JP6182127B2 - 腫瘍において示差的に発現する遺伝子産物およびその利用 - Google Patents

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Description

学際的なアプローチおよび古典的治療手順の徹底的な使用にも拘わらず、癌はいまだに死の主な原因である。より最近の治療の考え方は患者の免疫系を、組換え腫瘍ワクチンおよびその他の特定の手法、例えば抗体療法を用いて治療全体の考え方に導入することをねらいとする。かかる戦略の成功のための必要条件は、そのエフェクター機能が介入により増強されるべき患者の免疫系による腫瘍特異的または腫瘍関連抗原あるいはエピトープの認識である。腫瘍細胞はその起源である非悪性細胞と生物学的にかなり異なっている。その差は腫瘍発達の際に獲得した遺伝的変化によるものであり、その結果、とりわけ癌細胞において質または量が変化した分子構造が形成される。腫瘍担持宿主の特異的免疫系によって認識されるこの種の腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原とよばれる。腫瘍関連抗原の特異的認識は細胞性および体液性メカニズムを含み、これらは２つの機能的に相互接続した単位である：ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球はＭＨＣ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）クラスＩＩおよびＩ分子に提示されたプロセシングされた抗原をそれぞれ認識し、Ｂリンパ球はプロセシングされていない抗原に直接に結合する循環性の抗体分子を産生する。腫瘍関連抗原の潜在的な臨床治療的重要性は、免疫系による腫瘍細胞上の抗原の認識がヘルパーＴ細胞の存在下での細胞障害性エフェクター機構の開始を導き、癌細胞の排除を導きうるという事実に起因する（Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ４：５２５−３１、１９９８）。したがって腫瘍免疫学の主な目的は分子的にこれらの構造を規定することである。これら抗原の分子特性は長い間謎であった。適切なクローニング技術の開発によって初めて、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（ｖａｎ ｄｅｒＢｒｕｇｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１６４３−７、１９９１）の標的構造を分析することにより、あるいは循環性自己抗体をプローブとして用いることにより（Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：７０９−１６、１９９７）、腫瘍関連抗原について系統的に腫瘍のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることが可能となった。この目的のために、ｃＤＮＡ発現ライブラリーが新鮮な腫瘍組織から調製され、好適な系においてタンパク質として組換え的に発現された。患者から単離された免疫エフェクター、即ち、腫瘍特異的溶解パターンを示すＣＴＬクローンあるいは循環性自己抗体がそれぞれの抗原のクローニングに利用された。
近年、非常に多数の抗原がこれらアプローチによって様々な新形成において規定されている。しかし、上記の古典的方法において抗原同定のために利用されるプローブは、通常既に進展した癌を有する患者からの免疫エフェクター（循環性自己抗体またはＣＴＬクローン）である。多くのデータが、腫瘍は例えば、Ｔ細胞の寛容化および反応不顕性化（ａｎｅｒｇｉｚａｔｉｏｎ）を導くことができ、そして、疾患の経過において、特に有効な免疫認識をもたらしうる特異性が免疫エフェクターレパートリーから失われるということを示している。現在の患者の研究は、以前に発見され利用されてきた腫瘍関連抗原の真の作用の確かな証拠を未だにもたらしていない。したがって、自発的免疫応答を誘発するタンパク質が誤った標的構造を有するということを排除することは出来ない。
本発明の目的は癌の診断および治療のための標的構造を提供することにあった。
本発明によると、この目的は請求の範囲記載の主題によって達成される。
本発明によると、腫瘍に関連して発現する抗原およびそれをコードする核酸の同定および提供のための戦略が追求された。この戦略は臓器特異的に発現する特定の遺伝子、例えば結腸、肺または腎臓組織にてもっぱら発現する遺伝子は、それぞれの臓器の腫瘍細胞において、そしてさらにその他の組織の腫瘍細胞において異所的に禁じられた態様で再活性化されるという事実に基づく。まず、データマイニングによりできるだけ完全にすべての既知の臓器特異的遺伝子をとりだす。これらは次いで様々な腫瘍におけるその異常な活性化について特異的ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析によって評価される。データマイニングは腫瘍関連遺伝子の同定のための公知の方法である。しかしこの常套方法において、正常組織ライブラリーのトランスクリプトームがコンピュータにより腫瘍組織ライブラリーから通常差し引かれ、残った遺伝子が腫瘍特異的であると予想される（Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ． ２７：４２５１−６０、１９９９； Ｖａｓｍａｔｚｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９５：３００−４、１９９８； Ｓｃｈｅｕｒｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：４０３７−４３、２０００）。
しかしより有効であることが判明した本発明の概念は、すべての臓器特異的遺伝子をコンピュータにより抽出するためにデータマイニングを利用することおよび該遺伝子の腫瘍における発現を評価することに基づく。
本発明はしたがって一つの態様において、腫瘍において示差的に発現する組織特異的遺伝子を同定する戦略に関する。該戦略は、公共の配列ライブラリーのデータマイニング（「インシリコ」）とそれに続く実験室での（「ウェットベンチ」）研究の評価を組み合わせるものである。
