przeciwciała, które rozpoznają specyficzny epitop kodowany przez wariant składania. Te przeciwciała mogą być otrzymane przy użyciu peptydów immunizujących, które są specyficzne dla tego wariantu składania. W tym aspekcie wynalazek w szczególności dotyczy peptydów, które mają lub zawierają sekwencję wybraną z listy sekwencji SEQ ID Nr: 17-19, 111-115, 120 i 137 i specyficznych przeciwciał, które są skierowane do tego. Szczególnie odpowiednie do immunizacji są aminokwasy, których epitopy są wyraźnie różne od wariantu(ów) produktu genetycznego, który jest(są) chętniej wytwarzany(e) w zdrowych komórkach. Detekcja komórek nowotworowych przy użyciu przeciwciał może być tutaj przeprowadzona w próbce wyizolowanej od pacjenta albo jako odwzorowanie z dożylnym podaniem przeciwciał. Oprócz użyteczności diagnostycznej, warianty składania mające nowe lub zmienione epitopy są atrakcyjnym celem immunoterapii. Będące przedmiotem wynalazku epitopy mogą być używane dla docelowych aktywnych terapeutycznie monoklonalnych przeciwciał lub limfocytów T. W pasywnej immunoterapii, przeciwciała lub limfocyty T, które rozpoznają specyficzne epitopy wariantów składania są przenoszone tutaj adopcyjnie. Tak jak w przypadku innych antygenów, przeciwciała mogą być wytwarzane także przy użyciu standardowych technologii (immunizacja zwierząt, strategie panoramowania do izolacji zrekombinowanych przeciwciał) przy użyciu polipeptydów, które zawierają te epitopy. Alternatywnie, możliwe jest użycie do immunizacji kodujących kwasów nukleinowych dla oligo- lub polipeptydów zawierających te epitopy. Różne techniki wytwarzania in vivo i in vitro, specyficznych dla epitopu limfocytów T są znane i zostały opisane w szczegółach (na przykład Kessler JH, i wsp., 2001, Sahin i wsp., 1997). Są one także oparte na stosowaniu oligo i polipeptydów, które zawierają specyficzne warianty składania epitopów lub kwasów nukleinowych kodująPL 219 093 B1 cych te oligo- lub polipeptydy. Oligo- lub polipeptydy, które zawierają warianty składania specyficznych epitopów mogą także być użyte jako substancje aktywne farmaceutycznie w aktywnej immunoterapii (szczepienie, terapia szczepionką).
Niniejszy wynalazek opisuje także białka, które różnią się między normalną i nowotworową tkanką naturą i stopniem ich drugorzędowych modyfikacji (na przykład Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res. 56: 5309-18).
Analiza modyfikacji białek może być wykonana przy użyciu Western blot. W szczególności, glikozylacje, które z reguły mają rozmiar kilku kDa powodują zwiększenie całkowitej masy docelowego białka, które może być wyizolowane przy użyciu SDS-PAGE. Do wykrywania specyficznych O- lub N-glikozydowych wiązań białek, przed denaturacją z użyciem SDS, lizaty są inkubowane z O- lub N-glikozylazami (zgodnie z instrukcją odpowiedniego producenta, na przykład Pngase, endoglikozydaza F, endoglikozydaza H, Roche Diagnostic). Po tym przeprowadzany jest Western blot. Jeżeli rozmiar docelowego białka jest zmniejszony, specyficzna glikozylacja może być wykryta po inkubacji z glikozydazą i w ten sposób także może być analizowana specyficzność modyfikacji względem nowotworu. Szczególnie interesujące są regiony białek, które są glikozylowane odmiennie w nowotworowych i w zdrowych komórkach. Jednak takie różnice w glikozylacji zostały dotychczas opisane tylko dla kilku powierzchniowych białek komórkowych (na przykład Mucl).
Zgodnie z wynalazkiem, możliwe było wykrycie w nowotworach zróżnicowanej glikozylacji dla Claudin-18. Nowotwory żołądkowo-jelitowe, nowotwory trzustki, nowotwory przełyku, nowotwory prostaty oraz nowotwory płuc mają formę Claudin-18, która jest glikozylowana na niskim poziomie. Glikozylacja w zdrowych tkankach maskuje białkowe epitopy Claudin-18, które w komórkach nowotworowych nie są pokryte, w związku z brakiem glikozylacji. Odpowiednio, możliwe jest, zgodnie z wynalazkiem, wybranie ligandów i przeciwciał, które wiążą się do tych domen. Takie ligandy i przeciwciała, zgodnie z wynalazkiem, nie wiążą się do Claudin-18 w zdrowych komórkach, ponieważ tutaj z powodu glikozylacji epitopy są pokryte.
Jak to opisano powyżej, dla epitopów białkowych, które są pochodnymi związanych z nowotworem wariantów składania, dla celów diagnostycznych i terapeutycznych, możliwe jest użycie różnicującej glikozylacji, do rozróżniania komórek normalnych i nowotworowych.
W pewnym aspekcie wynalazek dotyczy farmaceutycznej kompozycji zawierającej czynnik, który rozpoznaje, zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, związany z nowotworem antygen i który, dobrze jeżeli jest selektywny w stosunku do komórek, w których zachodzi ekspresja lub nieprawidłowa ekspresja związanego z nowotworem antygenu, zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem. W szczególnych postaciach czynnik ten może powodować śmierć komórek, zmniejszenie wzrostu komórek, uszkodzenie błony komórkowej lub sekrecję cytokin i wskazane, żeby miał aktywność hamującą nowotwór. W pewnej postaci, czynnik jest nonsensownym kwasem nukleinowym, który selektywnie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen. W kolejnej postaci, czynnik jest przeciwciałem, które wiąże się selektywnie ze związanym z nowotworem antygenem, w szczególności aktywowanym dopełniaczem lub przeciwciałem sprzężonym z toksyną, które wiąże się selektywnie do antygenu związanego z nowotworem. W kolejnej postaci, czynnik zawiera dwa lub więcej czynników, z których każdy selektywnie rozpoznaje różne związane z nowotworem antygeny, z których przynajmniej jeden jest związanym z nowotworem antygenem identyfikowanym zgodnie z wynalazkiem. Rozpoznawaniu nie musi bezpośrednio towarzyszyć hamowanie aktywności lub ekspresji antygenu. W tym aspekcie wynalazku, antygen selektywnie ograniczony do nowotworów, korzystnie służy jako oznakowanie dla mechanizmów pozyskiwania efektora dla tej specyficznej lokalizacji. W preferowanej postaci, czynnik jest cytotoksycznym limfocytem T, który rozpoznaje antygen na cząsteczce HLA i lizuje znakowane w ten sposób komórki. W dalszej postaci, czynnik jest przeciwciałem, które selektywnie wiąże się do związanego z nowotworem antygenu i w ten sposób pozyskuje naturalne lub sztuczne mechanizmy efektorowe dla tej komórki. W dalszej postaci, czynnik jest pomocniczym limfocytem T specyficznie rozpoznającym ten antygen, który poprawia efektorowe funkcje innych komórek.
W pewnej postaci, wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej czynnik, który hamuje ekspresję lub aktywność związanego z nowotworem identyfikowanego zgodnie z wynalazkiem antygenu. W preferowanej postaci, czynnik jest nonsensownym kwasem nukleinowym, który hybrydyzuje selektywnie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen. W dalszej postaci, czynnik jest przeciwciałem, które wiąże się selektywnie ze związanym z nowotworem antygenem. W kolejnej postaci, czynnik zawiera dwa lub więcej czynniki, z których każdy selektywnie hamuje
PL 219 093 B1 ekspresję lub aktywność różnych związanych z nowotworem antygenów, z których przynajmniej jeden jest związanym z nowotworem antygenem zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem. W dalszej kolejności wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera czynnik, który kiedy jest podany, selektywnie zwiększa ilość kompleksów cząsteczki HLA i peptydowego epitopu ze związanego z nowotworem, zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem antygenu. W pewnej postaci, czynnik zawiera jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z (i) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje ten związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (iv) izolowanych kompleksów peptydowych epitopów tego związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC. W pewnej postaci, czynnik zawiera dwa lub więcej czynników, z których każdy selektywnie zwiększa ilość kompleksów cząsteczek MHC i peptydowych epitopów różnych związanych z nowotworem antygenów, z których przynajmniej jeden jest antygenem związanym z nowotworem zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem.
W dalszej kolejności wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej, która zawiera jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z (i) zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (iv) nonsensownego kwasu nukleinowego, który specyficznie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym zidentyfikowany z zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen, (v) komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (vi) izolowanego kompleksu zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki HLA.
Kwas nukleinowy kodujący zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen lub jego część może być obecny w kompozycji farmaceutycznej w wektorze ekspresyjnym i może być funkcjonalnie połączony z promotorem.
Komórka gospodarza, obecna w będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej, może wydzielać związany z nowotworem antygen lub jego część, ekspresja antygenu może zachodzić na powierzchni lub może dodatkowo zachodzić ekspresja cząsteczki HLA, która wiąże się do tego związanego z nowotworem antygenu lub do tej jego części. W pewnej postaci, w komórce gospodarza ekspresja HLA zachodzi endogennie. W kolejnej postaci, w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części zachodzi metodą rekombinacji. Korzystnie, jeżeli komórka gospodarza jest nieproliferacyjna. W preferowanej postaci, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.
Przeciwciało obecne w będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach, przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym fragmentem naturalnego przeciwciała lub syntetycznym przeciwciałem, z których każde może być otrzymane technikami kombinatoryjnymi. Przeciwciało może być przyłączone do czynnika użytecznego terapeutycznie lub diagnostycznie.
Nonsensowny kwas nukleinowy znajdujący się w będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej może zawierać sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem związany z nowotworem antygen.
W kolejnych postaciach, związany z nowotworem antygen, dostarczany poprzez będącą przedmiotem wynalazku kompozycję farmaceutyczną, albo bezpośrednio albo przez ekspresję kwasu nukleinowego, lub jego część, wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, korzystnie, żeby to było wiązanie powodujące cytolityczną reakcję i/lub indukujące uwalnianie cytokiny.
Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna, może zawierać farmaceutycznie kompatybilny nośnik i/lub adiuwant. Adiuwant może być wybrany z: saponiny, GM-CSF, nukleotydów CpG, RNA, cytokiny lub chemokiny. Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna jest chętnie używana do leczenia choroby charakteryzującej się selektywną ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu. W preferowanej postaci, chorobą jest rak.
Ponadto wynalazek dotyczy metod leczenia lub diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów.
PL 219 093 B1
W pewnej postaci, leczenie obejmuje podawanie będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej.
W pewnym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem. Sposób obejmuje wykrywanie (i) kwasu nukleinowego, który koduje antygen związany z nowotworem lub jego część i/lub (ii) wykrywanie antygenu związanego z nowotworem lub jego części, i/lub (iii) wykrywanie przeciwciała dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części i/lub (iv) wykrywanie w izolowanej od pacjenta próbce biologicznej cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T, które są specyficzne dla związanego z nowotworem antygenu lub dla jego części. W szczególnych postaciach wykrywanie obejmuje (i) kontaktowanie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen lub jego część, z tym związanym z nowotworem antygenem lub tą jego częścią, z przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T specyficznymi dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (ii) wykrywanie tworzenia kompleksu czynnika z kwasem nukleinowym lub jego częścią, związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią, przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T. W pewnej postaci choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i wykrywanie obejmuje wykrywanie dwóch lub więcej kwasów nukleinowych kodujących te dwa lub więcej związane z nowotworem antygeny lub ich części, wykrywanie dwóch lub więcej związanych z nowotworem antygenów lub ich części, wykrywanie dwóch lub więcej przeciwciał wiążących te dwa lub więcej różne związane z nowotworem antygeny lub ich części lub wykrywanie dwóch lub więcej cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T specyficznych w stosunku do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów. W dalszej postaci, wyizolowana od pacjenta próbka biologiczna jest porównywana z normalną porównawczą próbką biologiczną.
W kolejnym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który to sposób znany tym, że monitoruje się próbki od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzany, że podlega tej chorobie, z uwzględnieniem jednego lub więcej parametrów wybranych z grupy składającej się z (i) ilość kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (ii) ilość antygenu związanego z nowotworem lub jego część, (iii) ilość przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu lub jego część i (iv) ilość cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki MHC. Korzystnie, jeżeli sposób zawiera oznaczanie parametru(ów) w pierwszej próbce w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim z kolei punkcie czasowym i w którym przebieg choroby jest oznaczony przez porównanie dwóch próbek. W szczególnych postaciach, choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i monitorowanie obejmuje monitorowanie (i) ilości dwóch lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują te dwa lub więcej różne, związane z nowotworem antygeny lub ich części i/lub (ii) ilości tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub ich części i/lub (iii) ilości dwóch lub więcej przeciwciał, które wiążą się do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub ich części i/lub (iv) ilości dwóch lub więcej cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksów tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub ich części i cząsteczek MHC.
Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie kwasu nukleinowego lub jego części lub monitorowanie kwasu nukleinowego lub jego części może być przeprowadzone przy użyciu sondy polinukleotydowej, która specyficznie hybrydyzuje z tym kwasem nukleinowym lub tą jego częścią lub może być przeprowadzone przez selektywne powielanie tego kwasu nukleinowego lub jego części. W pewnej postaci, sonda polinukleotydowa zawiera 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów tego kwasu nukleinowego.
W szczególnych postaciach, związany z nowotworem antygen lub jego część, żeby był wykryty jest prezentowany wewnątrz lub na powierzchni komórki. Zgodnie z wynalazkiem wykrywanie związanego z nowotworem antygenu lub jego części lub monitorowanie ilości związanego z nowotworem antygenu lub jego części może być przeprowadzone przy użyciu przeciwciała specyficznie wiążącego się do tego związanego z nowotworem antygenu lub tej jego części.
PL 219 093 B1
W dalszych postaciach, związany z nowotworem antygen lub jego część, żeby był wykryty jest prezentowany w kompleksie z cząsteczką MHC, w szczególności z cząsteczką HLA.
Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie przeciwciała lub monitorowanie ilości przeciwciał może być przeprowadzone przy użyciu białka lub peptydu specyficznie wiążącego się do tego przeciwciała.
Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T lub monitorowanie cytolitycznych komórek T lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla kompleksów antygenu lub jego części i cząsteczek MHC, może być przeprowadzone przez użycie komórki prezentującej kompleks tego antygenu lub tej jego części i cząsteczki MHC.
Wskazane, żeby sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd lub komórka, które są użyte do wykrywania lub monitorowania, były znakowane w sposób pozwalający na wykrycie. W szczególnych postaciach, dający się wykrywać wskaźnik jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym. Limfocyty T mogą być dodatkowo wykrywane poprzez wykrywanie ich proliferacji, wytwarzania przez nie cytokin i wyzwalania ich specyficznej cytotoksycznej aktywności wywoływanej przez specyficzną stymulację kompleksem MHC i związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Limfocyty T mogą także być wykrywane przez zrekombinowaną cząsteczkę MHC lub jeszcze przez kompleks dwóch lub więcej cząsteczek MHC, które są obciążone szczególnym immunogenicznym fragmentem jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów i które mogą identyfikować specyficzne limfocyty T przez kontakt ze specyficznym receptorem komórek T.
W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobów leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby, która charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje podawanie przeciwciała, które wiąże się do tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części i które jest połączone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym. Przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała naturalnego.
Wynalazek dotyczy także sposobów leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który to sposób zawiera (i) pobranie próbki zawierającej immunoreaktywne komórki od tego pacjenta, (ii) kontaktowanie tej próbki z komórką gospodarza, w której zachodzi ekspresja tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części w warunkach, które sprzyjają wytwarzaniu cytolitycznych komórek T przeciw temu związanemu z nowotworem antygenowi lub jego części, (iii) wprowadzenie cytolitycznych komórek T pacjentowi w ilości odpowiedniej do wywołania lizy komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Wynalazek dotyczy również klonowania receptora komórkowego T komórek cytolitycznych T przeciwko związanemu z nowotworem antygenowi. Ten receptor może być transferowany do innych komórek T, które w ten sposób otrzymają pożądaną specyficzność i mogą być wprowadzone pacjentowi.
W pewnej postaci, w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA zachodzi endogennie. W kolejnej postaci, w komórce gospodarza zachodzi rekombinacyjna ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części. Wskazane, żeby komórka gospodarza była komórką nieproliferacyjną. W preferowanej postaci, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.
W następnym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje (i) identyfikowanie kwasu nukleinowego, który koduje zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, związany z nowotworem antygen i którego ekspresja zachodzi w komórkach związanych z tą chorobą, (ii) transfekowanie komórki gospodarza tym kwasem nukleinowym lub jego częścią, (iii) hodowanie transfekowanej komórki gospodarza w celu ekspresji tego kwasu nukleinowego (nie jest to konieczne, jeżeli otrzymuje się wysoki stopień transfekcji) i (iv) wprowadzenie komórek gospodarza lub ich ekstraktu pacjentowi w ilości odpowiedniej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej komórek pacjenta związanych z chorobą. Sposób może następnie zawierać identyfikowanie prezentującej związany z nowotworem antygen lub jego część cząsteczki MHC z komórki gospodarza, w której zachodzi ekspresja zidentyfikowanej i prezentującej ten związany z nowotworem antygen lub jego część cząsteczki MHC. Odpowiedź immunologiczna może zawierać odpowiedź komórki B lub odpowiedź komórki T. Co więcej, odpowiedź komórki T może zawierać wytwarzanie cytolitycznych komórek T i/lub pomocniczych komórek T, które są specyficzne dla komórek gospodarza prezentująPL 219 093 B1 cych związany z nowotworem antygen lub jego część lub specyficzne dla komórek pacjenta, w których zachodzi ekspresja tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
Wynalazek dotyczy także sposobu leczenia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu, który to sposób obejmuje (i) identyfikowanie komórek pacjenta, w których zachodzi ekspresja nieprawidłowych ilości związanego z nowotworem antygenu, (ii) izolowanie próbki tych komórek, (iii) hodowanie tych komórek i (iv) wprowadzenie tych komórek pacjentowi w ilości wystarczającej do wywołania odpowiedzi immunologicznej na te komórki.
Korzystnie, jeżeli komórki gospodarza użyte zgodnie z wynalazkiem są nieproliferacyjne lub są uczynione nieproliferacyjnymi. W szczególności, choroba charakteryzująca się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu jest rakiem.
W dalszej kolejności niniejszy wynalazek dotyczy kwasu nukleinowego wybranego z grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 3-5, jego części lub pochodnej, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ściśle kontrolowanych warunkach, (c) kwas nukleinowy, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwas nukleinowy, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c). W dalszej kolejności, wynalazek dotyczy kwasu nukleinowego, który koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 10 i 12-14, jego części lub pochodnej.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy sekwencji promotora będących przedmiotem wynalazku kwasów nukleinowych. Te sekwencje mogą być funkcjonalnie przyłączone do innego genu, lepiej w wektorze ekspresyjnym i w ten sposób zapewniają selektywną ekspresję tego genu w odpowiednich komórkach.
W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy cząsteczki zrekombinowanego kwasu nukleinowego, w szczególności cząsteczki DNA lub RNA, która zawiera będący przedmiotem wynalazku kwas nukleinowy.
Wynalazek dotyczy także komórek gospodarza, które zawierają będący przedmiotem wynalazku kwas nukleinowy lub cząsteczkę zrekombinowanego kwasu nukleinowego zawierającą będący przedmiotem wynalazku kwas nukleinowy.
Komórka gospodarza może także zawierać kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA. W pewnej postaci, ekspresja cząsteczki HLA w komórce gospodarza zachodzi endogennie. W dalszej postaci, w komórce gospodarza zachodzi ekspresja rekombinacyjna cząsteczki HLA i/lub będącego przedmiotem wynalazku kwasu nukleinowego lub jego części. Korzystnie, jeżeli komórka gospodarza jest nieproliferacyjna. W preferowanej postaci, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem.
W dalszej postaci wynalazek dotyczy oligonukleotydów, które hybrydyzują z kwasem nukleinowym zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem i które mogą być użyte jako genetyczne sondy lub jako cząsteczki „nonsensowne. Cząsteczki kwasów nukleinowych w formie oligonukleotydowych starterów lub kompetentnych próbek, które hybrydyzują ze zidentyfikowanym zgodnie z wynalazkiem kwasem nukleinowym lub z jego częściami, mogą być użyte do znajdowania kwasów nukleinowych, które są homologiczne do tego kwasu nukleinowego zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem. Do znajdowania homologicznych kwasów nukleinowych może być użyte powielanie PCR, hybrydyzacja Southern i Northern. Hybrydyzacja może być przeprowadzona w łagodnie kontrolowanych warunkach, lepiej umiarkowanie kontrolowanych a najlepiej w ściśle kontrolowanych warunkach. Zgodnie z wynalazkiem termin „ściśle kontrolowane warunki dotyczy warunków, które pozwalają na specyficzną hybrydyzację między polinukleotydami. W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy białka, polipeptydu lub peptydu, który jest kodowany przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 3-5, jego części lub pochodnej, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ściśle kontrolowanych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b) i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c). W preferowanej postaci, wynalazek dotyczy białka lub polipeptydu lub peptydu, który zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 10 i 12-14, jego części lub pochodnej.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy immunogenicznego fragmentu zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu. Wskazane, żeby ten fragment wiązał się do
PL 219 093 B1 ludzkiego receptora HLA lub do ludzkiego przeciwciała. Wskazane, żeby będący przedmiotem wynalazku fragment zawierał sekwencję przynajmniej 6, w szczególności przynajmniej 8, przynajmniej 10, przynajmniej 12, przynajmniej 15, przynajmniej 20, przynajmniej 30 lub przynajmniej 50 aminokwasów.
W tym aspekcie wynalazek w szczególności dotyczy peptydu, który ma lub zawiera sekwencję wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 i 135-137, jego części lub pochodnej.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy czynnika, który wiąże się do zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub do jego części. W preferowanej postaci czynnikiem jest przeciwciało. W dalszych postaciach przeciwciało jest chimerycznym humanizowanym przeciwciałem lub przeciwciałem wytwarzanym technikami kombinatoryjnymi lub jest fragmentem przeciwciała. Ponadto wynalazek dotyczy przeciwciała, które wiąże się selektywnie do kompleksu (i) zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem, związanego z nowotworem antygenu lub jego części i (ii) cząsteczki MHC, do której ten zidentyfikowany zgodnie z wynalazkiem, związany z nowotworem antygen lub ta jego część wiąże się, z tym przeciwciałem niewiążącym się do samego (i) lub do samego (ii). Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało może być przeciwciałem monoklonalnym. W dalszych postaciach przeciwciało jest chimerycznym lub humanizowanym przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała naturalnego.
W szczególności, wynalazek dotyczy takiego czynnika, w szczególności przeciwciała, które specyficznie wiąże się do peptydu, który ma lub zawiera sekwencję wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 17-19, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 120, 123, 124 i 135-137, jego części lub pochodnej.
Poza tym wynalazek dotyczy koniugatu będącego przedmiotem wynalazku czynnika, który wiąże się do zidentyfikowanego zgodnie z wynalazkiem związanego z nowotworem antygenu lub do jego części lub będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała i terapeutycznego lub diagnostycznego czynnika. W pewnej postaci terapeutycznym lub diagnostycznym czynnikiem jest toksyna.
W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy zestawu do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji związanego z nowotworem antygenu, który to zestaw zawiera czynniki do wykrywania (i) kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (ii) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (iii) przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu lub jego części i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki MHC. W pewnej postaci, czynniki do wykrywania kwasu nukleinowego lub jego części, są cząsteczkami kwasu nukleinowego do selektywnego powielania tego kwasu nukleinowego, który w szczególności zawiera sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów tego kwasu nukleinowego.
Szczegółowy opis wynalazku
Zgodnie z wynalazkiem opisane są geny, które selektywnie lub w sposób odbiegający od normy podlegają ekspresji w komórkach nowotworu i które są związanymi z nowotworem antygenami.
Zgodnie z wynalazkiem, te geny i/lub ich genetyczne produkty i/lub ich pochodne i/lub części są preferowanymi docelowymi strukturami do zastosowań terapeutycznych. Jeśli chodzi o koncepcję, te terapeutyczne zastosowania mogą mieć na celu hamowanie aktywności selektywnie zachodzącej ekspresji związanego z nowotworem produktu genetycznego. Jest użyteczne, jeżeli ta odbiegająca od normy lub selektywna ekspresja jest funkcjonalnie ważna w patogenezie nowotworu i jeżeli ligacji produktu genu towarzyszy selektywne uszkodzenie odpowiadających komórek. Inne terapeutyczne koncepcje rozważają związane z nowotworem antygeny jako znaczniki, które włączają mechanizmy efektora mające możliwość selektywnego uszkadzania komórek nowotworu. Tu działanie samych w sobie docelowych cząsteczek i ich rola w rozwoju nowotworu są całkowicie oderwane.
Zgodnie z wynalazkiem „pochodna kwasu nukleinowego oznacza, że pojedyncze lub wielokrotne nukleotydowe podstawienia, delecje i/lub addycje są obecne w tym kwasie nukleinowym. Poza tym termin „pochodna zawiera także chemiczną derywatyzację kwasu nukleinowego lub zasady nukleotydowej na cukrze lub na fosforanie. Termin „pochodna obejmuje także kwasy nukleinowe, które zawierają nukleotydy lub analogi nukleotydów nie występujące naturalnie.
Zgodnie z wynalazkiem korzystnie, jeżeli kwasem nukleinowym jest kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA) lub rybonukleinowy (RNA). Zgodnie z wynalazkiem kwasy nukleinowe zawierają wytworzone rekombinacyjnie i zsyntetyzowane chemicznie cząsteczki genomowego DNA, cDNA, mRNA. Zgodnie z wynalazkiem kwas nukleinowy może być obecny jako jedno niciowy i dwu niciowy oraz liniowa i kowalentna koliście zamknięta cząsteczka.
PL 219 093 B1
Wskazane, żeby opisane zgodnie z wynalazkiem kwasy nukleinowe zostały izolowane. Zgodnie z wynalazkiem termin „izolowany kwas nukleinowy oznacza, że kwas nukleinowy był (i) powielany in vitro, na przykład przez reakcję łańcuchową z polimerazą (PCR), (ii) rekombinacyjnie otrzymany przez klonowanie, (iii) oczyszczony, na przykład przez cięcie i elektroforetyczne frakcjonowanie na żelu lub (iv) syntetyzowany, na przykład w drodze syntezy chemicznej. Izolowany kwas nukleinowy jest kwasem nukleinowym, który jest dostępny do manipulowania technikami rekombinacji DNA.
Kwas nukleinowy jest „komplementarny do innego kwasu nukleinowego, jeżeli dwie cząsteczki są zdolne do hybrydyzacji i do tworzenia jedna z drugą stabilnego dupleksu, korzystnie, jeżeli hybrydyzacja jest przeprowadzana w warunkach, które pozwalają na specyficzną hybrydyzację między polinukleotydami (ściśle kontrolowane warunki). Ściśle kontrolowane warunki są na przykład opisane w Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook i wsp., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i wsp., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i odwołują się na przykład do hybrydyzacji w 65°C w buforze hybrydyzacyjnym (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% poliwinylopirolidon, 0,02 albumina surowicy wołowej, 2,5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0,5 SDS, 2 mM EDTA). SSC jest to 0,15 M chlorek sodu/0,15 M cytrynian sodu, pH 7. Po hybrydyzacji, błona, na którą DNA został transferowany, jest przemywana, na przykład 2 xSSC w temperaturze pokojowej i później w 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS w temperaturze do 68°C.
Zgodnie z wynalazkiem, komplementarne kwasy nukleinowe mają przynajmniej 40%, w szczególności przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80%, przynajmniej 90%, korzystnie przynajmniej 95%, przynajmniej 98%, przynajmniej 99% identycznych nukleotydów.
Kwasy nukleinowe kodujące związane z nowotworem antygeny, zgodnie z wynalazkiem mogą być obecne same lub w połączeniu z innymi kwasami nukleinowymi, w szczególności z heterologicznymi kwasami nukleinowymi. W preferowanych postaciach, kwas nukleinowy jest funkcjonalnie połączony z sekwencjami kontrolnymi lub sekwencjami regulatorowymi ekspresji, które mogą być homologiczne lub heterologiczne w stosunku do tego kwasu nukleinowego. Sekwencja kodująca i sekwencja regulatorowa są wzajemnie „funkcjonalnie połączone. Jeżeli są połączone kowalencyjnie to w taki sposób, że ekspresja lub transkrypcja sekwencji kodującej jest pod kontrolą lub pod wpływem tej regulatorowej sekwencji. Jeżeli sekwencja kodująca ma ulegać translacji w białko funkcjonalne, wtedy indukcja tej sekwencji regulatorowej sekwencją regulatorową funkcjonalnie związaną z sekwencją kodującą daje w wyniku transkrypcję tej sekwencji kodującej, nie tworząc ramki odczytu w sekwencji kodującej lub ta sekwencja kodująca nie jest w stanie ulegać translacji w pożądane białko.
Termin „sekwencja kontrolna ekspresji lub „sekwencja regulatorowa, zgodnie z wynalazkiem, obejmuje promotory, enhancery i inne elementy kontrolne, które regulują ekspresję genu. W szczególnych postaciach wynalazku, sekwencje kontroli ekspresji mogą być regulowane. Dokładna struktura sekwencji regulatorowych może różnić się w zależności od gatunku lub typu komórek ale zazwyczaj posiada nie podlegające transkrypcji sekwencje 5' i nie podlegające translacji sekwencje b' które są włączone odpowiednio w inicjację transkrypcji i translacji, takie jak TATA box, sekwencja czapeczki, sekwencja CAAT i temu podobne. Bardziej specyficznie, nie podlegająca transkrypcji regulatorowa sekwencja 5' zawiera region promotora, który obejmuje sekwencję promotora do kontroli transkrypcji funkcjonalnie połączonego genu. Sekwencje regulatorowe mogą także zawierać sekwencje enhancera lub sekwencje aktywatora w pozycji powyżej.
Tak więc, zilustrowane tutaj, związane z nowotworem antygeny mogą być łączone ze wszystkimi sekwencjami kontroli ekspresji i promotorami. Z drugiej strony, zgodnie z wynalazkiem, zilustrowane tutaj promotory związanych z nowotworem produktów genetycznych mogą być łączone ze wszystkimi genami. To pozwala na wykorzystywanie selektywnej aktywności tych promotorów.
Zgodnie z wynalazkiem, kwas nukleinowy może poza tym występować w połączeniu z innym kwasem nukleinowym, który koduje polipeptyd kontrolujący sekrecję z komórki gospodarza białka lub polipeptydu kodowanego przez ten kwas nukleinowy. Zgodnie z wynalazkiem, kwas nukleinowy może występować także w połączeniu z innym kwasem nukleinowym, który koduje polipeptyd powodując, że kodowane białko lub polipeptyd jest umocowane na błonie komórkowej komórki gospodarza lub rozdzielane do poszczególnych organelli tej komórki. Podobnie możliwe jest, połączenie z kwasem nukleinowym, który reprezentuje gen reporterowy lub każdy „tag.
W preferowanej postaci, zgodnie z wynalazkiem, cząsteczka zrekombinowanego DNA jest wektorem, jeśli potrzeba z promotorem, który kontroluje ekspresję kwasu nukleinowego, na przykład kwasu nukleinowego kodującego będący przedmiotem wynalazku, związany z nowotworem antygen. Termin „wektor jest użyty tutaj w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i zawiera pośredni nośnik dla
PL 219 093 B1 kwasu nukleinowego, który umożliwia na przykład temu kwasowi nukleinowemu, żeby był wprowadzony do prokariotycznych i/lub eukariotycznych komórek i tam jeżeli potrzeba był zintegrowany z genomem. Wektory tego rodzaju są chętnie replikowane i ulegają ekspresji w komórkach. Pośredni nośnik może być adaptowany, na przykład, do użycia w elektroporacji, w bombardowaniu mikropociskami, w podawaniu liposomów, przy transferze przy pomocy agrobakterii lub przy wstawianiu poprzez DNA lub RNA wirusów. Wektory obejmują plazmidy, fagemidy lub genomy wirusowe.
Kwasy nukleinowe kodujące antygen, zidentyfikowane zgodnie z wynalazkiem, mogą być użyte do transfekcji komórek gospodarza. Tutaj kwasy nukleinowe oznaczają zarówno zrekombinowany DNA jak i RNA. Zrekombinowany RNA może być otrzymany przez transkrypcję in vitro matrycy DNA. Co więcej, może być on modyfikowany przed zastosowaniem przez sekwencje stabilizujące, dodawanie czapeczki i poliadenylację.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „komórka gospodarza dotyczy każdej komórki, która może być transformowana lub transfekowana egzogennym kwasem nukleinowym. Zgodnie z wynalazkiem, termin „komórka gospodarza obejmuje komórki priokariotyczne (np. E. coli) lub eukariotyczne (np. komórki dendrytyczne, komórki B, komórki CHO, komórki COS, komórki K562, komórki drożdży i komórki insektów). Szczególnie pierwszeństwo daje się komórkom ssaków, takich jak komórki ludzkie, mysie, chomików, świń, kóz, naczelnych. Komórki mogą pochodzić z różnych typów tkanek i zawierać komórki pierwotne i linie komórkowe.
Specyficzne przykłady obejmują kreatynocyty, leukocyty krwi obwodowej, komórki rdzeniowe szpiku kostnego i embrionalne komórki rdzeniowe. W dalszych postaciach, komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen, w szczególności komórką dendrytyczną, monocytem lub makrofagiem. Kwas nukleinowy może być obecny w komórce gospodarza w formie pojedynczej kopii lub dwóch lub więcej kopii i w pewnej postaci, jego ekspresja zachodzi w komórce gospodarza.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „ekspresja jest używany w jego najbardziej ogólnym znaczeniu i obejmuje wytwarzanie RNA lub RNA i białka. Obejmuje on także częściową ekspresję kwasów nukleinowych. Ponadto, ekspresja może być przeprowadzona przejściowo lub trwale. Preferowane układy ekspresji w komórkach ssaka obejmują pcDNA3.1 i pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA), które zawierają dający się selekcjonować wskaźnik, taki jak gen przekazujący oporność na G418 (i w ten sposób znakują trwale linie transfekowanych komórek by mogły być selekcjonowane) i sekwencje enhancerpromotor cytomegalowirusa (CMV).
W tych przypadkach wynalazku, w których cząsteczka HLA prezentuje związany z nowotworem antygen lub jego część, wektor ekspresyjny może także zawierać sekwencję kwasu nukleinowego kodującego tę cząsteczkę HLA. Sekwencja kwasu nukleinowego, kodująca cząsteczkę HLA może być obecna w tym samym wektorze ekspresyjnym, co kwas nukleinowy kodujący związany z nowotworem antygen lub jego część lub oba kwasy nukleinowe mogą być obecne na różnych wektorach ekspresyjnych. W tym drugim przypadku, dwa ekspresyjne wektory mogą być kotransfekowane do komórki. Jeżeli w komórce gospodarza nie zachodzi ekspresja ani związanego z nowotworem antygenu lub jego części, ani cząsteczki HLA, oba kodujące kwasy nukleinowe są zatem transfekowane do komórki albo na tym samym wektorze ekspresyjnym albo na różnych wektorach ekspresyjnych. Jeżeli w komórce zachodzi już ekspresja cząsteczki HLA, tylko sekwencja kwasu nukleinowego kodująca związany z nowotworem antygen lub jego część może być transfekowana do komórki.
Wynalazek obejmuje także zestaw do powielania kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen. Takie zestawy zawierają na przykład, parę starterów do powielania, które hybrydyzują z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen. Wskazane, żeby startery zawierały sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego i żeby nie zachodziły one na siebie, żeby zapobiec tworzeniu się dimerów starterów. Jeden ze starterów będzie hybrydyzował do jednej nici kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen a drugi starter będzie hybrydyzował do komplementarnej nici w układzie, który pozwala na powielanie kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen.
Cząsteczki „nonsensowne lub „nonsensowne kwasy nukleinowe mogą być użyte do regulowania, w szczególności redukowania ekspresji kwasu nukleinowego. Zgodnie z wynalazkiem, termin „nonsensowna cząsteczka lub „nonsensowny kwas nukleinowy dotyczy oligonukleotydu, który jest oligorybonukleotydem, oligodezoksyrybonukleotydem, zmodyfikowanym oligorybonukleotydem lub zmodyfikowanym oligodezoksyrybonukleotydem i który w fizjologicznych warunkach hybrydyzuje z DNA zawierającym określony gen lub z mRNA tego genu, w ten sposób hamuje transkrypcję tego genu i/lub translację tego mRNA. Zgodnie z wynalazkiem, „nonsensowna cząsteczka obejmuje także
PL 219 093 B1 konstrukt, który zawiera kwas nukleinowy lub jego część w odwrotnej orientacji w stosunku do jego naturalnego promotora. Nonsensowny transkrypt kwasu nukleinowego lub jego części może tworzyć dupleks z naturalnie występującym mRNA określającym enzym i tak zapobiega gromadzeniu lub translacji mRNA do aktywnego enzymu. Inną możliwością jest użycie rybosomów do inaktywacji kwasu nukleinowego. Preferowane, zgodnie z wynalazkiem, nonsensowne oligonukleotydy mają sekwencję 6-50, w szczególności 10-30, 15-30 i 20-30 przylegających nukleotydów docelowego kwasu nukleinowego i dobrze, jeżeli są całkowicie komplementarne do docelowego kwasu nukleinowego lub jego części.
W preferowanych postaciach, nonsensowny nukleotyd hybrydyzuje z N-końcem lub miejscem 5' powyżej takim jak miejsce inicjacji translacji, miejsce inicjacji transkrypcji lub miejsce promotora. W dalszych postaciach, nonsensowny nukleotyd hybrydyzuje z niepodlegającym translacji regionem 3' lub miejscem składania mRNA.
W pewnej postaci, będący przedmiotem wynalazku oligonukleotyd składa się z rybonukleotydów, dezoksyrybonukleotydów lub ich kombinacji ze wzajemnym połączeniem końca 5' jednego nukleotydu z końcem 3' drugiego nukleotydu wiązaniem fosfodiestrowym. Te oligonukleotydy mogą być syntetyzowane sposobem konwencjonalnym lub wytwarzane techniką rekombinacji.
W preferowanych postaciach, będący przedmiotem wynalazku oligonukleotyd jest „modyfikowanym oligonukleotydem. Tutaj oligonukleotyd może być modyfikowany bardzo różnymi sposobami, bez uszkadzania jego zdolności do wiązania jego celu, żeby na przykład zwiększyć jego stabilność lub efektywność terapeutyczną. Zgodnie z wynalazkiem, termin „zmodyfikowany oligonukleotyd oznacza oligonukleotyd, w którym (i) przynajmniej dwa z jego nukleotydów są wzajemnie połączone przez syntetyczne między nukleotydowe wiązanie (np. między nukleotydowe wiązanie, które nie jest fosfodiestrowym wiązaniem) i/lub (ii) grupa chemiczna, która zwykle nie znajduje się w kwasie nukleinowym, jest kowalencyjnie przyłączona do oligonukleotydu. Preferowanymi syntetycznymi wiązaniami między nukleotydowymi są wiązania tiofosforanów, alkilofosfonianów, ditiofosforanów, estrów fosforanowych, alkilotiofosfotionianów, fosfoamidów, karbaminianów, węglanów, trójestrów fosforanowych, acetoamidów, estrów karboksymetylowych i peptydów.
Termin „zmodyfikowany oligonukleotyd obejmuje także oligonukleotydy mające kowalencyjnie zmodyfikowaną zasadę i/lub cukier. „Zmodyfikowane oligonukleotydy obejmują na przykład oligonukleotydy z resztami cukrowymi, które są kowalencyjnie połączone z grupami organicznymi o małym ciężarze cząsteczkowym, innymi niż grupa hydroksylowa w pozycji 3' i grupa fosforanowa w pozycji 5'. Zmodyfikowane oligonukleotydy mogą zawierać na przykład 2'-O-alkilowaną resztę rybozy lub inny cukier zamiast rybozy, taki jak arabinoza.
Dobrze, jeżeli białka opisane zgodnie z wynalazkiem zostały wyizolowane. Terminy „izolowane białko lub „izolowany polipeptyd oznaczają, że białko lub polipeptyd zostało oddzielone od swojego naturalnego środowiska. Izolowane białko lub polipeptyd może być w stanie istotnie oczyszczonym. Termin „istotnie oczyszczony oznacza, że białko lub polipeptyd jest istotnie wolny od innych substancji, z którymi jest powiązany w naturze lub in vivo.
Takie białka i polipeptydy mogą być użyte na przykład, do wytwarzania przeciwciał i w testach immunologicznych lub diagnostycznych lub w lecznictwie. Opisane zgodnie z wynalazkiem białka i polipeptydy mogą być izolowane z próbek biologicznych takich jak homogenaty tkankowe lub komórkowe i mogą także być otrzymane technikami ekspresji rekombinacyjnej w różnorodnych pro- lub eukariotycznych systemach ekspresji.
Dla celów niniejszego wynalazku „pochodne białek lub polipeptydów albo sekwencji aminokwasów zawierają warianty wstawień aminokwasów, warianty delecji aminokwasów i/lub warianty podstawień aminokwasów.
Warianty wstawienia aminokwasów obejmują połączenia amino i/lub karboksy końca a także wstawienie jednego lub dwóch lub więcej aminokwasów w określonej sekwencji aminokwasów. W przypadku mających wstawienie wariantów sekwencji aminokwasów, jedna lub więcej reszt aminokwasowych jest wstawiona w określone miejsce sekwencji aminokwasów, chociaż możliwe jest także losowe wstawienie z odpowiednim skriningiem otrzymanego produktu. Warianty delecji aminokwasu charakteryzują się usunięciem jednego lub więcej aminokwasów z sekwencji. Warianty substytucji aminokwasów charakteryzują się tym, że przynajmniej jedna reszta w sekwencji zostaje usunięta i inna reszta zostaje wstawiona na jej miejsce. Daje się pierwszeństwo modyfikacjom w pozycjach sekwencji aminokwasów, które między homologicznymi białkami i polipeptydami nie są konserwatywne. Daje się pierwszeństwo do zastępowania aminokwasów innymi, mającymi podobne właściwości takie jak hydrofobowość, hydrofilowość, elektroujemność, objętość bocznego łańcucha i podobne
PL 219 093 B1 (podstawienia konserwatywne). Podstawienia konserwatywne, na przykład, dotyczą zamiany jednego aminokwasu przez inny aminokwas wymieniony poniżej w tej samej grupie aminokwasów, które mają być podstawiane:
1. reszty małe alifatyczne, niepolarne lub o niewielkiej polarności: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. reszty ujemnie naładowane i ich amidy: Asn, Asp, Glu, Gln
3. reszty dodatnio naładowane: His, Arg, Lys
4. duże alifatyczne, niepolarne reszty: Met, Leu, Ile, Val, (Cys)
5. reszty duże aromatyczne: Phe, Tyr, Trp.
Z powodu ich udziału w architekturze białek trzy reszty są pokazane w nawiasach. Gly jest jedyną resztą bez łańcucha bocznego i dlatego przekazuje do łańcucha giętkość. Pro ma niezwykłą geometrię, która znacznie ogranicza łańcuch. Cys może tworzyć mostki dwusiarczkowe.
Opisane powyżej warianty aminokwasów mogą być łatwo otrzymane przy pomocy znanych technik syntezy peptydów, takich jak na przykład, synteza w fazie stałej (Merrifield, 1964) i podobnymi sposobami lub przez manipulację rekombinacją DNA. Techniki wprowadzania mutacji polegającej na substytucji we wcześniej określonym miejscu w DNA, które ma znaną lub częściowo znaną sekwencję, są dobrze znane i obejmują na przykład mutagenezę M13. Ta manipulacja sekwencją DNA w celu otrzymania białek mających substytucje, wstawienia lub delecje, jest opisana w szczegółach na przykład w Sambrook i wsp., (1989).
Zgodnie z wynalazkiem „pochodne białek, polipeptydów lub peptydów także zawierają pojedyncze lub wielokrotne substytucje, delecje i/lub addycje wszystkich związanych z enzymem cząsteczek takich jak węglowodany, lipidy i/lub białka, polipeptydy lub peptydy. Termin „pochodna także rozciąga się na wszystkie funkcjonalne chemiczne równoważniki tych białek, polipeptydów lub peptydów.
Zgodnie z wynalazkiem, część lub fragment związanego z nowotworem antygenu ma funkcjonalne właściwości polipeptydu z którego pochodzi. Takie funkcjonalne właściwości obejmują interakcję z przeciwciałami, interakcje z innymi polipeptydami lub białkami, selektywne wiązanie kwasów nukleinowych i aktywność enzymatyczną. Szczególną własnością jest zdolność do formowania kompleksu z HLA i kiedy to stosowne, wytwarzanie odpowiedzi immunologicznej. Ta odpowiedź immunologiczna może być oparta na stymulowaniu cytotoksycznych lub pomocniczych komórek T. Będące przedmiotem wynalazku część lub fragment związanego z nowotworem antygenu, dobrze jeżeli zawiera sekwencję przynajmniej 6, w szczególności przynajmniej 8, przynajmniej 10, przynajmniej 12, przynajmniej 15, przynajmniej 20, przynajmniej 30 lub przynajmniej 50 kolejnych aminokwasów związanego z nowotworem antygenu.
Część lub fragment kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen, zgodnie z wynalazkiem, dotyczy części kwasu nukleinowego, która koduje przynajmniej związany z nowotworem antygen i/lub część lub fragment tego związanego z nowotworem antygenu, jak to zdefiniowano powyżej.
Izolacja i zidentyfikowanie genów kodujących związane z nowotworem antygeny stwarza także możliwość diagnozy chorób charakteryzujących się ekspresją jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów. Te sposoby zawierają oznaczanie jednego lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują związany z nowotworem antygen i/lub oznaczanie tych kodowanych związanych z nowotworem antygenów i/lub pochodnych od nich peptydów. Kwasy nukleinowe mogą być oznaczane konwencjonalnie, włączając reakcję łańcuchową z polimerazą lub hybrydyzację ze znakowaną sondą. Związane z nowotworem antygeny lub pochodne od nich peptydy, mogą być oznaczane przez skrining surowicy odpornościowej pacjenta pod względem rozpoznawania antygenu i/lub peptydów. Mogą być one także oznaczane przez skrining komórek T pacjenta na specyficzną odpowiedź na odpowiedni związany z nowotworem antygen.
Niniejszy wynalazek umożliwia także, żeby białka wiążące się do opisanego tutaj, związanego z nowotworem antygenu były izolowane, włączając przeciwciała i wiążących komórkowych partnerów tych związanych z nowotworem antygenów.
Zgodnie z wynalazkiem, poszczególne postaci powinny obejmować dostarczanie „dominujących negatywnych polipeptydów pochodnych od związanych z nowotworem antygenów. Dominujący negatywny polipeptyd jest wariantem nieaktywnego białka, które w drodze interakcji z komórkowym mechanizmem wypiera aktywne białko z jego interakcji z komórkowymi mechanizmami albo, które konkuruje z aktywnym białkiem, przez co redukuje efekt tego aktywnego białka. Na przykład dominująco negatywny receptor, który wiąże się z ligandem ale nie daje żadnego sygnału jako odpowiedzi na
PL 219 093 B1 wiązanie z ligandem, może redukować biologiczny efekt tego liganda. Podobnie, dominująco negatywna katalitycznie nieaktywna kinaza, która zazwyczaj wchodzi w interakcje z docelowymi białkami ale nie fosforyluje tych docelowych białek, może zmniejszać fosforylację tych docelowych białek w odpowiedzi na sygnał komórkowy. Podobnie dominujący negatywny czynnik transkrypcyjny, który wiąże się do miejsca promotorowego w kontrolnym regionie genu ale nie zwiększa transkrypcji tego genu, może redukować efekt normalnego czynnika transkrypcyjnego przez okupowanie miejsca wiążącego promotor, bez zwiększania transkrypcji.
Wynikiem ekspresji dominującego negatywnego polipeptydu w komórce jest zmniejszenie funkcji aktywnych białek. Biegli pracownicy mogą otrzymać dominujące negatywne warianty białka, na przykład metodami konwencjonalnej mutagenezy i przez ocenianie dominujących negatywnych efektów wariantu polipeptydu.
Wynalazek także obejmuje substancje takie jak polipeptydy, które wiążą się do związanych z nowotworem antygenów. Takie substancje wiążące mogą być użyte na przykład w badaniach skriningowych do wykrywania związanych z nowotworem antygenów i kompleksów związanych z nowotworem antygenów z ich wiążącymi partnerami i w oczyszczaniu tych związanych z nowotworem antygenów i ich kompleksów z ich wiążącymi partnerami. Takie substancje mogą także być użyte do hamowania aktywności związanych z nowotworem antygenów, na przykład przez wiązanie do takich antygenów.
Tak więc wynalazek zawiera substancje wiążące takie jak na przykład przeciwciała lub fragmenty przeciwciał, które są zdolne selektywnie wiązać się do związanych z nowotworem antygenów. Przeciwciała obejmują poliklonalne i monoklonalne przeciwciała otrzymywane konwencjonalnymi sposobami.
Takie przeciwciała mogą rozpoznawać białka w natywnym i/lub zdenaturowanym stanie (Anderson i wsp., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem i wsp., Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller i wsp., J. Immunol. Methods 224: 51-60, 1999).
Surowica odpornościowa, która zawiera specyficzne przeciwciała, wiążące się specyficznie do docelowego białka, może być otrzymana różnymi standardowymi sposobami; patrz na przykład „Monoclonal Antibodies: A Practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Wskutek tego, możliwe jest wytworzenie powinowactwa i specyficznych przeciwciał, które rozpoznają kompleks błonowych białek w ich natywnej formie (Azorsa i wsp., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson i wsp., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Jest to w szczególności odpowiednie do wytwarzania przeciwciał, które są do użytku terapeutycznego ale także do wielu diagnostycznych zastosowań. Z tego względu możliwe jest immunizowanie całym białkiem, częściowymi sekwencjami zewnątrzkomórkowymi jak i komórkami, w których zachodzi ekspresja docelowej molekuły w fizjologicznie pozwijanej formie.
Monoklonalne przeciwciała są przygotowywane tradycyjnie przy użyciu technologii hybrydoma. (W celu znalezienia technicznych szczegółów patrz: „Monoclonal Antibodies: A practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; „Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447; „Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447)).
Wiadomo, że tylko mała część cząsteczki przeciwciała, paratop, jest włączona w wiązanie przeciwciała do jego epitopu (porównaj Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Na przykład regiony pFc' i Fe są efektorami kaskady dopełniacza ale nie są włączone w wiązanie antygenu. Przeciwciało, z którego region pFc' został enzymatycznie usunięty albo takie, które zostało otrzymane bez regionu pFc', określane jako fragment F(ab')2, przenosi oba wiążące antygen miejsca kompletnego przeciwciała. Podobnie, przeciwciało z którego region Fe został enzymatycznie usunięty albo takie, które zostało otrzymane bez tego regionu Fe, określane jako fragment Fab, przenosi jedno miejsce wiążące antygen nietkniętej cząsteczki przeciwciała. Ponadto, fragmenty Fab składają się z kowalencyjnie związanego lekkiego łańcucha przeciwciała i części ciężkiego łańcucha tego przeciwciała, określanego jako Fd. Fragmenty Fd są głównymi determinantami specyficzności przeciwciała (pojedynczy fragment Fd może być związany z wieloma, do dziesięciu, różnymi lekkimi łańcuchami bez zmiany specyficzności przeciwciała) i wyizolowane fragmenty Fd kiedy są wyizolowane, zachowują zdolność do wiązania epitopu.
PL 219 093 B1
Wewnątrz części przeciwciała wiążącej antygen umiejscowione są regiony determinujące dopasowanie (CDRy), które oddziaływują bezpośrednio z epitopem antygenu i regionami zrębowymi (FRy), które utrzymują trzeciorzędową strukturę paratopu. I fragment Fd ciężkiego łańcucha i lekki łańcuch immunoglobulin IgG zawierają cztery regiony zrębowe (FR1 do FR4), które w każdym przypadku są oddzielone przez trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR1 do CDR3). Regiony CDRów, a w szczególności CDR3 a jeszcze dokładniej region CDR3 ciężkiego łańcucha w dużym zakresie są odpowiedzialne za specyficzność przeciwciała.
Wiadomo, że inne niż CDR regiony przeciwciał ssaków mogą być zastąpione przez podobne regiony przeciwciał o takiej samej lub różnej specyficzności, z zachowaniem specyficzności oryginalnego przeciwciała do epitopu. To daje możliwość rozwoju „humanizowanych przeciwciał, w których inne niż ludzkie CDRy są kowalencyjnie połączone z regionami ludzkich FR i/lub Fc/pFc' w celu wytwarzania funkcjonalnych przeciwciał.
Jest to użyteczne w tak zwanej technologii „SLAM, w której izolowane są komórki B z całkowitej krwi i komórki są monoklonowane. Następnie supernatant pojedynczych komórek B jest analizowany pod względem ich specyficzności jako przeciwciał. W przeciwieństwie do technologii hybrydoma, różne regiony genu przeciwciała są powielane przy użyciu PCR pojedynczej komórki i klonowane do odpowiedniego wektora. W ten sposób dostarczanie monoklonalnych przeciwciał jest przyspieszane (de Wildt i wsp., J. Immunol. Methods 207: 61-67, 1997).
Jako inny przykład WO 92/04381 opisuje wytwarzanie i stosowanie mysich humanizowanych przeciwciał RSV, w których przynajmniej część mysich regionów FR została zastąpiona regionami FR pochodzącymi od ludzi. Przeciwciała tego rodzaju, włączając w to fragmenty nietkniętych przeciwciał ze zdolnością wiązania antygenu, są często określane jako przeciwciała „chimerowe.
Wynalazek dostarcza także fragmentów F(ab')2, Fab, Fv i Fd przeciwciał, przeciwciał chimerowych, w których regiony Fc i/lub FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub lekkiego łańcucha CDR3 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, fragmentu F(ab')2 chimerowych przeciwciał, w którym regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub lekkiego łańcucha CDR3 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami fragmentu Fab chimerowych przeciwciał, w którym regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 i/lub lekkiego łańcucha CDR3 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami, fragmentu Fd chimerowych przeciwciał, w którym regiony FR i/lub CDR1 i/lub CDR2 mogą być zastąpione homologicznymi ludzkimi lub innymi niż ludzkie sekwencjami. Wynalazek zawiera także „jedno-łańcuchowe przeciwciała.
Wynalazek obejmuje także polipeptydy, które wiążą się specyficznie do związanych z nowotworem przeciwciał. Polipeptydy wiążące substancje tego rodzaju mogą być dostarczone na przykład przez zdegenerowanie bibliotek peptydów, które mogą być otrzymane w prosty sposób w roztworze w unieruchomionej formie lub jako biblioteki obrazowania faga. Możliwe jest również sporządzenie kombinatoryjnych bibliotek peptydów z jednym lub więcej aminokwasami. Mogą także być otrzymane biblioteki peptoidów i niepeptydowych syntetycznych reszt.
Obrazowanie faga może być szczególnie efektywne w identyfikowaniu będących przedmiotem wynalazku peptydów wiążących. W tym połączeniu, na przykład, otrzymywana jest biblioteka faga (używając na przykład, fagów M13, fd lub lambda), która prezentuje wstawki długości od 4 do około 80 reszt aminokwasów. Selekcjonowane są następnie fagi, które noszą wstawki, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu. Ten proces może być powtarzany przez dwa lub więcej cykli ponownej selekcji wiązania fagów do związanego z nowotworem antygenu. Powtarzanie cykli powoduje zatężenie fagów noszących określone sekwencje. Analiza sekwencji DNA może być przeprowadzona żeby identyfikować sekwencję polipeptydów, których ekspresja zachodzi. Może być oznaczona najmniejsza liniowa część sekwencji wiążącej związanego z nowotworem antygenu. „Dwu-hybrydowy system drożdży także może być użyteczny do identyfikowania polipeptydów, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu. Opisane zgodnie z wynalazkiem związane z nowotworem antygeny lub ich fragmenty mogą być użyte do skriningu bibliotek peptydów, włączając w to biblioteki obrazowania fagów, żeby zidentyfikować i wybrać partnerów peptydów wiążących związane z nowotworem antygeny. Takie cząsteczki mogą być, na przykład, użyte do testów skriningowych, protokołów oczyszczania, do interferencji z działaniem związanego z nowotworem antygenu i do innych celów znanych biegłym pracownikom.
Opisane powyżej przeciwciała i inne wiążące cząsteczki mogą być użyte, na przykład, do identyfikacji tkanek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu. Przeciwciała mogą także być sprzężone ze specyficznymi diagnostycznymi substancjami, w celu uwidocznienia komórek i tkanek, w których zachodzi ekspresja związanych z nowotworem antygenów. Mogą być one takPL 219 093 B1 że sprzęgane z substancjami użytecznymi terapeutycznie. W nieograniczający sposób, substancje diagnostyczne zawierają: siarczan baru, kwas iocetamic, kwas iopanoic, ipodate wapnia, diatrizoate sodu (sól kwasu kwasu 3,5-diacetamido-2,4,6-trijodobenzoesowego), meglumine diatrizoate, metrizamide, tyropanoate sodu i radiodiagnostyczne włączając w to emitery pozytronowe takie jak fluor-18 i węgiel-11, emitery gamma takie jak jod-123, technet 99m, jod-131 i ind 111, nuklidy do jądrowego rezonansu magnetycznego takie jak fluor i gadolin. Zgodnie z wynalazkiem, termin „substancja użyteczna terapeutycznie oznacza każdą cząsteczkę terapeutyczną, która jeśli jest pożądana, jest wybiórczo wprowadzana do komórki, w której zachodzi ekspresja jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów, włączając w to środki przeciwnowotworowe, radioaktywne znakowane jodem związki, toksyny, leki cytostatyczne lub cytolityczne etc. Na przykład, przeciwrakowe czynniki zawierają aminoglutetimid, azatioprynę, siarczan bleomycyny, bisulfan, karmustynę, chlorambucyl, cysplatynę, cyklofosfamid, cyklosporynę, cytarabidynę, dakarbazynę, etopozyd, fluorouracyl, interferon-α, lomustynę, merkaptopurynę, metotreksat, mitotan, prokarbazynę HCl, tioguaninę, siarczan winblastyny, i siarczan winkrystyny. Inne przeciwrakowe środki są opisane na przykład w Goodman i Gilman, „The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., w szczególności rozdział 52 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner). Toksyny mogą być białkami takimi jak antywirusowe białko z rośliny Phytolacca, toksyna cholery, toksyna krztuśca, rycyna, gelonina, abryna, egzotoksyna dyfterytu lub egzotoksyna Pseudomonas. Reszty toksyn mogą także być radionuklidami emitującymi promieniowanie o wysokiej energii, takimi jak kobalt-60.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „pacjent oznacza człowieka, naczelne inne niż człowiek lub inne zwierzęta, w szczególności ssaki takie jak krowa, koń, świnia, owca, koza, pies, kot i gryzonie takie jak mysz i szczur. W szczególnie preferowanej postaci, pacjentem jest istota ludzka.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „choroba dotyczy każdego stanu patologicznego, w którym związane z nowotworem antygeny podlegają ekspresji lub podlegają nieprawidłowej ekspresji. Zgodnie z wynalazkiem, „nieprawidłowa ekspresja oznacza, że ekspresja jest zmieniona, lepiej podniesiona w stosunku do stanu u zdrowego osobnika. Wzrost ekspresji dotyczy wzrostu o przynajmniej 10%, w szczególności o przynajmniej 20%, o przynajmniej 50% lub o przynajmniej 100%. W pewnej postaci, ekspresja związanego z nowotworem antygenu zachodzi tylko w tkankach chorego osobnika, podczas gdy ekspresja w tkankach zdrowego osobnika jest tłumiona. Przykładem takiej choroby jest rak, gdzie zgodnie z wynalazkiem termin „rak obejmuje białaczkę, nasieniak, melanoma, potworniak, glejak, raka nerek, raka nadnerczy, raka tarczycy, raka jelit, raka wątroby, raka okrężnicy, raka żołądka, raka żołądkowo-jelitowego, raka węzłów chłonnych, raka przełyku, raka odbytnicy, raka trzustki, raka ucha, raka nosa i gardzieli (ENT), raka piersi, raka prostaty, raka macicy, raka jajników i raka płuc oraz ich przerzuty.
Zgodnie z wynalazkiem, próbka biologiczna do użycia przy stosowaniu różnych opisanych tutaj sposobów, może być próbką tkanki i/lub próbką zawierającą komórki i może być otrzymana w konwencjonalny sposób taki jak biopsja tkanki, biopsja trepanem, przez pobranie krwi, zasysanie z oskrzeli, plwocina, mocz, fekalia lub inne płyny biologiczne.
Zgodnie z wynalazkiem, termin „komórka immunoreaktywna oznacza komórkę, która przy odpowiedniej stymulacji, może dojrzewać do komórki odpornościowej (takiej jak komórka B, pomocnicza komórka T lub cytolityczna komórka T). Komórki immunoreaktywne zawierają komórki macierzyste układu krwiotwórczego CD34+, niedojrzałe i dojrzałe komórki T oraz niedojrzałe i dojrzałe komórki B. Jeżeli pożądane jest wytwarzanie cytolitycznych lub pomocniczych komórek T rozpoznających związany z nowotworem antygen, immunoreaktywne komórki są kontaktowane z komórką, w której zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu w warunkach, które sprzyjają wytwarzaniu, różnicowaniu i/lub selekcji cytolitycznych komórek T i pomocniczych komórek T. Różnicowanie prekursorów komórki T w cytolityczną komórkę T, wtedy gdy są wystawione na działanie antygenu jest podobne do klonalnej selekcji układu immunologicznego.
Pewne sposoby terapii są oparte na reakcji układu immunologicznego pacjenta, która powoduje lizę komórek prezentujących antygen, takich jak komórki rakowe, które prezentują jeden lub więcej antygenów związanych z nowotworem. Na przykład, w tym połączeniu, autologiczne, cytotoksyczne limfocyty T, specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC są podawane pacjentowi, u którego występują komórkowe nieprawidłowości. Znane jest wytwarzanie takich cytotoksycznych limfocytów T in vitro. Przykład sposobu różnicowania komórek T może być znaleziony w WO-A-9633265. Ogólnie, próbka zawierająca komórki takie jak komórki krwi jest pobierana od pacjenta i komórki są kontaktowane z komórką, która prezentuje kompleks i która może po24
PL 219 093 B1 wodować namnażanie cytotoksycznych limfocytów T (np. komórki dendrytyczne). Docelowe komórki mogą być komórkami transfekowanymi, takimi jak komórka COS. Te transfekowane komórki prezentują pożądany kompleks na swojej powierzchni i kiedy są kontaktowane z cytotoksycznymi limfocytami T, stymulują namnażanie tych ostatnich. Klonalnie powiększone autologiczne, cytotoksyczne limfocyty T są następnie podawane pacjentowi.
W innym sposobie selekcji specyficznych w stosunku do antygenu cytotoksycznych limfocytów T, fluorogeniczne tetramery kompleksów cząsteczki MHC klasy I/peptyd są używane do wykrywania klonów cytotoksycznych limfocytów T (Altman i wsp., Science 274: 94-96, 1996; Dunbar i wsp., Curr Biol. 8: 413-416, 1998). Rozpuszczalne cząsteczki MHC klasy I są zwijane in vitro w obecności mikroglobulin β2 i peptydowego antygenu wiążącego się do tej cząsteczki klasy I. Kompleksy MHC/peptyd są oczyszczane a następnie znakowane biotyną. Tetramery są tworzone przez mieszanie kompleksów biotynylowany peptyd-MHC ze znakowaną awidyną (np. fikoerytryną) w stosunku molowym 4:1. Tetramery są następnie kontaktowane z cytotoksycznymi limfocytami T takimi jak krew obwodowa lub węzły limfatyczne. Tetramery wiążą się do cytotoksycznych limfocytów T, które rozpoznają kompleks peptydowy antygen/MHC klasy I. Komórki, które są wiązane do tetramerów mogą być sortowane przy użyciu sortowania komórek kontrolowanego fluorescencyjnie, w celu wyizolowania reaktywnych cytotoksycznych limfocytów T. Izolowane cytotoksyczne limfocyty T mogą być namnażane in vitro. W metodzie terapeutycznej określanej jako transfer adopcyjny (Greenberg, J. Immunol. 136 (5): 1917, 1986; Riddel i wsp., Science 257:238, 1992; Lynch i wsp., Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410, 1991; Kast i wsp., Cell 59: 603-614, 1989), komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendrytyczne) są łączone z cytotoksycznymi limfocytami T pacjenta, który ma być leczony, co powoduje namnażanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T. Namnażane cytotoksyczne limfocyty T są następnie podawane pacjentowi, u którego występuje anomalia komórkowa charakteryzująca się określonymi nieprawidłowymi komórkami prezentującymi specyficzny kompleks. Następnie cytotoksyczne limfocyty T powodują lizę nieprawidłowych komórek, osiągając w wyniku tego pożądany efekt terapeutyczny.
Często z repertuaru komórek T pacjenta, mogą być namnażane tylko komórki T z niskim powinowactwem do specyficznego kompleksu tego rodzaju, ponieważ te z wysokim powinowactwem zostały wygaszone w związku z rozwojem tolerancji. Alternatywą może być tutaj transfer samego receptora komórki T. Dlatego też, komórki prezentujące pożądany kompleks (np. komórki dendrytyczne) są łączone z cytotoksycznymi limfocytami zdrowych osobników lub innych gatunków (np. myszy). To powoduje namnażanie specyficznych cytotoksycznych limfocytów T z wysokim powinowactwem, jeżeli limfocyty T pochodzą z organizmu donora, który nie miał poprzednio kontaktu ze specyficznym kompleksem. Receptor komórki T o wysokim powinowactwie, tych namnażanych specyficznych limfocytów jest klonowany. Jeżeli receptory komórek T o wysokim powinowactwie zostały sklonowane z innych gatunków, mogą być one humanizowane w różnym zakresie. Takie receptory komórki T, jeśli są pożądane, są następnie transdukowane poprzez transfer genowy, na przykład stosując wektory retrowirusowe, do komórek T pacjentów. Następnie przeprowadzany jest adopcyjny transfer przy użyciu tych genetycznie zmienionych limfocytów T (Stanislawski i wsp., Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels i wsp., Nat Immunol. 2:957-61, 2001).
Powyższe terapeutyczne aspekty, opierają się na fakcie, że przynajmniej niektóre nieprawidłowe komórki pacjenta prezentują kompleks związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki HLA. Takie komórki mogą być identyfikowane znanym samym przez się sposobem. Tak szybko jak komórki prezentujące kompleks zostały zidentyfikowane, mogą być one połączone z próbką od pacjenta, która zawiera cytotoksyczne limfocyty T. Jeżeli cytotoksyczne limfocyty T lizują komórki prezentujące kompleks, można przypuszczać, że związany z nowotworem antygen jest prezentowany.
Transfer adopcyjny nie jest jedyną formą terapii, jaka może być zastosowana zgodnie z wynalazkiem. Cytotoksyczne limfocyty T mogą także być wytwarzane in vivo znanym samym przez się sposobem. Pewien sposób używa komórek nieproliferacyjnych, w których zachodzi ekspresja kompleksu. Używane tutaj komórki będą tymi, w których zwykle zachodzi ekspresja kompleksu, takimi jak naświetlane komórki nowotworowe lub komórki transfekowane jednym lub oboma genami niezbędnymi do prezentacji kompleksu (np. antygenowy peptyd i cząsteczka prezentująca cząsteczkę HLA). Mogą być używane różne typy komórek. Poza tym, możliwe jest użycie wektorów, które przenoszą jeden lub oba będące przedmiotem zainteresowania geny. Szczególnie pierwszeństwo daje się wektorom wirusowym lub bakteryjnym. Na przykład, kwasy nukleinowe kodujące związany z nowotworem antygen lub jego część mogą być funkcjonalnie połączone z sekwencjami promotora lub enhancera, które kontrolują ekspresję tego związanego z nowotworem antygenu lub jego fragmentu w określoPL 219 093 B1 nych tkankach lub typach komórek. Kwas nukleinowy może być inkorporowany do wektora ekspresyjnego. Wektory ekspresyjne mogą być niezmodyfikowanymi, poza chromosomalnymi kwasami nukleinowymi, plazmidami lub genomami wirusowymi do których mogą być wstawione egzogenne kwasy nukleinowe. Kwasy nukleinowe, kodujące związany z nowotworem antygen, mogą także być wstawione do genomu retrowirusowego, pozwalając w ten sposób, żeby kwas nukleinowy był zintegrowany z genomem docelowej tkanki lub komórki. W tych układach, mikroorganizm taki jak wirus krowianki, wirus pox, wirus opryszczki, retrowirus lub adenowirus przenosi będący przedmiotem zainteresowania gen i de facto „infekuje komórki gospodarza. Inną korzystną formą jest wprowadzenie związanego z nowotworem antygenu w formie zrekombinowanego RNA, który może być wprowadzony do komórek na przykład przez transfer liposomalny lub przez elektroporację. W wyniku, komórki prezentują będący przedmiotem zainteresowania kompleks i są rozpoznawane przez autologiczne cytotoksyczne limfocyty T, które są potem namnażane.
Podobny efekt może być osiągnięty przez łączenie związanego z nowotworem antygenu lub jego fragmentu z adiuwantem, w celu umożliwienia inkorporacji do komórek prezentujących antygen in vivo. Związany z nowotworem antygen lub jego część może być przedstawiony jako białko, jako DNA (np. w wektorze) lub jako RNA. Związany z nowotworem antygen jest przetwarzany w celu otrzymania peptydowego partnera dla cząsteczki HLA, podczas gdy jego fragment może być prezentowany bez potrzeby dalszego przetwarzania. To drugie w szczególności w przypadku, jeżeli mogą się one wiązać do cząsteczek HLA. Pierwszeństwo daje się formom podawania, w których kompletny antygen jest przetwarzany in vivo przez komórkę dendrytyczną, ponieważ może to wytwarzać także odpowiedzi pomocniczej komórki T, które są potrzebne dla efektywnej odpowiedzi immunologicznej (Ossendrop i wsp., Immunol Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendrop i wsp., J. Exp. Med. 187: 693-702, 1998). Na ogół możliwe jest podanie pacjentowi efektywnej ilości związanego z nowotworem antygenu na przykład przez śródskórną iniekcję. Jednakże iniekcja może być także przeprowadzona do węzłów limfatycznych (Maloy i wsp., Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303, 2001). Może być także przeprowadzona w połączeniu z odczynnikami, które ułatwiają wychwyt do komórek dendrytycznych. Preferowane antygeny związane z nowotworem zawierają te, które reagują z allogeniczną surowicą przeciwrakową lub z komórkami T wielu pacjentów z nowotworami. Jednakże szczególnie interesujące są te, przeciw którym poprzednio nie istniała spontaniczna odpowiedź immunologiczna. Możliwa oczywiście jest indukcja przeciwko tym odpowiedziom immunologicznym, które mogą lizować nowotwory (Keogh i wsp., J Immunol. 167: 787-96, 2001; Appella i wsp., Biomed Pept Proteins Nucleic Asids 1: 177-84, 1995; Wentworth i wsp., Mol Immunol. 32: 603-12, 1995).
Opisane zgodnie z wynalazkiem kompozycje farmaceutyczne, mogą także być użyte do immunizacji jako szczepionki. Zgodnie z wynalazkiem, termin „immunizacja lub „szczepienie oznacza wzrost lub aktywację odpowiedzi immunologicznej na antygen. Możliwe jest użycie modeli zwierzęcych do testowania immunizującego wpływu na nowotwór, użycia związanego z nowotworem antygenu lub kodującego go kwasu nukleinowego. Na przykład ludzkie komórki nowotworowe mogą być wprowadzone myszy w celu wytworzenia nowotworu i może być podany jeden lub więcej kwasów nukleinowych kodujących związany z nowotworem antygen. Jako pomiar efektywności immunizacji przez kwas nukleinowy, może być mierzony wpływ na komórki nowotworowe (na przykład zmniejszenie rozmiaru nowotworu).
Jako część kompozycji do immunizacji, jeden lub więcej związanych z nowotworem antygenów lub ich stymulujących fragmentów może być podana razem z jednym lub więcej adiuwantami w celu indukcji odpowiedzi immunologicznej lub w celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej. Adiuwant jest substancją, która jest inkorporowana do antygenu lub podawana razem z tym ostatnim i która zwiększa odpowiedź immunologiczną. Adiuwanty mogą zwiększać odpowiedź immunologiczną przez dostarczanie zbiornika antygenów (zewnątrz komórkowo lub w makrofagach), aktywującego makrofagi i/lub stymulującego określone limfocyty. Adiuwanty są znane i, w sposób nieograniczający, zawierają monofosforylowany lipid A (MPL, SmithKline Beecham), saponiny takie jak QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739) QS7, QS17, QS18 i QS-L1 (So i wsp., Mol Cells 7:178-186, 1997), niekompletny adiuwant Freunda, kompletny adiuwant Freunda, witaminę E, montanid, ałun, oligonukleotydy CpG (porównaj Kreig i wsp., Nature 374:546-9, 1995) i różne emulsje wody i oleju przygotowywane z ulegających biologicznej degradacji olei takich jak skwalen i/lub tokoferol. Dobrze jeżeli peptydy są podawane w mieszaninie z DQS21/MPL. Typowo stosunek DQS21 do MPL jest około 1:10 do 10:1, lepiej 1:5 do 5:1 a w szczególności około 1:1. Typowy preparat szczepionki do podawania ludziom, zawiera DQS21 i MPL w zakresie od około 1 gg do około 100 gg.
PL 219 093 B1
Mogą być także podane inne substancje, które stymulują immunologiczną odpowiedź pacjenta. Możliwe jest na przykład użycie do szczepienia cytokin ze względu na ich regulatorowe właściwości w stosunku do limfocytów. Takie cytokiny na przykład zawierają interleukinę-12 (IL-12), która, co zostało wykazane, zwiększa ochronne działanie szczepionek (porównaj, Science 268: 1432-1434, 1995), GM-CSF i IL-18.
Istnieje kilka związków, o których wiadomo, że zwiększają odpowiedź immunologiczną i dlatego mogą być używane do szczepienia. Te związki zawierają kostymulujące cząsteczki dostarczane w formie białek lub kwasów nukleinowych. Przykładami takich kostymulujących cząsteczek są B7-1 i B7-2 (odpowiednio CD80 i CD86), których ekspresja zachodzi w komórkach dendrytycznych (DC) i które oddziaływują z cząsteczką CD28, której ekspresja zachodzi w komórkach T. Te interakcje dostarczają kostymulacji (sygnał 2) do stymulowanej antygenem/MHC/TCR (sygnał 1) komórki T, zwiększając w ten sposób namnażanie tej komórki T i zwiększając działanie efektorowe. B7 oddziaływuje także z CTLA4 (CD152) w komórkach T i badania obejmujące ligandy CTLA4 i B7 wykazują, że interakcja CTLA4-B7 może zwiększać antynowotworową odporność i namnażanie CTL (Zheng, P. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(11): 6284-6289 (1998).
Zazwyczaj ekspresja B7 nie zachodzi w komórkach nowotworowych, tak więc nie są one komórkami aktywnie prezentującymi antygen dla komórek T (APC). Indukcja ekspresji B7 mogłaby umożliwić komórkom nowotworowym stymulowanie efektywniejszego namnażania cytotoksycznych limfocytów T i działanie efektorowe. Kostymulacja przez łączenie B7/IL-6/IL-12 ujawnia indukcję profilu IFN-gamma i cytokiny Th1 w populacji komórek T powodując zwiększenie aktywności komórek T (Gajewski i wsp., J. Immunol. 154:5648 (1995)).
Całkowita aktywacja cytotoksycznych limfocytów T i całkowite działanie efektora wymaga włączenia komórek pomocniczych T poprzez oddziaływanie liganda CD40 na te pomocnicze komórki T i cząsteczkę CD40, których ekspresja zachodzi w komórkach dendrytycznych (Ridge i wsp., Nature
393:474 (1998), Bennett i wsp., Nature 393:478 (1998), Schonberger i wsp., Nature 393:480 (1998). Mechanizm tego kostymulującego sygnału prawdopodobnie dotyczy zwiększenia produkcji B7 i towarzyszącej produkcji IL-6/IL-12 przez te dendrytyczne komórki (komórki prezentujące antygen). W ten sposób oddziaływanie CD40-CD40L uzupełnia oddziaływanie sygnału 1 (antygen/MHC-TCR) i sygnału 2 (B7-CD28).
Można by się spodziewać, że użycie przeciwciał przeciw CD-40 do stymulowania komórek dendrytycznych, bezpośrednio zwiększy reakcję na antygeny nowotworu, które są zwykle poza zakresem odpowiedzi zapalnej albo, które są prezentowane przez nieprofesjonalne komórki prezentujące antygen (komórki nowotworowe). W tych sytuacjach, sygnały kostymulujące pomocnicze T i B7 nie są dostarczane. Ten mechanizm może być użyty w połączeniu z terapiami opartymi o komórki dendrytyczne uderzane antygenem.
Wynalazek dostarcza także kwasów nukleinowych, polipeptydów lub peptydów do podawania. Polipeptydy i peptydy mogą być podawane w znany sposób. W pewnej postaci, kwasy nukleinowe są podawane sposobami ex vivo, to jest przez usunięcie komórek od pacjenta, genetyczną modyfikację tych komórek w celu wprowadzenia związanego z nowotworem antygenu i ponowne wprowadzenie zmienionych komórek pacjentowi. Ogólnie, zawiera to wprowadzenie funkcjonalnej kopii genu do komórek pacjenta in vitro i ponowne wprowadzenie genetycznie zmienionych komórek pacjentowi. Funkcjonalna kopia genu jest pod funkcjonalną kontrolą elementów regulatorowych, które pozwalają na ekspresję genu w genetycznie zmienionych komórkach. Metody transfekcji i transdukcji są znane biegłym pracownikom. Wynalazek dotyczy także podawania kwasów nukleinowych in vivo przy użyciu wektorów takich jak wirusy i liposomy z kontrolą celowania.
W preferowanej postaci, wirusowy wektor do podawania kwasu nukleinowego kodującego antygen związany z nowotworem jest wybierany z grupy składającej się z adenowirusów, wirusów pox, włączając wirus krowianki i osłabione wirusy pox, wirus Semliki Forest, retrowirusów, wirusa Sindbis i podobnych do wirusów cząstek Ty. Szczególnie daje się pierwszeństwo adeno i retrowirusom. Retrowirusy mają zazwyczaj deficyt replikacji (to jest są niezdolne do wytwarzania cząstek zakaźnych).
W celu wprowadzenia, zgodnie z wynalazkiem, kwasów nukleinowych do komórek in vitro i in vivo mogą być używane różne sposoby. Sposoby tego rodzaju obejmują transfekcję strontów CaPO4 kwasów nukleinowych, transfekcję kwasów nukleinowych związanych z DEAE, transfekcję lub infekcję powyższymi wirusami przenoszącymi będące przedmiotem zainteresowania kwasy nukleinowe, transfekcję przy udziale liposomów i temu podobne. W szczególnych postaciach, pierwszeństwo ma kierowanie kwasu nukleinowego do określonych komórek. W takich postaciach, nośnik używany do podaPL 219 093 B1 wania kwasu nukleinowego do komórki (np. retrowirus lub liposom) może mieć związaną cząsteczkę kontroli celu. Na przykład, cząsteczka taka jak przeciwciało specyficzne dla białka powierzchniowego docelowej komórki lub ligand receptora docelowej komórki może być włączona lub przyłączona do nośnika kwasu nukleinowego. Preferowane przeciwciała zawierają przeciwciała, które wiążą się selektywnie do związanego z nowotworem antygenu. Jeżeli pożądane jest podawanie kwasu nukleinowego poprzez liposomy, do formuły liposomu mogą być włączone białka wiążące do powierzchniowego białka błonowego związanego z endocytozą, żeby umożliwić kontrolowanie celu i/lub wychwytu. Takie białka obejmują białka kapsydowe lub ich fragmenty, które są specyficzne dla określonego typu komórki, przeciwciała dla białek, które są internalizowane, białek umiejscowionych wewnątrz komórki i temu podobne.
Będące przedmiotem wynalazku kompozycje terapeutyczne mogą być podawane w farmaceutycznie kompatybilnych preparatach. Takie preparaty zwykle zawierają farmaceutycznie kompatybilne stężenia soli, substancje buforujące, środki konserwujące, nośniki, substancje uzupełniające, które zwiększają odporność takie jak adiuwanty, CpG i cytokiny oraz gdzie jest to właściwe inne terapeutycznie aktywne związki.
Będące przedmiotem wynalazku terapeutycznie aktywne związki mogą być podawane jakąkolwiek konwencjonalną drogą, włączając iniekcje lub infuzje. Podawanie może być przeprowadzane na przykład doustnie, dożylnie, dootrzewnowo, domięśniowo, podskórnie lub śródskórnie. Dobrze, jeżeli przeciwciała są podawane terapeutycznie przez aerozol do płuc. Nonsensowne kwasy nukleinowe chętnie są podawane przez powolne dożylne podawanie.
Będące przedmiotem wynalazku kompozycje podawane są w efektywnych ilościach. „Efektywna ilość odnosi się do ilości, która osiąga pożądaną reakcję lub pożądany efekt sama lub razem z kolejnymi dawkami. W przypadku leczenia określonej choroby lub określonego stanu charakteryzującego się ekspresją jednego lub więcej związanych z nowotworem antygenów, pożądana reakcja dotyczy hamowania przebiegu choroby. Obejmuje to zwolnienie rozwoju choroby a w szczególności przerwanie rozwoju choroby. Pożądaną reakcją w leczeniu choroby lub stanu może także być opóźnienie rozpoczęcia lub zapobieżenie rozpoczęciu tej choroby lub tego stanu.
Efektywna ilość będącej przedmiotem wynalazku kompozycji będzie zależała od stanu, który ma być leczony, nasilenia choroby, indywidualnych parametrów pacjenta włączając w to wiek, fizjologiczną kondycję, rozmiar i wagę, czas trwania leczenia, typ towarzyszącej terapii (jeżeli jest obecny), specyficzną drogę podawania i temu podobne czynniki.
Korzystne jest, jeżeli będące przedmiotem wynalazku farmaceutyczne kompozycje są sterylne i zawierają terapeutycznie aktywną substancję, w efektywnej do wytworzenia pożądanej reakcji lub pożądanego efektu ilości. Podawane dawki będących przedmiotem wynalazku kompozycji, mogą zależeć od różnych parametrów takich jak typ podawania, stan pacjenta, pożądany okres podawania etc. W przypadku, kiedy reakcja u pacjenta jest niewystarczająca po początkowej dawce, mogą być użyte wyższe dawki (lub efektywnie wyższe dawki osiągane przez inną, bardziej zlokalizowaną drogę podania).
Na ogół, w celu leczenia lub wytwarzania lub zwiększania odpowiedzi immunologicznej, dawki związanego z nowotworem antygenu formułowane są i podawane w ilości 1 ng do 1 mg, lepiej 10 ng do 100 μg. Jeżeli pożądane jest podawanie kwasów nukleinowych (DNA i RNA) kodujących związane z nowotworem antygeny, formułowane i podawane są dawki 1 ng do 0,1 mg.
Będące przedmiotem wynalazku kompozycje farmaceutyczne na ogół są podawane w farmaceutycznie zgodnych ilościach i w farmaceutycznie zgodnych kompozycjach. Termin „farmaceutycznie zgodne dotyczy nietoksycznego materiału, który nie oddziaływuje z aktywnymi składnikami kompozycji farmaceutycznej. Zwykle preparaty tego rodzaju mogą zawierać sole, substancje buforujące, środki konserwujące, nośniki i jeżeli to właściwe, inne terapeutycznie aktywne związki. Jeżeli są stosowane w medycynie, sole powinny być farmaceutycznie zgodne. Jednakże sole, które nie są farmaceutycznie zgodne mogą być użyte do przygotowywania soli farmaceutycznie zgodnych i są włączone w wynalazek. Farmakologicznie i farmaceutycznie zgodne sole tego rodzaju, zawierają w nieograniczający sposób, te przygotowywane z następujących kwasów: chlorowodorowego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, cytrynowego, mrówkowego, malonowego, bursztynowego i temu podobnych. Farmaceutycznie zgodne sole mogą także być otrzymane jako sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, takie jak sole sodowe, sole potasowe lub sole wapnia.
PL 219 093 B1
Będąca przedmiotem wynalazku kompozycja farmaceutyczna może zawierać farmaceutycznie zgodny nośnik. Zgodnie z wynalazkiem, „farmaceutycznie zgodny nośnik odnosi się do jednego lub więcej zgodnych, stałych lub ciekłych wypełniaczy, rozcieńczalników lub substancji tworzących pojemnik, które są odpowiednie do podawania ludziom. Termin „nośnik dotyczy organicznego lub nieorganicznego składnika, naturalnego lub syntetycznego, z którym aktywny składnik jest połączony w celu ułatwienia zastosowania. Składniki będącej przedmiotem wynalazku kompozycji farmaceutycznej są zazwyczaj takie, że nie występują oddziaływania, które w istotnym stopniu uszkadzają pożądaną farmaceutyczną skuteczność.
Będące przedmiotem wynalazku farmaceutyczne kompozycje mogą zawierać odpowiednie substancje buforujące, takie jak sole kwasu octowego, sole kwasu cytrynowego, sole kwasu bornego i sole kwasu fosforowego.
Kompozycje farmaceutyczne mogą, gdy jest to potrzebne, zawierać także odpowiednie środki konserwujące takie jak chlorek benzalkonium, chlorobutanol, paraben i timerosal.
Kompozycje farmaceutyczne są zwykle dostarczane w postaci jednostkowych dawek i mogą być otrzymywane w powszechnie znany sposób. Będące przedmiotem wynalazku kompozycje farmaceutyczne mogą być, na przykład, w formie kapsułek, tabletek, pastylek do ssania, zawiesin, syropów, eliksirów lub w formie emulsji. Kompozycje odpowiednie do podawania pozajelitowego, zwykle zawierają sterylne wodne lub nie wodne preparaty aktywnego związku, które dobrze jeżeli są izotoniczne w stosunku do krwi biorcy. Przykładami zgodnych nośników i rozpuszczalników są roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. Dodatkowo jako roztwór lub środowisko dla zawiesiny, używane są, zazwyczaj sterylne, zestalone oleje. Niniejszy wynalazek jest szczegółowo opisany poprzez ryciny i przykłady poniżej, które są użyte tylko w celu zilustrowania a nie są ogran iczające. Dzięki opisowi i przykładom, dalsze postaci, które są również włączone w wynalazek są dostępne dla biegłych pracowników.
Ryciny:
Ryc. 1. Ekspresja mRNA GPR35 w biopsjach raka okrężnicy
Badania RT-PCR przy użyciu DNA wolnego od RNA wykazują ekspresję GPR35 w większości biopsji raka okrężnicy. W przeciwieństwie do tego, ekspresja jest niewykrywalna w normalnych tkankach. (1-piersi, 2-płuca, 3-węzły chłonne, 4-grasica, 5-okrężnica, 6-15 rak okrężnicy, 16 ujemna próba kontrolna).
Ryc. 2. Ilościowa analiza PCR ekspresji GUCY2C mRNA w normalnych i nowotworowych tkankach
Badania PCR w czasie rzeczywistym ze starterami specyficznymi dla GUCY2C (SEQ ID Nr: 22-23) pokazują selektywną ekspresję mRNA w normalnym jelicie krętym, okrężnicy i we wszystkich próbkach raka okrężnicy otrzymanych metodą biopsji. Także różne ilości transkryptów GUCY2C wykrywano w przerzutach raka okrężnicy w wątrobie.
Ryc. 3. Identyfikacja specyficznych dla nowotworu wariantów składania GUCY2C
Produkty PCR z normalnych tkanek okrężnicy i raka okrężnicy klonowano i klony z obu grup sprawdzano przy użyciu analizy restrykcyjnej (EcoR I) i sekwencjonowano.
Ryc. 4. Selektywna ekspresja SCGB3A w prawidłowych płucach i w raku płuc
Analiza RT-PCR ze specyficznymi dla genu SCGB3A2 starterami (SEQ ID Nr: 37, 38) wykazuje powielanie DNA wyłącznie w normalnych płucach (pasmo 8, 14-15) i w biopsjach raka płuc (pasmo 16-24). (1-wątroba-N, 2-PBMC-N, 3-węzły chłonne-N, 4-żołądek-N, 5-jądro-N, 6-pierś-N, 7-nerki-N, 8-płuco-N, 9-grasica-N, 10-jajnik-N, 12-śledziona-N, 14-15-płuco-N, 16-24-rak płuc, 25-kontrola negatywna).
Ryc. 5. Ekspresja claudin-18A2.1 w żołądku, przełyku, raku żołądka i raku trzustki
Analiza RT-PCR ze specyficznymi dla claudin-18A2.1 starterami (SEQ ID Nr: 39, 40), zgodnie z wynalazkiem, wykazuje wyraźnie zaznaczoną ekspresję claudin-18A2.1 w 8/10 pochodzących z biopsji próbkach raka żołądka i 3/6 pochodzących z biopsji próbkach raka trzustki. Odmienną ekspresję wykryto także w żołądku i normalnej tkance przełyku. W przeciwieństwie do tego, ekspresja nie została wykryta w jajniku i raku jajnika.
Ryc. 6. Ekspresja SLC13A1 w nerkach i rakowych komórkach nerki
Analiza RT-PCR ze specyficznymi w stosunku do SLC13A1 starterami (SEQ ID Nr: 49, 50) wykazuje ekspresję w 7/8 próbek komórek rakowych nerki. Poza tym, w prawidłowych tkankach transkrypty były wykrywane wyłącznie w nerkach. (1-2-nerki, 3-komórki rakowe nerek, 11-pierś, 12-płuco,
PL 219 093 B1
13-wątroba, 14-okrężnica, 15-węzły chłonne, 16-śledziona, 17-przełyk, 18-grasica, 19-tarczyca, 20-PBMC, 21-jajnik, 22-jądra).
Ryc. 7. Ekspresja CLCA1 w okrężnicy, raku okrężnicy i raku żołądka
Badania RT-PCR ze starterami specyficznymi dla CLCA1 (SEQ ID Nr: 67, 68) potwierdzają selektywną ekspresję w okrężnicy i wykazują wysoką ekspresję w (3/7) badanych próbkach raka okrężnicy i (1/3) badanych próbek raka żołądka. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują lub wykazują tylko bardzo słabą ekspresję.
Ryc. 8. Ekspresja FLJ21477 w okrężnicy i raku okrężnicy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla FLJ21477 starterami (SEQ ID Nr: 69, 70) wykazują selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji w (7/12) badanych próbek raka okrężnicy. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Ryc. 9. Ekspresja FLJ20694 w okrężnicy i raku okrężnicy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla FLJ20694 starterami (SEQ ID Nr: 71, 72) wykazują selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji w (5/9) badanych próbek raka okrężnicy. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Ryc. 10. Ekspresja von Ebner w żołądku, płucu i raku płuc
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla von Ebner starterami (SEQ ID Nr: 73, 74) wykazują selektywną ekspresję w żołądku i w płucu i w (5/10) badanych próbek raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Ryc. 11. Ekspresja Plunc w grasicy, płucu i raku płuc
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla Plunc starterami (SEQ ID Nr: 75, 76) wykazują selektywną ekspresję w grasicy i w płucu i w (6/10) badanych próbek raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Ryc. 12. Ekspresja SLC26A9 w płucu i raku płuc i tarczycy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla SLC26A9 starterami (SEQ ID Nr: 77, 78) wykazują selektywną ekspresję w płucu i we wszystkich (13/13) badanych próbkach raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji za wyjątkiem tarczycy.
Ryc. 13. Ekspresja THC1005163 w żołądku, jajniku, płucu i raku płuc
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla THC1005163 starterami (SEQ ID Nr: 79) i niespecyficznym oligo dT tag starterem wykazują ekspresję w żołądku, jajniku, płucu i (5/9) pochodzących z biopsji próbek raka płuc. Inne prawidłowe tkanki (NT) nie wykazują ekspresji.
Ryc. 14. Ekspresja LOC134288 w nerkach i komórkach rakowych nerki
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla LOC134288 starterami (SEQ ID Nr: 80, 81) wykazują selektywną ekspresję w nerkach i w (5/8) pochodzących z biopsji badanych próbek komórek rakowych nerek.
Ryc. 15. Ekspresja THC943866 w nerkach i komórkach rakowych nerki
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla THC943866 starterami (SEQ ID Nr: 82, 83) wykazują selektywną ekspresję w nerkach i w (4/8) pochodzących z biopsji badanych próbek komórek rakowych nerek.
Ryc. 16. Ekspresja FLJ21458 w okrężnicy i raku okrężnicy
Badania RT-PCR ze specyficznymi dla FLJ21458 starterami (SEQ ID Nr: 86, 87) wykazują selektywną ekspresję w okrężnicy i w (7/10) pochodzących z biopsji, badanych próbek raka okrężnicy. (1-2-okrężnica, 3 wątroba, 4-PBMC, 5-śledziona, 6-prostata, 7-nerki, 8-jajniki, 9-skóra, 10-jelito cienkie, 11-płuco, 12-jądra-, 13-22 rak okrężnicy, 23 kontrola ujemna).
Ryc. 17. Komórkowa lokalizacja GPR35
Immunofluorescencja do wykrywania komórkowej lokalizacji GPR35 po transfekcji plazmidu, którego ekspresja daje białko fuzyjne GPR35-GFP. Strzałki identyfikują związaną z błoną fluorescencję fluoryzującego GFP.
Ryc. 18. Ilościowa ekspresja GPR35
A. Ilościowy PCR-RT ze specyficznymi dla GPR35 starterami (SEQ ID Nr: 88, 89) wykazuje selektywną ekspresję w próbkach jelita, nowotworu okrężnicy i w przerzutach nowotworu jelita. Analizowano następujące prawidłowe tkanki: wątrobę, płuco, węzły chłonne, żołądek, śledzionę, nadnercza, nerki, przełyk, jajniki, jądra, grasicę, skórę, pierś, trzustkę, limfocyty, aktywowane limfocyty, prostatę, tarczycę, jajowód, endometrium, móżdżek, mózg.
B. Rozpowszechnienie GPR35 w nowotworach okrężnicy i ich przerzutach. Ekspresja GPR35 zachodzi w ponad 90% przypadków zarówno w nowotworze jak i w przerzutach.
PL 219 093 B1
Ryc. 19. Ilościowa ekspresja GUCY2C
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi dla GUCY2C starterami (SEQ ID Nr: 98, 99) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowych tkankach żołądka i okrężnicy (A) i specyficzną ekspresję GUCY2C w próbkach nowotworu okrężnicy i żołądka (B). GUCY2C jest wykrywalny w 11/12 przypadkach raka okrężnicy i w 7/10 przypadkach raka żołądka.
Ryc. 20. Ilościowa ekspresja SCGB3A2
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi dla SCGB3A2 starterami (SEQ ID Nr: 103, 104) wykazuje selektywną ekspresję w próbkach płuc i próbkach raka płuc. 19/20 próbek raka płuc jest SCGB3A2 pozytywna, współczynnik nadekspresji SCGB3A2 wynosi przynajmniej w więcej niż 50% próbek. Analizowano następujące prawidłowe tkanki: wątrobę, płuco, węzły chłonne, żołądek, śledzionę, nadnercza, nerki, przełyk, jajniki, jądra, grasicę, skórę, pierś, trzustkę, limfocyty, aktywowane limfocyty, prostatę, tarczycę, jajowód, endometrium, móżdżek, mózg.
Ryc. 21. Immunofluorescencja z przeciwciałami specyficznymi dla SCGB3A2
Komórki COS7 transfekowano plazmidem, który koduje białko fuzyjne SCGB3A2-GFP. A. Wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przy użyciu specyficznej króliczej surowicy 30 odpornościowej przeciwko SCGB3A2 (immunizacja przy użyciu SEQ ID Nr: 105). B. Wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przy użyciu fluorescencji GFP. C. Nałożenie dwóch fluorescencji: z A i z B. Żółty kolor jest wytwarzany w punktach, w których nakładają się dwie fluorescencje i w ten sposób wykazuje specyficzność surowicy odpornościowej SCGB3A2.
Ryc. 22. Schematyczne opisanie wariantów składania claudin-18
Dwa warianty składania claudin-18, A1 i A2, różnią się N-końcem i różną zdolnością miejsc do glikozylacji.
Ryc. 23. Ilościowa ekspresja wariantu A1 claudin-18
Claudin-A1 jest silnie aktywowana w znacznej liczbie nowotworowych tkanek. Szczególnie silną ekspresję stwierdza się w nowotworach żołądka, nowotworach płuc, nowotworach trzustki i nowotworach przełyku.
Ryc. 24. Ilościowa ekspresja wariantu A2 claudin-18
Wariant A2, podobnie jak wariant A1 jest aktywowany w wielu nowotworach.
Ryc. 25. Zastosowanie przeciwciał specyficznych dla claudin-18A2 (domena pozakomórkowa) (Góra) Znakowanie komórek nowotworu żołądka claudin-18A2 pozytywnych (SNU-16) przy użyciu przeciwciał, które zostały wyprodukowane przez immunizację peptydem (SEQ ID Nr: 17). Znakowanie błony pojawia się szczególnie silnie w regionach interakcji komórka/komórka. A-przed surowicą odpornościową, MeOH; B-surowica odpornościowa MeOH, 5 ąg/ml; (Poniżej) Wykazanie specyficzności przeciwciał przez analizę kolokalizacji w komórkach 293T transfekowanych claudin-18A2-GFP. A-Claudin-18A2 GFP, B-anty-claudin-A2; C-Nałożenie.
Ryc. 26. Zastosowanie przeciwciał specyficznych dla claudin-18A2 (domena pozakomórkowa)
Znakowanie błony komórek nowotworowych żołądka claudin-18A2 pozytywnych (SNU-16) przeciwciałami, które otrzymano przez immunizację peptydem (SEQ ID Nr: 113, domena pozakomórkowa umiejscowiona N-końcem). Do barwienia kontrastowego użyto przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko E-kadherynie. A-przeciwciało; B-barwienie kontrastowe; C-nałożenie.