本発明によると、２種類のバイオインフォマティックスクリプト（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ｓｃｒｉｐｔｓ）に基づく組み合わせ戦略により、新規腫瘍遺伝子の同定が可能となった。これらは以前に純粋に臓器特異的であると分類されたものである。これら遺伝子が腫瘍細胞において異常に活性化しているという知見により、それら遺伝子に実質的に新規の機能予測をともなう性質が割り当てられるようになる。本発明によると、これら腫瘍関連遺伝子およびそれらによってコードされる遺伝子産物は、免疫原性作用とは独立に同定及び提供された。
本発明によって同定された腫瘍関連抗原は以下からなる群から選択される核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する：
（ａ）配列番号１−８、４１−４４、５１−５９、８４、１１７および１１９からなる群から選択される核酸配列を
含む核酸、その一部または誘導体、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）の核酸にハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸と縮重する核酸、および、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸と相補的な核酸。
好適な態様において、本発明によって同定される腫瘍関連抗原は配列番号１−８、４１−４４、５１−５９、８４、１１７および１１９からなる群から選択される核酸によってコードされるアミノ酸配列を有する。さらに好適な態様において、本発明によって同定される腫瘍関連抗原は配列番号９−１９、４５−４８、６０−６６、８５、９０−９７、１００−１０２、１０５、１０６、１１１−１１６、１１８、１２０、１２３、１２４および１３５−１３７からなる群から選択されるアミノ酸配列、その一部または誘導体を含む。
本発明は一般に、本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分または誘導体、それをコードする核酸または該コード核酸に対する核酸、あるいは本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分または誘導体に対する抗体の、治療および診断のための使用に関する。この利用は診断、治療および進行管理における個々のものに関するだけでなく、２以上のかかる抗原、機能的断片、核酸、抗体などの組み合わせ、そして一つの態様においてその他の腫瘍関連遺伝子および抗原との組み合わせにも関する。
治療および／または診断に好適な疾患は１または複数の本発明によって同定される腫瘍関連抗原が選択的に発現または異常に発現している疾患である。
本発明はまた、腫瘍細胞に関連して発現する核酸および遺伝子産物にも関する。
さらに、本発明は既知の遺伝子の選択的スプライシング（スプライスバリアント）または選択的オープンリーディングフレームを用いる変化した翻訳によって産生される遺伝子産物、即ち核酸およびタンパク質またはペプチドに関する。この態様において、本発明は配列表の配列番号３−５による配列からなる群から選択される核酸配列を含む核酸に関する。さらに、この態様において、本発明は配列表の配列番号１０および１２−１４による配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチドに関する。本発明のスプライスバリアントは腫瘍疾患の診断および治療のための標的として本発明にしたがって利用できる。
特に、本発明は配列表の配列番号１０によるアミノ酸配列に関し、これは本発明により同定される選択的オープンリーディングフレームによりコードされ、以前に記載されたタンパク質配列（配列番号９）と、タンパク質のＮ末端におけるさらなる８５アミノ酸において異なる。
全く異なる機構によりスプライスバリアントが産生され、例えば、以下が挙げられる
−異なる転写開始部位の利用
−さらなるエキソンの利用
−１または２あるいはそれ以上のエキソンの完全または不完全なスプライシング、
−スプライス制御配列の突然変異による変化（欠失または新たな供与／受容配列の作成）、
−イントロン配列の不完全な除去。
遺伝子の選択的スプライシングにより異なる転写産物配列（スプライスバリアント）が生じる。その変化した配列の領域におけるスプライスバリアントの翻訳の結果、元のタンパク質とは構造および機能において顕著に異なる変化したタンパク質が生じる。腫瘍関連スプライスバリアントにより腫瘍関連転写産物および腫瘍関連タンパク質／抗原が生じうる。これらは腫瘍細胞の検出および腫瘍の治療標的化のための分子マーカーとして利用できる。腫瘍細胞の、例えば、血液、血清、骨髄、痰、気管支洗浄液、分泌液および組織診における検出は、本発明にしたがって行うことが出来、例えば、スプライスバリアント特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅による核酸の抽出後に行うことが出来る。特に、プライマー対はオリゴヌクレオチドとして好適であり、その少なくとも一方はストリンジェントな条件下で腫瘍関連スプライスバリアント領域に結合する。本発明によると、実施例においてこの目的で記載されるオリゴヌクレオチドが好適であり、特に、配列表の配列番号３４−３６、３９、４０、および１０７−１１０から選択される配列を有するまたは含むオリゴヌクレオチドが好適である。本発明によると、すべての配列依存的検出系が検出に好適である。それらは、ＰＣＲは別として、例えば、遺伝子チップ／マイクロアレイ系、ノザンブロット、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（ＲＤＡ）その他が挙げられる。すべての検出系は共通して、検出は少なくとも１つのスプライスバリアント特異的核酸配列との特異的ハイブリダイゼーションに基づく。しかし、腫瘍細胞はスプライスバリアントによってコードされる特異的エピトープを認識する抗体によって、本発明にしたがって検出されうる。該抗体は該スプライスバリアントに特異的な免疫化ペプチドを用いて調製できる。この態様において、本発明は特に、配列表の配列番号１７−１９、１１１−１１５、１２０、および１３７から選択される配列を有するまたは含むペプチドおよびそれに特異的な抗体に関する。免疫化に好適なのは特にそのエピトープが健康細胞において好適に産生される遺伝子産物のバリアントと顕著に異なるアミノ酸である。抗体による腫瘍細胞の検出は患者から単離したサンプルに対して行うことが出来、あるいは静脈内投与した抗体の撮像として行うことが出来る。