Ryc. 27. Zastosowanie przeciwciał przeciw pozakomórkowej domenie C-końca claudin-18 (Lewy, góra i poniżej) Znakowanie błony komórek nowotworowych żołądka claudin-18A2 pozytywnych (SNU-16) przeciwciałami, które otrzymano przez immunizację peptydem (SEQ ID Nr: 116, domena pozakomórkowa umiejscowiona C-końcem). Do barwienia kontrastowego użyto przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciwko E-kadherynie (prawo góra, poniżej).
Ryc. 28. Zastosowanie specyficznych przeciwciał przeciw claudin-18A1 (góra) Słabe lub brak znakowania komórek nowotworowych żołądka (SNU-16; claudin18A2 pozytywne) przez przeciwciało, które zostało wytworzone przez immunizację specyficznym peptydem claudin-18A1 (SEQ ID Nr: 115). A-anty-E-kadheryna; B-anty-claudin-18A1; C-nałożenie.
(Poniżej) Wykazanie specyficzności przeciwciał przez analizę kolokalizacji w komórkach 293T transfekowanych claudin-18A1-GFP. A-GFP-claudin-18A1; B-anty-claudin-18A1; C-nałożenie.
Ryc. 29. Wykrywanie claudin-18A2 w Western blot
Western blot z lizatami z różnych zdrowych tkanek z przeciwciałem specyficznym dla claudin18A2 skierowanym przeciw epitopowi z SEQ ID Nr:17. 1-Żołądek; 2-jądra; 3-skóra; 4-pierś; 5-wątroba; 6-okrężnica; 7-płuco; 8-nerki; 9-węzły chłonne.
Ryc. 30. Western blotting Claudin-18A2 z próbkami żołądka i nowotworów żołądka
PL 219 093 B1
Lizaty z próbek żołądka i próbek nowotworów żołądka przenoszono i testowano przy użyciu specyficznych dla claudin-18A2 przeciwciał przeciwko epitopowi mającemu SEQ ID Nr: 17. Nowotwory żołądka wykazują mniej glikozylowanych form claudin-18A2. Potraktowanie lizatów żołądka PNGazą F prowadzi do powstawania nisko glikozylowanych form. Lewa: 1-żołądek Nr#A; 2-żołądek Tu #A; 3-żołądek Nr #B; 4-żołądek Tu #B
Prawa: 1-żołądek Nr#A; 2-żołądek Nr #B 3-żołądek Nr #B + PNGaza F; 4-żołądek Tu #C; 5-żołądek Tu #D; 6-żołądek Tu 5 #D + PNGaza F
Ryc. 31. Ekspresja claudin-18 w nowotworach płuc
Nisko glikozylowane warianty claudin-18A2 wykrywano w raku płuc, zgodnie z ryc. 30. 1-Żołądek Nr; 2-żołądek Tu; 3-9-płuco Tu.
Ryc. 32. Immunohistochemiczna analiza claudin-18 w tkance nowotworu żołądka przy użyciu przeciwciał specyficznych dla claudin-18A2
Ryc. 33. Pośrednia immunofluorescencja specyficznych dla żołądka komórek Snu16 z poliklonalną surowicą odpornościową specyficzną dla claudin-18
A. Znakowanie surowicą sprzed immunizacji, wytworzoną przed immunizacją; B. Znakowanie surowicą specyficzną dla claudin-18.
Ryc. 34. Ilościowa ekspresja SLC13A1
Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi dla SLC13A1 starterami (SEQ ID Nr: 121, 122) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance nerek (A) i specyficzną dla SLC13A1 w nowotworowych komórkach nerek (B). Transkrypcja SLC13A1 jest wykrywalna w 5/8 przypadków nowotworowych komórek nerek.
Ryc. 35. Komórkowa lokalizacja SLC13A1
Immunofluorescencja w celu wykazania komórkowej lokalizacji SLC13A1 po transfekcji plazmidu, który dostarcza białka fuzyjnego SLC13A1-GFP. Związana z błoną fluorescencja białka fuzyjnego SLC13A1 jest w celu klarownego uwidocznienia (jako pierścień dookoła transfekowanej komórki).
Ryc. 36. Ilościowa ekspresja CLCA1
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla CLCA1 (SEQ ID Nr: 125, 126) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance okrężnicy i żołądka (A) i ekspresję specyficzną dla CLCA1 próbkach nowotworowej tkanki okrężnicy i żołądka (B). CLCA1 jest wykrywalne w 6/12 przypadkach raka okrężnicy i 7/10 raka żołądka.
Ryc. 37. Ilościowa ekspresja FLJ21477
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla FLJ21477 (SEQ ID Nr: 127, 128) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance okrężnicy i żołądka i słabą ekspresję w grasicy, przełyku i mózgu (A) i ekspresję specyficzną dla FLJ21477 w próbkach nowotworowej tkanki okrężnicy (B).
FLJ21477 jest wykrywalne w 11/12 przypadkach raka okrężnicy.
Ryc. 38. Ilościowa ekspresja FLJ20694
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla FLJ20694 (SEQ ID Nr: 129, 130) wykazuje wysoką i selektywną ekspresję w prawidłowej tkance okrężnicy i żołądka (A) i specyficzną dla
FLJ20694 nadekspresję w próbkach nowotworowej tkanki okrężnicy i żołądka (B). FLJ20694 jest wykrywalne w 11/12 przypadkach raka okrężnicy i 7/ raka żołądka.
Ryc. 39. Ilościowa ekspresja FLJ21458
Ilościowy RT-PCR ze starterami specyficznymi dla FLJ21458 (SEQ ID Nr: 133, 134) wykazuje selektywną ekspresję w tkance jąder, żołądka i jelit. Dodatkowo specyficzne dla FLJ21458 transkrypty były wykrywalne w 20/20 przypadków raka okrężnicy i w 7/11 przerzutów raka okrężnicy. Analizowano następujące prawidłowe tkanki: wątrobę, płuca, węzły chłonne, śledzionę, nadnercza, nerki, przełyk, jajniki, jądra, grasicę, skórę, pierś, trzustkę, limfocyty, aktywowane limfocyty, prostatę, tarczycę, jajowód, endometrium, móżdżek, mózg.
Ryc. 40. Immunofluorescencja ze specyficznymi dla FLJ21458 przeciwciałami (Góra) Komórki 293 transfekowano plazmidem, który koduje białko fuzyjne FLJ21458-GFP. A: wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przy użyciu specyficznej dla FLJ21458 króliczej surowicy odpornościowej (immunizacja SEQ ID Nr: 136). B: wykrywanie transfekowanego białka fuzyjnego przez fluorescencję GFP. C: nałożenie dwóch fluorescencji: z A i z B. Żółty kolor jest wytwarzany w punktach w których fluorescencje nałożyły się i to demonstruje specyficzność antysurowicy FLJ21458.
(Poniżej) Analiza komórek Snu16, które endogennie syntetyzują FLJ21458. A: wykrywanie białka przy użyciu specyficznej dla FLJ21458 antysurowicy (immunizacja SEQ ID Nr: 136). B: wykrywanie
PL 219 093 B1 białka błonowego kadheryny-E. C: nałożenie dwóch fluorescencji z A i z B. Żółty kolor jest wytwarzany w punktach, w których fluorescencję nałożyły się i demonstruje błonową lokalizację FLJ21458.
Ryc. 41. Sekwencje
Pokazane są sekwencje do których robione są odnośniki.
P r z y k ł a d y:
Materiał i metody
Terminy „in silico, elektroniczny i „wirtualne klonowanie dotyczą wyłącznie stosowania opartych na bazach danych metod, które mogą być także zastosowane do symulacji doświadczalnych procesów laboratoryjnych.
Jeżeli nie jest to wyraźnie zdefiniowane inaczej, wszystkie inne terminy i oznaczenia używane są tak, jak jest to rozumiane przez biegłego pracownika. Wspomniane techniki i sposoby są przeprowadzane sposobem zrozumiałym samym przez się i są opisane na przykład w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY. Wszystkie sposoby, w których używa się zestawów i odczynników są wykonywane zgodnie z instrukcją producenta.
Strategie oznaczania nowych związanych z nowotworami genów oparte na eksploracji danych
Łączone są dwie strategie in silico, mianowicie szukanie przy użyciu słowa kluczowego w GenBank i cDNAxProfiler. Stosując NCBI ENTREZ Search i Retrieval System (Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez) szukanie w GenBank jest przeprowadzane dla genów kandydujących, dla których zanotowano, że ich ekspresja zachodzi specyficznie w ściśle określonych tkankach (Wheeler i wsp., Nucleic Acids Resarch 28:10-14, 2000).
Przeprowadzając poszukiwania przy użyciu słów kluczowych takich jak „gen specyficzny dla okrężnicy, „gen specyficzny dla żołądka, „gen specyficzny dla nerek, wybierano z baz danych geny kandydujące (GOI, geny będące przedmiotem zainteresowania). Poszukiwania ograniczono do części całkowitej informacji zawartej w tych bazach danych przez użycie ograniczeń „homo sapiens dla organizmu i „mRNA dla typu cząsteczki.
Listę znalezionych GOI sprawdzano przez określanie różnych nazw dla tej samej sekwencji i eliminowanie podobnych nadmiarów.
Wszystkie geny kandydujące otrzymane przez poszukiwanie przy użyciu słów kluczowych badano z kolei ze względu na ich tkankową dystrybucję przy użyciu metody „elektronicznego Northen'a (eNorthen). eNorthen jest oparty na szeregowaniu sekwencji GOI przy użyciu bazy danych dla EST (sekwencja tag ulegająca ekspresji) (Adams i wsp., Science 252:1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Pochodzenie tkankowe każdego EST, dla którego znaleziono, że jest homologiczny do wstawionego GOI może być oznaczone i w ten sposób suma wszystkich EST daje wstępną ocenę tkankowej dystrybucji GOI. Dalsze badania przeprowadzono tylko z tymi GOI, które nie miały homologii z EST z narządowo niespecyficznych prawidłowych tkanek. Ta ocena bierze także pod uwagę, że ta własność publiczna zawiera źle opisane biblioteki cDNA (Scheurle i wsp., Cancer Res. 60: 4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm).
Drugą stosowaną metodą eksploracji danych był cDNAxProfiler NCBI Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler) (Hillier i wsp., Genome Research 6:807-828, 1996; Pennisi, Science 276: 1023-1024, 1997). Pozwala to, żeby przy użyciu operatorów logicznych, pule transkryptomów zdeponowane w bazach danych były odnoszone jedna do drugiej. Zdefiniowaliśmy pulę A, do której zostały przypisane wszystkie biblioteki ekspresyjne otrzymane, na przykład z okrężnicy, z wyłączeniem bibliotek mieszanych. Wszystkie biblioteki cDNA z prawidłowych tkanek innych niż okrężnica, zostały przypisane do puli B. Ogólnie, używane były wszystkie biblioteki cDNA niezależnie od zasadniczych metod otrzymywania, ale przyjęto tylko te o rozmiarze >1000. Pula B była cyfrowo odjęta od puli A za pomocą operatora BUT NOT. Znaleziony w ten sposób zbiór GOI poddano także badaniom eNorthen'a i potwierdzono danymi z piśmiennictwa.
Ta łączona eksploracja danych, będących własnością publiczną, obejmuje wszystkie z około 13 000 pełnej długości genów i prognozuje poza tymi genami mającymi potencjalnie narządowo specyficzną ekspresję.
Wszystkie inne geny, przy zastosowaniu RT-PCR, były oceniane najpierw w tkankach prawidłowych. Wszystkie GOI, dla których udowodniono, że ulegają ekspresji w narządowo niespecyficznych, prawidłowych tkankach, musiały być uznane za fałszywie dodatnie i były wykluczane z dalszych badań. Pozostałe badano w dużym panelu szerokiego wachlarza tkanek nowotworowych. Udowodniono tutaj, że antygeny przedstawione poniżej są aktywowane w komórkach nowotworowych.
PL 219 093 B1
Ekstrakcja RNA, otrzymywanie cDNA wyposażonego w poli-d(T) i konwencjonalna analiza RT-PCR
Całkowity RNA ekstrahowano z natywnego materiału tkanki przy użyciu guanidyno-izocjanianu jako czynnika chaotropowego (Chomczyński & Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-9, 1987). Po ekstrakcji z kwasowym fenolem i strąceniu izopropanolem, ten RNA rozpuszczano w DEPC traktowanym wodą.
Syntezę pierwszej nici cDNA z 2-4 μg całkowitego RNA przeprowadzano w 20 μΐ mieszaniny reakcyjnej przy użyciu Superscript II (Invitrogen), zgodnie z instrukcją producenta. Użytym starterem był oligonukleotyd d(T). Integralność i jakość cDNA sprawdzano przez powielanie p53 w 30 cyklach PCR (sensowny CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, nonsensowny CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, temperatura hybrydyzacji 67°C).
Archiwum pierwszej nici cDNA otrzymano z kilku prawidłowych tkanek i z jednostek nowotworu. Do badań ekspresji, powielano 0,5 μΐ tych cDNA w 30 μΐ mieszaniny reakcyjnej używając specyficznych dla GOI starterów (patrz poniżej) i 1 U polimerazy DNA HotStarTaq (Qiagen). Każda mieszanina reakcyjna zawierała 0,3 mM dNTP, 0,3 μl każdego startera i 0,3 μl 10x buforu reakcyjnego. Startery wybierano tak, żeby były umiejscowione w dwóch różnych eksonach a eliminację interferencji zanieczyszczeniami genomowego DNA, powód fałszywie dodatnich wyników, potwierdzano przez testowanie użytego jako matrycy DNA, które nie zostało otrzymane drogą odwrotnej transkrypcji. Po 15 minutach w 95°C w celu zaktywowania polimerazy DNA HotStarTaq, przeprowadzano 35 cykli PCR (1 min w 94°C, 1 min. w konkretnej temperaturze hybrydyzacji, 2 min. w 72°C i końcowe wydłużanie w przy 72°C przez 6 min.).
μΐ z tej reakcji frakcjonowano i analizowano na żelu agarozowym znakowanym bromkiem etydyny.
Do analizy ekspresji odpowiednich antygenów używano następujących starterów we wskazanej temperaturze hybrydyzacji.
GPR35 (65°C)
Sensowny: 5-AGGTACATGAGCATCAGCCTG-3'
Nonsensowny: 5'-GCAGCAGTTGGCATCTGAGAG-3'
GUCY2C (62°C)
Sensowny: 5'-GCAATAGACATTGCCAAGATG-3'
Nonsensowny: 5'-AACGCTGTTGATTCTCCACAG-3'
SCGB3A2 (66°C)
Sensowny: 5'-CAGCCTTTGTAGTTACTCTGC-3'
Nonsensowny: 5'-TGTCACACCAAGTGTGATAGC-3'
Claudin18A2 (68°C)
Sensowny1: 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3'
Nonsensowny: 5'-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3'
Sensowny2: 5'-TGTTTTCAACTACCAGGGGC-3'
Nonsensowny: 5'-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3'
Claudin18Al (64°C)
Sensowny: 5'-GAGGCAGAGTTCAGGCTTCACCGA-3'
Nonsensowny: 5'-TGTTGGCTTTGGCAGAGTCC-3'
SLC13Al (64°C)
Sensowny: 5'-CAGATGGTTGTGAGGAGTCTG-3'
Nonsensowny: 5'-CCAGCTTTAACCATGTCAATG-3'
CLCAl (62°C)
Sensowny: 5'-ACACGAATGGTAGATACAGTG-3'
Nonsensowny: 5'-ATACTTGTGAGCTGTTCCATG-3'
FLJ21477 (68°C)
Sensowny: 5'-ACTGTTACCTTGCATGGACTG-3'
Nonsensowny: 5'-CAATGAGAACACATGGACATG-3'
FLJ20694 (64°C)
Sensowny: 5'-CCATGAAAGCTCCATGTCTA-3'
Nonsensowny: 5'-AGAGATGGCACATATTCTGTC-3'
Ebner (70°C)
Sensowny: 5'-ATCGGCTGAAGTCAAGCATCG-3'
Nonsensowny: 5'-TGGTCAGTGAGGACTCAGCTG-3'
PL 219 093 B1
Plunc (55°C)
Sensowny: 5'-TTTCTCTGCTTGATGCACTTG-3'
Nonsensowny: 5'-GTGAGCACTGGGAAGCAGCTC-3'
SLC26A9 (67°C)
Sensowny: 5'-GGCAAATGCTAGAGACGTGA-3'
Nonsensowny: 5'-AGGTGTCCTTCAGCTGCCAAG-3'
THC1005163 (60°C)
Sensowny: 5'-GTTAAGTGCTCTCTGGATTTG-3'
LOC134288 (64°C)
Sensowny: 5'-ATCCTGATTGCTGTGTGCAAG-3'
Nonsensowny: 5'-CTCTTCTAGCTGGTCAACATC-3'
THC943866 (59°C)
Sensowny: 5'-CCAGCAACAACTTACGTGGTC-3'
Nonsensowny: 5'-CCTTTATTCACCCAATCACTC-3'
FLJ21458 (62°C)
Sensowny: 5'-ATTCATGGTTCCAGCAGGGAC-3'
Nonsensowny: 5'-GGGAGACAAAGTCACGTACTC-3'
Przygotowanie dowolnego startera cDNA będącego heksamerem i ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
Ekspresja poszczególnych genów była oznaczana ilościowo przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym. Produkty PCR wykrywano używając SYBR Green jako wtrąconego barwnika reporterowego. Fluorescencja reportera SYBR Green jest tłumiona w roztworze i barwnik jest aktywny tylko po związaniu do fragmentów dwuniciowego DNA. Do ilościowego oznaczenia używany jest wzrost fluorescencji SYBR Green powstałej w wyniku specyficznego powielania przy użyciu starterów specyficznych dla GOI, po każdym cyklu PCR. Ekspresja docelowego genu jest oznaczana bezwzględnie lub względem ekspresji kontrolnego genu, który wykazuje stałą ekspresję w tkance, która ma być badana. Ekspresję mierzono po standaryzacji próbek przeciw RNA 18s tzw. genu housekeeping (gen kodujący białko konstytutywne) używając metody ΔΔ-Ct (PE Biosystems, USA). Reakcję przeprowadzano w duplikatach a oznaczenia w triplikatach. Zestawu QuantiTec SYBR Green PCR (Qiagen, Hilden) używano zgodnie z instrukcją producenta. cDNA syntetyzowano stosując zestaw cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA) o wysokiej wydajności i używając starterów heksamerowych zgodnie z instrukcją producenta. Do PCR każda 5 ąl porcja rozcieńczonego cDNA była stosowana w całkowitej objętości 25 ąl: sensowny starter 300 nM, nonsensowny starter 300 nM; początkowa denaturacja 15 min w 95°C; 30 sek. w 95°C; przyłączanie przez 30 sek.; 30 sek. w 72°C; 40 cykli. Sekwencje używanych starterów pokazano w odpowiednich przykładach.
Klonowanie i analiza sekwencji
Klonowanie genów pełnej długości i fragmentów genów miało miejsce przy użyciu konwencjonalnych metod. Żeby ustalić sekwencję, odpowiednie antygeny powielano używając polimerazy proofreading pfu (Stratagene). Po zakończeniu PCR adenozyna była ligowana przy użyciu polimerazy DNA HotStarTaq do końców amplikonu, żeby zgodnie z instrukcjami producenta, sklonować fragmenty wektora TOPO-TA. Sekwencjonowanie przeprowadzano przy użyciu komercyjnego serwisu. Sekwencje analizowano używając konwencjonalnych programów predykcyjnych i algorytmów.
Western blotting
Komórki z hodowli komórkowej (endogenna ekspresja docelowego genu lub synteza docelowego białka po transfekcji wektora ekspresyjnego, który koduje docelowe białko) lub próbki tkanek, które mogą zawierać docelowe białko są lizowane w 1% roztworze SDS. SDS denaturuje białka obecne w lizacie. Lizaty doświadczalnej mieszaniny są frakcjonowane wg wielkości przy użyciu elektroforezy na 8-15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (zawierającym 1% SDS), zależnie od oczekiwanego rozmiaru białka (elektroforeza na żelu poliakrylamidowym w obecności SDS, SDS-PAGE). Białka są następnie przenoszone metodą pół-suchego elektroblottingu (Biorad) na membranę nitrocelulozową (Schleicher & Sch^l), na której pożądane białko może być wykryte. W tym celu membrana jest wstępnie blokowana (np. mlekiem w proszku) a następnie inkubowana ze ściśle określonym przeciwciałem w rozcieńczeniu 1:20 - 1:200 (zależnie od specyficzności przeciwciała) przez 60 minut. Po przemyciu membrana jest inkubowana ze sprzężonym ze wskaźnikiem (np. enzymem takim jak peroksydaza lub fosfataza alkaliczna) przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe. Następnie, po kolejnym przemywaniu, docelowe białko jest wizualizowane na membranie w wyniku
PL 219 093 B1 barwnej lub chemiluminescencyjnej reakcji za pomocą reakcji enzymatycznej (np. ECL, Amersham Bioscience). Wynik jest dokumentowany poprzez zrobienie zdjęć odpowiednią kamerą.
Analiza modyfikacji białek zazwyczaj jest wykonywana metodą Western blotting. Glikozylacje, które zwykle mają rozmiar kilku kDa, dają w wyniku większą całkowitą masę docelowego białka, które może być frakcjonowane przy użyciu SDS-PAGE. Do wykrycia specyficznych O- i N-glikozydowych wiązań, lizaty białkowe z komórek lub tkanek są przed denaturacją SDS inkubowane z O- lub N-glikozydazami (zgodnie z odpowiednimi instrukcjami producenta, np. PNgasa, endoglikozydaza F, endoglikozydaza H, Roche Diagnostics). Po tym stosowany jest Western blotting, tak jak opisano powyżej. Tak więc, jeżeli zmniejsza się rozmiar docelowego białka po inkubacji z glikozydazą, możliwe jest wykrycie specyficznej glikozylacji i w ten sposób nowotworowo specyficznej modyfikacji. Dokładna pozycja glikozylowanego aminokwasu może być przewidywana przy użyciu algorytmów i programów predykcyjnych.
Immunofluorescencja
Używane są komórki ustalonych linii komórkowych, które albo syntetyzują endogennie docelowe białko(detekcja RNA metodą RT-PCR lub białka metodą Western blotting) lub też zostały transfekowane DNA plazmidu przed IF. Opracowanych jest wiele różnorodnych sposobów (np. elektroporacja, transfekcja za pomocą liposomów, strącanie fosforanem wapnia) transfekowania DNA linii komórkowych (np. Lemoine i wsp. Methods Mol. Biol. 1997; 75: 441-7). Transfekowany plazmid może w metodach immunofluorescencyjnych kodować niezmodyfikowane białko lub też sprzęgać różne aminokwasowe wskaźniki z docelowym białkiem. Najważniejszymi markerami są na przykład fluoryzujące „zielone białko fluorescencyjne (GFP) w jego różnych w różny sposób fluoryzujących formach i krótkie sekwencje peptydowe 6-12 aminokwasów dla których dostępne są specyficzne przeciwciała o wysokim powinowactwie. Komórki, które syntetyzują docelowe białko są utrwalane w paraformaldehydzie, saponinie lub metanolu. Jeżeli jest to wymagane, komórki mogą być permeabilizowane przez inkubację z detergentami (np. 0,2% Triton X-100). Po utrwalaniu/ permeabilizacji komórki są inkubowane z przeciwciałami pierwszorzędowymi, które są skierowane przeciwko białku docelowemu lub jednemu ze sprzężonych markerów. Po przemyciu, mieszanina jest inkubowana z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym ze wskaźnikiem fluorescencyjnym (np. fluoresceiną, Texas Red, Dako), które wiąże się do przeciwciała pierwszorzędowego. Znakowane w ten sposób komórki są następnie pokrywane warstwą glicerolu i analizowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcjami producenta. Emisja specyficznej fluorescencji jest w tym przypadku osiągana przez specyficzne pobudzenie zależne od użytych substancji. Analiza zazwyczaj zezwala na lokalizację białka docelowego, właściwości przeciwciała i białka docelowego są potwierdzane w podwójnym znakowaniu, żeby wyznakować w uzupełnieniu do białka docelowego także sprzężone aminokwasowe wskaźniki lub inne wskaźniki białkowe, których lokalizacja została opisana w piśmiennictwie. GFP i jego pochodne reprezentują specjalny przypadek, może być on bezpośrednio pobudzany i może sam fluoryzować tak, że przeciwciała nie są konieczne do detekcji.
Immunohistochemia
IHC służy szczególnie do (1) dawania możliwości oznaczenia ilości docelowego białka w tkankach nowotworowych i prawidłowych, (2) analizowania jak wiele komórek w tkance nowotworowej i zdrowej syntetyzuje docelowy gen, i/lub (3) określenia typu komórki w tkance (komórki nowotworowe, zdrowe), w których białko jest wykrywalne.
Różne procedury muszą być używane dla poszczególnych przeciwciał (np. „Diagnostic Immunochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667' lub „Microscopy, Immunochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704).
Immunhistochemia (IHC) ściśle określonych próbek tkanek służy do wykrywania białka w odpowiedniej tkance. Celem tego sposobu jest zidentyfikować lokalizację białka w funkcjonalnie nietkniętej całej tkance.
IHC jest szczególnie przydatny, ze względu (1) na zdolność oznaczania ilości docelowego białka w tkankach nowotworowych i prawidłowych, (2) analizowanie jak wiele komórek w tkance nowotworowej i w tkance zdrowej syntetyzuje gen docelowy i (3) określania w tkance typu komórek (nowotwór, zdrowe komórki), w których białko docelowe jest wykrywalne. Alternatywnie, ilość białka docelowego genu może być zmierzona ilościowo przy zastosowaniu immunofluorescencji tkankowej przy użyciu kamery cyfrowej z odpowiednim oprogramowaniem (np. Tillvision, Till-photonics, Germany). Opis tej techniki jest często publikowany i szczegóły dotyczące znakowania oraz mikroskopii mogą być znalezione na przykład w „Diagnostic Immunochemistry David J., MD Dabbs ISBN:0443065667 lub
PL 219 093 B1 „Microscopy, Immunochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704. Należy zwrócić uwagę, że ze względu na różne właściwości przeciwciał, w celu otrzymania rzetelnego wyniku, muszą być używane różne procedury (przykład jest opisany poniżej).
Zazwyczaj, w IHC stosowane są histologicznie określone tkanki nowotworowe i jako referencyjne stosowane są porównywalne zdrowe tkanki. Poza tym, możliwe jest użycie jako kontroli pozytywnych i negatywnych linii komórkowych, w których obecność genu docelowego jest znana dzięki analizie RT-PCR. Zawsze musi być uwzględnione kontrolne tło.
Stosowana jest utrwalona tkanka (np. utrwalanie substancjami zawierającymi aldehyd, formaldehyd, paraformaldehyd lub w roztworach alkoholu) lub gwałtownie zamrożone skrawki o grubości 1-10 gm, na szklanym podłożu. Próbki zatopione w parafinie są odparafinowywane przy użyciu na przykład ksylenu. Próbki są przemywane TBS-T i blokowane surowicą. Potem następuje inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym (rozcieńczenie 1:2 do 1:2000) przez 1-18 godzin, zazwyczaj stosowane są przeciwciała oczyszczone na kolumnie powinowactwa. Po przemyciu następuje około 30-60 minut inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym, które jest sprzężone z fosfatazą alkaliczną (alternatywnie na przykład z peroksydazą) i jest skierowane przeciwko przeciwciału pierwszorzędowemu. Następnie przeprowadza się reakcję barwną przy użyciu barwnych substratów, które są przekształcane przez przyłączone enzymy (porównaj na przykład Shi wsp., J. Hostochem. Cytochem. 39: 741-748, 1991; Shin i wsp., Lab. Invest. 64: 693-702, 1991). W celu wykazania specyficzności przeciwciała, reakcja może być blokowana przez uprzednie dodanie immunogenu.
Immunizacja (Patrz także Monoclonal Antibodies: A Practical Approach Philip Shepherd, Christopher Dean, isbn 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manual Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Proces otrzymywania przeciwciał jest krótko opisany poniżej, a szczegóły mogą być znalezione w cytowanych publikacjach. Najpierw zwierzęta (np. króliki) są immunizowane przez pierwszą iniekcję pożądanego białka docelowego. Odpowiedź immunologiczna zwierząt na immunogen może być podwyższona przez drugą i trzecią immunizację w określonym okresie czasu (około 2-4 tygodni po poprzedniej immunizacji). Raz za razem, po określonych, różnych okresach czasu (pierwsze skrwawianie po 4 tygodniach, później co około dwa tygodnie, razem do 5 razy), krew jest pobierana od zwierząt i otrzymywana jest z niej surowica odpornościowa.
Zwierzęta są zazwyczaj immunizowane jednym z czterech dobrze opracowanych sposobów, dostępne są także inne sposoby. Co więcej, możliwe jest immunizowanie peptydami specyficznymi dla białka docelowego, całkowitym białkiem lub niepełnymi, pozakomórkowymi sekwencjami białka, które może być identyfikowane eksperymentalnie lub poprzez programy prognozujące.
(1) W pierwszym przypadku, peptydy (długość: 8-12 aminokwasów) sprzężone z KLH (hemocjanina pijawki w kształcie dziurki od klucza) syntetyzowane są przy użyciu znormalizowanych metod i te peptydy używane są do immunizacji. Zazwyczaj przeprowadzane są 3 immunizację ze stężeniem 5-1000 gg/immunizację. Immunizacja może także być przeprowadzana jako usługa dostawcy.
(2) Alternatywnie immunizacja może być przeprowadzana z białkami zrekombinowanymi. W tym celu sklonowane DNA genu docelowego, jest klonowane do wektora ekspresyjnego i docelowe białko jest syntetyzowane w analogii do warunków poszczególnych wytwórców (np. Roche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen) na przykład in vitro bez komórek, w bakteriach (np. E. Coli), w drożdżach (np. S. Pombe), w komórkach insektów lub w komórkach ssaków. Po syntezie w jednym z tych systemów, białko docelowe jest oczyszczane, w tym przypadku zazwyczaj przy użyciu znormalizowanych metod chromatograficznych. W związku z tym, możliwe jest także użycie do immunizacji białek, które mają molekularne zamocowanie jako ułatwienie oczyszczania (np. His tag, Qiagen; FLAG tag, Roche Diagnostics; białka fuzyjne Gst). Ogromna liczba procedur może być znaleziona na przykład w „Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons Ltd., Wiley Interscience.
(3) Jeżeli dostępna jest linia komórkowa, która syntetyzuje endogennie pożądane białko, ta linia komórkowa także może być użyta do wytwarzania specyficznej surowicy odpornościowej. W tym przypadku, immunizacja ma miejsce podczas 1-3 iniekcji, w każdym przypadku z około 1-5 x 107 komórek.
(4) Immunizacja może także mieć miejsce po iniekcji DNA (immunizacja DNA). W tym celu gen docelowy początkowo jest klonowany do wektora ekspresyjnego, tak że sekwencja docelowa jest pod kontrolą silnego eukariotycznego promotora (np. promotora CMV). Następnie 5-10 gg DNA jest transPL 219 093 B1 ferowanych jako immunogen przy użyciu „strzelby genowej do regionów organizmu (np. mysz, królik), gdzie są naczynia włosowate z silnym przepływem krwi. Transferowane DNA jest pobierane przez komórki zwierzęce, zachodzi ekspresja genu docelowego i w końcu u zwierzęcia rozwija się odpowiedź immunologiczna na gen docelowy (Jung i wsp., Mol Cells 12:41-49, 2001; Kasinrerk i wsp., Hybrid Hybridomics 21: 287-293, 2002).
Kontrola jakości surowicy poliklonalnej lub przeciwciała
Najodpowiedniejsze do wykazania specyficzności są badania oparte na hodowli komórkowej z późniejszym Western blotting (różne warianty są opisane na przykład w „Current Protocols in Protein Chemistry, John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience). W celu wykazania, komórki są transfekowane, będącym pod kontrolą silnego eukariotycznego promotora (na przykład promotora cytomegalo wirusa) cDNA dla białka docelowego. Opracowana jest duża różnorodność metod transfekowania linii komórkowych DNA (np. elektroporacja, ranfekcja w oparciu o liposomy, strącanie fosforanem wapnia) (np. Lemoine i wsp., Methods Mol. Biol. 75:441-7, 1997). Możliwe jest także alternatywne użycie linii komórkowych, w których endogennie zachodzi ekspresja docelowego genu (wykazanie przez specyficzne dla docelowego genu RT-PCR). W idealnym przypadku, jako kontrola, homologiczne geny także są transfekowane w doświadczeniu, żeby móc wykazać w późniejszym Western blot specyficzność analizowanego przeciwciała.
W późniejszym Western blot, komórki z hodowli komórkowej lub próbek tkanki, które mogą zawierać białko docelowe, są lizowane w 1% roztworze SDS i w wyniku tego białka są denaturowane. Lizaty są frakcjonowane według wielkości przy użyciu elektroforezy na 8-15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (zawierającym 1% SDS) (elektroforeza na żelu poliakrylamidowym z dodatkiem SDS, SDS-PAGE). Białka są następnie przenoszone przy użyciu jednej z wielu metod blottingu (np. pół-suchy elektroblot; Biorad) na specyficzne membrany (np. nitroceluloza, Schleicher & Sch^). Na tej membranie pożądane białko może być uwidocznione. W tym celu membrana jest najpierw przez 60 minut inkubowana z przeciwciałem, które rozpoznaje docelowe białko (rozcieńczenie 1:20-1:200, zależnie od specyficzności przeciwciała). Po przemyciu membrana jest inkubowana ze sprzężonym ze wskaźnikiem (np. enzymami takimi jak peroksydaza lub fosfataza alkaliczna) przeciwciałem drugorzędowym, które rozpoznaje przeciwciało pierwszorzędowe. Później możliwa jest, dzięki reakcji barwnej lub chemiluminescencyjnej, wizualizacja białka docelowego na membranie (np. ECL, Amersham Bioscience). W idealnym przypadku, przeciwciało o wysokiej specyficzności do białka docelowego rozpoznaje tylko pożądane białko.
Stosowane są różne sposoby potwierdzania lokalizacji, zidentyfikowanego w podejściu silico, białka docelowego na membranie. Ważną i dobrze rozwiniętą metodą używającą przeciwciał, jest opisana powyżej immunofluorescencja (IF). Używane są komórki ustalonych linii komórkowych, które albo syntetyzują docelowe białko (wykrywanie RNA w RT-PCR lub białka w Western blot) lub też zostały transfekowane DNA plazmidu. Duża różnorodność sposobów (np. elektroporacja, oparta na liposomach transfekcja, strącanie fosforanem wapnia) jest dobrze ustalona dla transfekcji DNA linii komórkowych (np. Lemoine i wsp., Methods Mol. Biol. 75:441-7, 1997). Plazmid transfekowany do komórek, może immunofluorescencyjnie kodować niezmodyfikowane białko lub też sprzęgać różne aminokwasowe wskaźniki z docelowym białkiem. Głównymi wskaźnikami są na przykład fluorescent „zielone białko fluorescencyjne (GFP) w jego odmiennych różnych formach fluorescencyjnych, krótka sekwencja peptydów, składająca się z 6-12 aminokwasów dla których dostępne są przeciwciała o wysokim powinowactwie i specyficzności lub krótka sekwencja aminokwasów, Cys-Cys-X-X-CysCys, która może wiązać poprzez swoją cysteinę specyficzne substancje fluorescencyjne (Invitrogen). Komórki, które syntetyzują docelowe białko są np. utrwalane paraformaldehydem lub metanolem. Później komórki można, jeżeli jest to wymagane, permeabilizować przez inkubację z detergentami (np. 0,2% Triton X-100). Komórki są następnie inkubowane z przeciwciałem pierwszorzędowym, skierowanym przeciw białku docelowemu lub przeciw jednemu ze sprzężonych wskaźników. Po przemyciu, mieszanina jest inkubowana z wiążącym się z pierwszorzędowym przeciwciałem, przeciwciałem drugorzędowym, które jest sprzężone ze wskaźnikiem fluoroscencyjnym (np. fluoresceina, Texas Red, Dako). Wyznakowane w ten sposób komórki są następnie pokrywane warstwą glicerolu i analizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego zgodnie z instrukcją producenta. Emisja specyficznej fluorescencji jest w tym przypadku osiągana przez specyficzne pobudzenie zależne od rodzaju użytych substancji. Analiza zezwala zazwyczaj na rzetelną lokalizację białka docelowego, właściwości przeciwciała i białka docelowego są potwierdzane w podwójnym znakowaniu żeby wyznakować oprócz białka docelowego także sprzężone aminokwasowe wskaźniki lub inne wskaźniki białkowe, których
PL 219 093 B1 lokalizacja została opisana w piśmiennictwie. GFP i jego pochodne reprezentują specjalny przypadek, możliwe jest ich bezpośrednie pobudzanie i mogą fluoryzować same z siebie. Przepuszczalność błonowa, która może być kontrolowana przez użycie detergentów, zezwala na wykazanie przy użyciu immunofluorescencji, czy immunogenny epitop jest umiejscowiony wewnątrz czy na zewnątrz komórki. Przewidywanie wybranych białek może być więc poparte doświadczalnie. Inną możliwością jest wykrycie pozakomórkowych domen przy użyciu cytometrii przepływowej. W tym celu komórki są utrwalane w warunkach nie permeabilizujących (np. w PBS/azydek Na/2% FCS/5 mM EDTA) i analizowane w cytometrze przepływowym zgodnie instrukcjami producenta. Żeby być analizowane tą metodą, tylko pozakomórkowe epitopy mogą być rozpoznawane przez przeciwciało. Różnica w porównaniu z immunofluorescencja jest taka, że możliwe jest rozróżnienie martwych i żywych komórek, na przykład przez użycie jodku propidyny, błękitu trypanowego, co zapobiega otrzymywaniu wyników fałszywie dodatnich.
Oczyszczanie przy wykorzystaniu powinowactwa
Oczyszczanie poliklonalnego przeciwciała dotyczy wyłącznie przeciwciał peptydowych lub częściowo, w przypadku przeciwciał przeciw zrekombinowanym białkom jako usługa dostawcy. W tym celu, w obu przypadkach, odpowiedni peptyd lub zrekombinowane białko było kowalencyjnie wiązane do podłoża i później po sprzężeniu było równoważone natywnym buforem (PBS: bufor fosforanowy) i następnie inkubowane z surową surowicą. Po dalszym przemyciu PBS, przeciwciało eluowano 100 mM glicyną, pH 2,7 i eluat bezzwłocznie zobojętniano 2M Trisem, pH 8. Przeciwciała oczyszczane w ten sposób, mogły potem być stosowane do specyficznej detekcji białek docelowych zarówno przy użyciu Western blotting jak i immunofluorescencji.
Przygotowywanie komórek transfekowanych EGFP
Dla celów mikroskopii fluorescencyjnej związanych z nowotworem antygenów, których ekspresja zachodzi heterogennie, klonowano całkowity ORF antygenów do wektorów pEGFP-C1 i pEGFP-N3 (Clontech). Komórki CHO i NIH3T3 hodowane na szkiełkach podstawowych były transfekowane zgodnie z instrukcjami producenta odpowiednimi konstruktami plazmidu przy użyciu odczynnika do transfekcji Fugene (Roche) i po 12-24 h analizowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.
P r z y k ł a d 1: Identyfikacja GPR35 jako celu diagnostyki i terapii nowotworu
GPR35 (SEQ ID Nr: 1) i produkt jego translacji (SEQ ID Nr: 9) zostały opisane jako przypuszczalny receptor związany z białkiem G. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod Nr akcesyjnym AF089087. Ten transkrypt koduje białko o 309 aminokwasach, o ciężarze cząsteczkowym 34kDa. Przewidywano, że GPR35 należy do nadrodziny receptorów związanych z białkiem G z 7 domenami transbłonowymi (O'Dowd i wsp., Genomics 47:310-13, 1998). W celu potwierdzenia przewidywanej lokalizacji GPR35 w komórce, wykonano fuzję białka do eGFP jako cząsteczki reporterowej i po transfekcji odpowiedniego plazmidu zaszła heterogenna ekspresja w komórkach 293. Lokalizacja była następnie analizowana w mikroskopie fluorescencyjnym. Zgodnie z wynalazkiem zostało potwierdzone, że GPR35 jest integralną transbłonową cząsteczką (ryc. 17). Dotychczasowe badania ludzkiego GPR35 (patrz między innymi Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell Gl Nat Genet 2000 Oct; 26 (2): 163-75) wskazują, że GPR35 jest aktywowane w wielu zdrowych tkankach. Ramka odczytu dla genu zawiera pojedynczy ekson. Zgodnie z wynalazkiem, para starterów (SEQ ID Nr: 20, 21) specyficznych dla genu GPR35 była używana w analizie RT-PCR do powielania cDNA w okrężnicy i raku okrężnicy (13/26). W przeciwieństwie do tego, nie wykryto znaczącej ekspresji w innych prawidłowych tkankach. Z tego szczególnego powodu, że GPR35 posiada pojedynczy ekson, zanieczyszczenia genomowego DNA nie mogą być wykryte poprzez startery obejmujące intron. Żeby nie dopuścić do genomowych zanieczyszczeń próbek RNA, wszystkie RNA traktowano DNAazą. Zgodnie z wynalazkiem transkrypty GPR35 wykrywano w okrężnicy, odbytnicy, w jądrach i rakach okrężnicy przy użyciu DNA wolnego od RNA.
PL 219 093 B1
T a b e l a 1. Ekspresja GPR35 w prawidłowych tkankach
Prawidłowa tkanka Ekspresja
Mózg -
Móżdżek -
Mięsień sercowy -
Mięsień szkieletowy -
Odbytnica ++
Żołądek -
Okrężnica ++
Trzustka -
Nerki -
Jądra -
Grasica -
Gruczoł piersiowy -
Jajniki -
Macica nie oznaczono
Skóra -
Płuca -
Tarczyca -
Węzły chłonne -
Śledziona -
PBMC -
Nadnercza -
Przełyk -
Jelito cienkie +
Prostata -
Selektywna i wysoka ekspresja transkryptów GPR35 prawidłowej tkanki okrężnicy i otrzymanej drogą biopsji nowotworowej tkanki okrężnicy (ryc. 1) nie była poprzednio znana, a zgodnie z wynalazkiem może być używana w metodach diagnostyki molekularnej takich jak RT-PCR do wykrywania rozprzestrzeniających się komórek nowotworowych w surowicy i szpiku kostnym oraz do wykrywania przerzutów w innych tkankach. Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 88 i 89) także potwierdza, że GPR35 jest wysoce selektywnym dla jelit, specyficznie różnicującym antygenem, który także występuje w nowotworach jelit i w przerzutach nowotworów jelitowych. W niektórych nowotworach jelit rzeczywiście występuje nadekspresja o jeden rząd wielkości w porównaniu z prawidłowym jelitem (ryc. 18). Przeciwciała do wykrywania białka GPR35 wytwarzano przez immunizację królika. Następujące peptydy były używane do namnażania tych przeciwciał:
SEQ ID Nr: 90: GSSDLTTWPPAIKLGC (AA 9-23)
SEQ ID Nr: 91: DRYVAVRHPLRARGLR (AA 112-127)
SEQ ID Nr: 92: VAPRAKAHKSQDSLC (koniec C)
SEQ ID Nr: 93: CFRSTRHNFNSMR (pozakomórkowa domena 2)
Znakowania tymi przeciwciałami, np. w Western Blot potwierdzają ekspresję w nowotworach. Zgodnie z wynalazkiem, wszystkie 4 pozakomórkowe domeny GPR35 (pozycja przewidywanych pozakomórkowych domen w sekwencji SEQ ID Nr: 9 AA 1-22 (SEQ ID Nr: 94); AA 81-94 (SEQ ID Nr: 95); AA 156-176 (SEQ ID Nr: 96); AA 280-309 (SEQ ID Nr: 97)) mogą być użyte, jako docelowe struktury dla monoklonalnych przeciwciał. Te przeciwciała wiążą się specyficznie do powierzchni komórkowej komó40
PL 219 093 B1 rek nowotworowych i mogą być użyte zarówno w metodach diagnostycznych jak i terapeutycznych.
Nadekspresja GPR35 w nowotworach dodatkowo potwierdza takie zastosowanie. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, sekwencja kodująca białka, może być użyta jako szczepionka (RNA, DNA, peptyd, białko) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (odpowiedzi przenoszonej przez komórki T i komórki B). Poza tym, co zaskakujące, stwierdzono, że istnieje dalszy kodon startowy 5' przed ogólnie znanym kodonem startowym i zachodzi ekspresja białka z rozszerzeniem N-końca.
Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że GPR35, białko, które poprzednio opisano jako ulegające ekspresji w bardzo wielu miejscach, ulega nadekspresji w powiązaniu z nowotworem, selektywnie w nowotworach jelitowo-żołądkowych, szczególnie w nowotworach okrężnicy. GPR35 jest więc odpowiednie, szczególnie jako molekularna docelowa struktura do diagnozy i leczenia tych nowotworów. Dotychczasowe badania ludzkiego GPR35 (patrz między innymi Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI Nat Genet 2000 Oct; 26(2): 163-75) wskazują, że GPR35 jest aktywowane w wielu zdrowych tkankach. Przeciwnie, według wynalazku badania wykazują, że wykrywalność GPR35 jest zaskakująco nie znacząca większości prawidłowych tkanek i w przeciwieństwie do tego jest mocno aktywowana w pierwotnych nowotworach okrężnicy i w przerzutach. Zgodnie z wynalazkiem, dodatkowo, oprócz opisanej sekwencji GPR35, został znaleziony nowy wariant translacyjny, który wykorzystuje alternatywny kodon startu (SEQ ID Nr: 10).
GPR jest członkiem grupy receptorów związanych z białkiem G (GPCR), bardzo dużej rodziny białek, których struktura i funkcja została bardzo dobrze zbadana. GPCR są wybitnie odpowiednie jako docelowe struktury do rozwoju farmaceutycznie aktywnych substancji, ponieważ niezbędne do tego sposoby (np. ekspresja receptorów, oczyszczanie, skrining ligandów, mutageneza, funkcjonalne hamowanie, selekcja ligandów o działaniu agonistycznym i antagonistycznym, radioznakowanie ligandów) są bardzo dobrze rozwinięte i szczegółowo opisane, porównaj na przykład „G Protein-Coupled Receptors Tatsuya Haga, Gabriel Berstein i Gabriel Berstein ISBN: 0849333849 i w „Identification and Expression of
G-Protein Coupled Receptors Receptor Biochemistry and Methodology Kevin R. Lynch ASIN: 0471183105. Zgodnie z wynalazkiem, to że GPR35 jest niewykrywalne w większości prawidłowych tkanek ale w powiązaniu z nowotworem ulega ekspresji na powierzchni komórek pozwala, żeby było używane jako związana z nowotworem struktura docelowa, na przykład dla farmaceutycznie aktywnych ligandów, szczególnie na przykład, sprzężonych z radioaktywnymi cząsteczkami jako substancjami farmaceutycznymi. W szczególnej postaci możliwe jest użycie radioznakowanych ligandów, które wiążą się do GPR35 w celu wykrywania komórek nowotworowych albo do leczenia nowotworów okrężnicy in vivo.
P r z y k ł a d 2: Identyfikacja GUCY2C w nowotworach wątroby i jajników i nowe warianty składania GUCY2C jako cele diagnostyki i terapii nowotworów
Cyklaza guanylinowa 2C (SEQ ID Nr: 2; produkt translacji SEQ ID Nr: 11) - typ I białka transbłonowego należy do rodziny sodopędnych receptorów peptydowych. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod numerem akcesyjnym NM_004963. Wiązanie peptydów guanylinowych i uroguanylinowych lub też enterotoksyn ciepłostałych (ST) zwiększa stężenie wewnątrzkomórkowego cGMP indukując w ten sposób sygnał procesów transdukcji wewnątrz komórki.
Ostatnie badania wskazują, że ekspresja GUCY2C rozciąga się także na pozajelitowe regiony takie jak na przykład rak pierwotny i przerzuty gruczolaka żołądka i przełyku (Park i wsp., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 11:739-44, 2002). Wariant składania GUCYC, który znaleziono zarówno w prawidłowej jak i zmienionej tkance jelita, zawiera delecje 142 bp w eksonie 1, zapobiegając tym sposobem translacji podobnego do GUCY2C produktu (Pearlman i wsp., Dig. Dis. Sci. 45:298-05, 2000). Jedyny opisany dotychczas wariant składania nie prowadzi do powstania produktu translacji. Zgodnym z wynalazkiem celem była identyfikacja związanych z nowotworem wariantów składania GUCY2C, które mogą być używane zarówno w diagnostyce jak i w terapii. Badania RT-PCR z parą starterów specyficznych dla GUCY2C (SEQ ID Nr: 22, 23, 98, 99) wykazują nasiloną ekspresję transkryptów GUCY2C w prawidłowej okrężnicy i żołądku a słabą ekspresję w wątrobie, jądrach, jajnikach, grasicy, śledzionie, mózgu i płucach (tabela 2, ryc. 19). Ekspresja w okrężnicy i żołądku była przynajmniej 50 razy większa niż we wszystkich innych prawidłowych tkankach. Poziomy znakowanych transkryptów GUCY2C były wykrywane w raku okrężnicy i raku żołądka (tab. 2). Te wyniki były sprecyzowane na podstawie ilościowej analizy PCR i wykazały nasiloną ekspresję GUCY2C w prawidłowej okrężnicy,
PL 219 093 B1 jelicie krętym i prawie wszystkich badanych próbkach raka okrężnicy (ryc. 2, 19B). Masywna nadekspresja była wykrywalna w niektórych próbkach raka okrężnicy. Poza tym ekspresję stwierdzono w 7/10 nowotworów żołądka. Co zaskakujące, stwierdziliśmy, że gen jest aktywowany w wielu innych uprzednio nie opisanych nowotworach, między innymi, nowotworach jajników, piersi, wątroby i prostaty (ryc. 19B, tab. 2).
T a b e l a 2. Ekspresja GUCY2C w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka Ekspresja
Mózg +
Móżdżek
Mięsień sercowy
Mięsień szkieletowy -
Mięsień sercowy
Odbytnica
Żołądek +++
Okrężnica +++
Trzustka -
Nerki -
Wątroba +
Jądra ++
Grasica +
Gruczoł piersiowy -
Jajniki +
Macica +
Skóra
Płuca +
Tarczyca
Węzły chłonne -
Śledziona +
PBMC -
Prostata -
Typ nowotworu Ekspresja
Rak okrężnicy +++
Rak trzustki -
Rak przełyku -
Rak żołądka +++
Rak oskrzeli -
Rak piersi -+
Rak jajników +
Rak endometrium
Nowotwory ENT
Rak komórek nerek
Rak prostaty +
Rak wątroby +
PL 219 093 B1
Do wykrywania wariantów składania w tkance okrężnicy i tkance raka okrężnicy używano następujących par starterów: GUCYC2C-118s/GUCYC2C-498as (SEQ ID Nr: 24, 29); GUCYC2C621s/GUCYC2C-1140as (SEQ ID Nr: 25, 30);
GUCYC2C-1450s/GUCYC2C-1790as (SEQ ID Nr: 26, 31);
GUCYC2C-1993s/GUCYC2C-2366as (SEQ ID Nr: 27, 32);
GUCYC2C-2717s/GUCYC2C-3200as (SEQ ID Nr: 28, 33);
GUCYC2C-118s/GUCYC2C-1140as (SEQ ID Nr: 24, 30);
GUCYC2C-621s/GUCYC2C-1790as (SEQ ID Nr: 25, 31);
GUCYC2C-1450s/GUCYC2C-2366as (SEQ ID Nr: 26, 32);
GUCYC2C-1993/GUCYC2C-3200as (SEQ ID Nr: 27, 33).
Zgodnie z wynalazkiem, w badaniach wariantów składania w raku okrężnicy zidentyfikowano trzy poprzednio nieznane formy.
a) delecja eksonu 3 (SEQ ID Nr: 3), która prowadzi do wariantu, który ma długość tylko 111 aminokwasów i w którym asparagina w pozycji 111 jest zastąpiona przez prolinę.
b) Delecja eksonu 6 (SEQ ID Nr: 4), który w wyniku daje produkt ekspresji, który ma długość 258 aminokwasów. To mogłoby wytwarzać neoepitop C-końca zawierający 13 aminokwasów.
c) Wariant, w którym nukleotydy w pozycjach 1606-1614 i odpowiadające aminokwasy L(536), L(537) i Q(538) są usunięte (SEQ ID Nr: 5).
Zgodnie z wynalazkiem, warianty składania z delecjami odpowiednio w eksonie 3 i 6 (SEQ ID Nr: 3 i 4) są rozróżniane w szczególności na podstawie produktów translacji (SEQ ID Nr: 12 i 13) nie mających domen transbłonowych. W przypadku delecji eksonu 6, wynikiem jest neoepitop C-końca o 13 aminokwasach, który nie wykazuje żadnej homologii z dotychczas znanymi białkami. Ten epitop jest więc predestynowany, by być docelową strukturą dla immunoterapii. Będący przedmiotem wynalazku wariant składania z delecją zasad w pozycjach 1606-1614 (SEQ ID Nr: 5) i produkt jego translacji8 (SEQ ID Nr: 14) podobnie zawiera neoepitop. Przeciwciała do wykrywania białka GUCY2C były otrzymywane przez immunizację królików. Do namnażania przeciwciał używano następujących peptydów:
SEQ ID Nr: 100: HNGSYEISVLMMGNS (AA 31-45)
SEQ ID Nr: 101: NLPTPPTVENQQRLA (AA 1009-1023)
Takie przeciwciała mogą być w zasadzie używane do celów diagnostycznych i terapeutycznych.
Zgodnie z wynalazkiem, w szczególności pozakomórkowa domena GUCY2C (pozycja przewidywanej pozakomórkowej domeny z sekwencji SEQ ID Nr: 11: AA 454-1073 (SEQ ID Nr: 102)) może być użyta jako docelowa struktura przeciwciał monoklonalnych. Jednak przewidywanie struktury może być niejednoznaczne i jeszcze nie zostało zweryfikowane eksperymentalnie, tak że alternatywna orientacja membrany jest także dopuszczalna. W tym przypadku aminokwasy 1-431 mogłyby być na zewnątrz komórki i być odpowiednie jako punkt startowy dla przeciwciał monoklonalnych. Te przeciwciała wiążą się specyficznie do powierzchni komórkowej komórek nowotworowych i mogą być użyte zarówno w diagnostyce jak i w terapii. Nadekspresja GUCY2C, szczególnie w nowotworach okrężnicy dostarcza dodatkowego wsparcia dla takiego zastosowania. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem sekwencje kodujące dla białek mogą być użyte jako szczepionki (RNA, DNA, peptydy, białko) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (odpowiedź immunologiczna przenoszona przez komórki T i komórki B).
Co więcej, zgodnie z komórkową funkcją cząsteczki GUCY2C, zgodnie z wynalazkiem, możliwy jest rozwój substancji, szczególnie małych cząsteczek, które modulują działanie enzymu na komórki nowotworowe. Produkt reakcji enzymatycznej cGMP, jest znaną komórkową cząsteczką sygnałową o szerokim zakresie działania (Tremblay i wsp., Mol Cell Biochem 230, 31).
P r z y k ł a d 3: Identyfikacja SCGB3A2 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
SCGB3A2 (SEQ ID Nr: 6) (produkt translacji: SEQ ID Nr: 15) należy do rodziny genów sekretoglobin. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod numerem akcesyjnym NM_054023. SCGB3A2 (UGRP1) jest homodimerycznym białkiem sekrecyjnym o wielkości 17 kDa, którego ekspresja zachodzi wyłącznie w płucach i nozdrzach (Niimi i wsp., Am J Hum Genet 70: 718-25, 2002). Badania RT-PCR z użyciem pary starterów (SEQ ID Nr: 37, 38) potwierdziły selektywną ekspresję w prawidłowej tkance płuc. Geny specyficzne dla płuc i tchawicy, np. dla powierzchniowo czynnych białek, są silnie regulowane w dół w nowotworach złośliwych podczas odróżnicowywania i normalnie są niewykrywalne w nowotworach płuc. Z zaskoczeniem stwierdzono, że SCGB3A2 jest aktywny w pierwotnym nowotworze płuc i w przerzutach. Badania zgodnie z wynalazkiem wykazały, że SCGB3A2 ulega silnej i częstej eksPL 219 093 B1 presji w raku oskrzeli (ryc. 4). Wszystkie pozostałe, 23 badane prawidłowe tkanki oprócz płuc i tchawicy, nie wykazywały ekspresji (porównaj ryc. 20).
Było to dodatkowo potwierdzone w specyficznym ilościowym RT-PCR (SEQ ID Nr: 103, 104) (ryc. 20), co dodatkowo pokazuje nadekspresję przynajmniej o jeden rząd wielkości większą w więcej niż 50% przypadków raka oskrzeli.
Selektywna i wysoka ekspresja SCGB3A2 w prawidłowej tkance płuc i biopsjach raka płuc, może być zgodnie z wynalazkiem zastosowana do wykrywania rozprzestrzeniających się komórek nowotworowych sposobami diagnostyki molekularnej takimi jak RT-PCR we krwi, szpiku kostnym, plwocinie, płynie odessanym z oskrzeli lub płynie z płukania oskrzeli oraz do wykrywania przerzutów w innych tkankach, np. w lokalnych węzłach chłonnych. W zdrowych płucach, SCGB3A2 jest wydzielane przez wyspecjalizowane komórki wyłącznie do oskrzeli. Zgodnie z tym, nie należy się spodziewać, że białko SCGB3A2 będzie wykrywalne w płynach ustrojowych na zewnątrz dróg oddechowych zdrowych osobników. W przeciwieństwie do tego, w szczególności komórki nowotworowe w przerzutach, wydzielają swoje produkty białkowe wprost do krwioobiegu. Dlatego pewien aspekt wynalazku, jako diagnostyka nowotworów płuc, dotyczy wykrywania produktów SCGB3A2 w surowicy lub osoczu pacjentów poprzez badanie przy użyciu specyficznych przeciwciał.
Przeciwciała do wykrywania białka SCGB3A2 były wytwarzane przez immunizowanie królików. Do namnażania przeciwciał stosowano następujące peptydy:
SEQ ID Nr: 105: LINKVPLPVDKLAPL
SEQ ID Nr: 106: SEAVKKLLEALSHLV
Specyficzna dla SCGB3A2 reakcja był wykrywana fluorescencyjnie (ryc. 21). Tak jak spodziewano się, dla wydzielonego białka, rozkład SCGB3A2 był przypisany do retikulum endoplazmatycznego i ziaren sekrecyjnych (ryc. 21A). W celu sprawdzenia specyficzności, komórki równolegle transfekowano plazmidem, który syntetyzuje białko fuzyjne SCGB3A2-GFP. W tym przypadku detekcja białka odbywała się dzięki autofluorescencji GFP (zielone białko fluorescencyjne) (ryc. 21B). Nałożenie na siebie dwóch fluorescencyjnych diagramów pokazuje, nie pozostawiając wątpliwości, że surowica odpornościowa rozpoznaje białko SCGB3A2 (ryc. 21C). Zgodnie z wynalazkiem takie przeciwciała mogą być np. używane w formie testów immunologicznych do celów diagnostycznych i terapeutycznych.
P r z y k ł a d 4: Identyfikacja wariantów składania claudin-18A1 i claudin-18A2 jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
Gen claudin-18 koduje cząsteczkę powierzchniową błony mającą 4 transbłonowe domeny i wewnątrzkomórkowy N koniec i C koniec. Niimi i współpracownicy (Moll. Cell. Biol. 21: 7380-90, 2001) opisali dwa warianty składania mysiego i ludzkiego claudin-18, które zostały opisane jako ulegające selektywnej ekspresji odpowiednio w tkance płuc (claudin-18A) i w tkance żołądka (claudin-18A2). Te warianty różnią się na N końcu (ryc. 22).
Zgodnie z wynalazkiem badano, do jakiego stopnia warianty składania claudin-18A2 (SEQ ID Nr: 7) i claudin-18A1 (SEQ ID Nr: 117) i odpowiednie produkty translacji (SEQ ID Nr: 16 i 118) mogą być użyte dla nowotworu jako wskaźniki lub docelowe struktury terapeutyczne. Zdolny do rozróżnienia między tymi dwoma wariantami ilościowy PCR został ustalony przez wybór par starterów specyficznych dla A1 (SEQ ID Nr: 109 & 110) i dla A2 (SEQ ID Nr: 107 & 108). Wariant składania A2 był dodatkowo testowany przy użyciu innej pary starterów w PCR konwencjonalnym (SEQ ID Nr: 39 & 40). Opisano, że wariant A1 jest aktywny tylko w prawidłowych płucach. Jednakże ku zaskoczeniu, zgodnie z wynalazkiem, stwierdzono, że wariant A1 jest aktywny także w śluzówce żołądka. Żołądek i płuca były jedynymi prawidłowymi tkankami wykazującymi znaczącą aktywację. We wszystkie pozostałych prawidłowych tkankach otrzymano dla claudin-A1 wynik negatywny. W badanych nowotworach z zaskoczeniem stwierdzono, że claudin-A1 jest aktywowana w ogromnej liczbie tkanek nowotworowych. Szczególnie silną ekspresję stwierdzono w nowotworach żołądka, nowotworach płuc, nowotworach trzustki, nowotworach przełyku (ryc. 23), nowotworach ENT i nowotworach prostaty. Poziomy ekspresji claudin-A1 w nowotworach ENT, prostaty, trzustki i przełyku są 100-10 000 wyższe niż w odpowiadających prawidłowych tkankach. Oligonukleotydy użyte do badania wariantu składania claudin-2A specyficznie znakują ten transkrypt, który ma być powielany (SEQ ID Nr: 39 & 40 i 107 & 108). Badania ujawniły, że wariant składania A2 nie ulega ekspresji w żadnej z badanych ponad 20 prawidłowych tkanek, za wyjątkiem śluzówki żołądka i w małym zakresie także tkanki jąder. Stwierdziliśmy także, że wariant A2, podobnie jak wariant A1 jest aktywowany w wielu nowotworach (wyliczone przy okazji przykładów na ryc. 24). Obejmują one nowotwory żołądka (8/10), nowotwory trzustki (6/6), nowotwory przełyku (5/10) i nowotwory wątroby.
PL 219 093 B1
Chociaż aktywacja claudin-18A2 nie jest wykrywalna w zdrowych płucach, z zaskoczeniem stwierdzono, że w pewnych nowotworach płuc zachodzi ekspresja wariantu składania A2.1.
T a b e l a 3A. Ekspresja claudin-18A2 w tkance prawidłowej i nowotworowej
Prawidłowa tkanka Ekspresja
Mózg -
Móżdżek -
Mięsień sercowy -
Mięsień szkieletowy -
Endometrium -
Żołądek +++
Okrężnica -
Trzustka -
Nerki -
Wątroba -
Jądra +
Grasica -
Gruczoł piersiowy -
Jajniki -
Macica -
Skóra -
Płuca -
Tarczyca -
Węzły chłonne -
Śledziona -
PBMC -
Przełyk -
Typ nowotworu Ekspresja
Rak okrężnicy -
Rak trzustki ++
Rak przełyku ++
Rak żołądka +++
Rak oskrzeli ++
Rak piersi -
Rak jajników -
Rak endometrium nie badano
Nowotwory ENT ++
Rak komórek nerek -
Rak prostaty -
PL 219 093 B1
T a b e l a 3B. Ekspresja claudin-18A1 w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka Ekspresja
Mózg -
Móżdżek -
Mięsień sercowy -
Mięsień szkieletowy -
Endometrium -
Żołądek +++
Okrężnica -
Trzustka -
Nerki -
Wątroba -
Jądra +
Grasica -
Gruczoł piersiowy -
Jajniki -
Macica -
Skóra -
Płuca +++
Tarczyca -
Węzły chłonne -
Śledziona -
PBMC -
Przełyk -
Typ nowotworu Ekspresja
Rak okrężnicy -
Rak trzustki ++
Rak przełyku ++
Rak żołądka +++
Rak oskrzeli ++
Rak piersi +
Rak jajników nie badano
Rak endometrium nie badano
Nowotwory ENT ++
Rak komórek nerek -
Rak prostaty ++
Konwencjonalny PCR, jako niezależne badanie kontrolne, także potwierdził wyniki otrzymane w ilościowym PCR. Użyte do tego oligonukleotydy (SEQ ID Nr: 39, 40) pozwalają na specyficzne powielanie wariantu składania A2. Zgodnie z wynalazkiem wykazano, że 8/10 nowotworów żołądka i połowa badanych nowotworów trzustki wykazuje silną ekspresję tego wariantu składania (ryc. 5). W przeciwieństwie do tego, w innych tkankach, ekspresja jest niewykrywalna przy użyciu konwencjonalnego PCR.
PL 219 093 B1
W szczególności nie stwierdzono ekspresji w płucach, wątrobie, krwi, węzłach chłonnych, tkance piersi i tkance nerek (tab. 3).
Tak więc, zgodnie z wynalazkiem, warianty składania reprezentują wysoce specyficzne molekularne wskaźniki nowotworów górnej części przewodu żołądkowo-jelitowego oraz nowotworów płuc, nowotworów ENT, nowotworów prostaty i ich przerzutów. Zgodnie z wynalazkiem, te molekularne wskaźniki mogą być użyte do wykrywania komórek nowotworowych. Zgodnie z wynalazkiem, wykrywanie nowotworów jest możliwe przy użyciu opisanych oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 39, 40, 107-110). Szczególnie odpowiednimi oligonukleotydami są pary starterów, z których przynajmniej jeden wiąże się w ściśle kontrolowanych warunkach do odcinka transkryptu, który ma długość 180 par zasad i jest specyficzny dla jednego (SEQ ID Nr: 8) lub drugiego (SEQ ID Nr: 119) wariantu składania.
Żeby potwierdzić te dane na poziomie białka, przeciwciała specyficzne w stosunku do claudin i surowicę odpornościową wytwarzano przez immunizację zwierząt. Lokalizację claudin-18 na błonie plazmowej i topologię białka potwierdzano przez analizę transbłonowych domen narzędziami bioinformatycznymi (TMHMM, TMPRED) i immunofluorescencyjnymi badaniami komórek, w których zachodzi ekspresja białek fuzyjnych claudin-18 znakowanych ulepszonym GFP. Claudin-18 ma dwie pozakomórkowe domeny. Pozakomórkowa domena N-końca różni się sekwencją w dwóch wariantach składania (SEQ ID Nr 11 dla A1 i SEQ ID Nr: 112 dla A2). Domena C końca jest identyczna dla obu wariantów (SEQ ID Nr: 137). Dotychczas nie opisano jeszcze przeciwciał, które wiążą się do pozakomórkowych domen claudin-18. Zgodnie z wynalazkiem, do immunizacji są wybrane epitopy peptydu, które są umiejscowione zewnątrzkomórkowo i są specyficzne dla wariantu A1 lub A2 lub pojawiają się w obu wariantach. Oba warianty claudin-18 nie mają konwencjonalnych motywów glikozylacji i dlatego glikozylacja białka nie jest oczekiwana. Niemniej jednak, przy wyborze epitopów, bierze się pod uwagę, że epitopy, które zawierają asparaginę, serynę, treoninę, są w rzadkich przypadkach potencjalnie glikozylowane, nawet bez konwencjonalnych miejsc glikozylacji. Glikozylacja epitopu może zapobiegać wiązaniu przeciwciała specyficznego dla tego epitopu. Między innymi, zgodnie z wynalazkiem, epitopy są wybierane tak, że przeciwciała wytwarzane w ten sposób dopuszczają stan glikozylacji antygenu, żeby był rozróżniany. Między innymi, do wytwarzania przeciwciał przez immunizację, wybrane były następujące peptydy:
SEQ ID Nr: 17: DQWSTQDLYN (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A2, wiążąca niezależnie od glikozylacji)
SEQ ID Nr: 18: NNPVTAVFNYQ (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A2, wiążąca głównie do nieglikozylowanej formy, N37)
SEQ ID Nr: 113: STQDLYNNPVTAVF (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A2, wiążąca tylko do nieglikozylowanej formy, N37)
SEQ ID Nr: 114: DMWSTQDLYDNP (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna do A1)
SEQ ID Nr: 115: CRPYFTILGLPA (pozakomórkowa domena N końca, specyficzna głównie do A1)
SEQ ID Nr: 116: TNFWMSTANMYTG (pozakomórkowa domena N końca, rozpoznaje A1 i A2).
Dane dla przeciwciała specyficznego dla A2, wytwarzanego przez immunizację SEQ ID Nr: 17 pokazane są przy okazji przykładu. Specyficzne przeciwciało, utrwalone różnymi sposobami, może być używane do badań immunofluorescencyjnych. Przy znakowaniach porównawczych linii komórkowych RT-PCR dodatnich i ujemnych, w ilości, która jest łatwo wykrywalna, odpowiadające białka mogą być specyficznie wykrywane w liniach komórkowych nowotworów żołądkowych określanych jako pozytywne (ryc. 25). Endogenne białko jest umiejscowione na błonie i tworzy na niej duże centralne skupiska. To przeciwciało było dodatkowo wykorzystane do wykrywania białka w Western Blottingu. Tak jak spodziewano się, białko jest wykrywalne tylko w żołądku i niewykrywalne w innych prawidłowych tkankach ani nawet w płucach (ryc. 29). Ku zaskoczeniu, porównawcze znakowanie nowotworów żołądka i sąsiadujących prawidłowych tkanek żołądka pacjenta ujawnia, że claudin-18 A2 ma mniejszą masę we wszystkich nowotworach żołądka, w których to białko jest wykrywane (ryc. 30, lewy). Zgodnie z wynalazkiem, w serii doświadczeń stwierdzono, że prążek także pojawia się na tym poziomie, kiedy lizat prawidłowej tkanki żołądka jest traktowany środkiem deglikozylującym, PNGaza F (ryc. 30, prawy). Podczas gdy we wszystkich prawidłowych tkankach żołądka wykrywalna jest wyłącznie glikozylowana forma wariantu A2. A2 jest wykrywane także w więcej niż 60% badanych żołądkowych nowotworów, w szczególności wyłącznie w deglikozylowanej formie. Chociaż wariant A2 nie jest wykrywany w prawidłowych płucach nawet na poziomie białka, został znaleziony w nowotworach oskrzeli, jak też poprzednio w ilościowym RT-PCR. Od nowa, tylko glikozylowany wariant jest obecny (ryc. 31) Przeciwciała, które rozpoznają pozakomórkową domenę wariantu składania claudin-18-A2 zostały wytworzone zgodnie z wynalazkiem. Poza tym, zostały wytworzone przeciwciała, które selektywnie rozpoznają domenę N-końca wariantu
PL 219 093 B1 składania claudin-18-A1 (ryc. 28) i przeciwciała, które wiążą się do obu wariantów w regionie C-końca pozakomórkowej domeny (ryc. 27). Zgodnie z wynalazkiem możliwe jest użycie tych przeciwciał do celów diagnostycznych, np. do immunohistologii (ryc. 32) ale także do celów terapeutycznych jak wyjaśniono powyżej. Dalsze ważne aspekty dotyczą różnicowania glikozylowanych domen claudin-18. Przeciwciała, które wiążą się wyłącznie do nieglikozylowanych epitopów zostały wytworzone zgodnie z wynalazkiem. Claudin-18 sama w sobie jest wysoce selektywnym różnicującym antygenem dla tkanki żołądka (A2) i dla płuc i żołądka (A1). Ponieważ jest ewidentnie zmieniana przez zmiany jakie zachodzą w mechanizmie glikozylacji w nowotworach, w szczególności w nowotworach jest wytwarzany deglikozylowany wariant A2. To może być użyteczne diagnostycznie i terapeutycznie. Surowica odpornościowa, taka jak ta opisana tutaj (przeciwko peptydowi SEQ ID Nr: 17) może być używana diagnostycznie na przykład w Western blotting. Przeciwciała, które wstępnie są niezdolne do wiązania do glikozylowanego epitopu, jak na przykład otrzymane przez immunizację peptydem SEQ ID Nr: 113 (ryc. 26), mogą rozróżniać tkankę nowotworową i tkankę prawidłową na podstawie wiązania. W szczególności możliwe jest wykorzystanie takich przeciwciał terapeutycznie, ponieważ są wysoce selektywne. Wytworzone przeciwciała mogą być także użyte bezpośrednio do wytwarzania zrekombinowanych chimerycznych lub humanizowanych przeciwciał. To także może mieć miejsce bezpośrednio z przeciwciałami otrzymanymi od królików (odnośnie tego, patrz J Biol Chem. 2000 May 5; 275 (18): 13668-76 Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3rd. ‘'The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies). W tym celu zachowano limfocyty od immunizowanych zwierząt. Aminokwasy 1-47 (SEQ ID Nr: 19 i 120) także reprezentują szczególnie dobre epitopy do immunoterapeutycznych sposobów takich jak szczepionki i adopcyjny transfer limfocytów T specyficznych w stosunku do antygenu.
P r z y k ł a d 5: Identyfikacja SLC13A1 jako celu diagnostyki i terapii nowotworu
SLC13A1 należy do rodziny kotransporterów siarczanu sodu. Ludzki gen, w przeciwieństwie do mysiego homologu tego genu, ulega selektywnej ekspresji w nerkach (Lee i wsp., Genomics 70:354-63). SLC13A1 koduje 595 aminokwasowe białko, które zawiera 13 domniemanych transmembranowych domen.
Alternatywne składanie daje w wyniku 4 różne transkrypty (SEQ ID Nr: 45-48). Badano, czy SLC13A1 może być użyteczne jako wskaźnik nowotworów nerek. Użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 49, 50), które są w zdolne specyficznie powielać SLC13A1.
T a b e l a 4. Ekspresja SLC13A1 w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka Ekspresja
Mózg -
Móżdżek nie oznaczono
Mięsień sercowy nie oznaczono
Mięsień szkieletowy nie oznaczono
Mięsień sercowy -
Żołądek -
Okrężnica -
Trzustka nie oznaczono
Nerki +++
Wątroba -
Jądra +
Grasica -
Gruczoł piersiowy -
Jajniki -
Macica nie oznaczono
PL 219 093 B1 cd. tabeli 4
Skóra nie oznaczono
Płuca -
Tarczyca -
Węzły chłonne -
Śledziona -
PBMC -
Esica -
Przełyk -
Typ nowotworu Ekspresja
Rak okrężnicy nie oznaczono
Rak trzustki nie oznaczono
Rak przełyku nie oznaczono
Rak żołądka nie oznaczono
Rak oskrzeli nie oznaczono
Rak piersi nie oznaczono
Rak jajników nie oznaczono
Rak endometrium nie oznaczono
Nowotwory ENT nie oznaczono
Rak komórek nerek +++
Rak prostaty nie oznaczono
Badania RT-PCR ze specyficzną dla SLC13A1 parą starterów (SEQ ID Nr: 49, 50) potwierdziły rzeczywiście selektywną ekspresję w nerkach i wykazały zgodną z wynalazkiem wysoką ekspresję w rzeczywiście wszystkich (7/8) badanych, otrzymanych drogą biopsji próbkach raka nerek (tab. 4, ryc. 6). Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 121, 122) także potwierdził te wyniki (ryc. 34). Słaby sygnał wykrywano w następujących prawidłowych tkankach: okrężnicy, żołądka, jąder, piersi, wątroby i mózgu. Jednakże ekspresja w nowotworach nerek była przynajmniej 100 razy wyższa niż we wszystkich innych prawidłowych tkankach.
W celu zanalizowania subkomórkowej lokalizacji SLC13A1 w komórce, białko przyłączano do eGFP jako cząsteczki reporterowej i po transfekcji odpowiedniego plazmidu heterogenna ekspresja zachodziła w komórkach 293. Lokalizację analizowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Nasze dane w imponujący sposób potwierdziły, że SLC13A1 jest integralną transbłonową cząsteczką (ryc. 35).
Przeciwciała do wykrywania SLC13A1 otrzymywano przez immunizowanie królików. Do namnażania tych przeciwciał używano peptydów SEQ ID Nr: 123 i 124. Takie przeciwciała w zasadzie mogą być używane w celach diagnostycznych i terapeutycznych.
Białko SLC13A1 ma 13 transbłonowych domen i 7 regionów pozakomórkowych. Zgodnie z wynalazkiem, w szczególności te pozakomórkowe domeny mogą być używane jako struktury docelowe dla przeciwciał monoklonalnych. SLC13A1 jako białko wchodzące w skład kanału, jest włączone w transport jonów. Pozakomórkowe domeny w zdrowych nerkach są skierowane polarnie w kierunku przewodu moczowego (do światła przewodu). Jednak stosowane terapeutycznie przeciwciała monoklonalne o dużym ciężarze cząsteczkowym, nie są wydalane do przewodu moczowego tak, że w zdrowych nerkach nie występuje wiązanie do SLC13A1. W przeciwieństwie do tego, w komórkach nowotworowych, polarność jest zniesiona i białko jest dostępne dla przeciwciała dostarczanego do celu bezpośrednio przez krwioobieg. Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres SLC13A1 w nowotworach nerek sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo interesującym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowoPL 219 093 B1 tworowych we krwi, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie, przy użyciu RT-PCR, przerzutów w innych narządach. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen SLC13A1 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, SLC13A1 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznych (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność SLC13A1 i mogą być stosowane do terapii nowotworów nerek.
P r z y k ł a d 6: Identyfikacja CLCA1 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
CLCA1 (SEQ ID Nr: 51; produkt translacji SEQ ID Nr: 60) należy do rodziny kanałów Cl- aktywowanych Ca2+. Sekwencja jest opublikowana w Genbank pod numerem akcesyjnym NM_001285. Ekspresja CLCA1 zachodzi wyłącznie w nabłonku zagłębienia jelit i w komórkach kubkowych (Gruber i wsp., Genomics 54: 200-14, 1998). Badano czy CLCA1 może być użyte jako wskaźnik dla nowotworów okrężnicy i żołądka. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 67, 68), które są zdolne do specyficznego powielania CLCA1. Badania RT-PCR z tym zestawem starterów potwierdziły selektywną ekspresję w okrężnicy i zgodnie z wynalazkiem wykazały wysoką ekspresję w badanych próbkach nowotworu okrężnicy (3/7), żołądka (1/3) (ryc. 7). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały, lub wykazywały tylko bardzo słabą ekspresję. Dodatkowo potwierdzono to specyficznym ilościowym RT-PCR (SEQ ID Nr: 125, 126), w którym to badaniu ekspresja nie była wykrywana w analizowanych prawidłowych tkankach (ryc. 36). W badanych w tym doświadczeniu próbkach nowotworów, 6/12 próbek nowotworu okrężnicy i 5/10 próbek nowotworu żołądka było CLCA1 pozytywnych. Ogólnie, w nowotworach pojawia się dysregulacja ekspresji genu. Oprócz próbek z bardzo silną ekspresja, w innych próbkach obserwuje się znaczną regulację w dół CLCA1.
Przewiduje się, że białko ma 4 transbłonowe domeny z ogólną liczbą 2 pozakomórkowych regionów. Zgodnie z wynalazkiem, te pozakomórkowe domeny CLCA1 mogą być użyte jako docelowe struktury dla przeciwciał monoklonalnych.
Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres CLCA1 w nowotworach żołądka i okrężnicy sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo interesującym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen CLCA1 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, CLCA1 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność jak transport białek CLCA1 i mogą być stosowane do terapii nowotworów żołądkowo-jelitowych.
P r z y k ł a d 7: Identyfikacja FLJ21477 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
FLJ21477 (SEQ ID Nr: 52) i jego przewidywany produkt translacji (SEQ ID Nr: 61) został opublikowany jako hipotetyczne białko w Genbank, pod numerem akcesyjnym NM_025153. Jest to integralne białko błonowe mające aktywność ATP-azy i 4 transbłonowe domeny, które jest stosownie odpowiednie do terapii przy użyciu specyficznych przeciwciał. Badania RT-PCR ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 69, 70) wykazały selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji (7/12) w badanych próbkach raka okrężnicy (ryc. 8). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji. Zostało to dodatkowo potwierdzone przy użyciu specyficznego ilościowego RT-PCR (SEQ ID Nr: 127, 128). Specyficzna dla FLJ21477 ekspresja była wykrywalna zarówno w okrężnicy (ryc. 37A) jak i 11/12 nowotworów okrężnicy. Dodatkowo, oprócz ekspresji w tkance okrężnicy, ekspresja była wykrywalna w tkance żołądka. Dodatkowo, w warunkach ilościowego RT-PCR wykrywalna w mózgu, grasicy i przełyku ekspresja była wyraźnie słabsza w porównaniu do okrężnicy i żołądka (ryc. 37A). Co więcej możliwe jest dodatkowo wykrycie ekspresji specyficznej dla FLJ21477 w następujących próbkach nowotworu: żołądka, trzustki, przełyku i wątroby. Przewiduje się, że białko ma 4 transbłonowe domeny z ogólną liczbą 2 pozakomórkowych regionów. Zgodnie z wynalazkiem, te pozakomórkowe domeny FLJ21477 mogą być użyte jako docelowe struktury dla przeciwciał monoklonalnych.
Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres FLJ21477 w nowotworach żołądka i okrężnicy sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo wartościowym diagnostycznym i terapeu50
PL 219 093 B1 tycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, pozakomórkowe domeny FLJ21477 mogą być użyte jako struktury docelowe do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, FLJ21477 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna).
P r z y k ł a d 8: Identyfikacja FLJ20694 jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
FLJ20694 (SEQ ID Nr: 53) i jego produkt translacji (SEQ ID Nr: 62) zostały opublikowane jako hipotetyczne białko w Genbank, pod numerem akcesyjnym NM_017928. To białko jest integralną transbłonową cząsteczką (transbłonowa domena AA 33-54), co bardzo prawdopodobne z funkcją tioredoksyny. Badania RT-PCR FLJ20694 ze specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 71, 72) wykazały selektywną ekspresję w okrężnicy i dodatkowo różne poziomy ekspresji (7/12) w badanych próbkach raka okrężnicy (ryc. 9). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji. Zostało to dodatkowo potwierdzone przy użyciu specyficznego ilościowego RT-PCR (SEQ ID Nr: 129, 130) (ryc. 38). Ekspresja FLJ20694 była niewykrywalna w jakichkolwiek innych prawidłowych tkankach oprócz okrężnicy i żołądka (nie analizowanych w pierwszym doświadczeniu).
Przewiduje się, że białko ma jedną transbłonową domenę z pozakomórkowym regionem. Zgodnie z wynalazkiem, te pozakomórkowe domeny FLJ20694 w szczególności mogą być użyte jako docelowe struktury dla przeciwciał monoklonalnych.
Dodatkowo, zgodnie z wynalazkiem, FLJ20694 może być stosowane jako szczepionka (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują aktywność biologiczną FLJ20694 i mogą być stosowane do terapii nowotworów żołądkowo-jelitowych.
P r z y k ł a d 9: Identyfikacja białka von Ebner'a (c20orf114) jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
Białko von Ebner'a (SEQ ID Nr: 54) i jego produkt translacji (SEQ ID Nr: 63) były opublikowane jako odpowiadające Plunc białko górnych dróg oddechowych i nabłonka noso-gardzieli w Genbank pod numerem akcesyjnym AF364078. Zgodnie z wynalazkiem badano, czy białko von Ebner'a może być użyte jako wskaźnik nowotworu płuc. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID NO: 73, 74), które są zdolne do specyficznego powielania białka von Ebner'a.
Badania RT-PCR z tym zestawem starterów wykazały selektywną ekspresję w płucach i w badanych próbkach (5/10) nowotworu płuc (ryc. 10). W grupie prawidłowych tkanek, ekspresję stwierdzono także w żołądku. Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji.
P r z y k ł a d 10: Identyfikacja Plunc jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
Plunc SEQ ID Nr: 55) i produkt jego translacji (SEQ ID 25 Nr: 64) były opublikowane w Genbank pod numerem akcesyjnym NM 016583. Ludzki Plunc koduje 256 aminokwasowe białko i wykazuje 72% homologii z mysim Plunc (Bingle i Bingle, Biochem, Biophys Acta 1493:363-7, 2000). Ekspresja Plunc jest ograniczona do tchawicy, górnych dróg oddechowych, nabłonka noso-gardzieli i gruczołu ślinowego.
Zgodnie z wynalazkiem badano, czy Plunc może być użyty jako wskaźnik raka płuc. W tym celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 75, 76), które są zdolne do specyficznego powielania Plunc.
Badania RT-PCR z tym zestawem starterów wykazały selektywną ekspresję w grasicy, w płucach i w (6/10) badanych próbek raka płuc (ryc. 11). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji.
P r z y k ł a d 11: Identyfikacja SLC26A9 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów SLC26A9 (SEQ ID Nr: 56) i jego produkt translacji (SEQ ID Nr: 65) zostały opublikowane w Genbank pod numerem akcesyjnym NM_134325. SLC26A9 należy do rodziny wymieniaczy anionowych. Ekspresja CLCA1 zachodzi wyłącznie w nabłonku oskrzelikowym i pęcherzykowym płuc (Lohi i wsp., J Bilo Chem 277:1424654, 2002).
Badano czy SLC26A9 może być użyte jako wskaźnik nowotworu płuc. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 77, 78), które są zdolne do specyficznego powielania SLC26A9. Badania RT-PCR z SLC26A9-specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 77, 78) wykazały selektywną ekspresję w płucach i we wszystkich (13/13) badanych próbkach nowotworu płuc (ryc. 12). Inne prawidłowe tkanki, z wyjątkiem tarczycy, nie wykazywały ekspresji. Możliwe jest najpierw w doświadczeniu w ilościowym RT-PCR ze starterami SEQ ID Nr: 131 i 132 potwierdzenie tych wyników i otrzymanie dodatPL 219 093 B1 kowych informacji. Możliwe jest w połączonych próbkach 4-5 nowotworowych tkanek wykrycie wysokiego poziomu ekspresji dla SLC26A9-specyficznego RNA w nowotworach płuc, okrężnicy i żołądka.
SLC26A9 jest członkiem rodziny transbłonowych transporterów anionowych. W zdrowych płucach białko jest skierowane względem światła przewodu w kierunku dróg oddechowych i dlatego nie jest bezpośrednio dostępne dla przeciwciał IgG z krwi. Zgodnie z wynalazkiem jest więc możliwe użycie SLC26A9 jako celu terapeutycznego przy użyciu przeciwciał monoklonalnych w określonych nowotworach, między innymi nowotworach płuc, nowotworach żołądka, nowotworach trzustki. Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres SLC26A9 w nowotworach płuc, żołądka i trzustki sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest znakomitym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen SLC26A9 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi. Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest zastosowanie SLC26A9 jako szczepionki (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznej dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność SLC26A9 i mogą być stosowane do terapii nowotworów płuc i nowotworów żołądkowo-jelitowych.
P r z y k ł a d 12: Identyfikacja THC1005163 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
THC1005163 (SEQ ID Nr: 57) jest fragmentem genu z indeksu genów TIGR. Gen jest zdefiniowany tylko w regionie 3' podczas gdy brakuje ORF. Badania RT-PCR przeprowadzano ze specyficznym dla THC1005163 starterem i starterem oligo dT18, który ma specyficzny tag 21 specyficznych zasad na końcu 5'. Ten tag był badany przy użyciu programów do przeszukiwania baz danych ze względu na homologię ze znaną sekwencją. Ten specyficzny starter początkowo był stosowany w syntezie cDNA w celu wykluczenia zanieczyszczeń genomowym DNA. Badania RT-PCR z tym zestawem starterów wykazały ekspresję w żołądku, jajnikach, płucach i (5/9) biopsjach nowotworu płuc (ryc. 13). Inne prawidłowe tkanki nie wykazywały ekspresji.
P r z y k ł a d 13: Identyfikacja LOC134288 jako celów diagnostyki i terapii nowotworów
LOC134288 (SEQ ID Nr: 58) i jego przewidywany produkt translacji (SEQ ID Nr: 66) został opublikowany w Genbank, pod numerem akcesyjnym XM_059703.
Badano zgodnie z wynalazkiem czy LOC134288 może być użyty jako wskaźnik nowotworu komórek nerek. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 80, 81), które są zdolne do specyficznego powielania LOC134288. Badania RT-PCR wykazały selektywną ekspresję w nerkach i w (5/8) badanych biopsji nowotworów komórek nerek (ryc. 14).
P r z y k ł a d 14: Identyfikacja THC943866 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
THC 943866 (SEQ ID Nr: 59) jest fragmentem genu z indeksu genów TIGR. Zgodnie z wynalazkiem badano, czy THC943866 może być użyty jako wskaźnik nowotworu komórek nerek. Do tego celu użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 82, 83), które są zdolne do specyficznego powielania THC943866.
Badania RT-PCR z THC943866-specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 82, 83) wykazały selektywną ekspresję w nerkach i w (4/8) badanych biopsji nowotworów komórek nerek (ryc. 15).
P r z y k ł a d 15: Identyfikacja FLJ21458 jako celu diagnostyki i terapii nowotworów
FLJ21458 (SEQ ID Nr: 84) i jego przewidywany produkt translacji (SEQ ID Nr: 85) został opublikowany w Genbank, pod numerem akcesyjnym NM_034850. Analiza sekwencji ujawniła, że białko reprezentuje nowego członka rodziny butyrofilin. Analiza strukturalna ujawniła, że reprezentuje typ 1 białka transbłonowego z pozakomórkowa domeną immunoglobulinową. Do badania ekspresji użyto oligonukleotydów (SEQ ID Nr: 86, 87), które są zdolne specyficznie powielać FLJ21458. Badania RT-PCR z FLJ21458-specyficznymi starterami (SEQ ID Nr: 86, 87) wykazały selektywną ekspresję w biopsjach nowotworu okrężnicy (ryc. 16, tab. 5). Ilościowy RT-PCR ze specyficznymi starterami SEQ ID Nr: 86, 87) potwierdził ten specyficzny profil (ryc. 39). W doświadczeniu dodatkowo było możliwe wykrycie specyficznie żołądkowo-jelitowego FLJ21458 w okrężnicy i w żołądku, odbytnicy, jelicie ślepym i w jądrach. 7/11 próbek przerzutów okrężnicy także było pozytywnych w ilościowym PCR. FLJ21458-specyficzna ekspresja rozciągała się na inne nowotwory i specyficzna dla białka ekspresja była wykrywalna w nowotworach żołądka, trzustki i wątroby (tab. 5).
Przeciwciała do wykrywania białka FLJ21458 były otrzymywane przez immunizację królików. Do namnażania przeciwciał używano następujących peptydów:
PL 219 093 B1
SEQ ID Nr: 135: QWQVFGPDKPVQAL
SEQ ID Nr: 136: AKWKGPQGQDLSTDS
FLJ21458-specyficzna reakcja była wykrywalna metodą immunofluorescencji (ryc. 40). Żeby sprawdzić specyficzność przeciwciał, komórki 293 transfekowano plazmidem, który koduje białko fuzyjne FLJ21458-GFP. Specyficzność wykazano na jednym prążku przez badanie kolokalizacji używając specyficznego dla FLJ21458 przeciwciała i z drugiej strony poprzez autofluorescencja GFP. Nałożenie dwóch fluorescencyjnych diagramów pokazuje jednoznacznie, że surowica odpornościowa rozpoznaje białko FLJ21458 (ryc. 40a). Z powodu nadekspresji białka, wynik znakowania komórek był rozmyty i nie pozwalał na jednoznaczną lokalizację białka. Z tego powodu przeprowadzono dalsze doświadczenie z zastosowaniem immunofluorescencji z linią komórkową Snu16 specyficzną dla nowotworu żołądka, w której ekspresja FLJ21458 zachodzi endogennie (ryc. 41B). Komórki znakowano surowicą odpornościową specyficzną dla FLJ21458 i innym przeciwciałem, które rozpoznaje białko błonowe E-kadherynę.
Przeciwciało specyficzne dla FLJ21458 znakuje przynajmniej słabo błonę komórkową i to jest dowodem, że FLJ21458 jest zlokalizowane w błonie komórkowej.
Badania bioinformatyczne wykazały, że białko kodowane przez FLJ21458 reprezentuje cząsteczkę powierzchniową komórki i ma domenę immunoglobulinowej supercząsteczki.
Selektywna ekspresja tej powierzchniowej cząsteczki sprawia, że jest ona dobrym celem do rozwoju diagnostycznych metod wykrywania komórek nowotworowych i do terapeutycznych sposobów eliminacji komórek nowotworowych. Wyraźnie zaznaczona ekspresja i duży zakres FLJ21458 w nowotworach żołądka i okrężnicy sprawiają, że zgodnie z wynalazkiem, białko to jest bardzo interesującym diagnostycznym i terapeutycznym wskaźnikiem. Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to wykrywanie rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych w surowicy, szpiku kostnym, moczu oraz wykrywanie przerzutów w innych narządach przy użyciu RT-PCR. Poza tym, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest użycie pozakomórkowych domen FLJ21458 jako struktur docelowych do immunodiagnostyki i terapii przeciwciałami monoklonalnymi.
Co więcej, zgodnie z wynalazkiem, możliwe jest zastosowanie FLJ21458 jako szczepionki (RNA, DNA, białko, peptydy) w celu indukcji specyficznych dla nowotworu odpowiedzi immunologicznej (przenoszona przez komórki T i B odpowiedź immunologiczna). Zgodnie z wynalazkiem, obejmuje to także rozwój tak zwanych małych związków, które modulują biologiczną aktywność FLJ21458 i mogą być stosowane do terapii nowotworów płuc i nowotworów żołąd kowo-jelitowych.