診断用途に加えて、新しいまたは異なるエピトープを有するスプライスバリアントは免疫療法の魅力的な標的である。本発明のエピトープは治療的に活性なモノクローナル抗体またはＴリンパ球の標的化に用いることが出来る。受動免疫療法において、スプライスバリアント特異的エピトープを認識する抗体またはＴリンパ球が養子免疫伝達される。その他の抗原の場合のように、抗体をかかるエピトープを含むポリペプチドの利用により標準技術によって作成することが出来る（動物の免疫化、組換え抗体単離のパニング戦略）。あるいは該エピトープを含むオリゴまたはポリペプチドをコードする核酸を免疫化に用いることも出来る。エピトープ特異的Ｔリンパ球の作成のためのインビトロまたはインビボでの多くの技術が知られており詳細に記載されており（例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒ ＪＨ、ｅｔ ａｌ． ２００１、Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、１９９７）、おそらくスプライスバリアント特異的エピトープを含むオリゴまたはポリペプチドまたは該オリゴまたはポリペプチドをコードする核酸の使用に基づく。スプライスバリアント特異的エピトープを含むオリゴまたはポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸は医薬上活性な物質として能動免疫療法（ワクチン化、ワクチン療法）にも用いることが出来る。
本発明はまた、正常及び腫瘍組織において二次修飾の性質および程度が異なるタンパク質も記載する（例えば、Ｄｕｒａｎｄ ＆ Ｓｅｔａ、２０００； Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４６： ７９５−８０５； Ｈａｋｏｍｏｒｉ、１９９６； Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６： ５３０９−１８）。
タンパク質修飾の分析はウェスタンブロットにて行うことが出来る。特に、原則として数ｋＤａのサイズを有するグリコシル化の結果標的タンパク質の全質量が増加し、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離することが出来る。特異的Ｏ−およびＮ−グリコシド結合の検出のために、タンパク質溶解液をＳＤＳを用いた変性の前にＯ−またはＮ−グリコシラーゼとインキュベートする（それぞれ製造業者の指示にしたがう。例えば、ＰＮｇａｓｅ、エンドグリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。その後、ウェスタンブロットを行う。標的タンパク質のサイズが低下している場合は特異的グリコシル化がグリコシダーゼとのインキュベーション後に検出することが出来、したがって修飾の腫瘍特異性が分析できる。腫瘍細胞および健康細胞において示差的にグリコシル化されたタンパク質領域が特に興味深い。かかるグリコシル化の差はしかしこれまでにいくつかの細胞表面タンパク質について記載されているに過ぎない（例えば、Ｍｕｃ１）。
本発明によると、腫瘍におけるクローディン１８についての示差的グリコシル化を検出することが出来た。胃腸癌、膵臓癌、食道腫瘍、前立腺腫瘍および肺腫瘍は低レベルにてグリコシル化された形態のクローディン１８を有する。健康組織におけるグリコシル化はクローディン１８のタンパク質エピトープをマスクし、このエピトープはグリコシル化の欠失によって腫瘍細胞上では被覆されない。これに対応して本発明によるとこれらドメインに結合するリガンドおよび抗体を選択することが出来る。本発明によるかかるリガンドおよび抗体は健康細胞上のクローディン１８には結合しない。というのは健康細胞上ではエピトープがグリコシル化によって被覆されているからである。
腫瘍関連スプライスバリアント由来のタンパク質エピトープについて上記したように、示差的グリコシル化を用いて診断および治療目的で正常細胞と腫瘍細胞を識別することが出来る。
一つの態様において、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原を認識し、本発明によって同定される腫瘍関連抗原発現または異常発現を有する細胞に好ましくは選択的な剤を含む医薬組成物に関する。特定の態様において、該剤は細胞死の誘導、細胞増殖の低減、細胞膜の障害またはサイトカインの分泌をもたらし得、好ましくは腫瘍阻害活性を有する。一つの態様において、剤は腫瘍関連抗原をコードする核酸に選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸である。さらなる態様において、剤は腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体、特に補体活性化または毒素結合抗体であって腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体である。さらなる態様において、剤はそれぞれ選択的に、その少なくとも１つが本発明によって同定される腫瘍関連抗原である異なる腫瘍関連抗原を認識する２以上の剤を含む。認識には直接に抗原の活性または発現の阻害を伴う必要はない。本発明のこの態様において、腫瘍に選択的に限定される抗原は好ましくはエフェクター機構のこの特異的位置への動員のための標的として役立つ。好適な態様において、剤はＨＬＡ分子上の抗原を認識し、こうして標識された細胞を溶解する細胞障害性Ｔリンパ球である。さらなる態様において、剤は腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体でありしたがって自然または人工エフェクター機構を該細胞に動員する。さらなる態様において、剤はその他の細胞の該抗原を特異的に認識するエフェクター機能を増強するヘルパーＴリンパ球である。
一つの態様において、本発明は本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または活性を阻害する剤を含む医薬組成物に関する。好適な態様において、剤は腫瘍関連抗原をコードする核酸に選択的にハイブリダイズするアンチセンス核酸である。さらなる態様において、剤は腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体である。さらなる態様において、剤は、少なくともその１つが本発明によって同定される腫瘍関連抗原である異なる腫瘍関連抗原の発現または活性をそれぞれ選択的に阻害する２以上の剤を含む。
本発明はさらに投与された際にＨＬＡ分子と本発明によって同定される腫瘍関連抗原からのペプチドエピトープとの複合体の量を選択的に増加させる剤を含む医薬組成物に関する。一つの態様において、剤は１または複数の以下からなる群から選択される成分を含む：
（ｉ）腫瘍関連抗原またはその部分、
（ｉｉ）該腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸、
（ｉｉｉ）該腫瘍関連抗原またはその部分を発現する宿主細胞、および、
（ｉｖ）該腫瘍関連抗原からのペプチドエピトープとＭＨＣ分子との単離複合体。
一つの態様において、剤はＭＨＣ分子とそれぞれ異なる腫瘍関連抗原のペプチドエピトープとの複合体の量を選択的に増加させる２以上の剤を含み、ここで腫瘍関連抗原の少なくとも１つは本発明によって同定される腫瘍関連抗原である。
本発明はさらに１または複数の以下からなる群から選択される成分を含む医薬組成物に関する：
（ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分、
（ｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸、
（ｉｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分に結合する抗体、
（ｉｖ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸、
（ｖ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分を発現する宿主細胞、および、
（ｖｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分とＨＬＡ分子との単離複合体。
本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸は医薬組成物中において発現ベクター中にプロモーターに機能的に連結させて存在させてもよい。
本発明の医薬組成物中に存在する宿主細胞は、腫瘍関連抗原またはその部分を分泌し、それを表面上に発現するものでもよいし、さらに該腫瘍関連抗原またはその該部分に結合するＨＬＡ分子を発現するものでもよい。一つの態様において、宿主細胞はＨＬＡ分子を内因的に発現する。さらなる態様において、宿主細胞はＨＬＡ分子および／または腫瘍関連抗原またはその部分を組換えにより発現する。宿主細胞は好ましくは非増殖性である。好適な態様において、宿主細胞は抗原提示細胞であり、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
本発明の医薬組成物に存在する抗体はモノクローナル抗体であるのがよい。さらなる態様において、抗体はキメラまたはヒト化抗体、天然の抗体または合成の抗体の断片であってよく、これらすべてはコンビナトリー技術によって産生できる。抗体は治療上または診断上有用な薬剤と結合させてもよい。
本発明の医薬組成物に存在するアンチセンス核酸は６−５０の配列、特に１０−３０、１５−３０および２０−３０の、本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸の連続ヌクレオチドを含むものであってよい。
さらなる態様において、直接または核酸の発現を介して本発明の医薬組成物によって提供される腫瘍関連抗原またはその部分は細胞表面のＭＨＣ分子に結合し、該結合は好ましくは細胞溶解性応答の誘発および／またはサイトカイン放出の誘導をもたらす。
本発明の医薬組成物は医薬上許容される担体および／またはアジュバントを含むものでもよい。アジュバントは、サポニン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧヌクレオチド、ＲＮＡ、サイトカインまたはケモカインから選択すればよい。本発明の医薬組成物は好ましくは腫瘍関連抗原の選択的発現または異常発現によって特徴づけられる疾患の治療に用いられる。好適な態様において、疾患は癌である。
本発明はさらに１または複数の腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患の治療または診断方法にも関する。一つの態様において、治療は本発明の医薬組成物の投与を含む。
一つの態様において、本発明は、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患の診断方法に関する。該方法は患者から単離した生物学的サンプルにおける、以下の検出を含む：
（ｉ）腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸の検出、および／または、（ｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分の検出、および／または
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分に対する抗体の検出、および／または
（ｉｖ）腫瘍関連抗原またはその部分に特異的な細胞障害性またはヘルパーＴリンパ球の検出。
特定の態様において、検出は以下の工程を含む：
（ｉ）生物学的サンプルを、腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸、該腫瘍関連抗原または該その部分、腫瘍関連抗原またはその部分に特異的な抗体あるいは細胞障害性またはヘルパーＴリンパ球に特異的に結合する剤と接触させる工程、および
（ｉｉ）剤と核酸またはその部分、腫瘍関連抗原またはその部分、抗体あるいは細胞障害性またはヘルパーＴリンパ球との複合体の形成を検出する工程。
一つの態様において、疾患は２以上の異なる腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられ、検出は、該２以上の異なる腫瘍関連抗原またはその部分をコードする２以上の核酸の検出、２以上の異なる腫瘍関連抗原またはその部分の検出、該２以上の異なる腫瘍関連抗原またはその部分に結合する２以上の抗体の検出または該２以上の異なる腫瘍関連抗原に特異的な２以上の細胞障害性またはヘルパーＴリンパ球の検出を含む。さらなる態様において、患者から単離した生物学的サンプルを対応する正常な生物学的サンプルと比較する。