T a b e l a 5. Ekspresja FLJ21458 w tkankach prawidłowych i nowotworowych
Prawidłowa tkanka Ekspresja
Mózg -
Móżdżek -
Mięsień sercowy nie oznaczono
Mięsień szkieletowy
Mięsień sercowy -
Żołądek ++
Okrężnica +++
Trzustka -
Nerki -
Wątroba -
Jądra ++
Grasica nie oznaczono
Gruczoł piersiowy nie oznaczono
Jajniki -
Macica -
PL 219 093 B1 cd. tabeli 5
Skóra -
Płuca -
Tarczyca nie oznaczono
Węzły chłonne -
Śledziona -
PBMC -
Nadnercza nie oznaczono
Przełyk -
Jelito cienkie -
Prostata -
Typ nowotworu Ekspresja
Rak okrężnicy 7/10
Rak trzustki 5/6
Rak przełyku nie oznaczono
Rak żołądka 8/10
Rak oskrzeli nie oznaczono
Rak piersi nie oznaczono
Rak jajników nie oznaczono
Rak endometrium nie oznaczono
Nowotwory ENT nie oznaczono
Rak komórek nerek nie oznaczono
Rak prostaty nie oznaczono
Przerzuty okrężnicy 7/11
Rak wątroby 5/8
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1 LISTA SEKWENCJI <110> Ganymed Pharmaceuticals ag Sahin Dr., ugur Tureci Dr,, ózlem Koslowski Dr,, Michael <120> Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania v leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu iub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji <130> 342-4PCT <150> DE 102 54 601.0 <151> 2002-11-22 <160> 137 <170> Patentln wersja 3.1
<210> 1
<211> 1875
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
caggccagag tcccagctgt cctggactct gctgtgggga agggctgatg caggtgtgga 60
gtcaaatgtg ggtgcctcct gcagccgggt gccaggaggg gtggaggggc caccctgggc 120
rttgtccggg agcctggtct tcccgtcctt gggctgacag gtgctgctgc ctctgagccc 180
tccctgctaa gagctgtgtg ctgggtaagg ctggtggccc tttgggctcc ctgtccagga 240
tttgtgctct ggagggtagg gcttgctggg ctggggactg gaggggaacg tggagctcct 300
tctgcctcct ttcctgcccc atgacagcag gcagatccca ggagagaaga gctcaggaga 360
tgggaagagg atctgtccag gggttagacc tcaagggtga cttggagttc tttacggcac 420
ccatgctttc tttgaggagt tttgtgtttg tgggtgtggg gtcggggctc acctcctccc 480
acatccctgc ccagaggtgg gcagagtggg ggcagtgcct tgctccccct gctcgctctc 540
tgctgacctc cggctrcctg tgctgcccca ggaccatgaa tggcacctac aacacctgtg 600
PL 219 093 B1
gctccagcga cctcacctgg cccccagcga 342-4PCTeng1 tcaagctggg cttctacgcc tacttgggcg 660
tcctgctggt gctaggcctg ctgctcaaca gcctggcgct ctgggtgttc tgctgccgca 720
tgcagcagtg gacggagacc cgcatctaca tgaccaacct ggcggtggcc gacctctgcc 780
tgctgtgcac cttgcccttc gtgctgcact ccctgcgaga cacctcagac acgccgctgt 840
gccagctctc ccagggcatc tacctgacca acaggtacat gagcatcagc ctggtcacgg 900
ccatcgccgt ggaccgctat gtggccgtgc ggcacccgct gcgtgcccgc gggctgcggt 960
cccccaggca ggctgcggcc gtgtgcgcgg tcctctgggt gctggtcatc ggctccctgg 1020
tggctcgctg gctcctgggg attcaggagg gcggcttctg cttcaggagc acccggcaca 1080
atttcaactc catggcgttc ccgctgctgg gattctacct gcccctggcc gtggtggtct 1140
tctgctccct gaaggtggtg actgccctgg cccagaggcc acccaccgac gtggggcagg 1200
cagaggccac ccgcaaggct gcccgcatgg tctgggccaa cctcctggtg ttcgtggtct 1260
gcttcctgcc cctgcacgtg gggctgacag tgcgcctcgc agtgggctgg aacgcctgtg 1320
ccctcctgga gacgatccgt cgcgccctgt acataaccag caagctctca gatgccaact 1380
gctgcctgga cgccatctgc tactactaca tggccaagga gttccaggag gcgtctgcac 1440
tggccgtggc tcccagrgct aaggcccaca aaagccagga ctctctgtgc gtgaccctcg 1500
cctaagaggc gtgctgtggg cgctgtgggc caggtctcgg gggctccggg aggtgctgcc 1560
tgccagggga agctggaacc agtagcaagg agcccgggat cagccctgaa ctcactgtgt 1620
attctcttgg agccttgggt gggcagggac ggcccaggta cctgctctct tgggaagaga 1680
gagggacagg gacaagggca agaggactga ggccagagca aggccaatgt cagagacccc 1740
cgggatgggg cctcacactt gccaccccca gaaccagctc acctggccag agtgggttcc 1800
tgctggccag ggtgcagcct tgatgacacc tgccgctgcc cctcggggct ggaataaaac 1860
tccccaccca gagtc 1875
<210> 2 <211> 3222
<212> DNA 3 sapiens
<213> Home
<400> 2 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60
tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120
atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240
actttcatgt atteggatgg tetgatteat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300
gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360
gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420
atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480
atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540
cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600
gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660
ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720
aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt 780
gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac 840
ttggaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct 900
cetgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac 960
tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt 1020
gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt 1080
gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg 1140
cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac 1200
gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt 1260
cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact 1320
ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat 1380
tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag 1440
accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc 1500
cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac 1560
aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagttgct tcagattgac 1620
tattacaacc tgaccaagtt ctacggcaca gtgaaacttg ataccatgat cttcggggtg 1680
atagaatact gtgagagagg atccctccgg gaagttttaa atgacacaat ttcctaccct 1740
gatggcacat tcatggattg ggagtttaag atctctgtct tgtatgacat tgctaaggga 1800
atgtcatatc tgcactccag taagacagaa gtccatggtc gtctgaaatc taccaactgc 1860
gtagtggaca gtagaatggt ggtgaagatc actgattttg gctgcaattc cattttacct 1920
ccaaaaaagg acctgtggac agctccagag cacctccgcc aagccaacat ctctcagaaa 1980
ggagatgtgt acagctatgg gateategea caggagatca ttctgcggaa agaaaccttc 2040
tacactttga gctgtcggga ccggaatgag aagattttca gagtggaaaa ttccaatgga 2100
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
atgaaaccct tccgcccaga tttattcttg gaaacagcag aggaaaaaga gctagaagtg 2160
tacctacttg taaaaaactg ttgggaggaa gatccagaaa agagaccaga tttcaaaaaa 2220
attgagacta cacttgccaa gatatttgga ctttttcatg accaaaaaaa tgaaagctat 2280
atggatacct tgatccgacg tctacagcta tattetegaa acctggaaca tctggtagag 2340
gaaaggacac agctgtacaa ggcagagagg gacagggctg acagacttaa ctttatgttg 2400
cttccaaggc tagtggtaaa gtctctgaag gagaaaggct ttgtggagcc ggaactatat 2460
gaggaagtta caatctactt cagtgacatt gtaggtttca ctactatctg caaatacagc 2520
acccccatgg aagtggtgga catgcttaat gacatctata agagttttga ccacattgtt 2580
gatcatcatg atgtctacaa ggtggaaacc atcggtgatg cgtacatggt ggctagtggt 2640
ttgcctaaga gaaatggcaa teggeatgea atagacattg ccaagatggc cttggaaatc 2700
ctcagcttca tggggacctt tgagctggag catcttcctg gcctcccaat atggattcgc 2760
attggagttc actctggtcc ctgtgctgct ggagttgtgg gaatcaagat geetegttat 2820
tgtctatttg gagatacggt caacacagcc tctaggatgg aatccactgg cctccctttg 2880
agaattcacg tgagtggctc caccatagcc atcctgaaga gaactgagtg ccagttcctt 2940
tatgaagtga gaggagaaac atacttaaag ggaagaggaa atgagactac ctactggctg 3000
actgggatga aggaccagaa attcaacctg ccaacccctc ctactgtgga gaatcaacag 3060
cgtttgcaag cagaattttc agacatgatt gccaactctt tacagaaaag acaggcagca 3120
gggataagaa gccaaaaacc cagacgggta gccagctata aaaaaggcac tctggaatac 3180
ttgcagctga ataccacaga caaggagagc acctattttt aa 3222
<210> 3
<211> 336
<212> DNA
<213> Home i sapiens
<400> 3 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60
tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120
atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180
gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240
actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300
gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca ccttga 336
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
<210> 4
<211> 777
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60
tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120
atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180
gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240
actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300
gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360
gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420
atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480
atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540
cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600
gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660
ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720
aggaaaagca atgtgaccag tacttggagg acaatgtcac agcccctgac tatatga 777
<210> 5
<211> 3213
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60
tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120
atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180
gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240
actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300
gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360
gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480
atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540
cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600
gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660
ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720
aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt 780
gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac 840
ttggaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct 900
cctgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac 960
tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt 1020
gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt 1080
gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg 1140
cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac 1200
gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt 1260
cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact 1320
ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat 1380
tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag 1440
accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc 1500
cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac 1560
aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagattga ctattacaac 1620
ctgaccaagt tctacggcac agtgaaactt gataccatga tcttcggggt gatagaatac 1680
tgtgagagag gatccctccg ggaagtttta aatgacacaa tttcctaccc tgatggcaca 1740
ttcatggatt gggagtttaa gatctctgtc ttgtatgaca ttgctaaggg aatgtcatat 1800
ctgcactcca gtaagacaga agtccatggt cgtctgaaat ctaccaactg cgtagtggac 1860
agtagaatgg tggtgaagat cactgatttt ggctgcaatt ccattttacc tccaaaaaag 1920
gacctgtgga cagctccaga gcacctccgc caagccaaca tctctcagaa aggagatgtg 1980
tacagctatg ggatcatcgc acaggagatc attctgcgga aagaaacctt ctacactttg 2040
agctgtcggg accggaatga gaagattttc agagtggaaa attccaatgg aatgaaaccc 2100
ttccgcccag atttattctt ggaaacagca gaggaaaaag agctagaagt gtacctactt 2160
gtaaaaaact gttgggagga agatccagaa aagagaccag atttcaaaaa aattgagact 2220
acacttgcca agatatttgg actttttcat gaccaaaaaa atgaaagcta tatggatacc 2280
PL 219 093 B1
ttgatccgac gtctacagct 342-4PCTengl 2340
atattctcga aacctggaac atctggtaga ggaaaggaca
cagctgtaca aggcagagag ggacagggct gacagactta actttatgtt gcttccaagg 2400
ctagtggtaa agtctctgaa ggagaaaggc tttgtggagc cggaactata tgaggaagtt 2460
acaatctact tcagtgacat tgtaggttrc actactatcr gcaaatacag cacccccatg 2520
gaagtggtgg acatgcttaa tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2580
gatgtctaca aggtggaaac catcggtgat gcgtacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2640
agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2700
atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggagtt 2760
cactctggtc cctgtgctgc tggagttgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2820
ggagatacgg tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gagaattcac 2880
gtgagtggct ccaccatagc catcctgaag agaactgagt gccagttcct ttatgaagtg 2940
agaggagaaa catacttaaa gggaagagga aatgagacra cctactggct gactgggatg 3000
aaggaccaga aattcaacct gccaacccct cctactgtgg agaatcaaca gcgtttgcaa 3060
gcagaatttt cagacatgat tgccaactct ttacagaaaa gacaggcagc agggataaga 3120
agccaaaaac ccagacgggt agccagctat aaaaaaggca ctctggaata cttgcagctg 3180
aataccacag acaaggagag cacctatttt taa 3213
<210> 6 <211> 550 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 6 ggggacactt tgtatggcaa gtggaaccac tggcttggtg gattttgcta gatttttctg 60
atttttaaac tcctgaaaaa tatcccagat aactgtcatg aagctggtaa ctatcttcct 120
gctggtgacc atcagccttt gtagttactc tgctactgcc ttcctcatca acaaagtgcc 180
ccttcctgtt gacaagttgg cacctttacc tctggacaac attcttccct ttatggatcc 240
attaaagctt cttctgaaaa ctctgggcat ttctgrtgag caccttgrgg aggggctaag 300
gaagtgtgta aatgagctgg gaccagaggc ttctgaagct gtgaagaaac tgctggaggc 360
gctatcacac ttggtgtgac atcaagataa agagcggagg tggatgggga tggaagatga 420
tgctcctatc ctccctgcct gaaacctgtt ctaccaatra tagatcaaat gcccraaaat 480
gtagtgaccc gtgaaaagga caaataaagc aatgaatact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540
aaaaaaaaaa 550 <210> 7
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
<211> 786
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60
atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120
acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180
accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240
gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300
ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360
tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420
aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480
atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540
gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600
ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660
aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720
tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780
gtgtaa 786 <210> 8 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 8 tgcgccacca tggccgtgac tgcctgtcag ggcttggggt tcgtggtttc actgattggg 60
attgcgggca tcattgctgc cacctgcatg gaccagtgga gcacccaaga cttgtacaac 120
aaccccgtaa cagctgtttt caactaccag gggctgtggc gctcctgtgt ccgagagagc 180
<210> 9 <211> 309 <212> PRT
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <213> Homo sapiens <400> 9
Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr cys Gly Ser Ser ASp Leu Thr Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Ile Lys Leu Gly Phe Tyr Ala Tyr Leu Gly Val Leu Leu Val
20 25 30
Leu Gly Leu Leu Leu Asn Ser Leu Ala Leu Trp Val Phe Cys Cys Arg
35 40 45
Met Gin Gin Trp Thr Glu Thr Arg Ile Tyr Met Thr Asn Leu Ala Val
50 55 60
Ala Asp Leu Cys Leu Leu cys Thr Leu Pro Phe val Leu Hi s Ser Leu
65 70 75 80
Arg ASp Thr Ser ASp Thr Pro Leu cys Gin Leu Ser Gin Gly Ile Tyr
85 90 95
Leu Thr Asn Arg Tyr Met Ser Ile Ser Leu val Thr Ala Ile Ala val
100 105 110
Asp Arg Tyr 115 val Ala val Arg His 120 Pro Leu Arg Ala Arg 125 Gly Leu Arg
Ser Pro Arg Gin Ala Ala Ala val cys Ala Val Leu Trp val Leu val
130 135 140
Ile Gly Ser Leu val Ala Arg Trp Leu Leu Gly Ile Gin Glu Gly Gly
145 150 155 160
Phe Cys Phe Arg Ser Thr Arg His Asn Phe Asn Ser Met Arg Phe Pro
165 170 175
Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Pro Leu Ala val val val Phe cys Ser Leu
180 185 190
Lys Val val Thr Ala Leu Ala Gin Arg pro Pro Thr Asp val Gly Gin
195 200 205
Ala Glu Ala Thr Arg Lys Ala Ala Arg Met val Trp Ala Asn Leu Leu
210 215 220
Val Phe Val val Cys Phe Leu pro Leu His Val Gly Leu Thr val Arg
PL 219 093 B1
342-4RCTengl
225 230 235 240
Leu Ala val Gly Trp Asn Ala Cys Ala Leu Leu Glu Thr Ile Arg Arg 245 250 255
Ala Leu Tyr Ile Thr ser Lys Leu ser Asp Ala Asn cys cys Leu Asp 260 265 270
Al a Ile cys Tyr Tyr Tyr Met Ala Lys Glu Phe Gin Glu Ala Ser Ala
275 280 285
Leu Al a val Ala Pro Arg Ala Lys Al a Hi s Lys Ser Gin Asp Ser Leu
290 295 300
Cys Val 305 Thr Leu Ala
<210> 10
<211> 394
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Thr Ala Gly Arg Ser Gin Glu Arg Arg Ala Gin Glu Met Gly Arg 15 10 15
Gly Ser Val Gin Gly Leu Asp Leu Lys Gly Asp Leu Glu Phe Phe Thr 20 25 30
Al a Pro Met Leu Ser Leu Arg Ser Phe Val Phe va1 Gly val Gly Ser
35 40 45
Gly Leu Thr Ser Ser His Ile Pro Ala Gin Arg Trp Al a Glu Trp Gly
55 60
Gin Cys Leu Ala Pro Pro Ala Arg Ser Leu Leu Thr ser Gly ser Leu
65 70 75 80
cys cys Pro Arg Thr Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly ser Ser
85 90 95
Asp Leu Thr T rp Pro Pro Al a Ile Lys Leu Gly Phe Tyr Ala Tyr Leu
100 105 110
PL 219 093 B1
Gly val Leu 115 Leu val Leu Gly Leu 120 342-4PCTengl Ala Leu Trp
Leu Leu Asn ser Leu 12 5
val Phe Cys cys Arg Met Gin Gin Trp Thr Glu Thr Arg Ile Tyr Met
130 135 140
Thr Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu cys Leu Leu Cys Thr Leu Pro Phe
145 150 155 160
val Leu His ser Leu Arg Asp Thr ser Asp Thr Pro Leu Cys Gin Leu
165 170 175
ser Gin Gly U e 180 Tyr Leu Thr Asn Arg 185 Tyr Met Ser ile Ser 190 Leu val
Thr Ala Ile Al a Val Asp Arg Tyr val Ala val Arg Hi s Pro Leu Arg
195 200 205
Ala Arg Gly Leu Arg ser Pro Arg Gin Ala Ala Ala val Cys Ala val
210 215 220
Leu Trp Val Leu Val Ile Gly Ser Leu Va1 Ala Arg Trp Leu Leu Gly
225 230 235 240
Ile Gin Glu Gly Gly Phe cys Phe Arg Ser Thr Arg His Asn Phe Asn
245 250 255
Ser Met Ala Phe Pro Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Pro Leu Ala val val
260 265 270
Va1 Phe Cys ser Leu Lys val Val Thr Ala Leu Al a Gin Arg Pro Pro
275 280 285
Thr ASp val Gly Gin Al a Glu Ala Thr Arg Lys Ala Ala Arg Met Val
290 295 300
Trp Ala Asn Leu Leu val Phe val val Cys Phe Leu Pro Leu Hi s Val
305 310 315 320
Gly Leu Thr val Arg Leu Ala Val Gly Trp ASn Ala Cys Ala Leu Leu
325 330 335
Glu Thr ile Arg Arg Ala Leu Tyr Ile Thr Ser Lys Leu Ser Asp Ala
340 345 350
Asn Cys cys Leu Asp Ala ile Cys Tyr Tyr Tyr Met Ala Lys Glu Phe
355 360 365
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1
Glu Al a Ser Ala Leu Ala Val Ala Pro Ser Ala Lys Ala His Lys
370 375 380
Gin ASp Ser Leu Cys Val Thr Leu Ala
385 390 <210> 11 <211> 1073 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11
Met 1 Lys Thr Leu Leu Leu 5 Asp Leu Ala Leu Trp 10 Ser Leu Leu Phe 15 Gl π
Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gin Val Ser Gin Asn Cys Hi s Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu Ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu ASp Al a val Asn Glu Gly Leu Glu ile
50 55 60
val Arg Gly Arg Leu Gin Asn Ala Gly Leu Asn val Thr Va1 Asn Al a
65 70 75 80
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Asn Ser Gly Asp cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile ser Asn Al a
100 105 110
Gin Arg Met Gly Cys Val Leu Ile Gly Pro Ser Cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Phe Gl n Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile ser Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Gly Leu ser cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Al a Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu val Asn Phe Trp Lys
165 170 175
PL 219 093 B1
342- 4PCTengl
Thr Α5Π Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr val
180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu A5p Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Al a
195 200 205
Leu Glu Ala Ser Val Ser Tyr Phe Ser HI s Gl u Leu Gly Phe Lys val
210 215 220
val Leu Arg Gin Asp Lys Glu Phe Gin Asp Ile Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn val Ile ile Met Cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr
245 250 255
Lys Leu Lys Gly ASp Arg Al a val Ala Glu Asp Ile val Ile Ile Leu
260 265 270
val Asp Leu Phe Asn Asp Gin Tyr Leu Glu Asp Asn val Thr Ala Pro
275 280 285
ASp Tyr Met Lys Asn val Leu Val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser
290 295 300
Leu Leu Asn Ser Ser Phe Ser Arg Asn Leu Ser pro Thr Lys Arg Asp
305 310 315 320
phe Al a Leu Ala Tyr Leu Asn Gly Ile Leu Leu Phe Gly Hl s Met Leu
325 330 335
Lys Ile phe Leu Glu Asn Gly Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Al a
340 345 350
His Ala Phe Arg Α5Π Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly pro val Thr
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp val Asp Ser Thr Met Val Leu Leu Tyr Thr
370 375 380
Ser val ASP Thr Lys Lys Tyr Lys Val Leu Leu Thr Tyr ASp Thr His
385 390 395 400
Val Asn Lys Thr Tyr Pro val Asp Met ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys
405 410 415
Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp ile Thr Gly Arg Gly Pro Gin Ile Leu
PL 219 093 B1
420 425 342-4PCTengl 430
Met Ile Ala Val Phe Thr Leu Thr Gly Al a val val Leu Leu Leu Leu
435 440 445
val Ala Leu Leu Met Leu Arg Lys Tyr Arg Lys Asp Tyr Glu Leu Arg
450 455 460
Gin Lys Lys Trp ser His Ile Pro Pro Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu
465 470 475 480
Thr Asn Glu Thr Asn Hi s val Ser Leu Lys ile Asp Asp ASp Lys Arg
485 490 495
Arg ASp Thr Ile 500 Gin Arg Leu Arg Gin 505 cys Lys Tyr Asp Lys 510 Lys Arg
val ile Leu Lys ASp Leu Lys His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Gl u Lys
515 520 525
Gin Lys Ile Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gin Ile Asp Tyr Tyr Asn Leu
530 535 540
Thr tys Phe Tyr Gly Thr val Lys Leu ASp Thr Met Ile Phe Gly val
545 550 555 560
Ile Glu Tyr cys Glu Arg Gly ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr
565 570 575
Ile Ser Tyr Pro Asp Gly Thr Phe Met ASp Trp Glu Phe Lys Ile Ser
580 585 590
va1 Leu Tyr ASP Ile Al a Lys Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys
595 600 605
Thr Glu val His Gly Arg Leu Lys Ser Thr Asn Cys val val Asp Ser
610 615 620
Arg Met Val val Lys Ile Thr ASP Phe Gly Cys Asn Ser Ile Leu Pro
625 630 635 640
pro Lys Lys Asp Leu Trp Thr Al a Pro Glu Hi s Leu Arg Gin Ala Asn
645 650 655
Ile Ser Gin tys Gly Asp val Tyr ser Tyr Gly Ile Ile Ala Gin Glu
660 665 670
PL 219 093 B1
Ile ile Leu 675 Arg Lys Glu Thr Phe Tyr 680 342-4PCTengl
Thr Leu Ser Cys 685 Arg Asp Arg
Asn Glu Lys Ile Phe Arg val Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys ΡΓΟ Phe
690 695 700
Arg Pro ASP Leu Phe Leu Glu Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu val
705 710 715 720
Tyr Leu Leu val Lys Asn cys Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro
725 730 735
Asp Phe Lys Lys Ile Glu Thr Thr Leu Al a Lys ile Phe Gly Leu Phe
740 745 750
His ASp Gin Lys Asn Glu Ser Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu
755 760 765
Gin Leu Tyr Ser Arg Asn Leu Glu His Leu val Glu Glu Arg Thr Gin
770 775 780
Leu Tyr Lys Ala Glu Arg Asp Arg Al a Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu
785 790 795 800
Leu Pro Arg Leu val val Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe val Glu
805 810 815
Pro Glu Leu Tyr Glu Glu val Thr Ile Tyr Phe Ser Asp Ile val Gly
820 825 830
Phe Thr Thr Ile Cys Lys Tyr Ser Thr Pro Met Glu Val val Asp Met
835 840 845
Leu Asn Asp ile Tyr Lys Ser Phe Asp His Ile val ASP His His Asp
850 855 860
val Tyr Lys val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met val Ala Ser Gly
865 870 875 880
Leu Pro Lys Arg Asn Gly Asn Arg His Ala Ile Asp Ile Ala Lys Met
885 890 895
Ala Leu Glu Ile Leu Ser Phe Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu
900 905 910
Pro Gly Leu Pro Ile Trp Ile Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro cys
915 920 925
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Ala Ala Gly val val Gly ile Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly 930 935 940
Asp Thr Val Asn Thr Ala Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu
945 950 955 960
Arg Ile His val ser Gly Ser Thr Ile Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu
965 970 975 cys Gin Phe Leu Tyr Glu Val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arq 980 985 990
Gly Asn Glu Thr Thr Tyr Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gin Lys Phe 995 1000 1005 '
Asn Leu Pro Thr Pro Pro Thr Val Glu Asn Gin Gin
1010 1015 1020
Ala Gl U Phe Ser Asp Met Ile Al a Asn Ser Leu Gin
1025 1030 1035
Ala Ala Gly Ile Arg Ser Gin Lys Pro Arg Arg Val
1040 1045 1050
Lys Lys Gly Thr Leu Glu Tyr Leu Gin Leu Asn Thr
105 5 1060 1065
Glu Ser Thr Tyr Phe
1070
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo
<400> 12
Met 1 Lys Thr Leu Leu 5 Leu Asp Leu Al a Leu 10 Trp Ser Leu Leu Phe 15 Gin
Pro Gly T rp Leu Ser Phe Ser Ser Gin val Ser Gl n Asn Cys Hi s Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu Ile Ser val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Glu Pro Leu Lys ASO Leu Gl u Asp Al a Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile
50 55 60
val Arg Gly Arg Leu Gin Asn Ala Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala
65 70 75 80
Thr Phe Met Tyr Ser ASP Gly Leu Ile Hi s Asn Ser Gly Asp Cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Pro
100 105 110
<210> : 13
<2ii> ; 258
<212> 1 3RT
<213> Homo sapi ens
<400> : L3
Met Lys Thr Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu T rp Ser Leu Leu Phe Gin
1 5 10 15
pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gin Val Ser Gin Asn Cys Hi s Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Glu Pro Leu Lys Asn Leu Glu ASp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile
50 55 60
Val Arg Gly Arg Leu Gin Asn Al a Gly Leu Asn Val Thr Val Asn Ala
65 70 75 80
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu ile Hi s Asn Ser Gly Asp cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Al a
100 105 110
Gin Arg Met Gly Cys Val Leu Ile Gly Pro Ser cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 12 5
Phe Gin Met Tyr Leu Asp Thr Gl u Leu Ser Tyr pro Met Ile Ser Ala
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
140
130
135
Gly Ser Phe Gly Leu Ser cys ASp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu val Asn Phe Trp Lys
165
170
175
Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp ser Thr ser Tyr val 180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp Cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala 195 200 205
Leu Glu Ala Ser val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val 210 215 220 val Leu Arg Gin Asp Lys Glu Phe Gin Asp Ile Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn Val Thr Ser Thr Trp Arg Thr Met Ser Gin Pro Leu
245 250 255
Thr ile
<210> 14
<211> 1070
<212> PRT
<213> Homo
<400> 14
Met 1 Lys Thr Leu Leu 5 Leu Asp Leu Ala Leu 10 Trp Ser Leu Leu phe 15 Gin
Pro Gly Trp Leu Ser Phe Ser Ser Gin val Ser Gin Asn Cys Hi s Asn
20 25 30
Gly Ser Tyr Glu ile Ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser Ala Phe Ala
35 40 45
Gl u Pro Leu Lys Asn Leu Glu ASp Ala Val Asn Glu Gly Leu Glu Ile
PL 219 093 B1
val 65 Arg Gly Arg Leu Gl n 70 Asn Ala Gly 342-4PCTengl
Leu Asn 75 Vai Thr Val Asn a! a 80
Thr Phe Met Tyr Ser Asp Gly Leu Ile His Asn Ser Gly Asp Cys Arg
85 90 95
Ser Ser Thr Cys Glu Gly Leu Asp Leu Leu Arg Lys Ile Ser Asn Ala
100 105 110
Gin Arg Met Gly cys Val Leu Ile Gly Pro Ser cys Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Phe Gin Met Tyr Leu Asp Thr Glu Leu Ser Tyr Pro Met Ile Ser Ala
130 135 140
Gly Ser Phe Gly Leu ser cys Asp Tyr Lys Glu Thr Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Met Ser Pro Ala Arg Lys Leu Met Tyr Phe Leu val Asn Phe Trp Lys
165 170 175
Thr Asn Asp Leu Pro Phe Lys Thr Tyr Ser Trp Ser Thr Ser Tyr val
180 185 190
Tyr Lys Asn Gly Thr Glu Thr Glu Asp cys Phe Trp Tyr Leu Asn Ala
195 200 205
Leu g! u Ala ser val Ser Tyr Phe Ser His Glu Leu Gly Phe Lys Val
210 215 220
val Leu Arg Gin Asp Lys Glu Phe Gin Asp Ile Leu Met Asp His Asn
225 230 235 240
Arg Lys Ser Asn val ile Ile Met cys Gly Gly Pro Glu Phe Leu Tyr
245 2 50 255
Lys Leu Lys Gly ASP Arg Al a val Al a Glu Asp Ile val Ile Ile Leu
260 265 270
val Asp Leu Phe Asn Asp Gl n Tyr Leu Glu Asp Asn val Thr Ala Pro
275 280 285
Asp Tyr Met Lys Asn Val Leu val Leu Thr Leu Ser Pro Gly Asn Ser
290 295 300
Leu Leu Asn Ser Ser Phe ser Arg Asn Leu Ser Pro Thr Lys Arg ASp
305 310 315 320
PL 219 093 B1
Phe Ala Leu Ala 342-4PCTengl
Tyr 325 Leu Asn Gly Ile Leu 330 Leu Phe Gly HIS Met 335 Leu
Lys Ile Rhe Leu Glu Asn Gly Glu Asn Ile Thr Thr Pro Lys Phe Ala
340 345 350
His Ala Phe Arg Asn Leu Thr Phe Glu Gly Tyr Asp Gly Pro val Thr
355 360 365
Leu Asp Asp Trp Gly Asp Val Asp Ser Thr Met Va1 Leu Leu Tyr Thr
370 375 380
Ser Val ASp Thr Lys Lys Tyr Lys val Leu Leu Thr Tyr ASP Thr His
385 390 395 400
Val Asn Lys Thr Tyr pro val ASp Met Ser Pro Thr Phe Thr Trp Lys
405 410 415
Asn Ser Lys Leu Pro Asn Asp Ile Thr Gly Arg Gly pro Gin ile Leu
420 425 430
Met Ile Ala val Phe Thr Leu Thr Gly Ala val val Leu Leu Leu Leu
435 440 445
Val Al a Leu Leu Met Leu Arg Lys Tyr Arg Lys ASp Tyr Glu Leu Arg
450 455 460
Gin Lys Lys Trp ser Hi s ile Pro Pro Glu Asn Ile Phe Pro Leu Glu
465 470 475 480
Thr Asn Glu Thr Asn Hi 5 val Ser Leu Lys Ile Asp Asp Asp Lys Arg
485 490 495
Arg Asp Thr Ile Gin Arg Leu Arg Gin Cys Lys Tyr Asp Lys Lys Arg
500 505 510
Val ile Leu Lys ASP Leu Lys His Asn Asp Gly Asn Phe Thr Glu Lys
515 520 525
Gin Lys Ile Glu Leu Α5Π Lys ile ASp Tyr Tyr Asn Leu Thr Lys Phe
530 535 540
Tyr Gly Thr Val Lys Leu Asp Thr Met Ile Phe Gly val Ile Glu Tyr
545 550 555 560
cys Glu Arg Gly ser Leu Arg Glu val Leu Asn Asp Thr Ile Ser Tyr
565 570 575
PL 219 093 B1
342- -4PCTengl
ΡΓΟ ASP Gly Thr Phe Met ASp Trp Glu Phe Lys Ile Ser val Leu Tyr
580 585 590
ASp ile Al a Lys Gly Met Ser Tyr Leu His Ser Ser Lys Thr Glu Val
595 600 605
ni s Gly Arg Leu Lys ser Thr Asn Cys val val Asp Ser Arg Met Val
610 615 620
val Lys Ile Thr Asp Phe Gly cys Asn Ser Ile Leu Pro Pro Lys Lys
625 630 635 640
Asp Leu Trp Thr Ala Pro Glu His Leu Arg Gin Ala Asn Ile ser Gin
645 650 655
Lys Gly Asp val Tyr ser Tyr Gly Ile ile Ala Gin Glu Ile Ile Leu
660 665 670
Arg Lys Glu Thr Phe Tyr Thr Leu ser Cys Arg Asp Arg ASH Glu Lys
675 680 685
Ile Phe Arg val Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe Arg Pro Asp
690 695 700
Leu Phe Leu Glu Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu val Tyr Leu Leu
705 710 715 720
val Lys Asn cys Trp Glu Glu ASp Pro Glu Lys Arg Pro ASp Phe Lys
725 730 735
Lys Ile Glu Thr Thr Leu Ala Lys Ile Phe Gly Leu Phe Hi 5 Asp Gin
740 745 750
Lys Asn Glu Ser Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu Gin Leu Tyr
755 760 765
Ser Arg Asn Leu Glu His Leu Val Glu Gl u Arg Thr Gin Leu Tyr Lys
770 775 780
Ala Glu Arg Asp Arg Ala ASP Arg Leu Asn Phe Met Leu Leu Pro Arg
785 790 795 800
Leu val Val Lys ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe val Glu Pro Glu Leu
805 810 815
Tyr Glu Glu val Thr ile Tyr phe Ser ASp Ile Val Gly Phe Thr Thr
PL 219 093 B1
820 825 342-4PCTengl 830
Ile Cys Lys Tyr Ser Thr Pro Met Glu val val Asp Met Leu Asn Asp
835 840 845
Ile Tyr Lys Ser Phe Asp Hi s Ile val Asp His His Asp val Tyr Lys
850 855 860
val Glu Thr Ile Gly Asp Ala Tyr Met val Ala Ser Gly Leu Pro Lys
865 870 875 880
Arg Asn Gly Asn Arg His Al a Ile Asp Ile Ala Lys Met Ala Leu Glu
885 890 895
Ile Leu Ser Phe Met Gly Thr Phe Glu Leu Glu His Leu Pro Gly Leu
900 905 910
Pro Ile Trp Ile Arg Ile Gly val His Ser Gly Pro cys Ala Ala Gly
915 920 925
val val Gly Ile Lys Met Pro Arg Tyr cys Leu Phe Gly ASp Thr Va1
930 935 940
Asn Thr Al a Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu Pro Leu Arg Ile His
945 950 955 960
Val Ser Gly Ser Thr Ile Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu cys Gin Phe
965 970 975
Leu Tyr Glu val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg Gly Asn Glu
980 985 990
Thr Thr Tyr Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gin Lys Phe Asn Leu pro
995 1000 1005
Thr Pro Pro Thr val Glu Asn Gin Gin Arg Leu Gin Ala Glu phe 1010 1015 1020
Ser Asp Met Ile Ala Asn Ser Leu Gin Lys Arg Gin Ala Ala Gly 1025 1030 1035 ' ile Arg Ser Gin Lys Pro Arg Arg Val Ala Ser Tyr Lys Lys Gly 1040 1045 1050 '
Thr Leu Glu Tyr Leu Gin Leu Asn Thr Thr Asp Lys Glu ser Thr 1055 1060 1065
PL 219 093 B1
Tyr Phe 1070
342-4PCTengl
<210> 15
<211> 93
<212> PRT
<213> Homo
<400> 15
Met Lys Leu Val Thr Ile Phe Leu Leu va1 Thr ile ser Leu cys Ser 15 10 15
Tyr Ser Ala Thr 20 Ala Lys Leu ile Asn 25 Lys cys Pro Leu Pro 30 Val ASp
Lys Leu Ala Pro Leu Pro Leu Asp Asn Ile Leu pro phe Met Asp Pro
Leu Lys Leu Leu Leu Lys Thr Leu Gly ile Ser Val Glu His Leu val 50 55 60
Glu Gly Leu Arg Lys Cys val Asn Glu Leu Gly Pro Glu Ala Ser Glu
65 70 75 80
Al a val Lys Lys Leu Leu Glu Ala Leu ser His Leu val
<210> 16
<211> 261
<212> PRT
<213> Homo
<400> 16
Met Ala Val Thr Ala Cys Gin Gly Leu Gly Phe val val Ser Leu ile 15 10 15
Gly Ile Ala Gly Ile Ile Ala Ala Thr Cys Met Asp Gin Trp Ser Thr
20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gl rt Gly
35 40 45
PL 219 093 B1
Leu Trp Arg Ser 342-4PCTeng1
Cys val Arg Glu Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg
50 55 60
Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala Val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu ASP Ser
100 105 110
Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser
115 120 125
Gly Leu cys Al a Ile Ala Gly Val Ser val Phe Al a Asn Met Leu val
130 135 140
Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly
145 150 155 160
Met Val Gin Thr val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Al a Ala Leu Phe
165 170 175
val Gly Trp val Al a Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met
180 185 190
cys Ile Al a cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
val Ser Tyr His Ala Ser Gly His ser val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Α5Π Lys Lys Ile
225 230 235 240
Tyr ASP Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Gl u Val Gin Ser Tyr Pro ser
245 250 255
Lys His ASP Tyr val
260
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
PL 219 093 B1
<213> Homo sapiens 342-4PCTengl
<400> 17
Asp Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn
1 5 10
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Asn Asn i Pro val Thr Ala val Phe Asn Tyr Gin
1 5 10
<210> 19
<211> 47
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Met Ala val Thr Ala Cys Gin Gly Leu Gly Phe Val val Ser Leu Ile
1 5 10 15
Gly rle Ala Gly Ile Ile Al a Ala Thr Cys Met Asp Gl π Trp Ser Thr
20 25 30
Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro val Thr Ala Val Phe Asn Tyr Gin
40 45 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <400> 20 aggtacatga gcatcagcct g <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 21 gcagcagttg gcatctgaga g <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O> . . .
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 22 gcaatagaca ttgccaagat g <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 23 aacgctgttg attctccaca g <210> 24 <211> 33
PL 219 093 B1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja
342-4PCTengl <220> . , .
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 24 ggatcctcct ttagttccca ggtgagtcag aac <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 25 tgctctggag gctagcgttt c
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Opisanie sztucznej
<400> 25
accaatcatg ttagcctcaa g <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <400> 27 agctatggga tcatcgcaca g 21 <210> 28 <21ł> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 28 cctttgagct ggagcatctt c 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 29
ctttctagct ggagacatca g 21
<2l0> 30
<211> 21
<212> DNA
<2l'3> Sztuczna sekwencja
<220> <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 30
caccatggta ctgtcaacat c 21
<210> 31
<211> 21
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 31 atgtcataca agacagagat c
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<2T3> Sztuczna sekwenc j a
<220> <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 32 tctgccttgt acagctgtgt c <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 33 tctgtggtat tcagctgcaa g <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223 > Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1 <400> 34 tactcaggaa aatttcacct tg <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 35 gaccacaaca ggaaaagcaa tgtgacc <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O> . . , . , , , <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 36 gatagaattg aacaagattg ac
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<2 2 3 > Opisanie sztucznej
<400> 37
cagcctttgt agttactctg c <210> 38 <211> 21
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 38 tgtcacacca agtgtgatag c 21 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 39 ggttcgtggt ttcactgatt gggattgc 28 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 40 cggctttgta gttggtttct tctggtg 27
<210> 41
<211> 3814
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
ctattgaagc cacctgctca ggacaatgaa attcttcagt tacattctgg tttatcgccg
PL 219 093 B1
342-4pcTeng1
atttctcttc gtggttttca ctgtgttggt tttactacct ctgcccatcg tcctccacac 120
caaggaagca gaatgtgcct acacactctt tgtggtcgcc acattttggc tcacagaagc 180
attgcctctg tcggtaacag ctttgctacc tagtttaatg ttacccatgt ttgggatcat 240
gccttctaag aaggtggcat ctgcttattt caaggatttt cacttactgc taattggagt 300
tatctgttta gcaacatcca tagaaaaatg gaatttgcac aagagaattg ctctgaaaat 360
ggtgatgatg gttggtgtaa atcctgcatg gctgacgctg gggttcatga gcagcactgc 420
ctttttgtct atgtggctca gcaacacctc gacggctgcc atggtgatgc ccattgcgga 480
ggctgtagtg cagcagatca tcaatgcaga agcagaggtc gaggccactc agatgactta 540
cttcaacgga tcaaccaacc acggactaga aattgatgaa agtgttaatg gacatgaaat 600
aaatgagagg aaagagaaaa caaaaccagt tccaggatac aataatgata cagggaaaat 660
ttcaagcaag gtggagttgg aaaagaactc aggcatgaga accaaatatc gaacaaagaa 720
gggccacgtg acacgtaaac ttacgtgttt gtgcattgcc tactcttcta ccattggtgg 780
actgacaaca atcactggta cctccaccaa cttgatcttt gcagagtatt tcaatacacg 840
ctatcctgac tgtcgttgcc tcaactttgg atcatggttt acgttttcct tcccagctgc 900
ccttatcatt ctactcttat cctggatctg gcttcagtgg cttttcctag gattcaattt 960
taaggagatg ttcaaatgtg gcaaaaccaa aacagtccaa caaaaagctt gtgctgaggt 1020
gattaagcaa gaataccaaa agcttgggcc aataaggtat caagaaattg tgacctrggt 1080
cctcttcatt ataatggctc tgctatggtt tagtcgagac cccggatttg Ttcctggttg 1140
gtctgcactt ttttcagagt accctggttt tgctacagat tcaactgttg ctttacttat 1200
agggctgcta ttctttctta tCCCagctaa gacactgact aaaactacac ctacaggaga 1260
aattgttgct tttgattact ctccactgat tactrggaaa gaattccagt cattcatgcc 1320
ctgggatata gccattcttg ttggtggagg gtttgccctg gcagatggtt gtgaggagtc 1380
tggattatct aagtggatag gaaataaatt atctcctctg ggttcattac cagcatggct 1440
aataattctg atatcttctt tgatggtgac atctttaact gaggtagcca gcaatccagc 1500
taccattaca ctctttctcc caatattatc tccattggcc gaagccattc atgtgaaccc 1560
tctttatatt ctgatacctt ctactctgtg tacttcattt gcattcctcc taccagtagc 1620
aaatccaccc aatgctattg tcttttcata tggtcatctg aaagtcattg acatggttaa 1680
agctggactt ggtgtcaaca ttgttggtgt tgctgtggtt atgcttggca tatgtacttg 1740
gattgtaccc atgtttgacc tctacactta cccttcgtgg gctcctgcta tgagtaatga 1800
gaccatgcca taataagcac aaaatttctg actatcttgc ggtaatttct ggaagacatt 1860
aatgattgac tgtaaaatgt ggctctaaat aactaatgac acacatttaa atcagttatg 1920
gtgtagctgc tgcaattccc gtgaataccc gaaacctgct ggtataactc agagtccata 1980
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1
tttgttattg cagtgcaact aaagagcatc tatgtgcctt catcaagaag cccatgtttt 2040
gagattttgc tcatgaacca tctgcaactt gcttcatcat aagaataatt tataacttga 2100
ccttcaaaga gattagagca tttgtttcat cttacagttg gagttcaatg taacatttta 2160
aatgcaattt attatttcag aaatttccca tgaaactaaa aatagaaaat aagatataca 2220
agttaattcg gtacttggat aaatcatttc tgcattgttg ttccagagaa tttgctgaga 2280
aatcaaagcc atggtcatct ggtgatgaag agaaaaggtt aatctaaatg atatgtgcat 2340
ttcctcattt aaaaaatcca attggattat tcttaatata tacatgtaat atgaaaattg 2400
agattgaagc actaattcca aaattatggc tgaatatact aaataacaga aaagttacag 2460
ataagaattt atttctactg aactctatag ttagtgtaat ataattcata tttttatgat 2520
attggcacac tgagaaattc attttgtaga gctatggata aggcttgcta tgatttgcac 2580
tattagtaca gtatagttag aaaggaaagc tgaacactat aaaactatta acatattttc 2640
gtatatgagt aacaactttg cttaagtgtt tatcttagtt cagaaataca taatgtcata 2700
tgttaaaaat aaagagatgt agaaatctaa atgaattatc actgtgtata cagacagaaa 2760
aatcacataa ctctggtgtg ttaacattgc aatgaaaaaa tgaaaaaaag aaggaaaaaa 2820
gaataagaat gaaaactgct gacgtattac aaaacagaaa aataaatgat ttaaaatcaa 2880
atcaaaaaga aaaaaactaa acatttaaac aaaaatggga taagaatagt cttctagaag 2940
tgaggatgcg taaaagaatg agtttccaat taccctgatg tgacaattac acattgtaga 3000
caggtagcaa aatatcacat acacccccaa aatatgtaca aatattatat atcaataaat 3060
aaatttttaa agagtaagtg ctattggcat tccaaaattc agctaaagga aaaatgatca 3120
aaaacaaagt aaggtgcaca gttagcaaaa gatgcagatg ttatatcaca gcaattctca 3180
tgctaaaaat acaacaaaag acaaagcaaa aaataaacct ttgctttttt tttttttttt 3240
tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt cgcccaggct ggagtgcagt ggcgggatct 3300
cggctcactg caagctccgc ctcccaggtt cacgccattc tcctgcctca gccaaacctt 3360
tgctattttt aatcttcgtt ggcactttcc agctgttact gaccttgtca ttttttgttc 3420
aaataagatt atttacaaac ttattcttga aactaaatat agtaaagagg gtttttaaaa 3480
taatatttaa catacgaatt attaattggc catgttcatt atttatctat gtttattaat 3540