さらなる態様において、本発明は本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患の退行、経過または発症を判定する方法に関し、該方法は、該疾患を有するか該疾患に罹患しやすい患者からのサンプルを、以下からなる群から選択される１または複数のパラメーターに関してモニタリングする工程を含む：
（ｉ）腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸の量、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分の量、
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分に結合する抗体の量、および
（ｉｖ）腫瘍関連抗原またはその部分とＭＨＣ分子との複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の量。
該方法は好ましくは第一のサンプルの第一の時点およびさらなるサンプルの第二の時点でのパラメーターを測定することを含み、ここで疾患の経過が２つのサンプルの比較によって判定される。特定の態様において、疾患は２以上の異なる腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられ、モニタリングは以下のモニタリングを含む：
（ｉ）該２以上の異なる腫瘍関連抗原またはそれらの部分をコードする２以上の核酸の量、および／または
（ｉｉ）該２以上の異なる腫瘍関連抗原またはそれらの部分の量、および／または
（ｉｉｉ）該２以上の異なる腫瘍関連抗原またはそれらの部分に結合する２以上の抗体の量、および／または
（ｉｖ）該２以上の異なる腫瘍関連抗原またはそれらの部分とＭＨＣ分子との複合体に特異的な２以上の細胞溶解性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の量。
本発明によると、核酸またはその部分の検出あるいは核酸またはその部分の量のモニタリングは該核酸または該その部分に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いて行うことが出来、あるいは該核酸または該その部分の選択的増幅によって行うことが出来る。一つの態様において、ポリヌクレオチドプローブは該核酸の連続するヌクレオチドの６−５０、特に、１０−３０、１５−３０および２０−３０の配列を含む。
特定の態様において、検出すべき腫瘍関連抗原またはその部分は細胞内または細胞表面に存在する。本発明によると、腫瘍関連抗原またはその部分の検出または腫瘍関連抗原またはその部分の量のモニタリングは、該腫瘍関連抗原または該その部分に特異的な抗体結合によって行いうる。
さらなる態様において、検出すべき腫瘍関連抗原またはその部分はＭＨＣ分子、特にＨＬＡ分子との複合体中に存在する。
本発明によると、抗体の検出または抗体の量のモニタリングは該抗体に特異的なタンパク質またはペプチドの結合を用いて行いうる。
本発明によると、抗原またはその部分とＭＨＣ分子との複合体に特異的な細胞溶解性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の検出あるいは細胞溶解性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の量のモニタリングは、該抗原または該その部分とＭＨＣ分子との複合体を提示する細胞を用いて行いうる。
検出またはモニタリングに使用されるポリヌクレオチドプローブ、抗体、タンパク質またはペプチドあるいは細胞は好ましくは検出可能な様式で標識される。特定の態様において、検出可能なマーカーは放射性マーカーまたは酵素マーカーである。さらにＴリンパ球は、その増殖、そのサイトカイン産生、およびそのＭＨＣと腫瘍関連抗原またはその部分との複合体での特異的刺激によってトリガーされる細胞障害性活性を検出することにより検出できる。Ｔリンパ球はまた１または複数の腫瘍関連抗原の特定の免疫原性断片を搭載し、特異的Ｔ細胞受容体を接触させることにより特異的Ｔリンパ球を同定しうる組換えＭＨＣ分子あるいは２以上のＭＨＣ分子の複合体を介して検出しうる。
さらなる態様において、本発明は本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患の治療、診断またはモニタリング方法に関し、該方法は、該腫瘍関連抗原またはその部分に結合し、治療または診断薬と複合化された抗体を投与することを含む。抗体はモノクローナル抗体であってよい。さらなる態様において、抗体はキメラまたはヒト化抗体あるいは天然の抗体の断片である。
本発明はまた、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患を有する患者の治療方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ｉ）該患者から免疫反応性細胞を含むサンプルを取り出す工程、
（ｉｉ）該サンプルと該腫瘍関連抗原またはその部分を発現する宿主細胞を、該腫瘍関連抗原またはその部分に対する細胞溶解性Ｔ細胞の産生に好適な条件下で接触させる工程、および、
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分を発現する細胞を溶解するのに好適な量の細胞溶解性Ｔ細胞を患者に導入する工程。
本発明はまた腫瘍関連抗原に対する細胞溶解性Ｔ細胞のＴ細胞受容体のクローニングにも関する。該受容体その他のＴ細胞に移入してもよく、それはそれによって所望の特異性を受け取り、そして（ｉｉｉ）のように、患者に導入してもよい。
一つの態様において、宿主細胞はＨＬＡ分子を内因的に発現する。さらなる態様において、宿主細胞は組換えによりＨＬＡ分子および／または腫瘍関連抗原またはその部分を発現する。宿主細胞は好ましくは非増殖性である。好適な態様において、宿主細胞は抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
さらなる態様において、本発明は腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患を有する患者の治療方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードし、該疾患に関連する細胞によって発現する核酸を同定する工程、
（ｉｉ）宿主細胞を該核酸またはその部分でトランスフェクトする工程、
（ｉｉｉ）該核酸を発現させるためにトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程（高効率のトランスフェクションが達成された場合これは必須ではない）、および、
（ｉｖ）疾患に関連する患者の細胞に対する免疫応答を上昇させるのに好適な量にて患者に宿主細胞またはその抽出物を導入する工程。
該方法はさらに腫瘍関連抗原またはその部分を提示するＭＨＣ分子を同定することも含み、ここで宿主細胞は同定されたＭＨＣ分子を発現し該腫瘍関連抗原またはその部分を提示する。免疫応答はＢ細胞応答またはＴ細胞応答のいずれでもよい。さらに、Ｔ細胞応答は腫瘍関連抗原またはその部分を提示する宿主細胞に特異的であるか、腫瘍関連抗原またはその部分を発現する患者の細胞に特異的である、細胞溶解性Ｔ細胞および／またはヘルパーＴ細胞の産生を含むものであり得る。
本発明はまた、本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患の治療方法にも関し、該方法は以下の工程を含む：
（ｉ）異常な量の腫瘍関連抗原を発現する患者からの細胞を同定する工程、
（ｉｉ）該細胞のサンプルを単離する工程、
（ｉｉｉ）該細胞を培養する工程、および、
（ｉｖ）細胞に対する免疫応答をトリガーするのに好適な量の該細胞を患者に導入する工程。
好ましくは本発明によって用いられる宿主細胞は非増殖性であるか非増殖性にされたものである。腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる疾患は特に癌である。
本発明はさらに以下からなる群から選択される核酸に関する：
（ａ）配列番号３−５からなる群から選択される核酸配列を含む核酸、その一部または誘導体、
（ｂ）（ａ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸と縮重する核酸、および、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
本発明はさらに配列番号１０および１２−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸、その一部または誘導体に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明の核酸のプロモーター配列に関する。これら配列は好ましくは発現ベクターにおいて別の遺伝子に機能的に連結していてもよく、該遺伝子の適当な細胞での選択的発現を確保してもよい。
さらなる態様において、本発明は本発明の核酸を含む組換え核酸分子、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する。
本発明はまた、本発明の核酸または本発明の核酸を含む組換え核酸分子を含む宿主細胞にも関する。
宿主細胞はＨＬＡ分子をコードする核酸を含むものでもよい。一つの態様において、宿主細胞は内因的にＨＬＡ分子を発現する。さらなる態様において、宿主細胞は組換えによりＨＬＡ分子および／または本発明の核酸またはその部分を発現する。好ましくは、宿主細胞は非増殖性である。好適な態様において、宿主細胞は抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。
さらなる態様において、本発明は、本発明により同定される核酸とハイブリダイズし、遺伝子プローブまたは「アンチセンス」分子として利用できるオリゴヌクレオチドに関する。本発明により同定される核酸またはその部分にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーまたはコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）サンプルの形態の核酸分子は、本発明により同定される核酸に相同的な核酸の発見に利用できる。ＰＣＲ増幅、サザンおよびノザンハイブリダイゼーションを相同的核酸の発見に用いることが出来る。ハイブリダイゼーションは低いストリンジェンシーで行ってもよく、より好ましくは中程度のストリンジェンシー、もっとも好ましくは高いストリンジェンシーの条件で行う。本発明による「ストリンジェントな条件」という語は、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件をいう。
さらなる態様において、本発明は以下からなる群から選択される核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに関する：
（ａ）配列番号３−５からなる群から選択される核酸配列を含む核酸、その一部または誘導体、
（ｂ）（ａ）の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の核酸と縮重する核酸、および、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の核酸と相補的な核酸。
好適な態様において、本発明は配列番号１０および１２−１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド、その一部または誘導体に関する。
さらなる態様において、本発明は本発明によって同定される腫瘍関連抗原の免疫原性断片に関する。該断片は好ましくはヒトＨＬＡ受容体またはヒト抗体に結合する。本発明の断片は好ましくは、少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０のアミノ酸の配列を有する。
この態様において、本発明は配列番号１７−１９、９０−９７、１００−１０２、１０５、１０６、１１１−１１６、１２０、１２３、１２４、および１３５−１３７からなる群から選択される配列を有するか含むペプチド、その一部または誘導体に関する。
さらなる態様において、本発明は本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分に結合する剤に関する。好適な態様において、剤は抗体である。さらなる態様において、抗体はキメラ、ヒト化抗体またはコンビナトリー技術によって産生される抗体あるいは抗体の断片である。さらに、本発明は以下の（ｉ）と（ｉｉ）の複合体に選択的に結合する抗体に関する：
（ｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分、および
（ｉｉ）本発明によって同定される腫瘍関連抗原または該その部分が結合するＭＨＣ分子、ここで該抗体は（ｉ）のみあるいは（ｉｉ）のみには結合しない。
本発明の抗体はモノクローナル抗体であってよい。さらなる態様において、抗体はキメラまたはヒト化抗体あるいは天然の抗体の断片である。
特に、本発明は、配列番号１７−１９、９０−９７、１００−１０２、１０５、１０６、１１１−１１６、１２０、１２３、１２４、および１３５−１３７からなる群から選択される配列を有するかそれを含むペプチド、その一部または誘導体に特異的に結合するかかる剤、特に抗体に関する。
本発明はさらに本発明によって同定される腫瘍関連抗原またはその部分に結合する本発明の剤または本発明の抗体と、治療または診断薬との結合体に関する。一つの態様において、治療または診断薬は毒素である。
さらなる態様において、本発明は本発明によって同定される腫瘍関連抗原の発現または異常発現の検出用キットに関し、該キットは以下の検出のための剤を含む：
（ｉ）腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸、
（ｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分、
（ｉｉｉ）腫瘍関連抗原またはその部分に結合する抗体、および／または
（ｉｖ）腫瘍関連抗原またはその部分とＭＨＣ分子との複合体に特異的なＴ細胞。
一つの態様において、核酸またはその部分の検出用の剤は該核酸の選択的増幅のための核酸分子であって、特に該核酸の６−５０、特に１０−３０、１５−３０および２０−３０の連続ヌクレオチド配列を含むものである。
発明の詳細な説明
本発明によると、腫瘍細胞において選択的または異常に発現し、腫瘍関連抗原である遺伝子が記載される。
本発明によると、これら遺伝子および／またはその遺伝子産物および／またはその誘導体および／または部分は治療アプローチのための好ましい標的構造である。概念的には、該治療アプローチは選択的に発現した腫瘍関連遺伝子産物の活性の阻害をねらうものである。これは、該異常なそれぞれの選択的発現が腫瘍病原性に機能的に重要である場合、そしてその連結に対応する細胞の選択的傷害が伴う場合に有用である。別の治療の考え方は腫瘍関連抗原を、腫瘍細胞に選択的に細胞傷害能を有するエフェクター機構を動員する標識として考えるものである。ここで、標的分子自体の機能および腫瘍発達におけるその役割は完全に無関係である。
本発明による核酸の「誘導体」とは、１または複数のヌクレオチド置換、欠失および／または付加が該核酸に存在することを意味する。さらに「誘導体」の語はまたヌクレオチド塩基、糖またはリン酸における核酸の化学的誘導体化も含む。「誘導体」の語はまた天然にはないヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログを含む核酸も含む。
本発明によると、核酸は好ましくは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。本発明による核酸はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え産生および化学合成された分子を含む。本発明によると、核酸は一本鎖でも二本鎖として存在してもよく、直鎖状でもよいし共有結合により閉環した分子であってもよい。
本発明により記載される核酸は好ましくは単離されたものである。「単離核酸」の語は、本発明によると、核酸が以下のものであることを意味する：
（ｉ）インビトロで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅されたもの、（ｉｉ）クローニングにより組換え産生されたもの、
（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画により精製されたもの、あるいは、
（ｉｖ）例えば化学合成により合成されたもの。
単離核酸は組換えＤＮＡ技術による操作を行える核酸である。
核酸は２つの配列がハイブリダイズでき、互いに安定な二本鎖を形成することが出来る場合、別の核酸と「相補的」であり、ここでハイブリダイゼーションは好ましくはポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能とする条件（ストリンジェントな条件）下で行う。ストリンジェントな条件は、例えば、以下に記載されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｅｄｉｔｏｒｓ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．、Ｅｄｉｔｏｒｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。これらによると、例えば、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中での６５℃でのハイブリダイゼーションをいう。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡをトランスファーしたメンブレンを例えば以下の条件で洗浄する：２×ＳＳＣ中、室温、その後、０．１−０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中、６８℃までの温度。
本発明によると、相補的な核酸は少なくとも４０％、特に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、そして好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％あるいは少なくとも９９％の、同一なヌクレオチドを有する。
腫瘍関連抗原をコードする核酸は、本発明によると、単独でまたはその他の核酸、特に異種核酸と組み合わせて存在してもよい。好適な態様において、核酸は、該核酸と同種であっても異種であってもよい発現制御配列または調節配列と機能的に連結している。コード配列と調節配列は、該コード配列の発現または転写が該調節配列の制御あるいは影響下となるように互いに共有結合している場合、互いに「機能的に」連結している。コード配列が翻訳されて機能的タンパク質となり、ここで調節配列が該コード配列に機能的に連結している場合、該調節配列の誘導の結果、該コード配列の転写が起こり、コード配列におけるフレームシフトは起こらず、所望のタンパク質またはペプチドへと翻訳され得ないコード配列は生じない。