gggccaatgc aaaaaatcat tttttcaaag aaaaatttgt ccatgtaaag cttaaattat 3600
aatattgctg ctttgtataa ctcttctatg tttattctat tcatttgttc ctttccctac 3660
catattttac acatgtattt ataatctgta gtatttatta catttctgct tttttctagt 3720
cattcaattt atcactgctg aattgcatca gatcatggat gcatttttat tatgaaaaaa 3780
taaaatgact tttcaaatta aaaaaaaaaa aaaa 3814
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
<210> 42
<211> 734
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 42
caggacaatg aaattcttca gttacattct ggtttatcgc cgatttctct tcgtggtttt 60
cactgtgttg gttttactac ctctgcccat cgtcctccac accaaggaag cagaatgtgc 120
ctacacactc tttgtggtcg ccacattttg gctcacagaa gcattgcctc tgtcggtaac 180
agctttgcta cctagtttaa tgttacccat gtttgggatc atgccttcta agaaggtggc 240
atctgcttat ttcaaggatt ttcacttact gctaattgga gttatctgtt tagcaacatc 300
catagaaaaa tggaatttgc acaagagaat tgctctgaaa atggtgatga tggttggtgt 360
aaatcctgca tggctgacgc tggggttcat gagcagcact gcctttttgt ctatgtggct 420
cagcaacacc tcgacggctg ccatggtgat gcccattgcg gaggctgtag tgcagcagat 480
catcaatgca gaagcagagg tcgaggccac tcagatgact tacttcaacg gatcaaccaa 540
ccacggacta gaaattgatg aaagtgttaa tggacatgaa ataaatgaga ggaaagagaa 600
aacaaaacca gttccaggat acaataatga tacagggaaa atttcaagca aggtggagtt 660
ggaaaagact gtttaactac tgaaatgaag ctattctcct gactaaacat aactgaaaaa 720
ccattcatta aatg 734
<210> 43 <211> 539 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 43 gccactcaga tgacttactt caacggatca accaaccacg gactagaaat tgatgaaagt 60
gttaatggac atgaaataaa tgagaggaaa gagaaaacaa aaccagttcc aggatacaat 120
aatgatacag ggaaaatttc aagcaaggtg gagttggaaa agcactggaa acttgcagtt 180
caagatggct ccccatctcc ctctgtccat tctgtatcgc agctagctgc tcaaggaaag 240
gagaaagtgg aaggcatatg tacttagaaa ttattctatt actttcctgg atttaagagt 300
attcagattt tctatttcaa catcaaacaa ttgcattttt aaaaagaaat ttatgtgttc 360
catgtcaaat ttagtagtgt gtggttgttt ataatatttt cttatatcta cttaatttct 420
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1 atagtattta tagttatatg tctttatttc taacattttt cttgtgcttt taaagattat 480 ttaaagatta tttttaaata atctttattt catttaaata aaatatttta tttaagtct 539 <210> 44 <211> 556 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44
cacggactag aaattgatga aagtgttaat ggacatgaaa taaatgagag gaaagagaaa 60
acaaaaccag ttccaggata caataatgat acagggaaaa tttcaagcaa ggtggagttg 120
gaaaagaact caggcatgag aaccaaatat cgaacaaaga agggccacgt gacacgtaaa 180
cttacgtgtt tgtgcattgc ctactcttct accattggtg gactgacaac aatcactggt 240
acctccacca acttgatctt tgcagagtar ttcaatacat tccatccaca cagaagagga 300
gatcgtacaa ggcatgtaca ccaggaggca gaaattrgag gcatatcttg gaactctgtc 360
taccacatcc tgaacatcac acagtttcca ctcttgrtgc cttcaatcct gagaatgcat 420
ccaggagcca ttctgtttta tgtcaattac taattagarc atgtcacgtt actaacttac 480
tacgttccaa ttagtcctta ttgcatttgt aataaaatcc gcatactttc ggactggcta 540
caaggttata catgat 556
<210> 45
<211> 595
<212> PRT
<213> Homo sapi ens
<400> 45
Met Lys Phe Phe Ser 5 Tyr ile Leu val Tyr 10 Arg Arg Phe Leu Phe 15 val
Va1 Phe Thr val Leu 20 val Leu Leu pro 25 Leu Pro Ile val Leu 30 His Thr
Lys Glu Al a 35 Glu Cys Ala Tyr Thr 40 Leu Phe val val Ala 45 Thr Phe Trp
Leu Thr Glu Ala Leu Pro Leu Ser val Thr Ala Leu Leu Pro Ser Leu
PL 219 093 B1
50 55 342-4PCTengl 60
Met Leu Pro Met phe Gly ile Met Pro Ser Lys Lys Val Ala Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Phe Lys Asp Phe Hi s Leu Leu Leu Ile Gly val Ile Cys Leu Ala
85 90 95
Thr Ser ile Glu Lys Trp Asn Leu His Lys Arg Ile Al a Leu Lys Met
100 105 110
val Met Met val Gly Val Asn Pro Ala Trp Leu Thr Leu Gl y Phe Met
115 120 125
Ser Ser Thr Ala Phe Leu Ser Met Trp Leu ser Asn Thr Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Met Val Met Pro Ile Ala Glu Ala Val val Gin Gin Ile Ile Asn
145 150 155 160
Ala Glu Ala Glu Val Glu Ala Thr Gin Met Thr Tyr Phe ASH Gly ser
165 170 175
Thr Asn His Gly Leu Glu Ile Asp Glu Ser Va1 Asn Gly His Glu ile
180 185 190
Asn Glu Arg Lys Glu Lys Thr Lys pro val Pro Gly Tyr Asn Asn ASp
195 200 205
Thr Gly Lys Ile Ser Ser Lys val Glu Leu Glu Lys Asn Ser Gly Met
210 215 220
Arg Thr Lys Tyr Arg Thr Lys Lys Gly Hi s val Thr Arg Lys Leu Thr
225 230 235 240
Cys Leu cys Ile Ala Tyr Ser Ser Thr ile Gly Gly Leu Thr Thr Ile
245 250 255
Thr Gly Thr Ser Thr Asn Leu Ile Phe Ala Gl u Tyr Phe Asn Thr Arg
260 265 270
Tyr Pro Asp Cys Arg Cys Leu Asn Rhe Gly Ser Trp Phe Thr Phe Ser
275 280 285
Phe Pro Ala Ala Leu Ile Ile Leu Leu Leu ser Trp Ile Trp Leu Gin
290 295 300
PL 219 093 B1
Trp Leu Phe Leu Gly Phe Asn 342-4PCTengl Gly Lys 320
Phe Lys Glu Met 315 Phe Lys Cys
305 310
Thr Lys Thr val Gin Gin Lys Ala Cys Al a Glu val Ile Lys Gin Glu
325 330 335
Tyr Gin Lys Leu Gly Pro Ile Arg Tyr Gin Glu Ile val Thr Leu val
340 345 3 50
Leu Phe Ile 355 Ile Met Al a Leu Leu 360 Trp Phe Ser Arg Asp 365 Pro Gly Phe
val Pro Gly Trp Ser Ala Leu Phe Ser Glu Tyr pro Gly Phe Al a Thr
370 375 380
Asp Ser Thr val Ala Leu Leu Ile Gly Leu Leu Phe Phe Leu ile Pro
385 390 395 400
Ala Lys Thr Leu Thr Lys Thr Thr Pro Thr Gly Glu Ile Va1 Ala Phe
405 410 415
ASp Tyr Ser Pro Leu Ile Thr Trp Lys Glu Phe Gin Ser Phe Met Pro
420 425 430
Trp Asp Ile Ala Ile Leu val Gly Gly Gly Phe Ala Leu Ala ASp Gly
435 440 445
Cys Glu Glu Ser Gly Leu Ser Lys Trp ile Gly Asn Lys Leu Ser Pro
450 455 460
Leu Gly Ser Leu Pro Ala Trp Leu Ile Ile Leu Ile ser Ser Leu Met
465 470 475 480
Val Thr Ser Leu Thr Glu Val Ala Ser Asn Pro Ala Thr Ile Thr Leu
485 490 495
Phe Leu Pro Ile Leu Ser Pro Leu Ala Glu Ala Ile His val Asn Pro
500 SO5 510
Leu Tyr Ile Leu Ile pro Ser Thr Leu cys Thr Ser Phe Ala Phe Leu
515 520 525
Leu Pro Val Ala Asn Pro Pro Asn Ala Ile Val Phe Ser Tyr Gly His
530 535 540
Leu Lys val Ile ASp Met val Lys Ala Gly Leu Gly Val Asn ile Val
545 550 555 560
PL 219 093 B1
Gly val Ala val 342-4PCTengl
val 565 Met Leu Gly Ile Cys Thr 570 Trp Ile val Pro Met 575
Phe Asp Leu Tyr Thr Tyr Pro Ser Trp Ala Pro Ala Met Ser Asn Gl u
580 585 590
Thr Met ΡΓΟ
595
<210> 46
<211> 224
<212> PRT
<213> 1 Homo sapiens
<400> 46
Arg Thr Met Lys Phe Phe Ser Tyr Ile Leu val Tyr Arg Arg phe Leu
1 5 10 15
Phe Val val Phe Thr Val Leu Val Leu Leu Pro Leu Pro Ile val Leu
20 25 30
Hi s Thr Lys Glu Ala Glu cys Ala Tyr Thr Leu phe val val Ala Thr
35 40 45
Phe Trp Leu Thr Glu Al a Leu Pro Leu Ser Val Thr Ala Leu Leu Pro
50 55 60
Ser Leu Met Leu Pro Met phe Gly Ile Met Pro Ser Lys Lys Val Ala
65 70 75 80
Ser Ala Tyr Phe Lys Asp Phe Hi s Leu Leu Leu Ile Gly val Ile cys
85 90 95
Leu Ala Thr Ser ile Glu Lys Trp Asn Leu His Lys Arg Ile Ala Leu
100 105 110
Lys Met val Met Met val Gly val Asn pro Al a Trp Leu Thr Leu Gly
115 120 125
Phe Met Ser ser Thr Al a phe Leu ser Met Trp Leu Ser Asn Thr Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Met val Met Pro ile Ala Glu Ala Val Val Gin Gin Ile
145 150 155 160
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Ile Asn Ala Glu Ala Glu Val Glu Ala Thr Gin Met Thr Tyr Phe Asn
165 170 175
Gly Ser Thr Asn His Gly Leu Glu ile ASp Glu Ser Val Asn Gly His
180 185 190
Glu Ile Asn Glu Arg Lys Glu Lys Thr Lys Pro val Pro Gly Tyr Asn
195 200 205
Asn Asp Thr Gly Lys Ile Ser ser Lys val Glu Leu Glu Lys Thr val
210 215 220
<210> 47
<211> 88
<212> PRT
<213> 1 Homo sapiens
<400> 47
Ala Thr Gl n Met Thr Tyr Phe Asn Gly Ser Thr Asn His Gly Leu Glu
1 5 10 15
Ile Asp Glu Ser Val Asn Gly His Glu Ile Asn Glu Arg Lys Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Pro val Pro Gly Tyr Asn Asn Asp Thr Gly Lys Ile Ser ser
35 40 45
Lys val Glu Leu Glu Lys His Trp Lys Leu Ala Val Gin ASp Gly Ser
50 55 60
Pro Ser Pro Ser Val Hi 5 Ser val Ser Gin Leu Al a Ala Gin Gly Lys
65 70 75 80
Glu Lys val Glu Gly ile Cys Thr 85
<210> 48
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo
PL 219 093 B1
342-4pcrengl <400> 48
His 1 Gly Leu Glu Ile 5 Asp Glu Ser val Asn 10 Gly His Glu Ile Asn 15 Glu
Arg Lys Glu Lys Thr Lys Pro Val Pro Gly Tyr Asn Asn Asp Thr Gly
20 25 30
Lys ile Ser Ser Lys val Glu Leu Glu Lys ASn Ser Gly Met Arg Thr
35 40 45
Lys Tyr Arg Thr Lys Lys Gly His val Thr Arg Lys Leu Thr Cys Leu
50 55 60
cys Ile Ala Tyr Ser Ser Thr ile Gly Gly Leu Thr Thr Ile Thr Gly
65 70 75 80
Thr Ser Thr Asn Leu ile Phe Ala Glu Tyr Phe Asn Thr Phe His Pro
85 90 95
His Arg Arg Gly ASp Arg Thr Arg His val His Gin Glu Al a Glu ile
100 105 110 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 49 ccagctttaa ccatgtcaat g 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
PL 219 093 B1 <400> 50 cagatggttg tgaggagtct g <210> 51 <211> 3311 <212> DNA <213> Homo sapiens
342-4PCTengl
<400> 51 tgctaatgct tttggtacaa atggatgtgg aatataattg aatattttct tgtttaaggg 60
gagcatgaag aggtgttgag gttatgtcaa gcatctggca cagctgaagg cagatggaaa 120
tatttacaag tacgcaattt gagactaaga tattgttatc attctcctat tgaagacaag 180
agcaatagta aaacacatca ggtcaggggg ttaaagacct gtgataaacc acttccgata 240
agttggaaac gtgtgtctat attttcatat ctgtatatat ataatggtaa agaaagacac 300
cttcgtaacc cgcattttcc aaagagagga atcacaggga gatgtacagc aatggggcca 360
tttaagagtt ctgtgttcat cttgattctt caccttctag aaggggccct gagtaattca 420
ctcattcagc tgaacaacaa tggctatgaa ggcattgtcg ttgcaatcga ccccaatgtg 480
ccagaagatg aaacactcat tcaacaaata aaggacatgg tgacccaggc atctctgtat 540
ctgtttgaag ctacaggaaa gcgattttat ttcaaaaatg ttgccatttt gattcctgaa 600
acatggaaga caaaggctga ctatgtgaga ccaaaacttg agacctacaa aaatgctgat 660
gttctggttg ctgagtctac tcctccaggt aatgatgaac cctacactga gcagatgggc 720
aactgtggag agaagggtga aaggatccac ctcactcctg atttcattgc aggaaaaaag 780
ttagctgaat atggaccaca aggtaaggca tttgtccatg agtgggctca tctacgatgg 840
ggagtatttg acgagtacaa taatgatgag aaattctact tatccaatgg aagaatacaa 900
gcagtaagat gttcagcagg tattactggt acaaatgtag taaagaagtg tcagggaggc 960
agctgttaca ccaaaagatg cacattcaat aaagttacag gactctatga aaaaggatgt 1020
gagtttgttc tccaatcccg ccagacggag aaggcttcta taatgtttgc acaacatgtt 1080
gattctatag ttgaattctg tacagaacaa aaccacaaca aagaagctcc aaacaagcaa 1140
aatcaaaaat gcaatctccg aagcacatgg gaagtgatcc gtgattctga ggactttaag 1200
aaaaccactc ctatgacaac acagceacca aatcccacct tctcattgct gcagattgga 1260
caaagaattg tgtgtttagt ccttgacaaa tctggaagca tggcgactgg taaccgcctc 1320
aatcgactga atcaagcagg ccagcttttc ctgctgcaga cagttgagct ggggtcctgg 1380
gttgggatgg tgacatttga cagtgctgcc catgtacaaa gtgaactcat acagataaac 1440
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
agtggcagtg acagggacac actcgccaaa agattacctg cagcagcttc aggagggacg 1500
tccatctgca gcgggcttcg atcggcattt actgtgatta ggaagaaata tccaactgat 1560
ggatctgaaa ttgtgctgct gacggatggg gaagacaaca ctataagtgg gtgctttaac 1620
gaggtcaaac aaagtggtgc catcatccac acagtcgctt tggggccctc tgcagctcaa 1680
gaactagagg agctgtccaa aatgacagga ggtttacaga catatgcttc agatcaagtt 1740
cagaacaatg gcctcattga tgcttttggg gccctttcat caggaaatgg agctgtctct 1800
cagcgctcca tccagcttga gagtaaggga ttaaccctcc agaacagcca gtggatgaat 1860
ggcacagtga tcgtggacag caccgtggga aaggacactt tgtttcttat cacctggaca 1920
acgcagcctc cccaaatcct tctctgggat cccagtggac agaagcaagg tggctttgta 1980
gtggacaaaa acaccaaaat ggcctacctc caaatcccag gcattgctaa ggttggcact 2040
tggaaataca gtctgcaagc aagctcacaa accttgaccc tgactgtcac gtcccgtgcg 2100
tccaatgcta ccctgcctcc aattacagtg acttccaaaa cgaacaagga caccagcaaa 2160
ttccccagcc ctctggtagt ttatgcaaat attcgccaag gagcctcccc aattctcagg 2220
gccagtgtca cagccctgat tgaatcagtg aatggaaaaa cagttacctt ggaactactg 2280
gataatggag caggtgctga tgctactaag gatgacggtg tctactcaag gtatttcaca 2340
acttatgaca cgaatggtag atacagtgta aaagtgcggg ctctgggagg agttaacgca 2400
gccagacgga gagtgatacc ccagcagagt ggagcactgt acatacctgg ctggattgag 2460
aatgatgaaa tacaatggaa tccaccaaga cctgaaatta ataaggatga tgttcaacac 2520
aagcaagtgt gtttcagcag aacatcctcg ggaggctcat ttgtggcttc tgatgtccca 2580
aatgctccca tacctgatct cttcccacct ggccaaatca ccgacctgaa ggcggaaatt 2640
cacgggggca gtctcattaa tctgacttgg acagctcctg gggatgatta tgaccatgga 2700
acagctcaca agtatatcat tcgaataagt acaagtattc ttgatctcag agacaagttc 2760
aatgaatctc ttcaagtgaa tactactgct ctcatcccaa aggaagccaa ctctgaggaa 2820
gtctttttgt ttaaaccaga aaacattact tttgaaaatg gcacagatct tttcattgct 2880
attcaggctg ttgataaggt cgatctgaaa tcagaaatat ccaacattgc acgagtatct 2940
ttgtttattc ctccacagac tccgccagag acacctagtc ctgatgaaac gtctgctcct 3000
tgtcctaata tteatatcaa cagcaccatt cctggcattc acattttaaa aattatgtgg 3060
aagtggatag gagaactgca gctgtcaata gcctagggct gaatttttgt cagataaata 3120
aaataaatca ttcatccttt ttttgattat aaaattttct aaaatgtatt ttagacttcc 3180
tgtagggggc gatatactaa atgtatatag tacatttata ctaaatgtat tcctgtaggg 3240
ggcgatatac taaatgtatt ttagacttcc tgtagggggc gataaaataa aatgctaaac 3300
aactgggtaa a 3311
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
<210> 52
<211> 3057
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 52
aattaaatta tgagaattaa aaagacaaca ttgagcagag atgaaaaagg aagggaggaa 60 aaggtggaaa agaaaagaag acaagaagcg agtagtggtc tctaacttgc tctttgaagg 120 atggtctcac aaagagaacc ccaacagaca tcatcgtggg aatcaaatca agaccagcaa 180 gtacaccgtg ttgtccttcg tccccaaaaa catttttgag cagctacacc ggtrtgccaa 240 tctctatttt gtgggcattg cggttctgaa ttttatccct gtggtcaatg ctttccagcc 300 tgaggtgagc atgataccaa tctgtgttat cctggcagtc actgccatca aggacgcttg 360 ggaagacctc cggaggtaca aatcggataa agtcatcaat aaccgagagt gcctcatcta 420 cagcagaaaa gagcagacct atgtgcagaa gtgctggaag gatgtgcgtg tgggagactt 480 catccaaatg aaatgcaatg agattgtccc agcagacata ctcctccttt tttcctctga 540 ccccaatggg atatgccatc tggaaactgc cagcttggat ggagagacaa acctcaagca 600 aagacgtgtc gtgaagggct tctcacagca ggaggtacag ttcgaaccag agcttttcca 660 caataccatc gtgtgtgaga aacccaacaa ccacctcaac aaatttaagg gttatatgga 720 gcatcctgac cagaccagga ctggctttgg ctgtgagagt cttctgcttc gaggctgcac 780 catcagaaac accgagatgg ctgttggcat tgtcatctat gcaggccatg agacgaaagc 840 catgctgaac aacagtggcc cccggtacaa acgcagcaag attgagcggc gcatgaatat 900 agacatcttc ttctgcattg ggatcctcat cctcatgtgc cttattggag ctgtaggtca 960 cagcatctgg aatgggacct ttgaagaaca ccctcccttc gatgtgccag atgccaatgg 1020 cagcttcctt cccagtgccc ttgggggctt ctacatgttc ctcacaatga tcatcctgct 1080 ccaggtgctg atccccatct ctttgtatgt ctccattgag ctggtgaagc tcgggcaagt 1140 gttcttcttg agcaatgacc ttgacctgta tgatgaagag accgatttat ccattcaatg 1200 tcgagccctc aacatcgcag aggacttggg ccagatccag tacatcttct ccgataagac 1260 ggggaccctg acagagaaca agatggtgtt ccgacgttgc accatcatgg gcagcgagta 1320 ttctcaccaa gaaaatggta tagaagctcc caagggctcc atccctcttt ctaaaaggaa 1380 ataccctgct ctcctaagaa acgaggagat aaaagacatt ctcctggctc tcttagaggc 1440 tgtgtggcat ttccacaagt tgcttcctgt atccctgtgg tcttccttgt cacagatcag 1500
PL 219 093 B1
ggctgttcca 342-4PCTengl
attacttgta aactttcatt tgtttacaaa ggttagaagt tatcccatat 1560
gtggttcccc ttcagctgat ctttgtctgg tgccagacaa agcactttat gagacgagtt 1620
ttttatctgt cagcaatgga ttggagacat ttcccaattg tgtgccagtc acacaaccaa 1680
ggcttaggaa tttctcaggc caccttacct gacatgtcag ggcaggtctg tgtctaggtg 1740
catggtcaga tttaatacat ccagaagatg tcttctattc taacagatct cttagcttgt 1800
cactgaggca aagttttgat ttaggagata gggctataaa atgcctggac tgttaccttg 1860
catggactga atatgactca taaaactgat ctgattcctt cagccatcat ctgcccaact 1920
tggttcccct ccccaccccc ccacaacaca cacacacact ttctaagaaa agaaaagaaa 1980
ttcttttttt tcaatacttt aagttctggg atacatgtgc agaatgtgca ggtttgttac 2040
ataggtatac atgtgtcatg gtggtttgca gcacccacca acccatcatc taccttaggt 2100
atttctccta atgctatccc tcccctagcc cccaaccccc cgatgggctc cagtgtgtga 2160
tgttcccctc catgtccatg tgttctcatt gttcaattcc cacttatgag tgagaacatg 2220
cagtatttgg ttttctgttc ttgtgttagt ttgctgatgg tttcctgttc atccgtgtcc 2280
ctgcaaagga catgaactca tcctttttta tggctgcata atattccatg gtgtatatgt 2340
gccacatttt ctttatccag tctatcgctg atgggcactg gggttggttc caagtctttg 2400
ctattgtgaa cagtgctgca ataaacttac atgtgcatgt gtctttagta gaatgattta 2460
taatcctttg ggtatatacc cagtaatggg attgctggtc aaatggtatt tctggttcta 2520
gatccttgag gaatctttgt cttccacaat ggttgaacta atttgtactc ccaccaacag 2580
tgtaaaagta ttcctgtttc tctacatcct cttcagcatc tgttgtgtcc tgacatttta 2640
atgatcacta ttctcactgg cgtgagatgt tatctcattg tggttttgat ttgcatttct 2700
ctaatgacca gtaatgatga gctttttttc atatgtttgt tggctgcata aatgtcttct 2760
tttgagaagt gtctgttcat atccttcacc cattttttga agaaaacaaa ctcttaagag 2820
agcagtattc attcttttga gtgtgaggga tggagaaaga gaaagatgga gagagtatta 2880
taagcagctg tatccccttt gccatggtga tagcagacca ttcacatggg agcttctggt 2940
ctctttgtaa taataataag agccacatta ccagtactta gagtatgcta gttattttaa 3000
cacattgtat cattaaatct tcaaaacatc cctatgagtt agaaacctaa aaaaaaaaaa 3060
aaaaaaa 3067 <210> 53 <211> 2778 <212> DNA <213> Homo sapiens
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
<400> 53 ctcattttga tgtctagaat caggggatcc aggatcatca ccaaggtcat tttcccaggt 60
atggaggggt ctttctgctt ctttcttgtc atgcacagct gctgaggaag gggctgggag 120
taaagacagt gaaatgggga ggaggagtcc attcaaaccg agaaacaaag tgtttggttt 180
ttcttacccc tggtgtagaa gctaccaacc ttttccaaga aagagggcct ggcccccttc 240
tcgggtctgg ctgggtgcct gctgtgcctc tctggcctcc cctccgaagg gcaccattcc 300
ctcgggtgag tactaccggc ctgcaccgtc ttccagtggg gacagcctga gaagagagtc 360
tggggcctta cttcagtacc ttccttcact ggcctcaccc tgtgcaaatc atgccacacg 420
ctgcagcctc cttttcccta tctataaaat aaaaatgacc ctgctctatc tcactgggct 480
ggcaagaaca cactgttgtt gccttgcaga cagatgtgct gaggctgtag aaagtgcttt 540
ttatttggtt gggagcttgt gcataaatgc gagaggggct gcacatctga cggactagag 600
gtgactcatg gctgaaccgg aacaggacat cggggagaag ccagcagcca tgctgaactc 560
tccacagggc cctgtgaaaa gctcttcacc tcctctgccc tctggatcta gtgaagccta 720
ttcatccttc agatgtcagc tcaaataatc aaccttcatg gaggcctccc ttgaccccta 780
acatgctttc aaagtactgt gtatttcaca ttcatcatgc cccgacaact gtgatttccc 840
atttattaat atctgtctct tctgctggcc tgcaaactcc aggagcacag agacatcttt 900
gggatttttg aacatgattt ccccagggct tagcccagtg cctggtgcaa agcaggcttt 960
caacatgttc agtggatatt gtaagaaaga aagaaataca caaaaggcct ggcatatgca 1020
aagcactcta aatattcact cctttccctt ccctctgggt gagaaaattt ctccttataa 1080
agacaccctc ctaactgtat ctctgctaga gaactgaaga cataaagcac tctgtgccaa 1140
aaatatttaa gtaaaaactt gagctaagca cagagattat aaatatttct tccccagatt 1200
acgcaccatt taaaaatact gtctcagctc cttttcatga tttgggtggt gattaaagaa 1260
aattactctt caagactgaa agtcattact gcccttttcc tgacttgcct tttcccttga 1320
gaaggggagg ataagctgca gggcaggaag tggaagtggg gcatccttgt cctttgtctg 1380
gcagacagcc aactggtcag gtactgctcc ttctcaactc tttcctgatt cccaggtgaa 1440
tataaacaag aaggcacaaa tccacacttg ccaacaacgg acccaagtga taacaagaaa 1500
cccagtgaca cctgtctagg tgaagactca gcccctatgt gaccaggttg caaagccaaa 1560
ctgaccatct gctttccatt tggactttta gttcatactg tatcttctca ggacagttaa 1620
gttggaatac aatgccactg tcctgaaaga tggtagaatt atcctatttc tggaggagtg 1680
ggggtggtgg gtaggaatct caagagcgat ttgctcctct gcacaatagc ttctttaagg 1740
acaccagggc ccccagggct atacatttcc ctgaagcttt ccagataagc aacaaggtat 1800
PL 219 093 B1
gagcacctgc tatgtattgc 342-4PCTeng1 1860
ccaagggtga tgtgtttaaa tatccattgc atattttaaa
tccttggctg gcttaaagct gcaagctttc tgtcttcagt ggatataatg ggggcataca 1920
tcccagagct tgcccaacac tccaagaaaa gaaccctcag ctaatgcaaa gtgtgtatgt 1980
gcccatgaaa gctccatgtc tacttaacat tcagttttta ggattattta tgctgtaata 2040
atagatatga aaatctctga caggtatttt gtttccttta caaactgtat ttgaatttat 2100
gggtgattta gagcttgtgt ttaaagtcag aattcagaac cccaaagaaa atgacttcat 2160
tgaaattgaa ctgaagagac aagaactgag ttaccaaaac ctactaaacg tgagttgctg 2220
tgaactgggg attaaaccag aacgagtgga gaagatcaga aagctaccaa acacactgct 2280
cagaaaggac aaagacattc gaagactgcg ggactttcag gaagtggaac tcattttaat 2340
gaaaaatgga agctccagat tgacagaata tgtgccatct ctgacagaaa ggccctgcta 2400
tgatagcaaa gctgcaaaaa tgacttatta aatactccca ggaatggccg cgcatggtgg 2460
ctcaccccct gtaatcccag cactttggga agccaaggtg ggcggatcac ctgaggtcag 2520
gagttctaga ccagcctggc caacatatag tgaaacccag tctctactaa aaaaaataca 2580
aaaattagct aggtgtggtg gcgcacacct gtagtagtcc cagctacatg ggaagctgag 2640
gcaggagaat cacctgaacc caggaggcag aggttgcagt gagctgagat tgcgccactg 2700
cactccagcc tggcgacaga gcaagactct gtctctcaaa ataaataaat aaataaataa 2760
ataaataaat aaataatc 2778
<210> 54 <211> 1646
<212> DNA <213> Home > sapiens
<400> 54 gcccgggaga ggagaggagc gggccgagga ctccagcgtg cccaggtctg gcatcctgca 60
cttgctgccc tctgacacct gggaagatgg ccggcccgtg gaccttcacc cttctctgtg 120
gtttgctggc agccaccttg atccaagcca ccctcagtcc cactgcagtt ctcatcctcg 180
gcccaaaagt catcaaagaa aagctgacac aggagctgaa ggaccacaac gccaccagca 240
tcctgcagca gctgccgctg ctcagtgcca tgcgggaaaa gccagccgga ggcatccctg 300
tgctgggcag cctggtgaac accgtcctga agcacatcat ctggctgaag gtcatcacag 360
ctaacatcct ccagctgcag gtgaagccct cggccaatga ccaggagctg ctagtcaaga 420
tccccctgga catggtggct ggattcaaca cgcccctggt caagaccatc gtggagttcc 480
acatgacgac tgaggcccaa gccaccatcc gcatggacac cagtgcaagt ggccccaccc 540
100
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
gcctggtcct cagtgactgt gccaccagcc atgggagcct gcgcatccaa ctgctgcata 600
agctctcctt cctggtgaac gccttagcta agcaggtcat gaacctccta gtgccatccc 660
tgcccaatct agtgaaaaac cagctgtgtc ccgtgatcga ggcttccttc aatggcatgt 720
atgcagacct cctgcagctg gtgaaggtgc ccatttccct cagcattgac cgtctggagt 780
ttgaccttct gtatcctgcc atcaagggtg acaccattca gctctacctg ggggccaagt 840
tgttggactc acagggaaag gtgaccaagt ggttcaataa ctctgcagct tccctgacaa 900
tgcccaccct ggacaacatc ccgttcagcc tcatcgtgag tcaggacgtg gtgaaagctg 960
cagtggctgc tgtgctctct ccagaagaat tcatggtcct gttggactct gtgcttcctg 1020
agagtgccca tcggctgaag tcaagcatcg ggctgatcaa tgaaaaggct gcagataagc 1080
tgggatctac ccagatcgtg aagatcctaa ctcaggacac tcccgagttt tttatagacc 1140
aaggccatgc caaggtggcc caactgatcg tgctggaagt gtttccctcc agtgaagccc 1200
tccgcccttt gttcaccctg ggcatcgaag ccagctcgga agctcagttt tacaccaaag 1260
gtgaccaact tatactcaac ttgaataaca tcagctctga tcggatccag ctgatgaact 1320
ctgggattgg ctggttccaa cctgatgttc tgaaaaacat catcactgag atcatccact 1380
ccatcctgct gccgaaccag aatggcaaat taagatctgg ggtcccagtg tcattggtga 1440
aggccttggg attcgaggca gctgagtcct cactgaccaa ggatgccctt gtgcttactc 1500
cagcctcctt gtggaaaccc agctctcctg tctcccagtg aagacttgga tggcagccat 1560
cagggaaggc tgggtcccag ctgggagtat gggtgtgagc tctatagacc atccctctct 1620
gcaatcaata aacacttgcc tgtgat 1646
<210* 55
<211* 1049
<212* DNA
<213* Homo sapiens
<400* 55
ggagtggggg agagagagga gaccaggaca gctgctgaga cctctaagaa gtccagatac 60 taagagcaaa gatgtttcaa actgggggcc tcattgtctt ctacgggctg ttagcccaga 120 ccatggccca gtttggaggc ctgcccgtgc ccctggacca gaccctgccc ttgaatgtga 180 atccagccct gcccttgagt cccacaggtc ttgcaggaag cttgacaaat gccctcagca 240 atggcctgct gtctgggggc ctgttgggca ttctggaaaa ccttccgctc ctggacatcc 300 tgaagcctgg aggaggtact tctggtggcc tccttggggg actgcttgga aaagtgacgt 360
PL 219 093 B1
101
342-4PCTeng1 cagtgattcc tggcctgaac aacatcattg acataaaggt cactgacccc cagctgctgg 420 aacttggcct tgtgcagagc cctgatggcc accgtctcta tgtcaccatc cctctcggca 480 taaagctcca agtgaatacg cccctggtcg gtgcaagtct gttgaggctg gctgtgaagc 540 tggacatcac tgcagaaatc ttagctgtga gagataagca ggagaggatc cacctggtcc 600 ttggtgactg cacccattcc cctggaagcc tgcaaatttc tctgcttgat ggacttggcc 660 ccctccccat tcaaggtctt ctggacagcc tcacagggat cttgaataaa gtcctgcctg 720 agttggttca gggcaacgtg tgccctctgg tcaatgaggt tctcagaggc Ttggacatca 780 ccctggtgca tgacattgtt aacatgctga tccacggact acagtttgtc atcaaggtct 840 aagccttcca ggaaggggct ggcctctgct gagctgcttc ccagtgctca cagatggctg 900 gcccatgtgc tggaagatga cacagttgcc ttctctccga ggaacctgcc ccctctcctt 960 tcccaccagg cgtgtgtaac atcccatgtg cctcacctaa taaaatggct cttcttctgc 1020 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1049
<210> 56
<211> 4815
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 56
gagcagagcc ctttcacaca cctcaggaac acctttcggc tgcccgctcc ccagacacac 60
ctgcagccct gcccagccgg ctttgctcac ccactgcttg taaatgcccc agatatgagc 120
cagcccaggc cccgctacgt ggtagacaga gccgcatact cccttaccct cttcgacgat 180
gagtttgaga agaaggaccg gacataccca gtgggagaga aacttcgcaa tgccttcaga 240
tgttcetcag ccaagatcaa agctgtggtg tttgggctgc tgcctgtgct ctcctggctc 300
cccaagtaca agattaaaga ctacatcatt cctgacctgc tcggtggact cagcggggga 360
tccatccagg tcccacaagg catggcattt gctctgctgg ccaaccttcc tgcagtcaat 420
ggcctctact cctccttctt ccccctcctg acctacttct tcctgggggg tgttcaccag 480
atggtgccag gtacctttgc cgttatcagc atcctggtgg gtaacatctg tctgcagctg 540
gccccagagt cgaaattcca ggtcttcaac aatgccacca atgagagcta tgtggacaca 600
gcagccatgg aggctgagag gctgcacgtg tcagctacgc tagcctgcct caccgccatc 660
atccagatgg gtctgggctt catgcagttt ggctttgtgg ccatctacct ctccgagtcc 720
ttcatccggg gcttcatgac ggccgccggc ctgcagatcc tgatttcggt gctcaagtac 780
atcttcggac tgaccatccc ctcctacaca ggcccagggt ccatcgtctt taccttcatt 840
strona 48
102
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
gacatttgca aaaacctccc ccacaccaac atcgcctcgc tcatcttcgc tctcatcagc 900
ggtgccttcc tggtgctggt gaaggagctc aatgctcgct acatgcacaa gattcgcttc 960
cccatcccta cagagatgat tgtggtggtg grggcaacag ctatctccgg gggctgtaag 1020
atgcccaaaa agtatcacat gcagatcgtg ggagaaatcc aacgcgggtt ccccaccccg 1080
gtgtcgcctg tggtctcaca gtggaaggac atgataggca cagccttctc cctagccatc 1140
gtgagctacg tcatcaacct ggctatgggc cggaccctgg ccaacaagca cggctacgac 1200
gtggattcga accaggagat gatcgctctc ggctgcagca acttctttgg ctccttcttt 1260
aaaattcatg tcatttgctg tgcgctttct gtcactctgg ctgtggatgg agctggagga 1320
aaatcccagg tggccagcct gtgtgtgtct ctggtggtga tgatcaccat gctggtcctg 1380
gggatctatc tgtatcctct ccctaagtct gtgctaggag ccctgatcgc tgtcaatctc 1440
aagaactccc tcaagcaact caccgacccc tactacctgt ggaggaagag caagctggac 1500
tgttgcatct gggtagtgag cttcctctcc tccttcttcc tcagcctgcc ctatggtgtg 1560
gcagtgggtg tcgccttctc cgtcctggtc gtggtcttcc agactcagtt tcgaaatggc 1620
tatgcactgg cccaggtcat ggacactgac atttatgtga atcccaagac ctataatagg 1680
gcccaggata tccaggggat taaaatcatc acgtactgct cccctctcta ctttgccaac 1740
tcagagatct tcaggcaaaa ggtcatcgcc aagacaggca tggaccccca gaaagtatta 1800
ctagccaagc aaaaatacct caagaagcag gagaagcgga gaatgaggcc cacacaacag 1860
aggaggtctc tattcatgaa aaccaagact gtctccctgc aggagctgca gcaggacttt 1920
gagaatgcgc cccccaccga ccccaacaac aaccagaccc cggctaacgg caccagcgtg 1980
tcctatatca ccttcagccc tgacagctcc tcacctgccc agagtgagcc accagcctcc 2040
gctgaggccc ccggcgagcc cagtgacatg ctggccagcg tcccaccctt cgtcaccttc 2100
cacaccctca tcctggacat gagtggagtc agcttcgtgg acttgatggg catcaaggcc 2160
ctggccaagc tgagctccac ctatgggaag atcggcgtga aggtcttctt ggtgaacatc 2220
catgcccagg tgtacaatga cattagccat ggaggcgtct ttgaggatgg gagtctagaa 2280
tgcaagcacg tctttcccag catacatgac gcagtcctct ttgcccaggc aaatgctaga 2340
gacgtgaccc caggacacaa cttccaaggg gctccagggg atgctgagct ctccttgtac 2400
gactcagagg aggacattcg cagctactgg gacttagagc aggagatgtt cgggagcatg 2460
tttcacgcag agaccctgac cgccctgtga gggctcagcc agtcctcatg ctgcctacag 2520
agtgcctggc acttgggact tccataaagg atgagcctgg ggtcacaggg ggtgtcgggc 2580
ggaggaaagt gcatccccca gagcttgggt tcctctctcc tctccccctc tctcctccct 2640
tccttccctc cccgcatctc cagagagagc ctctcagcag caggggggtg ctacccttac 2700
PL 219 093 B1
103
gggagtgaga gtctggtgag 342-4PCTeng1 2760
cccactcttc acccgtcagg ccctggccgc aatggacaag
cctcctgctc actccacccc acccacatct gccctgtcct tggcagctga aggacacctt 2820
gacttccagc ttttacgagt gagccaaaaa cagaaggaca agtacaactg tgctggcctg 2880
ctgtacaagc ttcaaaaagt gtcccagagc ccgcacggct cggtgtcaga tggtgtcagg 2940
ctgtcacgga catagggata aacttggtta ggactctggc ttgccttccc cagctgcctc 3000
aactctgtct ctggcagctc tgcacccagg gaccatgtgc tctccacacc caggagtcta 3060
ggccttggta actatgcgcc ccccctccat catccccaag gctgcccaaa ccaccactgc 3120
tgtcagcaag cacatcagac tctagcctgg acagtggcca ggaccgtcga gaccaccaga 3180
gctacctccc cggggacagc ccactaaggt tctgcctcag cctcctgaaa catcactgcc 3240
ctcagaggct gctcccttcc cctggaggct ggctagaaac cccaaagagg gggatgggta 3300
gctggcagaa tcatctggca tcctagtaat agataccagt tattctgcac aaaacttttg 3360
ggaattcctc tttgcaccca gagactcaga ggggaagagg gtgctagtac caacacaggg 3420
aaaacggatg ggacctgggc ccagacagtc ccccttgacc ccagggccca tcagggaaat 3480
gcctcccttt ggtaaatctg ccttatcctt ctttacctgg caaagagcca atcatgttaa 3540
ctcttcctta tcagcctgtg gcccagagac acaatggggt ccttctgtag gcaaaggtgg 3600
aagtcctcca gggatccgct acatccccta actgcatgca gatgtggaaa ggggctgatc 3660
cagattgggt cttcctgcac aggaagactc tttaacaccc ttaggacctc aggccatctt 3720
ctcctatgaa gatgaaaata ggggttaagt tttccatatg tacaaggagg tattgagagg 3780
aaccctactg ttgacttgaa aataaatagg ttccatgtgt aagtgttttg taaaatttca 3840
gtggaaatgc acagaaaatc ttctggcctc tcatcactgc ttttctcaag cttcttcagc 3900
ttaacaaccc cttccctaac aggttgggct ggcccagcct aggaaaacat ccccatttct 3960
aacttcagcc agacctgcgt tgtgtgtctg tgtgttgagt gagctggtca gctaacaagt 4020
cttcttagag ttaaaggagg gggtgctggc caagagccaa cacattcttg gcccaggagc 4080
attgcttttc tgtgaattca ttatgccatc tggctgccaa tggaactcaa aacttggaag 4140
gcgaaggaca atgttatctg ggattcaccg tgcccagcac ccgaagtgcc aaattccagg 4200
aggacaagag ccttagccaa tgacaactca ctctccccta ctccacctcc ttccaagtcc 4260
agctcaggcc caggaggtgg gagaaggtca cagagcctca ggaatttcca agtcagagtc 4320
ccctttgaac caagtatcta gatcccctga ggacttgatg aagtgatcct taacccccaa 4380
gtaatcatta acccccagac cagcctcaga actgaaggag attgttgacc cagtgacctg 4440
gagttgaggc tcagggagag atctgccaca tgtctgaggg ttgcagagcc cgctgtggag 4500
gtaagattgg aaacacatga ggcagaggga agacattgaa gaaaacatct ctgctggaat 4560
atttggaaaa gaacactctt ctggacctgg ttgaagcagg aaagatggag gcaaagtagt 4620
104
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
gaaataatcc agaatttcaa tgcttttgaa tgttcttagt gatactgacc tgtgataata 4680
taattcccag ggaggactgg gaaccttatc tcttgagata tttgcataat ttatttaatt 4740
taagcctcat tctccttttg ttcattttgg taataaactg gatttgaatt gtgaacaaaa 4800
aaaaaaaaaa aaaaa 4815
<210> 57 <211> 2572
<212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 57 aatgctctaa gacctctcag cacgggcgga agaaactccc ggagagctca cccaaaaaac 60
aaggagatcc catctagatt tcttcttgct tttgactcac agctggaagt tagaaaagcc 120
tcgatttcat ctttggagag gccaaatggt cttagcctca gtctctgtct ctaaatattc 180
caccataaaa cagctgagtt atttatgaat tagaggctat agctcacatt ttcaatcctc 240
tatttctttt tttaaatata actttctact ctgatgagag aatgtggttt taatctctct 300
ctcacatttt gatgatttag acagactccc cctcttcctc ctagtcaata aacccattga 360
tgatctattt cccagcttat ccccaagaaa acttttgaaa ggaaagagta gacccaaaga 420
tgttattttc tgctgtttga attttgtctc cccaccccca acttggctag taataaacac 480
ttactgaaga agaagcaata agagaaagat atttgtaatc tctccagccc atgatctcgg 540
ttttcttaca ctgtgatctt aaaagttacc aaaccaaagt cattttcagt ttgaggcaac 600
caaacctttc tactgctgtt gacatcttct tattacagca acaccattct aggagtttcc 660
tgagctctcc actggagtcc tctttctgtc gcgggtcaga aattgtccct agatgaatga 720
gaaaattatt ttttttaatt taagtcctaa atatagttaa aataaataat gttttagtaa 780
aatgatacac tatctctgtg aaatagcctc acccctacat gtggatagaa ggaaatgaaa 840
aaataattgc tttgacattg tctatatggt actttgtaaa gtcatgctta agtacaaatt 900
ccatgaaaag ctcactgatc ctaattcttt ccctttgagg tctctatggc tctgattgta 960
catgatagta agtgtaagcc atgtaaaaag taaataatgt ctgggcacag tggctcacgc 1020
ctgtaatcct agcactttgg gaggctgagg aggaaggatc acttgagccc agaagttcga 1080
gactagcctg ggcaacatgg agaagccctg tctctacaaa atacagagag aaaaaatcag 1140
ccagtcatgg tggcatacac ctgtagtccc agcattccgg gaggctgagg tgggaggatc 1200
acttgagccc agggaggttg gggctgcagt gagccatgat cacaccactg cactccagcc 1260
PL 219 093 B1
105
aggtgacata gcgagatcct gtctaaaaaa 342-4PCTengl cacagcaagt 1320
ataaaaaata aataatggaa
cctaggaagt aggttaaaac taattcttta aaaaaaaaaa aaagttgagc ctgaattaaa 1380
tgtaatgttt ccaagtgaca ggtatccaca tttgcatggt tacaagccac tgccagttgg 1440
cagtagcact ttcctggcac tgtggtcggt tttgttttgt tttgctttgt ttagagacgg 1500
ggtctcactt tccaggctgg cctcaaactc ctgcactcaa gcaattcttc taccctggcc 1560
tcccaagtag ctggaattac aggtgtgcge catcacaact agctggtggt cagttttgtt 1620
actctgagag ctgttcactt ctctgaattc acctagagtg gttggaccat cagatgtttg 1680
ggcaaaactg aaagctcttt gcaaccacac accttccctg agcttacatc actgcccttt 1740
tgagcagaaa gtctaaattc cttccaagac agtagaattc catcccagta ccaaagccag 1800
ataggccccc taggaaactg aggtaagagc agtctctaaa aactacccac agcagcattg 1860
gtgcagggga acttggccat taggttatta tttgagagga aagtcctcac atcaatagta 1920
catatgaaag tgacctccaa ggggattggt gaatactcat aaggatcttc aggctgaaca 1980
gactatgtct ggggaaagaa cggattatgc cccattaaat aacaagttgt gttcaagagt 2040
cagagcagtg agctcagagg cccttctcac tgagacagca acatttaaac caaaccagag 2100
gaagtatttg tggaactcac tgcctcagtt tgggtaaagg atgagcagac aagtcaacta 2160
aagaaaaaag aaaagcaagg aggagggttg ageaatetag agcatggagt ttgttaagtg 2220
ctctctggat ttgagttgaa gagcatccat ttgagttgaa ggccacaggg cacaatgagc 2280
tctcccttct accaccagaa agtccctggt caggtctcag gtagtgcggt gtggctcagc 2340
tgggttttta attagcgcat tctctatcca acatttaatt gtttgaaagc ctccatatag 2400
ttagattgtg ctttgtaatt ttgttgttgt tgctctatct tattgtatat gcattgagta 2460
ttaacctgaa tgttttgtta cttaaatatt aaaaacactg ttatcctaca aaaaaaccct 2520
caaaggctga aaataaagaa ggaagatgga gacaccctct gggggtcctc tc 2572
<210> 58 <211> 1324
<212> DNA 3 sapiens
<213> Home
<400> 58 ctttgcagtg gatgeccttg gcagggtgag cccacaagga gcaatggagc agggcagcgg 60
ccgcttggag gacttccctg tcaatgtgtt ctccgtcact ccttacacac ccagcaccgc 120
tgacatccag gtgtccgatg atgacaaggc gggggccacc ttgctcttct caggcatctt 180
tctgggactg gtggggatca cattcactgt catgggctgg atcaaatacc aaggtgtctc 240
106
PL 219 093 B1
ccactttgaa tggacccagc tccttgggcc 342-4PCTeng1 cgtcctgctg tcagttgggg tgacattcat 300
cctgattgct gtgtgcaagt tcaaaatgct ctęctgccag ttgtgcaaag aaagtgagga 360
aagggtcccg gactcggaac agacaccagg aggaccatca tttgttttca ctggcatcaa 420
ccaacccatc accttccatg gggccactgt ggtgcagtac atccctcctc cttatggttc 480
tccagagcct atggggataa ataccagcta cctgcagtct gtggtgagcc cctgcggcct 540
cataacctct ggaggggcag cagccgccat gtcaagtcct cctcaatact acaccatcta 600
ccctcaagat aactctgcat ttgtggttga tgagggctgc ctttctttca cggacggtgg 660
aaatcacagg cccaatcctg atgttgacca gctagaagag acacagctgg aagaggaggc 720
ctgtgcctgc ttctctcctc ccccttatga agaaatatac tctctccctc gctagaggct 780
attctgatat aataacacaa tgctcagctc agggagcaag tgtttccgtc attgttacct 840
gacaaccgtg gtgttctatg ttgtaacctt cagaagttac agcagcgccc aggcagcctg 900
acagagatca ttcaaggggg gaaaggggaa gtgggaggtg caatttctca gattggtaaa 960
aattaggctg ggctggggaa attctcctcc ggaacagttt caaattccct cgggtaagaa 1020
atctcctgta taaggttcag gagcaggaat ttcacttttt catccaccac cctccccctt 1080
ctctgtagga aggcattggt ggctcaattt taaccccagc agccaatgga aaaatcacga 1140
cttctgagac tttgggagtt tccacagagg tgagagtcgg gtgggaagga agcagggaag 1200
agaaagcagg cccagctgga gatttcctgg tggctgtcct tggccccaaa gcagactcac 1260
taatcccaaa caactcagct gccatctggc ctctctgagg actctgggta ccttaaagac 1320
tata 1324 <210> 59 <211* 683 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 59 caggaaagtt cgtgctgcta ggcagaggaa ctgcagcttg ttggcaggtg aagggagcct 60
gtttagctgt gtccagcaac aacttacgtg gtcctgcttg tgttccaggt gaagcgtctg 120
gccgccgagc agaggaatca agacctgctc attctttcct cgggggatcc atccagcaat 180
gacatcatct catgctgcca caaggacccc aagtctgggc tgctggggac cagccacgct 240
ccccactgct cattccttca tcctagagac attctgactc tcctccgact gcgctgtgca 300
caggcgtgac aagctctttt acatctcagt ctgcacaact tcaggcactt agcagattga 360
PL 219 093 B1
107
342-4PCTengl tatgcatcca acaaatattg attgaaratc tgctaaatac ccagtaatgt ttcatgagtg 420 attgggtgaa taaaggaatg ctggttcctt ctggccatat taactcctgc acaatactaa 480 gaaaaataaa ttgcactagc tgtggaataa tgtgaatccc aatgtcatct attgaaatat 540 tacctgacta ttaagaggta tttatttttg tatcttttct agcaaagtaa ataaaattct 600 taatacagca tatcccctta ttcacggggg gtargttcca agacccccgg tggatgcctg 660 aaactatgga taataccaga tcc 683 <210> 60 <211> 914 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 60
Met 1 Gly Pro Phe Lys Ser Ser val 5 Phe Ile Leu Ile Leu His Leu teu
10 15
Glu Gly Ala Leu ser ASh Ser Leu Ile Gin teu Asn Asn Asn Gly Tyr
20 25 30
Glu Gly Ile val val Ala ile Asp Pro Asn val Pro Glu ASp Glu Thr
35 40 45
Leu Ile Gin Gin ile Lys ASp Met Va1 Thr Gin Ala Ser teu Tyr Leu
50 55 60
phe Glu Ala Thr Gly Lys Arg Phe Tyr Phe Lys Asn Val Al a Ile Leu
65 70 75 80
Ile ΡΓΟ Glu Thr Trp Lys Thr Lys Ala Asp Tyr val Arg Pro Lys Leu
85 90 95
Glu Thr Tyr Lys ASM Al a Asp val Leu val Ala Glu Ser Thr Pro Pro
100 105 110
Gly Asn Asp Glu Pro Tyr Thr Glu Gin Met Gly Asn Cys Gly Gl u Lys
115 120 125
Gly Gl u 130 Arg Ile His Leu Thr 135 Pro Asp Phe Ile Al a 140 Gly Lys Lys Leu
Ala Gl u Tyr Gly Pro Gin Gly Lys Ala Phe Val His Glu Trp Ala Hi s
145 150 155 160
108
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Leu Arg Trp Gly val Phe Asp Glu Tyr Asn Asn Asp Glu Lys Phe Tyr 165 170 175
Leu Ser Asn Gly Arg ile Gin Ala val Arg cys Ser Ala Gly ile Thr 180 185 190
Gly Thr Asn Val val Lys Lys Cys Gin Gly Gly ser cys Tyr Thr Lys
Arg cys Thr phe Asn Lys val Thr Gly Leu Tyr Glu Lys Gly Cys Glu 210 215 220
Phe val Leu Gin Ser Arg Gin Thr Glu Lys Ala Ser Ile Met Phe a! a
225 230 235 240
Gin His val ASp ser Ile val Gl u Phe cys Thr Glu Gin Asn His Asn
245 250 255
Lys Glu Ala Pro Asn Lys Gin Asn Gin Lys cys Asn Leu Arg Ser Thr
260 265 270
Trp Glu val Ile Arg Asp Ser Glu ASP Phe Lys Lys Thr Thr Pro Met
275 280 285
Thr Thr Gin Pro Pro Asn Pro Thr Phe Ser Leu Leu Gin Ile Gly Gl n
290 295 300
Arg Ile Val cys Leu Va1 Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ala Thr Gly
305 310 315 320
Asn Arg Leu Asn Arg Leu Asn Gin Ala Gly Gin Leu phe Leu Leu Gin
325 330 335
Thr Val Gl u Leu Gly Ser Trp Val Gly Met val Thr Phe Asp Ser Al a
340 345 350
Al a His val 355 Gin Ser Glu Leu ile 360 Gin Ile Asn Ser Gly 365 Ser Asp Arg
Asp Thr Leu Ala Lys Arg Leu Pro Al a Ala Ala ser Gl y Gly Thr Ser
370 375 380
Ile 385 Cys Ser Gly Leu Ara 390 Ser Ala Phe Thr val 395 Ile Arg Lys Lys Tyr 400
Pro Thr Asp Gly Ser Glu Ile val Leu Leu Thr Asp Gly Glu Asp Asn
PL 219 093 B1
109
405 342-4PCTengl 410 415
Thr Ile Ser Gly Cys Phe Asn Gl u Val Lys Gl π Ser Gly Al a Ile ile
420 425 430
Hi s Thr Val Ala Leu Gly Pro Ser Ala Ala Gl n Glu Leu Glu Glu Leu
435 440 445
Ser Lys Met Thr Gly Gly Leu Gin Thr Tyr Ala Ser ASp Gin Val Gin
450 455 460
Asn Asn Gly Leu Ile Asp Ala Phe Gly Ala Leu Ser Ser Gly Asn Gly
465 470 475 480
Ala val Ser Gin Arg Ser Ile Gin Leu Glu Ser Lys Gly Leu Thr Leu
485 490 495
Gin Asn Ser Gin Trp Met ASH Gly Thr val ile Val Asp Ser Thr val
500 505 510
Gly Lys Asp Thr Leu Phe Leu ile Thr Trp Thr Thr Gin Pro Pro Gin
515 520 525
ile Leu Leu Trp Asp Pro Ser Gly Gin Lys Gin Gly Gly Phe Val val
530 535 540
Asp Lys Asn Thr Lys Met Ala Tyr Leu Gin Ile Pro Gly Ile Ala Lys
545 550 555 560
val Gly Thr Trp Lys Tyr Ser Leu Gin Ala Ser ser Gin Thr Leu Thr
565 570 575
Leu Thr val Thr Ser Arg Al a Ser Asn Ala Thr Leu Pro Pro Ile Thr
580 585 590
val Thr Ser Lys Thr Asn Lys Asp Thr ser Lys Phe Pro Ser pro Leu
595 600 605
val Val Tyr Al a Asn Ile Arg Gl n Gly Ala Ser Pro ile Leu Arg Al a
610 615 620
Ser val Thr Al a Leu Ile Glu Ser Val Asn Gly Lys Thr val Thr Leu
625 630 635 640
Glu Leu Leu Asp Asn Gly Ala Gly Ala Asp Ala Thr Lys Asp Asp Gly
645 650 655
110
PL 219 093 B1
Val Tyr Ser Arg 660 Tyr Phe Thr Thr Tyr 565 342- Asp 4PCTengl Thr Asn Gly Arg 670 Tyr Ser
Val Lys val Arg Ala Leu Gly Gly Val Asn Ala Ala Arg Arg Arg val
675 680 685
Ile Pro Gin Gin Ser Gly Ala Leu Tyr ile Pro Gly Trp ile Glu Asn
690 695 700
Asp Glu Ile Gin Trp Asn Pro Pro Arg Pro Glu ile Asn Lys Asp Asp
705 710 715 720
val Gin His Lys Gin Val cys Phe Ser Arg Thr Ser Ser Gly Gly Ser
725 730 735
Phe val Ala ser ASp val ΡΓΟ Asn Ala Pro Ile Pro Asp Leu Phe Pro
740 745 750
Pro Gly Gin Ile Thr Asp Leu Lys Al a Glu Ile Hi s Gly Gly Ser Leu
755 760 765
Ile Asn Leu Thr Trp Thr Ala Pro Gly Asp Asp Tyr Asp His Gly Thr
770 775 780
Ala His Lys Tyr Ile ile Arg Ile Ser Thr Ser Ile Leu Asp Leu Arg
785 790 795 800
ASP Lys Phe Asn Glu Ser Leu Gin Val Asn Thr Thr Ala Leu Ile Pro
805 810 815
Lys Glu Ala Asn Ser Glu Glu val Phe Leu Phe Lys Pro Glu Asn Ile
820 82 5 830
Thr Phe Glu Asn Gly Thr Asp Leu Phe ile Ala Ile Gin Ala Val Asp
835 840 845
Lys Val ASp Leu Lys Ser Glu ile Ser Asn ile Ala Arg val Ser Leu
850 855 860
Phe Ile Pro pro Gin Thr Pro Pro Glu Thr Pro Ser Pro Asp Glu Thr
865 870 875 880
Ser Ala Pro Cys Pro Asn Ile His Ile Asn Ser Thr Ile pro Gly ile
885 890 895
His Ile Leu Lys Ile Met Trp Lys Trp Ile Gly Glu Leu Gin Leu Ser
900 905 910
PL 219 093 B1
111
342-4PCTengl
Ile Ala
<210> 61
<211> 501
<212> PRT
<213> Homo
<400> 61
Met 1 Lys tys Glu Gly 5 Arg tys Arg Trp tys Arg Lys Glu Asp Lys Lys
10 15
Arg Val Val val Ser Asn Leu Leu Phe Glu Gly Trp Ser His Lys Glu
20 25 30
Asn Pro Asn Arg His His Arg Gly Asn Gin ile Lys Thr Ser Lys Tyr
35 40 45
Thr val Leu Ser Phe val Pro Lys Asn Ile phe Glu Gin Leu His Arg
50 55 60
Phe Ala Asn Leu Tyr Phe val Gly Ile Ala val Leu Asn Phe Ile Pro
65 70 75 80
Val val Asn Ala Phe Gin Pro Glu val Ser Met Ile Pro Ile Cys Val
85 90 95
Ile Leu Al a val Thr Ala Ile Lys Asp Ala Trp Glu Asp Leu Arg Arg
100 105 110
Tyr Lys Ser Asp tys val Ile Asn Asn Arg Glu Cys Leu Ile Tyr Ser
115 120 125
Arg Lys Glu Gin Thr Tyr val Gin Lys Cys Trp Lys ASp Val Arg val
130 135 140
Gly Asp Phe ile Gin Met Lys Cys Asn Glu Ile Val Pro Ala Asp Ile
145 150 155 160
Leu Leu Leu Phe Ser Ser Asp Pro Asn Gly Ile Cys His Leu Glu Thr
165 170 175
Ala Ser Leu Asp Gly Glu Thr ASH Leu Lys Gin Arg Arg val val Lys
ISO 185 190
112
PL 219 093 B1
PL 219 093 B1
113
435 342- 4PCT engl
440 445
Pro Ala Leu Leu Arg Asn Glu Glu ile Lys ASp Ile Leu Leu Ala Leu
450 455 460
Leu Glu Ala Val Trp Hi s Phe His Lys Leu Leu pro val Ser Leu Trp
465 470 475 480
Ser Ser Leu Ser Gin Ile Arg Ala val Pro Ile Thr Cys Lys Leu Ser
485 490 495
Phe val Tyr Lys Gly 500
<210> 62
<211> 154
<212> PRT
<213> Homo
<400> 62
Met Gly Arg Arg ser Pro Phe Lys Pro Arg Asn Lys val ' 10 Phe Gly 15 Phe
1 5
Ser Tyr Pro Trp Cys Arg Ser Tyr Gin Pro Phe Pro Arg Lys Arg Ala
20 25 30
Trp Pro Pro Ser Arg val Trp Leu Gly Ala cys Cys Ala Ser Leu Ala
35 40 45
Ser Pro ΡΓΟ Lys Gly Thr Ile Pro Ser Gly Glu Tyr Tyr Arg Pro Ala
50 55 60
Pro Ser Ser Ser Gly Asp Ser Leu Arg Arg Glu Ser Gly Ala Leu Leu
65 70 75 80
Gin Tyr Leu Pro Ser Leu Ala Ser Pro cys Ala Asn His Ala Thr Arg
85 90 95
Cys Ser Leu Leu Phe Pro Ile Tyr Lys Ile Lys Met Thr Leu Leu Tyr
100 105 110
Leu Thr Gly Leu Ala Arg Thr His cys cys cys Leu Ala Asp Arg cys
115 120 125
114
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Ala Glu Ala Val Glu Ser Ala Phe Tyr Leu val Gly Ser Leu Cys ile 130 135 140
Asn Ala Arg Gly Ala Ala His Leu Thr Asp 145 150 <210> 63 <211> 484 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63
Met Ala Gly 1 Pro Trp Thr phe Thr Leu Leu cys Gly Leu Leu Al a 15 Al a
5 10
Thr Leu Ile Gin Ala Thr Leu Ser Pro Thr Ala Val Leu Ile Leu Gly
20 25 30
Pro Lys val Ile Lys Glu Lys Leu Thr Gin Glu Leu Lys ASp Hi s Asn
35 40 45
Al a Thr Ser Ile Leu Gin Gin Leu Pro Leu Leu Ser Ala Met Arg Glu
50 55 60
Lys Pro Ala Gly Gly Ile Pro val Leu Gly Ser Leu val Asn Thr Val
65 70 75 80
Leu Lys His ile Ile Trp Leu Lys val Ile Thr Ala Asn Ile Leu Gin
85 90 95
Leu Gin val Lys Pro ser Al a Asn Asp Gl Π Glu Leu Leu Va1 Lys ile
100 105 110
Pro Leu Asp Met val Ala Gly Phe Asn Thr Pro Leu val Lys Thr Ile
115 120 125
val Glu Phe His Met Thr Thr Glu Ala Gin Ala Thr Ile Arg Met Asp
130 135 140
Thr Ser Ala Ser Gly Pro Thr Arg Leu val Leu Ser ASp Cys Al a Thr
145 150 155 160
Ser His Gly Ser Leu Arg Ile Gin Leu Leu His Lys Leu Ser Phe Leu
165 170 175
PL 219 093 B1
115
342-4PCTengl
val Asn Ala Leu Ala Lys Gin val Met Asn Leu Leu Va1 Pro Ser Leu
180 185 190
Pro Asn Leu val Lys Asn Gin Leu Cys pro Val Ile Glu Al a Ser Phe
195 200 205
Asn Gly Met Tyr Ala Asp Leu Leu Gin Leu Val Lys Val Pro Ile Ser
210 215 220
Leu ser Ile Asp Arg Leu Glu Phe ASp Leu Leu Tyr ΡΓΟ Ala Ile Lys
225 230 235 240
Gly Asp Thr Ile Gin Leu Tyr Leu Gly Al a Lys Leu Leu Asp Ser Gin
245 250 255
Gly Lys val Thr Lys Trp Phe Asn Asn Ser Al a Ala Ser Leu Thr Met
260 265 270
Pro Thr Leu ASP Asn Ile Pro Phe Ser Leu Ile Val Ser Gin Asp val
275 280 285
Val Lys Ala Ala val Ala Ala val Leu Ser Pro Glu Glu Phe Met Val
290 295 300
Leu Leu ASp Ser Val Leu Pro Glu Ser Ala Hi s Arg Leu Lys Ser ser
305 310 315 320
ile Gly Leu Ile Asn Glu Lys Ala Ala Asp Lys Leu Gly Ser Thr Gin
325 330 335
ile val Lys Ile Leu Thr Gin Asp Thr Pro Glu Phe Phe Ile Asp Gin
340 345 350
Gly His Ala Lys val Ala Gin Leu Ile Val Leu Glu val Phe Pro Ser
355 360 365
ser Glu Ala Leu Arg Pro Leu Phe Thr Leu Gly Ile Glu Ala Ser Ser
370 375 380
Glu Ala Gin Phe Tyr Thr Lys Gly Asp Gin Leu Ile Leu Asn Leu Asn
385 390 395 400
Asn ile Ser Ser Asp Arg Ile Gin Leu Met Asn Ser Gly Ile Gly Trp
405 410 415
Phe Gin Pro Asp Val Leu Lys Asn ile ile Thr Glu Ile Ile His Ser
420 425 430
116
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
ile Leu Leu 435 Pro Asn Gin Asn Gly 440 Lys Leu Arg ser Gly 445 val ΡΓΟ val
Ser Leu val Lys Ala Leu Gly Phe Glu Ala Ala Glu Ser ser Leu Thr
450 455 460
Lys Asp Ala Leu val Leu Thr Pro Ala Ser Leu Trp Lys Pro Ser Ser
465 470 475 480
Pro val Ser Gin
<210> 64
<211> 256
<212> PRT
<213> Homo
<40O> 64
Met 1 Phe Gin Thr Gly 5 Gly Leu Ile val Phe Tyr Gly 10 Leu Leu Ala 15 Gin
Thr Met Ala Gin Phe Gly Gly Leu Pro Val Pro Leu Asp Gin Thr Leu
20 25 30
Pro Leu Asn Val Asn pro Ala Leu pro Leu Ser Pro Thr Gly Leu Al a
35 40 45
Gly ser Leu Thr Asn Ala Leu Ser Asn Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu
50 55 60
Leu Gly ile Leu Glu Asn Leu Pro Leu Leu Asp ile Leu Lys Pro Gl y
65 70 75 80
Gly Gly Thr Ser Gly Gly Leu Leu Gly Gly Leu Leu Gly Lys val Thr
85 90 95
Ser va1 Ile Pro Gly Leu Asn Asn Ile Ile Asp ile Lys Val Thr Asp
100 105 110
Pro Gin Leu Leu Glu Leu Gly Leu val Gin ser ΡΓΟ Asp Gly His Arg
115 120 12 5
Leu Tyr val Thr Ile Pro Leu Gly ile Lys Leu Gin val Asn Thr Pro
PL 219 093 B1
117
342-4PCTengl
130 135 140
Leu Val 145 Gly Ala Ser Leu Leu Arg 150 Leu Ala val 155 Lys Leu Asp Ile Thr 160
Ala Glu ile Leu Ala val Arg Asp Lys Gin Glu Arg Ile Hi s Leu Va1
165 170 175
Leu Gly Asp Cys Thr His Ser Pro Gly Ser Leu Gin ile Ser Leu Leu
180 185 190
Asp Gly Leu Gly Pro Leu Pro Ile Gin Gly Leu Leu ASD Ser Leu Thr
195 200 205
Gly ile Leu Asn Lys Val Leu Pro Glu Leu val Gin Gly Asn Val Cys
210 215 220
Pro Leu val Asn Gl u val Leu Arg Gly Leu ASp Ile Thr Leu val His
225 230 235 240
Asp ile val Asn Met Leu Ile His Gly Leu Gin Phe Val Ile Lys val
245 250 255 <210> 65 <211> 791 <212> PRT
<213> 1 Homo sap- i ens
<400> i 65
Met Ser Gin Pro Arg Pro Arg Tyr Val Val Asp Arg Ala Ala Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Thr Leu Phe Asp Asp Glu Phe Glu Lys Lys Asp Arg Thr Tyr Pro
20 25 30
Val Gly Glu Lys Leu Arg Asn Ala Phe Arg Cys ser Ser Ala Lys Ile
35 40 45
Lys Ala val val Phe Gly Leu Leu Pro Val Leu Ser Trp Leu Pro Lys
50 55 60
Tyr Lys Ile Lys Asp Tyr ile Ile Pro Asp Leu Leu Gly Gly Leu Ser
65 70 75 80
118
PL 219 093 B1
Gly Gly Ser ile Gin val 85 Pro 342-4PCTengl Ala
Gin Gly Met 90 Ala Phe Ala Leu Leu 95
Asn Leu Pro Ala val Α5Π Gly Leu Tyr Ser Ser Phe Phe Pro Leu Leu
100 105 110
Thr Tyr Phe Phe Leu Gly Gly val His Gin Met val Pro Gly Thr Phe
115 120 125
Al a val Ile Ser Ile Leu val Gly Asn Ile cys Leu Gin Leu Ala Pro
130 135 140
Glu Ser Lys Phe Gin Val Phe Asn Asn Ala Thr Asn Glu Ser Tyr val
145 150 155 160
ASp Thr Ala Ala Met Glu Al a Glu Arg Leu His val Ser Ala Thr Leu
165 170 175
Ala Cys Leu Thr Ala Ile Ile Gl n Met Gly Leu Gly Phe Met Gin Phe
180 185 190
Gly Phe Val Ala Ile Tyr Leu Ser Glu Ser Phe Ile Arg Gly Phe Met
195 200 205
Thr Ala Al a Gly Leu Gin ile Leu ile Ser val Leu Lys Tyr Ile Phe
210 215 220
Gly Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Thr Gly Pro Gly Ser Ile Val Phe Thr
225 230 235 240
Phe Ile ASp Ile Cys Lys Asn Leu Pro His Thr Asn Ile Ala Ser Leu
245 250 255
Ile phe Ala Leu Ile Ser Gly Al a Phe Leu val Leu val Lys Glu Leu
260 265 270
Asn Ala Arg Tyr Met Hi s Lys Ile Arg Phe Pro Ile Pro Thr Glu Met
275 280 285
Ile val val val Val Ala Thr Ala Ile ser Gly Gly cys Lys Met ΡΓΟ
290 295 300
Lys Lys Tyr His Met Gin Ile Val Gly Glu Ile Gin Arg Gly Phe Pro
305 310 315 320
Thr Pro val Ser Pro val val Ser Gin Trp Lys ASp Met Ile Gly Thr
325 330 335
PL 219 093 B1
119
342-4PCTengl
Ala Phe Ser Leu Ala Ile Val ser Tyr 345 val Ile Asn Leu Al a 3 50 Mer Gly
340
Arg Thr Leu Ala Asn Lys Hi s Gly Tyr Asp val Asp ser Α5Π Gin Glu
355 360 365
Met Il e Al a Leu Gly cys Ser Asn Phe Phe Gly Ser Phe Phe Lys Ile
370 375 380
Hi 5 385 Val Ile cys Cys Ala 390 Leu ser val Thr Leu 395 Ala val Asp Gly Ala 400
Gly Gly Lys Ser Gin val Ala Ser Leu cys Val Ser Leu Val Va1 Met
405 410 415
Ile Thr Met Leu Va1 teu Gly Ile Tyr Leu Tyr Pro Leu Pro Lys Ser
420 425 430
val Leu Gly Ala Leu Ile Ala Val Asn Leu Lys Asn Ser Leu Lys Gin
435 440 445
Leu Thr 450 A5p Pro Tyr Tyr Leu 455 Trp Arg Lys Ser Lys 460 Leu Asp cys Cys
Ile Trp Val val Ser Phe Leu Ser Ser Phe Phe Leu Ser Leu Pro Tyr
465 470 475 480
Gly val Al a val Gly val Ala Phe ser Val Leu val val Val Phe Gin
485 490 495
Thr Gin Phe Arg Asn Gly Tyr Al a Leu Ala Gin Val Met Asp Thr Asp
500 505 510
Ile Tyr Val Asn Pro Lys Thr Tyr Asn Arg Ala Gin Asp Ile Gin Gly
515 520 525
Ile Lys II e ile Thr Tyr Cys Ser ΡΓΟ Leu Tyr Phe Ala Asn ser Glu
530 535 540
Ile Phe Arg Gin Lys val ile Ala Lys Thr Gly Met Asp pro Gin Lys
545 550 555 560
Val Leu Leu Ala Lys Gl π Lys Tyr Leu Lys Lys Gin Gl u Lys Arg Arg
565 570 575
Met Arg Pro Thr Gin Gin Arg Arg Ser Leu Phe Met Lys Thr Lys Thr
580 585 590
120
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
val Ser Leu 595 Gin Gl u Leu Gin Gin Asp Phe Glu 600 Asn Ala 605 Pro Pro Thr
Asp Pro Asn Asn Asn Gin Thr Pro Al a Asn Gly Thr Ser Val Ser Tyr
610 615 620
Ile Thr Phe Ser Pro ASp Ser Ser Ser pro Ala Gin Ser Glu Pro Pro
625 630 635 640
Ala Ser Al a Glu Ala Pro Gly Glu Pro ser Asp Met Leu Ala Ser val
645 650 655
pro Pro Phe val Thr Phe Hi s Thr Leu ile Leu Asp Met ser Gly val
660 665 670
Ser Phe val Asp Leu Met Gly Ile Lys Al a Leu Ala Lys Leu Ser Ser
67 5 680 685
Thr Tyr Gly Lys Ile Gly val Lys Val Phe Leu Val Asn Ile Hi s Al a
690 695 700
Gin val Tyr Asn Asp Ile Ser His Gly Gly val Phe Glu Asp Gly Ser
705 710 715 720
Leu Glu Cys Lys His Val Phe Pro Ser Ile Hi 5 Asp Ala val Leu Phe
725 730 735
Ala Gin Al a Asn Al a Arg Asp val Thr Pro Gly Hi s Asn phe Gin Gly
740 745 750
Ala Pro Gly Asp Ala Glu Leu Ser Leu Tyr ASp Ser Glu Glu Asp Ile
755 760 765
Arg Ser Tyr Trp Asp Leu Gl u Gin Glu Met Phe Gly Ser Met Phe Hi s
770 775 780
Ala Glu Thr Leu Thr Ala Leu
785 790
<210> 66
<211> 243
<212> PRT
<213> Homo sapi ens
PL 219 093 B1
121
342- -4PCTengl
<40i 0> 66
Met Glu Gin Gly Ser Gly Arg Leu Glu Asp Phe Pro Val Asn Val Phe
1 5 10 15
Ser val Thr Pro 20 Tyr Thr Pro Ser Thr 25 Ala Asp ile Gin val 30 Ser Asp
Asp Asp Lys Ala Gly Ala Thr Leu Leu Phe ser Gly Ile Phe Leu Gly
35 40 45
Leu val 50 Gly Ile Thr Phe Thr 55 val Met Gly Trp Ile 60 Lys Tyr Gin Gly
val Ser Hi s Phe Glu Trp Thr Gin Leu Leu Gly Pro val Leu Leu Ser
65 70 75 80
val Gly val Thr Phe Ile Leu Ile Ala val Cys Lys Phe Lys Met Leu
90 95 ser cys Gin Leu Cys Lys Glu Ser Glu Glu Arg val Pro Asp Ser Glu 100 105 110
Gin Thr Pro Gly Gly Pro Ser Phe val Phe Thr Gly Ile Asn Gin Pro
115 120 125
ile Thr Phe Hi s Gly Al a Thr val Val Gin Tyr Ile Pro Pro Pro Tyr
130 135 140
Gly Ser pro Glu pro Met Gly ile Asn Thr Ser Tyr Leu Gin Ser val
145 150 155 160
Val Ser Pro cys Gly Leu Ile Thr Ser Gly Gly Al a Al a Ala Al a Met
165 170 175
Ser Ser Pro Pro Gin Tyr Tyr Thr Il e Tyr Pro Gin Asp Asn Ser Al a
180 185 190
Phe val val ASp Glu Gly cys Leu Ser Phe Thr Asp Gly Gly Asn His
195 200 205
Arg Pro Asn Pro Asp Val Asp Gin Leu Glu Glu Thr Gin Leu Glu Glu
210 215 220
Gl u Ala Cys Ala cys Phe Ser Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Ile Tyr Ser
225 230 235 240
122
PL 219 093 B1
Leu Pro Arg
342-4PCTengl <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 67 acacgaatgg tagatacagt g
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<2T3 > Sztuczna sekwencja
<220>
<223> θΡ i s ani e sztucznej s ekwenc j i;
<400> 68
atacttgtga gctgttccat g
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Opisanie sztucznej
<400> 69
zneg sekwencji: Oligonukleatyd actgttacct tgcatggact g <210> 70 <211> 21 <212> DNA
PL 219 093 B1
123
342-4PCTengl <213* Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 70 caatgagaac acatggacat g <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 71 ccatgaaagc tccatgtcta c <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 72 agagatggca catattctgt c <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
124
PL 219 093 B1 <400> 73 342-4PCTengl atcggctgaa gtcaagcatc g <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 74 tggtcagtga ggactcagct g <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 75 tttctctgct tgatgcactt g <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213* Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 76 gtgagcactg ggaagcagct c <210* 77 <211> 21 <212> DNA
PL 219 093 B1
125
342-4PCTengl <213 > Sztuczna sekwencja <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 77 ggcaaatgct agagacgtga c <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 78 aggtgtcctt cagctgccaa g 21
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<220> <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 79 gttaagtgct ctctggattt g 21
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
<22O> <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
126
PL 219 093 B1
342-4PCTeng1 <400> 80 atcctgattg ctgtgtgcaa g
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencj a
<220>
<223> Opisanie sztucznej
<400> 81
ctcttctagc tggtcaacat c
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213 > Sztuczna sekwencja
<?20>
<223> Opisanie sztucznej
<400> 82
ccagcaacaa cttacgtggt c <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O> . . , - , ·, Ł „ <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd.
<400> 83 cctttattca cccaatcact c <210> 84 <211> 2165 <212> DNA
PL 219 093 B1
127
342-4PCTengl <213> Homo sapiens
<400> 84
agaacagcgc agtttgccct ccgctcacgc agagcctctc cgtggcctcc gcaccttgag 60
cattaggcea gttctcctct tctctctaat ccatccgtca cctctcctgt catccgtttc 120
catgccgtga ggtccattca cagaacacat ccatggctct catgctcagt ttggttctga 180
gtctcctcaa gctgggatca gggcagtggc aggtgtttgg gccagacaag cctgtccagg 240
ccttggtggg ggaggacgca gcattctcct gtttcctgtc tcctaagacc aatgcagagg 300
ccatggaagt gcggttcttc aggggccagt tctctagcgt ggtccacctc tacagggacg 360
ggaaggacca gccatttatg cagatgccac agtatcaagg caggacaaaa ctggtgaagg 420
attctattgc ggaggggcgc atctctctga ggctggaaaa cattactgtg ttggatgctg 480
gcctctatgg gtgcaggatt agttcccagt cttactacca gaaggccatc tgggagctac 540
aggtgtcagc actgggctca gttcctctca tttccatcac gggatatgtt gatagagaca 600
tccagctact ctgtcagtcc tcgggctggt tcccccggcc cacagcgaag tggaaaggtc 660
cacaaggaca ggatttgtcc acagactcca ggacaaacag agacatgcat ggcctgtttg 720
atgtggagat ctctctgacc gtccaagaga acgccgggag catatcctgt tccatgcggc 780
atgctcatct gagccgagag gtggaatcca gggtacagat aggagatacc tttttcgagc 840
ctatatcgtg gcacctggct accaaagtac tgggaatact ctgctgtggc ctattttttg 900
gcattgttgg actgaagatt ttcttctcca aattccagtg taagcgagag agagaagcat 960
gggccggtgc cttattcatg gttccagcag ggacaggatc agagatgctc ccacatccag 1020
ctgcttctct tcttctagtc ctagcctcca ggggcccagg cccaaaaaag gaaaatccag 1080
gcggaactgg actggagaag aaagcacgga caggcagaat tgagagacgc ccggaaacac 1140
gcagtggagg tgactctgga tccagagacg gctcacccga agctctgcgt ttctgatctg 1200
aaaactgtaa cccatagaaa agctccccag gaggtgcctc actctgagaa gagatttaca 1260
aggaagagtg tggtggcttc tcagagtttc caagcaggga aacattactg ggaggtggac 1320
ggaggacaca ataaaaggtg gcgcgtggga gtgtgccggg atgatgtgga caggaggaag 1380
gagtacgtga ctttgtctcc cgatcatggg tactgggtcc tcagactgaa tggagaacat 1440
ttgtatttca cattaaatcc ccgttttatc agcgtcttcc ccaggacccc acctacaaaa 1500
ataggggtct tcctggacta tgagtgtggg accatctcct tcttcaacat aaatgaccag 1560
tcccttattt ataccctgac atgtcggttt gaaggcttat tgaggcccta cattgagtat 1620
ccgtcctata atgagcaaaa tggaactccc atagtcatct gcccagtcac ccaggaatca 1680
gagaaagagg cctcttggca aagggcctct gcaatcccag agacaagcaa cagtgagtcc 1740
128
PL 219 093 B1
342-4PCTengl tcctcacagg caaccacgcc cttcctcccc aggggtgaaa tgtaggatga atcacatccc 1800 acattcttct ttagggatat taaggtctct ctcccagatc caaagtcccg cagcagccgg 1860 ccaaggtggc ttccagatga agggggactg gcctgtccac atgggagtca ggtgtcatgg 1920 ctgccctgag ctgggaggga agaaggctga cattacattt agtttgctct cactccatct 1980 ggctaagtga tcttgaaata ccacctctca ggtgaagaac cgtcaggaat tcccatctca 2040 caggctgtgg tgtagattaa gtagacaagg aatgtgaata atgcttagat cttattgatg 2100 acagagtgta tcctaatggt ttgttcatta tattacactt tcagtaaaaa aaaaaaaaaa 2160 aaaaa 2165 <210> 85 <211> 347 <212> PRT
<213> 1 Homo sapi i ens
<400> i 85
Met Ala Leu Met Leu Ser Leu Val Leu Ser Leu Leu Lys Leu Gly Ser
1 5 10 15
Gly Gin Trp Gin Val phe Gly Pro Asp Lys Pro Val Gin Ala Leu Val
20 25 30
Gly Glu Asp Ala Ala Phe Ser Cys Phe Leu Ser Pro Lys Thr Asn Ala
35 40 45
Glu Ala Met Glu Val Arg Phe Phe Arg Gly Gin Phe Ser Ser Val Val
50 55 60
His Leu Tyr Arg Asp Gly Lys Asp Gin Pro Phe Met Gin Met Pro Gin
65 70 75 80
Tyr Gin Gl y Arg Thr 85 Lys Leu val Lys ASp 90 Ser Ile Ala Glu Gly 95 Arg
Ile Ser Leu Arg Leu Glu Asn Ile Thr val Leu ASp Ala Gly Leu Tyr
100 105 110
Gly Cys Arg Ile Ser Ser Gl n Ser Tyr Tyr Gin Lys Ala Ile Trp Glu
115 120 125
Leu Gin val ser Al a Leu Gly Ser val Pro Leu ile Ser Ile Thr Gly
PL 219 093 B1
129
130 135 342 -4PCTeng 140 1
Tyr Val Asp ' Arg Asp Ile Gin Leu Leu cys Gin Ser Ser Gly Trp Phe
145 150 15 5 160
Pro Arg Pro Thr Al a Lys Trp Lys Gly Pro Gl n Gly Gin Asp Leu ser
165 170 175
Thr Asp Ser Arg Thr Asn Arg ASp Met His Gly Leu Phe Asp val Glu
180 185 190
Ile Ser Leu 195 Thr val Gin Gl u Asn 200 Ala Gly ser ile Ser 205 cys Ser Met
Arg His Ala His Leu ser Arg Glu val Glu Ser Arg val Gin ile Gly
210 215 220
Asp Thr Phe Phe Glu Pro Ile ser Trp His Leu Ala Thr Lys Val Leu
225 230 235 240
Gly Π e Leu Cys Cys Gly Leu Phe Phe Gly Ile val Gly Leu Lys ile
245 250 255
Phe Phe Ser Lys Phe Gin Cys Lys Arg Glu Arg Glu Ala Trp Ala Gly
260 265 270
Ala Leu Phe Met val Pro Ala Gly Thr Gly Ser Gl u Met Leu Pro Hi s
275 280 285
Pro Ala Ala Ser Leu Leu Leu Val Leu Ala Ser Arg Gly Pro Gly Pro
290 295 300
Lys Lys Glu Asn Pro Gly Gly Thr Gly Leu Gl u Lys Lys Ala Arg Thr
305 310 315 320
Gly Arg Ile Glu Arg Arg Pro Glu Thr Arg Ser Gl y Gly Asp Ser Gly
325 330 335
Ser Arg Asp Gly Ser Pro Glu Ala Leu Arg Phe
340
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja
130
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 86 attcatggtt ccagcaggga c <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 87 gggagacaaa gtcacgtact c <210> 88 <211> 22 <212> dna <213> Sztuczna sekwencja <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 88 tcctggtgtt cgtggtctgc tt <210> 89 <211> 22 ^71?^ DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 89 gagagtcctg gcttttgtgg gc <210> 90 <211> 15 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 90 strona 77
PL 219 093 B1
131
342-4PCTengl
Gly Ser Ser Asp Leu Thr Trp Pro Pro Ala ile Lys Leu Gly Cys 1 5 10 15 <210> 91 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91
Asp Arg Tyr Val Ala Va1 Arg His Pro Leu Arg Ala Arg Gly Leu Arg 15 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92
Val Ala Pro Arg Ala Lys Ala His Lys Ser Gin Asp ser Leu Cys 15 10 15 <210> 93 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93
Cys Phe Arg Ser Thi? Arg His Asn Phe Asn ser Met Arg 1 5 10 <210> 94 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94
Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly ser ser Asp Leu Thr Trp Pro 15 10 15
Pro Ala Ile Lys Leu Gly 20
<210> <211> <212> <213> 95 14 PRT Homo sapi ens
<400> 95
Arg Asp Thr Ser Asp Thr Pro Leu Cys Gin Leu Ser Gin Gly
132
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <21Ο> 96 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96
Gly ile Gin Glu Gly Gly Phe Cys Phe Arg Ser Thr Arg His Asn phe 1 5 10 15
Asn ser Met Arg Phe Pro 20 <210> 97 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97
Ala Lys Glu Phe Gin Glu Ala ser Ala Leu Ala val Ala Pro Ara Ala 1 5 10 15 tys Ala His Lys Ser Gin Asp Ser Leu Cys Val Thr Leu Ala 20 25 30 <210> 98 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd S <400> 98 tcctgctcgt cgctctcctg at <210> 99 <211> 2© <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd e <400> 99 tcgctttttg tcgtatttgc <210> 100 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100
PL 219 093 B1
133
342-4PCTengl
His Asn Gly Ser Tyr Glu ile ser Val Leu Met Met Gly Asn Ser 1 5 10 15 <210> 101 <211> 15 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 101
Asn Leu Pro Thr Pro Pro Thr Val Glu Asn Gin Gin Arg Leu Ala 1 5 10 15 <210> 102 <211> 619 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102
Arg Lys Tyr Arg Lys 5 Asp Tyr Glu Leu Arg 10 Gin Lys Lys Trp Ser 15 Hi s
Ile Pro Pro Glu ASn ile Phe Pro Leu Glu Thr Asn Gl u Thr Asn His
20 25 30
Val ser Leu 35 Lys Ile Asp Asp Asp 40 Lys Arg Arg Asp Thr 45 Ile Gin Arg
Leu Arg 50 Gin cys Lys Tyr Asp 55 Lys Lys Arg val Ile 60 Leu Lys Asp Leu
Lys 65 His Asn ASp Gly Asn 70 Phe Thr Glu Lys Gin Lys Ile Glu 75 Leu Asn 80
Lys Leu Leu Gin Ile ASp Tyr Tyr Asn Leu Thr Lys Phe Tyr Gly Thr
85 90 95
val Lys Leu Asp Thr Met rle Phe Gly val Ile Glu Tyr cys Glu Arg
100 105 110
Gly Ser Leu Arg Glu Val Leu Asn Asp Thr Ile Ser Tyr Pro Asp Gly
115 120 125
Thr Phe Met Asp Trp Glu Phe Lys Ile Ser Val Leu Tyr Asp Ile Ala
130 135 140
Lys 145 Gly Met Ser Tyr Leu 150 His Ser Ser Lys Thr 155 Glu Val His Gly Arg 160
134
PL 219 093 B1
Leu Lys Ser Thr Asn cys val val 165 342-4PCTengl
Asp Ser Arg 170 Met Va1 Val Lys 175 Ile
Thr Asp Phe Gly cys Asn Ser Ile Leu Pro Pro Lys Lys Asp Leu Trp
180 185 190
Thr Ala Pro Glu His Leu Arg Gin Ala Asn Ile Ser Gin Lys Gly Asp
195 200 205
val Tyr Ser Tyr Gly Ile Ile Ala Gin Glu Ile Ile Leu Arg Lys Gl u
210 215 220
Thr phe Tyr Thr Leu Ser Cys Arg Asp Arg Asn Glu Lys Ile Phe Arg
225 230 235 240
va1 Glu Asn Ser Asn Gly Met Lys Pro Phe Arg Pro Asp Leu Phe Leu
245 250 255
Glu Thr Ala Glu Glu Lys Glu Leu Glu Val Tyr Leu Leu val Lys Asn
260 265 270
cys Trp Glu Glu Asp Pro Glu Lys Arg Pro Asp Phe Lys Lys Ile Glu
275 280 285
Thr Thr Leu Ala Lys ile Phe Gly Leu Phe His Asp Gin Lys Asn Glu
290 295 300
Ser Tyr Met Asp Thr Leu Ile Arg Arg Leu Gin Leu Tyr Ser Arg Asn
305 310 315 320
Leu Glu His Leu Val Glu Glu Arg Thr Gin Leu Tyr Lys Ala Glu Arg
325 330 335
Asp Arg Ala Asp Arg Leu Asn Phe Met Leu Leu Pro Arg Leu val val
340 345 350
Lys ser Leu Lys Glu Lys Gly Phe Val Glu Pro Glu Leu Tyr Gl u Gl u
355 360 365
val Thr ile Tyr Phe ser Asp Ile val Gly Phe Thr Thr Ile Cys Lys
370 375 380
Tyr Ser Thr Pro Met Glu val Val Asp Met Leu Asn ASp Ile Tyr Lys
385 390 395 400
Ser Phe Asp His Ile Val Asp Hi s Hi s Asp val Tyr Lys val Glu Thr
405 410 415
PL 219 093 B1
135
Ile Gly Asp Ala Tyr Met val Ala 342-4PCTengl Arg 430 Asn Gly
Ser 425 Gly Leu Pro Lys
420
Asn Arg His Ala Ile ASp Ile Ala Lys Met Ala Leu Glu Ile Leu Ser
435 440 445
Phe Met Gly Thr Phe Glu Leu Gl u His Leu Pro Gly Leu Pro Ile Trp
450 455 460
Ile Arg Ile Gly Val His Ser Gly Pro cys Ala Ala Gly val val Gly
465 470 475 480
Ile Lys Met Pro Arg Tyr Cys Leu Phe Gly ASp Thr val Asn Thr Ala
485 490 495
Ser Arg Met Glu Ser Thr Gly Leu pro Leu Arg Ile His Val Ser Gly
500 505 510
Ser Thr rle Ala Ile Leu Lys Arg Thr Glu cys Gin Phe Leu Tyr Glu
515 520 525
val Arg Gly Glu Thr Tyr Leu Lys Gly Arg Gly Asn Glu Thr Thr Tyr
530 535 540
Trp Leu Thr Gly Met Lys Asp Gin Lys Phe Asn Leu Pro Thr Pro Pro
545 550 555 560
Thr val Glu Asn Gin Gin Arg Leu Gin Ala Glu Phe Ser ASp Met Ile
565 570 575
Ala Asn Ser Leu Gin Lys Arg Gin Ala Ala Gly ile Arg Ser Gin Lys
580 585 590
Pro Arg Arg val Ala Ser Tyr Lys Lys Gly Thr Leu Glu Tyr Leu Gin
595 600 605
Leu Asn Thr Thr Asp Lys Glu ser Thr Tyr Phe
610 615 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 103
136
PL 219 093 B1
342-4PCTengl gctggtaact atcttcctgc <210> 104 <211> 20 <717-* ΓΊΜΔ <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd i <400> 104 gaagaatgtt gtccagaggt <210> 105 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105
Leu Ile Asn Lys Val Pro Leu Pro Val Asp Lys Leu Ala Pro Leu 15 10 15 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106
Ser Glu Ala val Lys Lys Leu teu Glu Ala teu Ser His Leu val 15 10 15
<210> <211> <212> <213> 107 20 DNA Sztuczna sekwencja
<220>
<223> Opisanie sztucznej
<400> 107
tgttttcaac taccaggggc sekwencj i:
Oligonukleotyd <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 108 tgttggcttt ggcagagtcc
PL 219 093 B1
137
342-4PCTengl <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 109 gaggcagagt tcaggcttca ccga 24 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 0>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 110 tgttggcttt ggcagagtcc 20 <210> 111 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111
Thr Gly Met ASP Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val
1 5 10 15
Thr Ser val Phe Gin Tyr Gl u Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gin
20 25 30
ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr rle Leu Gly Leu
35 40 45
Pro Ala Met Leu Gin Ala val Arg
55 <210> 112 <211> 53 <212> PRT
<213> Homo sapi ens
<400> 112
Asp Gin Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Al a val
1 5 10 15
Phe Asn Tyr Gin Gly Leu Trp Arg Ser cys Val Arg Glu ser Ser Gly
25 30
138
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met 35 40 45
Leu Gin Ala Val Arg 50 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Pro val Thr Ala val Phe 1 5 10 <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114
Asp Met Trp Ser Thr Gin Asp Leu Tyr Asp Asn pro 1 5 10 <210> 115 <211> 12 <212> prt <213> Homo sapiens' <400> 115
Cys Arg pro Tyr Phe Thr ile Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116
Thr Asn Phe Trp Met ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 1 5 10 <210> 117 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gccaggatca tgtccaccac cacatgccaa gtggtggcgt tcctcctgtc catcctgggg 60 ctggccggct gcatcgcggc caccgggatg gacatgtgga gcacccagga cctgtacgac 120
PL 219 093 B1
139
342-4PCTengl
aaccccgtca cctccgtgtt ccagtacgaa gggctctgga ggagctgcgt gaggcagagt 180
tcaggcttca ccgaatgcag gccctatttc accatcctgg gacttccagc catgctgcag 240
gcagtgcgag ccctgatgat cgtaggcatc gtcctgggtg ccattggcct cctggtatcc 300
atctttgccc tgaaatgcat ccgcattggc agcatggagg actctgccaa agccaacatg 360
acactgacct ccgggatcat gttcattgtc tcaggtcttt gtgcaattgc tggagtgtct 420
gtgtttgcca acatgctggt gactaacttc tggatgtcca cagctaacat gtacaccggc 480
atgggtggga tggtgcagac tgttcagacc aggtacacat ttggtgcggc tctgttcgtg 540
ggctgggtcg ctggaggcct cacactaatt gggggtgtga tgatgtgcat cgcctgccgg 600
ggcctggcac cagaagaaac caactacaaa gccgtttctt atcatgcetc aggccacagt 660
gttgcctaca agcctggagg cttcaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccaaaaac 720
aagaagatat acgatggagg tgcccgcaca gaggacgagg tacaatctta tccttccaag 780
cacgactatg tgtaatgctc taagacctct cagcac 816
<210> 118 <211> 261 <212> prt
<21 3> Homo sap i ens
<401 3> 118
Met Ser Thr Thr Thr Cys Gin Val val Ala Phe Leu Leu Ser ile Leu
1 5 10 15
Gly Leu Al a Gly cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr
20 25 30
Gin Asp Leu Tyr ASP Asn Pro val Thr Ser val Phe Gin Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser cys Val Arg Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gin Ala val Arg
65 70 75 80
Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Al a Ile Gly Leu Leu val
85 90 95
Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Lys Al a Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile val Ser
115 120 125
140
PL 219 093 B1
342-4PCTengl
Gly Leu cys Ala Ile Ala Gly val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val
130 135 140
Thr 145 Α5Π Phe Trp Met Ser 150 Thr Ala Asn Met Tyr 155 Thr Gly Met Gly Gly 160
Met val Gin Thr val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe
165 170 175
val Gly Trp val Ala Gly Gly Leu Thr Leu ile Gly Gly val Met Met
180 185 190
Cys Ile Ala cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala
195 200 205
val ser Tyr His Ala Ser Gly Hi s Ser val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly
210 215 220
Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys ile
225 230 235 240
Tyr ASp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu val Gin Ser Tyr Pro Ser
245 250 255
Lys His Asp Tyr Val,
260 <210* 119 <211> 227 <212> DNA
<213* Homo sapiens
<400> 119
gccaggatca tgtccaccac cacatgccaa gtggtggcgt tcctcctgtc catcctgggg 60 ctggccggct gcatcgcggc caccgggatg gacatgtgga gcacccagga cctgtacgac 120 aaccccgtca cctccgtgtt ccagtacgaa gggctctgga ggagctgcgt gaggcagagt 180 tcaggcttca ccgaatgcag gccctatttc accatcctgg gacttcc 227 <210> 120 <21L> 69 <212> prt <213> Homo sapiens <400> 120
Met ser Thr Thr Thr Cys Gin val val Ala Phe Leu Leu ser ile Leu 15 10 15
PL 219 093 B1
141
342-4RCTengl
Gly Leu Ala Gly Cys ile Ala Ala Thr Gly Met Asp 25 Met Trp 30 Ser Thr
20
Gin Asp Leu Tyr Asp Asn Pro val Thr Ser Val Phe Gin Tyr Glu Gly
35 40 45
Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gin Ser Ser Gly Phe Thr Glu cys Arg
50 55 60
Pro Tyr Phe Thr ile 65 <2l0> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 121 aatgagagga aagagaaaac 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22 0>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <4O0> 122 atggtagaag agtaggcaat 20 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123
Glu Lys Trp Asn Leu His Lys Arg Ile Ala Leu Lys Met val Cys
1 5 ' 10
<210> 124
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124
Cys Lei i Gly Phe Asn Phe Lys Glu Met Phe Lys
1 5 10
142
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 125 taatgatgaa ccctacactg agc
<210> 126 <211> 20 <21?> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> <223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 126 atggacaaat gccctacctt 20
<210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O> <22 3 > Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd
<400> 127 agtgctggaa ggatgtgcgt gt 22
<210> 128 <211> 20 <212> DNA
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 128 ttgaggtggt tgttgggttt <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220> .
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: oligonukleotyd
PL 219 093 B1
143 <400> 129 342-4PCTengl agatgtgctg aggctgtaga <210> 130 <211> 20 <212> DNA .
<213> Sztuczna sekwencja <220>
<i23> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 130 atgaaggttg attatttgag <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <22O>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 131 agccgcatac tcccttaccc tet <210> 132 <211> 20 <712> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 132 gcagcagccc aaacaccaca <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji: Oligonukleotyd <400> 133 ctgageegag aggtggaatc <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> Opisanie sztucznej sekwencji.: Oligonukleotyd
144
PL 219 093 B1
342-4PCTengl <400> 134 ctctctcgct tacactggaa 20 <210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135
Gin Trp Gin val Phe Gly Pro Asp Lys Pro val Gin Ala Leu 15 10
<210> 136
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 136
Ala Lys Trp Lys Gly Pro Gin Gly Gin Asp Leu Ser Thr Asp ser
1 5 10 15
<210> 137
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapi ens
<400> 137
Asn Met Leu val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr
1 5 10 15
Gly Met Gly Gly Met val Gl π Thr val Gin Thr Arg Tyr Thr Phe Gly
20 25 30
Zastrzeżenia patentowe

Claims (97)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca jeden lub więcej składników wybranych z grupy składającej się z:
    (i) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (ii) kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen lub jego część, (iii) przeciwciała, które wiąże się do związanego z nowotworem antygenu, (iv) antysensownego kwasu nukleinowego, który specyficznie hybrydyzuje z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen, (v) komórki gospodarza, z ekspresją związanego z nowotworem antygenu lub jego części, i (vi) izolowanego kompleksu pomiędzy związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią cząsteczki HLA, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów antygenu związanego z nowotworem, przy czym wspominany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
    PL 219 093 B1
    145 (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119.
    (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  2. 2. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas nukleinowy (ii) jest obecny w wektorze ekspresyjnym.
  3. 3. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że kwas nukleinowy (ii) jest funkcjonalnie połączony z promotorem.
  4. 4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka gospodarza wydziela związany z nowotworem antygen lub jego część.
  5. 5. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że dodatkowo w komórce gospodarza zachodzi ekspresja cząsteczki HLA, która wiąże się do związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
  6. 6. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA i/lub związanego z nowotworem antygenu lub jego części zachodzi metodą rekombinacji.
  7. 7. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 5, znamienna tym, że w komórce gospodarza ekspresja cząsteczki HLA zachodzi endogennie.
  8. 8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, 5 lub 7, znamienna tym, że komórka gospodarza jest komórką prezentującą antygen.
  9. 9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że komórka prezentująca antygen jest komórką dendrytyczną lub makrofagiem.
  10. 10. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1 i 4-9, znamienna tym, że komórka gospodarza jest komórką nieproliferacyjną.
  11. 11. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
  12. 12. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym.
  13. 13. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest fragmentem przeciwciała naturalnego.
  14. 14. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że przeciwciało jest sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym.
  15. 15. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 1, znamienna tym, że antysensowny kwas nukleinowy zawiera sekwencję 6-50 przylegających do siebie nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen.
  16. 16. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienna tym, że związany z nowotworem antygen lub jego część dostarczana przez tę farmaceutyczną kompozycję wiąże się do cząsteczek MHC na powierzchni komórek, w których zachodzi ekspresja nieprawidłowej ilości tego związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
  17. 17. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 16, znamienna tym, że wiązanie powoduje cytolityczną reakcję i/lub indukuje uwalnianie cytokin.
  18. 18. Kompozycja farmaceutyczna według któregokolwiek z zastrz. 1-17, zawierająca ponadto farmaceutycznie akceptowalny nośnik i/lub adiuwant.
  19. 19. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 18, znamienna tym, że adiuwantem jest saponina, GM-CSF, CpG, cytokina lub chemokina.
  20. 20. Kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano w zastrz. 1-19, do zastosowania w leczeniu choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu.
  21. 21. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 20, gdzie chorobą jest rak.
  22. 22. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 20, gdzie chorobą jest rak przełyku, rak oskrzeli, nowotwór płuc, nowotwór piersi, nowotwór prostaty, czerniak, nowotwór okrężnicy, nowotwór żołądka, nowotwór trzustki, nowotwór ucha, nosa i jamy gardłowej (ENT), rak komórek nerki, lub rak szyjki macicy, rak okrężnicy lub rak gruczołu piersiowego.
    146
    PL 219 093 B1
  23. 23. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1-22, gdzie związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  24. 24. Czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym czynnik ten jest do:
    (i) wykrywania kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen, i/lub (ii) wykrywania związanego z nowotworem antygen i/lub (iii) wykrywania przeciwciała związanego z nowotworem antygenu, i/lub (iv) wykrywania cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T, które są specyficzne dla związanego z nowotworem antygenu lub jego części zawierającej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu w biologicznej próbce izolowanej od pacjenta z tym związanym z nowotworem antygenem mającym sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  25. 25. Czynnik według zastrz. 24, znamienny tym, że wykrywanie obejmuje:
    (i) kontaktowanie biologicznej próbki z czynnikiem, który wiąże się specyficznie z kwasem nukleinowym kodującym związany z nowotworem antygen, z związanym z nowotworem antygenem, z przeciwciałem lub z cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T, i (ii) wykrywanie tworzenia się kompleksu między czynnikiem i kwasem nukleinowym, związanym z nowotworem antygenem lub jego częścią, przeciwciałem lub cytotoksycznymi lub pomocniczymi limfocytami T.
  26. 26. Czynnik według zastrz. 24 lub 25, znamienny tym, że wykrywanie jest przyrównywane do wykrywania w porównywalnej prawidłowej biologicznej próbce.
  27. 27. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-26, przy czym choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i w którym wykrywanie obejmuje wykrycie dwóch lub więcej kwasów nukleinowych kodujących te dwa lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów, wykrywanie wspomnianych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów, wykrywanie dwóch lub więcej przeciwciał wiążących się do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów lub wykrywanie dwóch lub więcej cytotoksycznych lub pomocniczych limfocytów T specyficznych dla tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów.
  28. 28. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-27, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest wykrywany przy użyciu sondy polinukleotydowej, która hybrydyzuje specyficznie z tym kwasem nukleinowym.
  29. 29. Czynnik według zastrz. 28, znamienny tym, że sonda polinukleotydowa zawiera sekwencję 6-50 przylegających do siebie nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego związany z nowotworem antygen.
  30. 30. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-27, znamienny tym, że kwas nukleinowy jest wykrywany poprzez selektywną amplifikację tego kwasu nukleinowego.
  31. 31. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-27, znamienny tym, że związany z nowotworem antygen lub jego część, aby mogły być wykryte są w postaci kompleksu z cząsteczką MHC.
  32. 32. Czynnik według zastrz. 31, znamienny tym, że cząsteczką MHC jest cząsteczka HLA.
  33. 33. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-27 i 31-32, znamienny tym, że związany z nowotworem antygen jest wykrywany przy użyciu przeciwciała wiążącego się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu.
  34. 34. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-27, znamienny tym, że przeciwciało jest wykrywane przy zastosowaniu białka lub peptydu wiążącego się specyficznie do tego przeciwciała.
  35. 35. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 28-29 i 33-34, znamienny tym, że sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko, lub peptyd lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie.
    PL 219 093 B1
    147
  36. 36. Czynnik według zastrz. 35, znamienny tym, że wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
  37. 37. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-36, znamienny tym, że próbka zawiera płyn ustrojowy i/lub tkankę.
  38. 38. Czynnik według zastrz. 33, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
  39. 39. Czynnik według zastrz. 33, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym.
  40. 40. Czynnik według zastrz. 33, znamienny tym, że przeciwciało jest fragmentem przeciwciała naturalnego.
  41. 41. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-40, znamienny tym, że chorobą jest rak.
  42. 42. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 24-40, znamienny tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  43. 43. Czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, który to czynnik jest czynnikiem do monitorowania próbki od pacjenta, który ma tę chorobę lub jest podejrzenie zachorowania na tę chorobę, ze względu na jeden lub więcej parametrów wybranych z grupy składającej się z:
    (i) ilość kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen, (ii) ilość związanego z nowotworem antygenu, (iii) ilość przeciwciał, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu, i (iv) ilość cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu i cząsteczki MHC, przy czym ten związany z nowotworem antygen ma sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, który jest wybrany z grupy składającej się z: kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  44. 44. Czynnik według zastrz. 43, w którym to sposobie oznacza się parametr(y) w pierwszej próbce, w pierwszym punkcie czasowym i w kolejnej próbce w drugim punkcie czasowym i w którym przebieg choroby jest oznaczany przez porównanie dwóch próbek.
  45. 45. Czynnik według zastrz. 43 lub 44, w którym choroba charakteryzuje się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i w którym monitorowanie zawiera monitorowanie:
    (i) ilości dwóch lub więcej kwasów nukleinowych, które kodują wspomniane dwa lub więcej różne związane z nowotworem antygeny, (ii) ilości tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów, (iii) ilości dwóch lub więcej przeciwciał, które wiążą się do tych dwóch lub więcej różnych związanych z nowotworem antygenów i/lub (iv) ilości dwóch lub więcej cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla kompleksów pomiędzy wspomnianymi dwoma lub więcej różnymi związanymi z nowotworem antygenami lub ich częściami zawierającymi co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów i cząsteczkami MHC.
  46. 46. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-45, znamienny tym, że ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana przy użyciu sondy polinukleotydowej, która hybrydyzuje specyficznie z tym kwasem nukleinowym.
  47. 47. Czynnik według zastrz. 46, znamienny tym, że polinukleotydowa sonda zawiera 6-50 przylegających nukleotydów kwasu nukleinowego kodującego ten związany z nowotworem antygen.
  48. 48. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-45, w którym ilość kwasu nukleinowego jest monitorowana poprzez selektywne powielanie tego kwasu nukleinowego.
    148
    PL 219 093 B1
  49. 49. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-45, w którym ilość związanego z nowotworem antygenu jest monitorowana przy użyciu przeciwciała wiążącego się specyficznie do tego związanego z nowotworem antygenu.
  50. 50. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-45, w którym ilość przeciwciał jest monitorowana przy użyciu białka lub peptydu wiążącego się specyficznie do przeciwciała.
  51. 51. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-45, w którym ilość cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T jest monitorowana przy użyciu komórek prezentujących kompleks pomiędzy związanym z nowotworem antygenem i cząsteczką MHC.
  52. 52. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 46-47 i 49-51, w którym sonda polinukleotydowa, przeciwciało, białko lub peptyd lub komórka są znakowane w sposób pozwalający na wykrycie.
  53. 53. Czynnik według zastrz. 52, w którym wskaźnik pozwalający na wykrycie jest wskaźnikiem radioaktywnym lub enzymatycznym.
  54. 54. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-53, znamienny tym, że próbka zawiera płyn ustrojowy i/lub tkankę.
  55. 55. Czynnik według zastrz. 49, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem monoklonalnym.
  56. 56. Czynnik według zastrz. 49, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem chimerycznym lub humanizowanym.
  57. 57. Czynnik według zastrz. 49, znamienny tym, że przeciwciało jest fragmentem naturalnego przeciwciała.
  58. 58. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-57, znamienny tym, że chorobą jest rak.
  59. 59. Czynnik według któregokolwiek z zastrz. 43-57 lub 58, znamienny tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  60. 60. Cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T do zastosowania w sposobie leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym te cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T otrzymuje się sposobem obejmującym etapy takie że:
    (i) pobiera się próbkę zawierającą immunoreaktywne komórki od tego pacjenta, i (ii) kontaktuje się tę próbkę z komórką gospodarza z ekspresją tego związanego z nowotworem antygenu lub jego częścią w warunkach które sprzyjają wytwarzaniu cytolitycznych lub uwalniających cytokiny komórek T, skierowanych przeciw temu związanemu z nowotworem antygenowi lub jego części i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje ponadto takie etapy, że:
    wprowadza się cytolityczne lub wydzielające cytokiny komórki T pacjentowi w ilości odpowiedniej do przeprowadzenia lizy komórek, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego części przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów tego związanego z nowotworem antygenu, mającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  61. 61. Cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T według zastrz. 60, znamienne tym, że w komórce gospodarza cząsteczka HLA wiążąca się do związanego z nowotworem antygenu, ulega ekspresji metodą rekombinacji.
  62. 62. Cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T według zastrz. 61, znamienne tym, że w komórce gospodarza endogennie zachodzi ekspresja cząsteczki HLA wiążącej się do związanego z nowotworem antygenu lub do jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu.
  63. 63. Cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T według któregokolwiek zastrz. 60-62, znamienne tym, że chorobą jest rak.
  64. 64. Cytolityczne lub wydzielające cytokine komórki T według któregokolwiek zastrz. 60-62 lub 63, znamienne tym, że związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
    PL 219 093 B1
    149
  65. 65. Komórka gospodarza lub jej wyciąg do zastosowania w sposobie leczenia pacjenta mającego chorobę charakteryzującą się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, przy czym wspomniane komórki gospodarza lub ich wyciąg otrzymuje się w sposobie obejmującym takie etapy, że:
    (i) identyfikuje się kwas nukleinowy, którego ekspresja zachodzi w komórkach związanych z tą chorobą, przy czy ten kwas nukleinowy wybrany jest grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c), (ii) transfekowania komórki gospodarza tym kwasem nukleinowym lub jego częścią, (iii) hodowania transfekowanej komórki gospodarza w celu ekspresji tego kwasu nukleinowego i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje wprowadzenie komórek gospodarza lub ich ekstraktu pacjentowi w ilości odpowiedniej do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej na komórki pacjenta związane z chorobą.
  66. 66. Komórka gospodarza lub jej wyciąg według zastrz. 65, przy czym sposób obejmuje ponadto identyfikowanie cząsteczki MHC prezentującej związany z nowotworem antygen lub jego część zawierającą co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów związanego z nowotworem antygenu, z komórką gospodarza w której zachodzi ekspresja zidentyfikowanej cząsteczki MHC i prezentującej związany z nowotworem antygen lub jego część.
  67. 67. Komórka gospodarza lub jej wyciąg według zastrz. 65 lub 66, w której odpowiedź immunologiczna obejmuje odpowiedź komórki B lub odpowiedź komórki T.
  68. 68. Komórka gospodarza lub jej wyciąg według zastrz. 67, w której odpowiedź immunologiczna jest odpowiedzią komórki T, obejmującą wytwarzanie cytolitycznych komórek T lub uwalniających cytokiny komórek T, które są specyficzne dla komórek gospodarza prezentujących związany z nowotworem antygen lub jego część lub specyficzne dla komórek pacjenta, w których zachodzi ekspresja związanego z nowotworem antygenu lub jego części.
  69. 69. Komórka gospodarza lub jej wyciąg według zastrz. 65-68, w której komórki gospodarza są nieproliferacyjne.
  70. 70. Komórka gospodarza lub jej wyciąg według zastrz. 65-69, gdzie chorobą jest rak.
  71. 71. Komórka gospodarza lub jej wyciąg według zastrz. 65-69 lub 70 gdzie związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  72. 72. Komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu do zastosowania w sposobie leczenia choroby charakteryzującej się ekspresją lub nieprawidłową ekspresją związanego z nowotworem antygenu, które to komórki otrzymuje się sposobem obejmującym takie etapy że:
    (i) identyfikuje się komórki od pacjenta, u którego zachodzi ekspresja nieprawidłowych ilości związanego z nowotworem antygenu (ii) izoluje się próbkę tych komórek, i (iii) hoduje się te komórki; i przy czym wspomniany sposób leczenia obejmuje takie etapy, że wprowadza się te komórki do pacjenta w ilości odpowiedniej do wyzwolenia odpowiedzi immunologicznej na te komórki, przy czym wspomniany związany z nowotworem antygen mający sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy, jest wybrany z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr: 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  73. 73. Komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu według zastrz. 62 gdzie chorobą jest rak.
  74. 74. Komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu według zastrz. 72 lub 73 w których związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
    150
    PL 219 093 B1
  75. 75. Kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającego się z SEQ ID Nr: 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  76. 76. Kwas nukleinowy, który koduje białko lub polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasów wybrana z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  77. 77. Cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, która zawiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 75 lub 76.
  78. 78. Cząsteczka zrekombinowanego DNA według zastrz. 77, która jest wektorem.
  79. 79. Cząsteczka zrekombinowanego DNA według zastrz. 78, znamienna tym, że wektor jest wektorem wirusowym lub bakteriofagiem.
  80. 80. Cząsteczka zrekombinowanego DNA według któregokolwiek z zastrz. 77-79, która ponadto zawiera sekwencję kontrolną ekspresji kontrolującą ekspresję kwasu nukleinowego lub region promotorowy który pochodzi z sekwencji kwasu nukleinowego wybranej z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119.
  81. 81. Cząsteczka zrekombinowanego DNA według zastrz. 80, znamienna tym, że sekwencje kontrolne ekspresji są homologiczne lub heterologiczne w stosunku do kwasu nukleinowego.
  82. 82. Komórka gospodarza, która zwiera kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 75 lub 76 lub zrekombinowaną cząsteczkę DNA jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. 77-81.
  83. 83. Komórka gospodarza według zastrz. 82, która zawiera ponadto kwas nukleinowy kodujący cząsteczkę HLA.
  84. 84. Białko lub polipeptyd, które są kodowane przez kwas nukleinowy jak zdefiniowano w zastrz. 75.
  85. 85. Białko lub polipeptyd, które zawierają sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  86. 86. Przeciwciało, który wiąże się specyficznie do białka lub do polipeptydu, lub związanego z nowotworem antygenu, przy czym białko lub polipeptyd lub związany z nowotworem antygen kodowane są przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  87. 87. Przeciwciało według zastrz. 86, gdzie wspomniane przeciwciało jest sprzężone z czynnikiem terapeutycznym lub diagnostycznym do zastosowania w sposobie leczenia, diagnozowania lub monitorowania choroby charakteryzującej się nieprawidłową ekspresją związanego nowotworem antygenu, gdzie wspomniany związany z nowotworem antygen posiada sekwencję kodowana przez kwas nukleinowy, który wybrany jest z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  88. 88. Przeciwciało według zastrz. 86 lub 87, w którym białko, polipeptyd lub związany z nowotworem antygen zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  89. 89. Przeciwciało według któregokolwiek z zastrz. 86-88 które jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała.
  90. 90. Przeciwciało, które wiąże się selektywnie do kompleksu:
    (i) białka lub polipeptydu lub jego części zawierającej co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów tego białka lub polipeptydu i
    PL 219 093 B1
    151 (ii) cząsteczki MHC, do której wiąże się białko lub polipeptyd lub jego część, z przeciwciałem, które nie wiąże się do samego (i) lub (ii) i to białko lub polipeptyd kodowane są przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z :
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w rygorystycznych warunkach, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  91. 91. Przeciwciało, według zastrz. 90, w którym białko lub polipeptyd zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z SEQ ID nr 16-19, 111-116, 118, 120 i 137.
  92. 92. Przeciwciało, według zastrz. 90 lub 91, które jest przeciwciałem monoklonalnym, chimerycznym lub humanizowanym lub fragmentem przeciwciała.
  93. 93. Produkt sprzęgania przeciwciała jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrz. 86 lub 88-92 i czynnika terapeutycznego lub diagnostycznego.
  94. 94. Produkt sprzęgania według zastrz. 93, w którym czynnik terapeutyczny lub diagnostyczny jest toksyną.
  95. 95. Zestaw do wykrywania ekspresji lub nieprawidłowej ekspresji związanego z nowotworem antygenu, znamienny tym, że zestaw zawiera czynniki do detekcji:
    (i) kwasu nukleinowego kodującego ten związany z nowotworem antygen, (ii) związanego z nowotworem antygenu lub jego części, (iii) przeciwciała, które wiążą się do związanego z nowotworem antygenu, i/lub (iv) komórek T, które są specyficzne dla kompleksu związanego z nowotworem antygenu lub jego części i cząsteczki MHC, przy czym wspomniana część zawiera co najmniej 6 przylegających do siebie aminokwasów tego związanego z nowotworem antygenu mającego sekwencję kodowaną przez kwas nukleinowy wybrany z grupy składającej się z:
    (a) kwasu nukleinowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy składającej się z SEQ ID Nr 7, 8, 117 i 119, (b) kwasu nukleinowego, który hybrydyzuje z kwasem nukleinowym (a) w ostrych warunkach hybrydyzacji, (c) kwasu nukleinowego, który jest zdegenerowany względem kwasu nukleinowego (a) lub (b), i (d) kwasu nukleinowego, który jest komplementarny do kwasu nukleinowego (a), (b) lub (c).
  96. 96. Zestaw według zastrz. 95, znamienny tym, że czynniki do wykrywania kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen są cząsteczkami kwasu nukleinowego do selektywnej amplifikacji tego kwasu nukleinowego.
  97. 97. Zestaw według zastrz. 96, znamienny tym, że cząsteczki kwasu nukleinowego do selektywnej amplifikacji kwasu nukleinowego zawierają sekwencję 6-50 przylegających do siebie nukleotydów kwasu nukleinowego, który koduje związany z nowotworem antygen.
PL392311A 2002-11-22 2003-11-21 Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji PL219093B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10254601A DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2002-11-22 Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL392311A1 PL392311A1 (pl) 2010-11-22
PL219093B1 true PL219093B1 (pl) 2015-03-31

Family

ID=32240310

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392311A PL219093B1 (pl) 2002-11-22 2003-11-21 Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub rozpoczęcia choroby, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, komórka gospodarza lub jej wyciąg, komórki z ekspresją związanego z nowotworem antygenu, kwas nukleinowy, cząsteczka zrekombinowanego DNA lub RNA, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania i zestaw do wykrywania ekspresji
PL392310A PL219043B1 (pl) 2002-11-22 2003-11-21 Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T do zastosowania w sposobie leczenia, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji
PL377240A PL219018B1 (pl) 2002-11-22 2003-11-21 Kompozycja farmaceutyczna, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji antygenu

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392310A PL219043B1 (pl) 2002-11-22 2003-11-21 Kompozycja farmaceutyczna, kompozycja farmaceutyczna do zastosowania w leczeniu choroby, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T do zastosowania w sposobie leczenia, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji
PL377240A PL219018B1 (pl) 2002-11-22 2003-11-21 Kompozycja farmaceutyczna, czynnik do zastosowania w sposobie diagnozowania choroby nowotworowej, czynnik do zastosowania w sposobie oznaczania regresji, przebiegu lub początku choroby nowotworowej, cytolityczne lub wydzielające cytokinę komórki T, kwas nukleinowy, komórka gospodarza, białko lub polipeptyd, przeciwciało, produkt sprzęgania przeciwciała i zestaw do wykrywania ekspresji antygenu

Country Status (21)

Country Link
US (7) US7527933B2 (pl)
EP (27) EP2400018B1 (pl)
JP (7) JP2006516190A (pl)
KR (7) KR101551621B1 (pl)
CN (4) CN106581694A (pl)
AU (2) AU2003282101B2 (pl)
BR (1) BR0316435A (pl)
CA (2) CA2505757A1 (pl)
CY (1) CY1117786T1 (pl)
DE (1) DE10254601A1 (pl)
ES (2) ES2583754T3 (pl)
HK (1) HK1165480A1 (pl)
HU (1) HUE027825T2 (pl)
IL (7) IL168168A (pl)
MX (2) MXPA05005423A (pl)
NZ (4) NZ539649A (pl)
PL (3) PL219093B1 (pl)
PT (1) PT2400018T (pl)
SG (3) SG2012077905A (pl)
SI (1) SI2400018T1 (pl)
WO (1) WO2004047863A2 (pl)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
GB0307403D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
GB0307428D0 (en) 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
DE10344799A1 (de) * 2003-09-26 2005-04-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
US20050221339A1 (en) 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
DE102004023187A1 (de) * 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
DE102004024617A1 (de) * 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
AU2011256897B2 (en) * 2004-05-18 2013-09-19 Astellas Pharma Inc. Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
US7892755B2 (en) 2004-08-30 2011-02-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Screening method
US7968287B2 (en) 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
DE102005013846A1 (de) * 2005-03-24 2006-10-05 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
AU2014208256B2 (en) * 2005-11-24 2016-01-14 Astellas Pharma Inc. Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2016202322B2 (en) * 2005-11-24 2018-03-08 Astellas Pharma Inc. Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
WO2007081387A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices, methods of use, and kits for performing diagnostics
WO2007133710A2 (en) 2006-05-11 2007-11-22 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices and methods of use thereof
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
WO2008021123A1 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008039941A2 (en) * 2006-09-27 2008-04-03 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dpt. Of Health And Human Services Scgb3a2 as a growth factor and anti-apoptotic agent
EP2862579B1 (en) * 2006-10-04 2017-05-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor immunity
US7951781B2 (en) * 2006-11-02 2011-05-31 University Of Iowa Research Foundation Methods and compositions related to PLUNC surfactant polypeptides
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
EP2060583A1 (en) * 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
WO2010036652A1 (en) * 2008-09-23 2010-04-01 Thomas Jefferson University Cancer vaccines against mucosal antigens and methods of making and using the same
US8528589B2 (en) 2009-03-23 2013-09-10 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
EP2486409A1 (en) 2009-10-09 2012-08-15 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
TWI483736B (zh) 2009-10-23 2015-05-11 Millennium Pharm Inc 抗－ｇｃｃ抗體分子及其相關之組合物及方法
WO2011079176A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
CA2789425C (en) 2010-02-12 2020-04-28 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis with polymerase error correction
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
EP2547695B1 (en) * 2010-03-16 2018-05-09 Biontech Protein Therapeutics GmbH Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2
EP2622103B2 (en) 2010-09-30 2022-11-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sandwich assays in droplets
EP2673614B1 (en) 2011-02-11 2018-08-01 Raindance Technologies, Inc. Method for forming mixed droplets
US9150852B2 (en) 2011-02-18 2015-10-06 Raindance Technologies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US10913781B2 (en) 2011-04-08 2021-02-09 Tufts Medical Center, Inc. Pepducin design and use
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
EP3216872B1 (en) 2011-06-02 2020-04-01 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
CN102526703B (zh) * 2012-01-18 2013-11-13 广东医学院司法鉴定中心 一种鼻咽癌相关易感基因yh1蛋白的制备方法及其应用
WO2013120089A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Raindance Technologies, Inc. Molecular diagnostic screening assay
HUE046404T2 (hu) 2012-04-27 2020-02-28 Millennium Pharm Inc GCC elleni ellenanyag-molekulák és alkalmazásuk GCC-t célzó terápiára való érzékenység tesztelésére
EP2844768B1 (en) 2012-04-30 2019-03-13 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2013167153A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
RU2678127C2 (ru) 2012-11-13 2019-01-23 Бионтех Аг Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
EP2986762B1 (en) 2013-04-19 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
EP3090063B1 (en) 2013-12-31 2019-11-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detection of latent retrovirus
PL3105309T3 (pl) 2014-02-13 2019-11-29 Basf Se Proszek i granulka, sposób wytwarzania takiego proszku i granulki oraz ich zastosowanie
WO2015124138A1 (de) * 2014-02-20 2015-08-27 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Tumor-assoziierte antigene und genprodukte in der diagnose und therapie
CN107750279A (zh) * 2015-03-16 2018-03-02 个人基因组诊断公司 核酸分析系统和方法
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
EP3374386B1 (en) 2015-11-13 2024-05-29 Oasis Pharmaceuticals, LLC Protease-activated receptor-2 modulators
CN105463094B (zh) * 2015-12-29 2018-09-07 北京泱深生物信息技术有限公司 直肠腺癌的诊治标记物
US11927591B2 (en) 2016-08-02 2024-03-12 Georgetown University Methods of identifying novel proteins and antigens in cancer cells
US10998178B2 (en) 2017-08-28 2021-05-04 Purdue Research Foundation Systems and methods for sample analysis using swabs
CN110862454B (zh) 2018-08-27 2022-12-30 南京圣和药业股份有限公司 一种抗Claudin18_2抗体及其应用
AU2020217012A1 (en) 2019-02-01 2021-08-19 Novarock Biotherapeutics, Ltd. Anti-claudin 18 antibodies and methods of use thereof
WO2021111003A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 SOTIO a.s. Humanized cldn18.2 antibodies
KR20220119117A (ko) 2019-12-23 2022-08-26 소티오 바이오테크 에이.에스. 종양 특이적 claudin 18.2 항체
KR20230016212A (ko) * 2020-05-25 2023-02-01 쑤저우 트랜스센타 테라퓨틱스 컴퍼니 리미티드 항-cldn18.2 항체 및 이의 진단 용도
WO2022043974A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 World Biotech Regenerative Medical Group Limited Personalized immunogenic compositions and methods for producing and using same
CN114181944B (zh) * 2020-09-14 2023-10-03 中国科学院动物研究所 突变基因及构建短肢性侏儒症小型猪模型的方法和用途
WO2022122709A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 Sotio Biotech A.S. Antibody-drug conjugates based on humanized cldn18.2 antibodies
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
IL302894A (en) 2020-12-23 2023-07-01 Sotio Biotech A S CLAUDIN 18.2 tumor-specific antibody-drug conjugates

Family Cites Families (245)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US4956556A (en) 1988-11-14 1990-09-11 Siemens Analytical X-Ray Instruments, Inc. Radiation scintillation detector
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6020145A (en) 1989-06-30 2000-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Methods for determining the presence of carcinoma using the antigen binding region of monoclonal antibody BR96
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
CA2070995A1 (en) 1989-12-27 1991-06-28 Thomas E. Kmiecik Diagnostic probe for detecting human stomach cancer
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
GB9019812D0 (en) 1990-09-11 1990-10-24 Scotgen Ltd Novel antibodies for treatment and prevention of infection in animals and man
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
FR2697752B1 (fr) 1992-11-10 1995-04-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions antitumorales contenant des dérivés du taxane.
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5589579A (en) * 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
WO2000075316A1 (en) 1999-06-02 2000-12-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
WO2001004311A1 (en) 1999-07-07 2001-01-18 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
WO1997025426A2 (en) * 1996-01-11 1997-07-17 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
US5939265A (en) * 1996-11-05 1999-08-17 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the lung
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
GB9704444D0 (en) * 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
US20070224663A1 (en) 1997-03-07 2007-09-27 Human Genome Sciences, Inc. Human Secreted Proteins
US7368531B2 (en) 1997-03-07 2008-05-06 Human Genome Sciences, Inc. Human secreted proteins
US7411051B2 (en) 1997-03-07 2008-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to HDPPA04 polypeptide
WO2000078961A1 (en) 1999-06-23 2000-12-28 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030073129A1 (en) 1998-09-01 2003-04-17 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030022298A1 (en) 1997-09-15 2003-01-30 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020127584A1 (en) 1997-09-18 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030166104A1 (en) 1997-09-18 2003-09-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20050196832A1 (en) 1997-09-18 2005-09-08 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030027272A1 (en) 1997-09-18 2003-02-06 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030008352A1 (en) 1997-09-18 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030170794A1 (en) 1997-09-18 2003-09-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7160985B2 (en) * 1997-10-29 2007-01-09 Genentech, Inc. Pro180 polypeptide
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US20030022835A1 (en) 1998-04-29 2003-01-30 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US20030040471A1 (en) 1998-04-29 2003-02-27 Watson James D. Compositions isolated from skin cells and methods for their use
US6852318B1 (en) * 1998-05-08 2005-02-08 The Regents Of The University Of California Methods for detecting and inhibiting angiogenesis
JP3428441B2 (ja) 1998-05-15 2003-07-22 エーザイ株式会社 タイトジャンクション構成膜蛋白質クローディンファミリー
EP1082459A4 (en) * 1998-05-21 2002-09-25 Diadexus Inc DIAGNOSTIC, MONITORING AND STADIFICATION TECHNIQUE FOR LUNG CANCER
US7351543B2 (en) 1998-06-02 2008-04-01 Genentech, Inc. Antibodies to a polypeptide encoded by a nucleic acid underexpressed in melanoma
US7319008B2 (en) 1998-06-02 2008-01-15 Genentech, Inc. Nucleic acid underexpressed in melanoma
JP2002517222A (ja) * 1998-06-11 2002-06-18 スミスクライン ビーチャム コーポレーション Ｇｐｒ３５ａ受容体
US7339033B2 (en) 1998-06-26 2008-03-04 Genentech, Inc. Pro1481
AU4857999A (en) * 1998-07-02 2000-01-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neurotransmission associated proteins
EP1104486A4 (en) 1998-08-04 2002-07-17 Diadexus Llc NEW METHOD FOR DIAGNOSIS, FOLLOW-UP, AND IMAGE OF LUNG CANCER
NZ531664A (en) 1998-09-01 2005-07-29 Genentech Inc Pro1317 polypeptides and sequences thereof with homology to the semaphorin B glycoprotein family
US20050181478A1 (en) 1998-09-01 2005-08-18 Baker Kevin P. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030187191A1 (en) 1998-09-01 2003-10-02 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030082626A1 (en) 1998-09-01 2003-05-01 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7538086B2 (en) 1998-09-01 2009-05-26 Genentech, Inc. PRO1303 polypeptides
JP2002524103A (ja) 1998-09-16 2002-08-06 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド 胃ポリペプチドｚｓｉｇ２８
AU5922999A (en) 1998-09-16 2000-04-03 Genentech Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6355623B2 (en) * 1998-09-24 2002-03-12 Hopital-Sainte-Justine Method of treating IBD/Crohn's disease and related conditions wherein drug metabolite levels in host blood cells determine subsequent dosage
EP1119620A2 (en) * 1998-10-06 2001-08-01 Curagen Corporation Polynucleotides coding for secreted polypeptides. some having similarity to syncollin or claudin or cytokine. their therapeutic uses
US7399834B2 (en) 1998-10-07 2008-07-15 Genentech, Inc. Anti-PRO1558 antibodies
AU1450900A (en) 1998-10-21 2000-05-08 Arch Development Corporation Methods of treatment of type 2 diabetes
CA2348824A1 (en) * 1998-10-28 2000-05-25 Human Genome Sciences, Inc. 12 human secreted proteins
US7026449B2 (en) 1999-01-05 2006-04-11 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
KR20010104373A (ko) 1999-03-08 2001-11-24 제넨테크, 인크. 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법
US7465785B2 (en) 1999-03-08 2008-12-16 Genentech, Inc. Polypeptide encoded by a nucleic acid over-expressed in melanoma
KR20030002292A (ko) 1999-03-08 2003-01-08 제넨테크, 인크. 분비 및 막횡단 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 핵산
US7507404B2 (en) 1999-03-08 2009-03-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2361221A1 (en) 1999-03-23 2000-09-28 Genentech, Inc. Novel protein which induces chondrocyte differentiation
JP2004507202A (ja) 1999-03-31 2004-03-11 キュラジェン　コーポレイション ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸；「ｏｒｆｘ」
US20080286821A1 (en) 1999-05-14 2008-11-20 Eaton Dan L Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU3246100A (en) 1999-06-02 2000-12-28 Genentech Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
ATE478145T1 (de) 1999-06-02 2010-09-15 Genentech Inc Sekretierte und transmembran polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren
CA2373915A1 (en) 1999-06-02 2000-12-07 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
ATE449109T1 (de) 1999-06-15 2009-12-15 Genentech Inc Sekretierte und transmembran-polypeptide sowie nukleinsäuren zu deren kodierung
WO2001012660A2 (en) * 1999-08-17 2001-02-22 Sagami Chemical Research Center HUMAN PROTEINS HAVING HYDROPHOBIC DOMAINS AND DNAs ENCODING THESE PROTEINS
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies
AU1205901A (en) * 1999-10-14 2001-04-23 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, The Tumor antigen derived gene-16 (tadg-16): a novel extracellular serine protease and uses thereof
CA2391455A1 (en) 1999-12-01 2001-06-07 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6380362B1 (en) 1999-12-23 2002-04-30 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Polynucleotides, polypeptides expressed by the polynucleotides and methods for their use
EP1244784A2 (en) 2000-01-06 2002-10-02 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting neoplastic cell growth
WO2001055326A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001055309A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001237958A1 (en) * 2000-01-31 2001-08-07 Human Genome Sciences, Inc. 22 human secreted proteins
US20030044890A1 (en) 2000-01-31 2003-03-06 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
AU2001241656A1 (en) * 2000-02-17 2001-08-27 Diadexus, Inc. Methods for diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating lung cancer via lung cancer specific genes
CA2401070A1 (en) * 2000-02-22 2001-08-30 Corixa Corporation Compositions and methods for diagnosis and therapy of malignant mesothelioma
AU6802801A (en) * 2000-03-01 2001-09-24 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001070979A2 (en) 2000-03-21 2001-09-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits, and method for identification, assessment, prevention and therapy of ovarian cancer
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides
CA2405563A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2001260847A1 (en) 2000-05-24 2001-12-03 Genesis Research And Development Corporation Limited Compositions isolated from skin cells and methods for their use
JP2004506413A (ja) * 2000-06-23 2004-03-04 ジェネンテック・インコーポレーテッド 血管形成に関与する疾患の診断と治療のための組成物と方法
CA2406649A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
WO2002002621A2 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Zymogenetics, Inc. Mammalian secreted proteins
EP1354040A2 (en) * 2000-07-20 2003-10-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2634294A1 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Production of humanized antibodies in transgenic animals
JP2004519215A (ja) 2000-08-15 2004-07-02 イミュネックス・コーポレーション クローディンポリペプチド
AU2001285047A1 (en) * 2000-08-16 2002-02-25 Chiron Corporation Human genes and gene expression products
WO2002018576A2 (en) * 2000-08-28 2002-03-07 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to lung specific genes
CA2419979A1 (en) 2000-09-08 2002-03-14 Schering Corporation Mammalian genes; related reagents and methods
JP2004537254A (ja) * 2000-09-15 2004-12-16 インサイト・ゲノミックス・インコーポレイテッド 輸送体及びイオンチャネル
AU2001292728A1 (en) 2000-09-18 2002-03-26 Thomas Jefferson University Compositions and methods for identifying and targeting stomach and esophageal cancer cells
JP2004520821A (ja) * 2000-10-26 2004-07-15 ディアデクサス インコーポレーテッド 肺特異的遺伝子およびタンパク質に関する組成物および方法
US7229960B2 (en) * 2000-11-03 2007-06-12 University Of Vermont And State Agricultural College Methods and compositions for inhibiting GRB7
TWI313299B (en) 2000-11-30 2009-08-11 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
WO2002061087A2 (en) * 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
WO2002068579A2 (en) 2001-01-10 2002-09-06 Pe Corporation (Ny) Kits, such as nucleic acid arrays, comprising a majority of human exons or transcripts, for detecting expression and other uses thereof
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1368499A2 (en) 2001-01-29 2003-12-10 Phase-1 Molecular Toxicology Inc. Rat toxicologically relevant genes and uses thereof
JP3948702B2 (ja) 2001-02-14 2007-07-25 社団法人畜産技術協会 ウシのＣｌａｕｄｉｎ−１６欠損症タイプ２の遺伝子診断法
JP2004526441A (ja) * 2001-02-26 2004-09-02 アリーナ・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド 内因性および非内因性型ヒトｇタンパク質共役受容体
US20030109434A1 (en) * 2001-03-19 2003-06-12 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of kidney cancer
US20030152939A1 (en) 2001-04-09 2003-08-14 Glennda Smithson Novel secreted proteins and polynucleotides encoding them
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2003000249A (ja) 2001-05-10 2003-01-07 Daiichi Fine Chemical Co Ltd クローディンによるＭＴ−ＭＭＰｓを介したｐｒｏＭＭＰ−２活性化
CA2449042A1 (en) 2001-05-30 2002-12-27 Biomedical Center In silico screening for phenotype-associated expressed sequences
WO2002098889A2 (en) * 2001-06-05 2002-12-12 Exelixis Inc. MAP3Ks AS MODIFIER OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
US20030148264A1 (en) 2001-07-06 2003-08-07 Genentech, Inc. Phage displayed PDZ domain ligands
CA2457424A1 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Arbor Vita Corporation Molecular interactions in cells
US20030018183A1 (en) 2001-12-06 2003-01-23 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
CA2379661A1 (en) 2002-03-28 2003-09-28 Kursad Turksen Paracellular drug delivery system
AU2003240495A1 (en) 2002-06-04 2003-12-19 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
WO2004029629A1 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Janssen Pharmaceutica N.V. N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses
BRPI0314814C1 (pt) 2002-09-27 2021-07-27 Xencor Inc anticorpo compreendendo uma variante de fc
CN1703243B (zh) 2002-10-10 2011-05-04 默克专利有限公司 针对erb-b1受体的药物组合物
CN101928344B (zh) 2002-10-17 2014-08-13 根马布股份公司 抗cd20的人单克隆抗体
EP1578365A4 (en) 2002-11-14 2009-09-23 Arbor Vita Corp MOLECULAR INTERACTIONS IN NEURONS
DE10254601A1 (de) 2002-11-22 2004-06-03 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1430902A1 (en) 2002-12-20 2004-06-23 Mondobiotech Laboratories Anstalt Pharmaceutical composition of interferon gamma with molecular diagnostics for the improved treatment of asthma bronchiale
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2004063355A2 (en) 2003-01-10 2004-07-29 Protein Design Labs, Inc. Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of matastatic cancer
US7393531B2 (en) * 2003-01-21 2008-07-01 Arius Research Inc. Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of MCSP
BRPI0410338A (pt) 2003-05-31 2006-05-30 Micromet Ag composição farmacêutica compreendendo um constructo de anticorpo biespecìfico para epcam, processo para sua produção, uso de um constructo biespecìfico, kit contendo o mesmo e método para a prevenção, tratamento ou alìvio de uma doença tumoral
AU2004242846A1 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-CD3, anti-CD19 antibody constructs for the treatment of B-cell related disorders
US20060019256A1 (en) 2003-06-09 2006-01-26 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
WO2005032495A2 (en) 2003-10-03 2005-04-14 Bayer Pharmaceuticals Corporation Gene expression profiles and methods of use
ES2358427T3 (es) 2003-10-16 2011-05-10 Micromet Ag Elementos de unión a cd-3 desinmunizados multiespecíficos.
DE10354601B3 (de) 2003-11-21 2005-06-23 Chiropro Gmbh Gelenkprothese für Fingerglieder
WO2005052182A2 (en) 2003-11-26 2005-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem A method of analyzing plasma membrane protein content of cells
WO2005061548A1 (en) 2003-12-23 2005-07-07 Nono Inc. Polypeptides for modulating binding of trp channel proteins and trp-associated proteins.
WO2005076939A2 (en) 2004-02-09 2005-08-25 University Of Kentucky Research Foundation Assay and method for diagnosing and treating alzheimer’s disease
CA2557181A1 (en) 2004-02-26 2005-09-09 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in muscle cells
KR20060134216A (ko) 2004-04-16 2006-12-27 에미스페어 테크놀로지스, 인코포레이티드 활성제 전달을 위한 8-(2-히드록시페녹시)옥틸디에탄올아민및 그의 염
US20050255041A1 (en) 2004-05-13 2005-11-17 Arius Research, Inc. Cancerous disease modifying antibodies
DE102004024617A1 (de) 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
EP1766412B1 (en) 2004-05-21 2009-04-01 The Institute for Systems Biology Compositions and methods for quantification of serum glycoproteins
WO2006023121A1 (en) 2004-07-27 2006-03-02 Ohio University Diagnosis of hyperinsulinemia and type ii diabetes and protection against same based on genes differentially expressed in white adipose tissue (13)
DE102004042822A1 (de) 2004-08-31 2006-03-16 Technische Universität Dresden Verbindungen und Methoden zur Behandlung, Diagnose und Prognose bei Pankreaserkrankungen
FR2876705B1 (fr) 2004-10-19 2008-12-12 Biomerieux Sa Procede pour le diagnostic d'une intolerance a l'aspirine
US20070072175A1 (en) 2005-05-13 2007-03-29 Biogen Idec Ma Inc. Nucleotide array containing polynucleotide probes complementary to, or fragments of, cynomolgus monkey genes and the use thereof
WO2007005800A1 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Abbott Laboratories Endoprosthesis having foot extensions
CA2613482A1 (en) 2005-07-01 2007-02-15 Arbor Vita Corporation Methods and compositions for diagnosis and treatment of influenza
US7931902B2 (en) 2005-08-15 2011-04-26 Genentech, Inc. Gene disruptions, compositions and methods relating thereto
EP1929003A4 (en) 2005-08-31 2009-04-29 Cell Signaling Technology Inc REAGENTS FOR DETECTION OF PROTEIN PHOSPORYLATION IN CARCINOMA SIGNALING PATHWAYS
AU2006288348B2 (en) 2005-09-08 2012-05-03 Medinet Co., Ltd. Method for activation treatment of antigen-presenting cell
BRPI0616211A2 (pt) 2005-09-19 2011-06-14 Veridex Llc mÉtodos para o diagnàstico de cÂncer pancreÁtico
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
CA2625403A1 (en) 2005-10-17 2007-04-26 Institute For System Biology Tissue-and serum-derived glycoproteins and methods of their use
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
EP2527370A1 (en) 2005-12-21 2012-11-28 Amgen Research (Munich) GmbH Compounds having resistance to soluble CEA
WO2007090670A1 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Micromet Ag Treatment of metastatic breast cancer
US7678373B2 (en) 2006-02-10 2010-03-16 Genentech, Inc. Anti-FGF19 antibodies and methods using same
US20070264193A1 (en) 2006-03-29 2007-11-15 Genentech, Inc. Diagnostics and treatments for tumors
WO2008013948A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Cell Signaling Technology, Inc. Tyrosine phosphorylation sites
EP2520935A3 (en) 2006-08-09 2013-02-13 Homestead Clinical Corporation Organ-specific proteins and methods of their use
US8450057B2 (en) 2006-08-14 2013-05-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Diagnostic tests using gene expression ratios
SG174826A1 (en) 2006-09-19 2011-10-28 Novartis Ag Biomarkers of target modulation, efficacy, diagnosis and/or prognosis for raf inhibitors
WO2008043561A2 (en) 2006-10-11 2008-04-17 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Influenza targets
EP2097538A4 (en) 2006-12-07 2011-11-30 Switchgear Genomics TRANSCRIPTION REAGULATION ELEMENTS OF BIOLOGICAL PATHS, TOOLS AND METHODS
EP2104734A2 (en) 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
US20100021886A1 (en) 2007-02-01 2010-01-28 Yixin Wang Methods and Materials for Identifying the Origin of a Carcinoma of Unknown Primary Origin
EP1970384A1 (en) 2007-03-14 2008-09-17 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
US20090004213A1 (en) 2007-03-26 2009-01-01 Immatics Biotechnologies Gmbh Combination therapy using active immunotherapy
EP1983002A3 (en) 2007-04-19 2009-03-11 Peter Hornbeck Tyrosine phosphorylation sites and antibodies specific for them
EP1997832A1 (en) 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
US20090227533A1 (en) 2007-06-08 2009-09-10 Bader Andreas G miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention
JPWO2008152822A1 (ja) 2007-06-15 2010-08-26 株式会社メディネット 医薬
WO2009008992A2 (en) 2007-07-06 2009-01-15 Osi Pharmaceuticals Inc. Combination anti-cancer therapy comprising an inhibitor of both mtorc1 and mt0rc2
US20100292303A1 (en) 2007-07-20 2010-11-18 Birrer Michael J Gene expression profile for predicting ovarian cancer patient survival
WO2009035497A2 (en) 2007-08-08 2009-03-19 Savidge Tor C Disease related cysteine modifications and uses thereof
EP2036987A1 (en) 2007-09-17 2009-03-18 Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Molecular markers for tumor cell content in tissue samples
AU2008301694B2 (en) 2007-09-19 2013-07-18 Suntory Holdings Limited Compositions Containing Sesamin-Class Compound(s) and Arachidonic Acid Class Compound(s)
JP2011501662A (ja) 2007-10-12 2011-01-13 ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン タイト結合を開放するための方法
US8563515B2 (en) 2007-11-19 2013-10-22 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Tight junction protein modulators and uses thereof
JP5596559B2 (ja) 2008-01-28 2014-09-24 メディミューン リミテッド 安定化アンジオポエチン２抗体とその用途
CA2726817A1 (en) 2008-06-02 2009-12-10 Nsabp Foundation, Inc. Identification and use of prognostic and predictive markers in cancer treatment
EP2303926A1 (en) 2008-06-20 2011-04-06 Oklahoma Medical Research Foundation Immunogenic memapsin 2 -secretase peptides and methods of use
JP2011529172A (ja) 2008-07-25 2011-12-01 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング モノクローナル抗体によるレセプター結合飽和を測定する方法
US20110190380A1 (en) 2008-10-23 2011-08-04 Elena Feinstein Methods for delivery of sirna to bone marrow cells and uses thereof
CN101381524A (zh) 2008-10-24 2009-03-11 南开大学 单层氧化石墨与水溶性高分子增强复合材料
RS56989B1 (sr) 2008-11-07 2018-05-31 Amgen Res Munich Gmbh Lečenje pedijatrijske akutne limfoblastne leukemije
WO2010059543A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use
GB0904957D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Tumour gene profile
US20120028816A1 (en) 2009-03-31 2012-02-02 Warren Stephen T Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated with autism spectrum disorders
CN101584860A (zh) 2009-04-27 2009-11-25 西安杰诺瓦生物科技有限公司 重组人Claudin18.2肿瘤疫苗及其制备方法
WO2010141093A2 (en) 2009-06-04 2010-12-09 The University Of Maryland, Baltimore Co-signaling methods for treating cancers
EP2483813A1 (en) 2009-10-01 2012-08-08 Chipdx LLC System and method for classification of patients
CN111875703A (zh) 2009-11-11 2020-11-03 安斯泰来制药股份有限公司 密蛋白6(cldn6)特异性的抗体
CN102858999A (zh) 2009-12-01 2013-01-02 简要生物科学有限公司 癌症的分类
WO2011090005A1 (ja) 2010-01-19 2011-07-28 協和発酵キリン株式会社 大腸癌の治療用医薬および治療方法
EP2547695B1 (en) 2010-03-16 2018-05-09 Biontech Protein Therapeutics GmbH Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2
EP2366709A1 (en) 2010-03-16 2011-09-21 BioNTech AG Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-proteins
US8945847B2 (en) 2010-05-24 2015-02-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Methods and kits for ascertaining biosafety of an agent
WO2011154139A2 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Gene expression markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
US20130157891A1 (en) 2010-06-24 2013-06-20 Xiao-Jun Li Organ specific diagnostic panels and methods for identification of organ specific panel proteins
WO2012070014A2 (en) 2010-11-26 2012-05-31 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Identification of novel cell surface markers for pancreatic progenitor cells and definite endodermal cells
JP5319023B2 (ja) 2011-01-12 2013-10-16 森永乳業株式会社 免疫調節作用を有する乳を産生する食餌のスクリーニング法
DE102011005235B4 (de) 2011-03-08 2017-05-24 Sirs-Lab Gmbh Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten
AU2013243947A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
WO2013167153A1 (en) 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2013174403A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014025198A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 Lfa3 변이체 및 상기 변이체 또는 lfa3 cd2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
WO2014025199A2 (ko) 2012-08-09 2014-02-13 주식회사 한독 스테필로코칼 엔테로톡신 유래의 초항원 변이체 및 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도
US20150299797A1 (en) 2012-08-24 2015-10-22 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods relating to blood-based biomarkers of breast cancer
US20140073524A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (ptsd)
US9856532B2 (en) 2012-09-07 2018-01-02 Institute For Systems Biology Markers and methods for detecting posttraumatic stress disorder (PTSD)
RU2678127C2 (ru) 2012-11-13 2019-01-23 Бионтех Аг Агенты для лечения экспрессирующих клаудин раковых заболеваний
WO2014127785A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014146672A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
JP6241403B2 (ja) 2014-10-24 2017-12-06 横浜ゴム株式会社 リン酸変性ポリマー

Also Published As

Publication number Publication date
EP2400005A3 (de) 2012-08-01
EP2400006A2 (de) 2011-12-28
EP2400000A3 (de) 2012-07-25
ES2675785T3 (es) 2018-07-12
CN103381274A (zh) 2013-11-06
EP2400003A3 (de) 2012-08-01
MX344216B (es) 2016-12-07
EP2400018A3 (de) 2012-05-02
EP2400011A3 (de) 2012-07-25
EP2399996B1 (de) 2017-09-06
EP2400005A2 (de) 2011-12-28
EP2400009A2 (de) 2011-12-28
US20060035852A1 (en) 2006-02-16
PL219018B1 (pl) 2015-02-27
EP2400004A3 (de) 2012-08-01
EP2400007A3 (de) 2012-07-25
CN103381274B (zh) 2016-08-03
PL392310A1 (pl) 2010-11-22
EP2400008A2 (de) 2011-12-28
KR20050083962A (ko) 2005-08-26
EP2400001B1 (de) 2018-02-28
HUE027825T2 (en) 2016-11-28
US8637012B2 (en) 2014-01-28
JP2013046626A (ja) 2013-03-07
CN106581694A (zh) 2017-04-26
JP2011136999A (ja) 2011-07-14
SI2400018T1 (sl) 2016-08-31
EP3348570A1 (de) 2018-07-18
IL231295A0 (en) 2014-04-30
PL377240A1 (pl) 2006-01-23
EP2400019A3 (de) 2012-06-06
JP2006516190A (ja) 2006-06-29
US20090155817A1 (en) 2009-06-18
KR20140114464A (ko) 2014-09-26
AU2010202440A1 (en) 2010-07-01
JP2017206551A (ja) 2017-11-24
EP2399995A2 (de) 2011-12-28
SG2012077905A (en) 2017-04-27
US20150337052A1 (en) 2015-11-26
JP5904478B2 (ja) 2016-04-13
EP2399997A3 (de) 2012-08-08
US8586047B2 (en) 2013-11-19
SG10201705641SA (en) 2017-08-30
IL231297A0 (en) 2014-04-30
EP2399995A3 (de) 2012-08-08
MXPA05005423A (es) 2005-08-03
EP2400018B1 (de) 2016-05-04
EP2400002A2 (de) 2011-12-28
EP2400009A3 (de) 2012-07-25
US7527933B2 (en) 2009-05-05
EP2399998A2 (de) 2011-12-28
KR20130135402A (ko) 2013-12-10
EP2400013A2 (de) 2011-12-28
AU2003282101A1 (en) 2004-06-18
CN1714150A (zh) 2005-12-28
EP2400015A3 (de) 2012-04-18
EP2400010A3 (de) 2012-07-25
NZ590225A (en) 2012-07-27
EP2400012A3 (de) 2012-04-11
NZ595896A (en) 2013-03-28
EP2400017A2 (de) 2011-12-28
US20140186338A1 (en) 2014-07-03
EP2399996A2 (de) 2011-12-28
KR20120006072A (ko) 2012-01-17
JP5726422B2 (ja) 2015-06-03
US20170320963A1 (en) 2017-11-09
EP2399999A2 (de) 2011-12-28
PL219043B1 (pl) 2015-03-31
EP2400011A2 (de) 2011-12-28
EP2400004A2 (de) 2011-12-28
IL231296A0 (en) 2014-04-30
IL168168A (en) 2014-09-30
HK1165480A1 (zh) 2012-10-05
JP2015063531A (ja) 2015-04-09
EP2400013A3 (de) 2012-04-11
AU2010202440B2 (en) 2012-11-01
EP2400017A3 (de) 2012-05-02
ES2583754T3 (es) 2016-09-22
KR20170031804A (ko) 2017-03-21
PT2400018T (pt) 2016-08-02
IL201278A0 (en) 2011-08-01
EP2400006A3 (de) 2012-07-25
EP2400007A2 (de) 2011-12-28
PL392311A1 (pl) 2010-11-22
EP2400016A2 (de) 2011-12-28
EP2400003A2 (de) 2011-12-28
EP2400000A2 (de) 2011-12-28
JP2010178740A (ja) 2010-08-19
CN1714150B (zh) 2011-03-02
CN101966337A (zh) 2011-02-09
IL201278A (en) 2014-09-30
EP2399996A3 (de) 2012-07-25
KR101483736B1 (ko) 2015-01-16
CY1117786T1 (el) 2017-05-17
KR101718117B1 (ko) 2017-03-20
EP2400001A2 (de) 2011-12-28
EP2399998A3 (de) 2012-07-25
EP2399997A2 (de) 2011-12-28
EP2400019A2 (de) 2011-12-28
CA3000243A1 (en) 2004-06-10
KR20150027313A (ko) 2015-03-11
EP2399999A3 (de) 2012-07-25
JP6182127B2 (ja) 2017-08-16
US8088588B2 (en) 2012-01-03
KR101604788B1 (ko) 2016-03-18
EP2400015A2 (de) 2011-12-28
EP1563068B1 (de) 2018-04-25
WO2004047863A3 (de) 2005-01-06
US10414824B2 (en) 2019-09-17
IL231294A0 (en) 2014-04-30
IL231298A0 (en) 2014-04-30
EP2400016A3 (de) 2012-05-02
EP2400002A3 (de) 2012-08-01
DE10254601A1 (de) 2004-06-03
EP2400001A3 (de) 2012-08-01
CA2505757A1 (en) 2004-06-10
KR20120123592A (ko) 2012-11-08
BR0316435A (pt) 2005-10-11
SG180019A1 (en) 2012-05-30
CA3000243C (en) 2023-01-03
KR101507976B1 (ko) 2015-04-07
EP2400018A2 (de) 2011-12-28
US20090208498A1 (en) 2009-08-20
US20120258091A1 (en) 2012-10-11
WO2004047863A2 (de) 2004-06-10
NZ539649A (en) 2009-09-25
EP2400010A2 (de) 2011-12-28
EP2400012A2 (de) 2011-12-28
EP2400014A3 (de) 2012-05-02
NZ578130A (en) 2011-02-25
EP2400008A3 (de) 2012-07-25
KR101551621B1 (ko) 2015-09-08
JP2016104800A (ja) 2016-06-09
EP1563068A2 (de) 2005-08-17
AU2003282101B2 (en) 2010-03-11
EP2400014A2 (de) 2011-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101718117B1 (ko) 종양에서 특이적으로 발현되는 유전 산물 및 그의 용도
CA2563666C (en) Differentially expressed claudin-18 variants in tumors and use thereof
AU2016203425C1 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof
AU2017201358A1 (en) Genetic products differentially expressed in tumors and the use thereof