「発現制御配列」または「調節配列」の語は、本発明によると、プロモーター、エンハンサーおよびその他の遺伝子発現を調節する制御要素を含む。本発明の特定の態様において、発現制御配列は制御されうる。調節配列の正確な構造は種または細胞型の関数として変化しうるが、一般にそれぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列等を含む。より具体的には、５’非転写調節配列は、機能的に連結した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。調節配列はまた、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含んでいてもよい。
したがって一方で、本明細書に記載する腫瘍関連抗原はいずれの発現制御配列およびプロモーターと組み合わせてもよい。しかし他方で、本明細書に記載する腫瘍関連遺伝子産物のプロモーターは、本発明によるとその他の遺伝子と組み合わせてもよい。これによってこれらのプロモーターの選択的活性が利用される。
本発明によると、核酸はさらに宿主細胞からの該核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチドの分泌を制御するポリペプチドをコードするその他の核酸と組み合わせて存在してもよい。本発明によると、核酸はコードされるタンパク質またはポリペプチドが宿主細胞の細胞膜にアンカーされるように、あるいは該細胞の特定のオルガネラに区画化されるようにするポリペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在してもよい。同様に、レポーター遺伝子またはいずれかの「タグ」を表すことが出来る核酸との組み合わせも可能である。
好適な態様において、本発明による組換えＤＮＡ分子は核酸、例えば本発明の腫瘍関連抗原をコードする核酸の発現を制御する適当なプロモーターとともにベクター中にあってもよい。もっとも一般的な意味において本明細書において用いる「ベクター」の語は、該核酸が、例えば、原核および／または真核細胞に導入され、適当な場合ゲノムに組み込まれるのを可能にする核酸のためのあらゆる中間媒体を含む。この種のベクターは細胞中で好ましくは複製および／または発現される。中間媒体は、例えば、エレクトロポーレーション、微粒子銃による衝撃、リポソーム投与、アグロバクテリウムによる移入またはＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを介した挿入における使用に適用される。ベクターにはプラスミド、ファージミドまたはウイルスゲノムが含まれる。
本発明によって同定される腫瘍関連抗原をコードする核酸は宿主細胞のトランスフェクションに利用できる。ここで核酸は組換えＤＮＡとＲＮＡの両方を意味する。組換えＲＮＡはＤＮＡテンプレートのインビトロ転写により調製できる。さらに、使用前に安定化配列、キャップおよびポリアデニル化によって修飾してもよい。
本発明によると、「宿主細胞」の語は外来核酸で形質転換またはトランスフェクトしうるあらゆる細胞を含む。本発明によると「宿主細胞」の語は原核（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。特に好ましいのは、哺乳類細胞、例えば、ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類由来細胞である。細胞は様々な組織タイプ由来であってよく、一次細胞および細胞株を含む。具体的な例としてはケラチン生成細胞、末梢血白血球、骨髄幹細胞および胚幹細胞が含まれる。さらなる態様において、宿主細胞は抗原提示細胞、特に、樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は宿主細胞中に単一コピーまたは２コピー以上の形態において存在し得、一つの態様において、宿主細胞中で発現される。
本発明によると、「発現」の語はもっとも広い意味で用いられ、ＲＮＡの産生またはＲＮＡとタンパク質の産生を含む。それはまた核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過的に行っても安定に行ってもよい。哺乳類細胞における好ましい発現系は、ｐｃＤＮＡ３．１およびｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含み、これらは選抜可能マーカー、例えば、Ｇ４１８に耐性を付与する遺伝子（したがって安定にトランスフェクトされた細胞株の選抜を可能にする）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンハンサー−プロモーター配列を含む。
本発明の、ＨＬＡ分子が腫瘍関連抗原またはその部分を提示する場合において、発現ベクターはまた該ＨＬＡ分子をコードする核酸配列を含んでいてもよい。ＨＬＡ分子をコードする核酸配列は腫瘍関連抗原をコードする核酸またはその部分と同一の発現ベクターに存在していてもよいし、あるいは両核酸は異なる発現ベクターに存在していてもよい。後者の場合、２つの発現ベクターを細胞に共トランスフェクトすればよい。宿主細胞が腫瘍関連抗原またはその部分またはＨＬＡ分子のいずれも発現しない場合、それらをコードする両核酸を細胞に同一の発現ベクターにおいてあるいは異なる発現ベクターにおいてトランスフェクトする。細胞が既にＨＬＡ分子を発現している場合、腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸配列のみを細胞にトランスフェクトすればよい。
本発明はまた、腫瘍関連抗原をコードする核酸の増幅のためのキットも含む。かかるキットは、例えば、腫瘍関連抗原をコードする核酸にハイブリダイズする増幅プライマーの対を含む。プライマーは好ましくは核酸の６−５０、特に、１０−３０、１５−３０および２０−３０の連続ヌクレオチドの配列を含み、プライマーダイマーが形成されないようにオーバーラップしないものである。プライマーの一方は腫瘍関連抗原をコードする核酸の一方の鎖にハイブリダイズし、他方のプライマーは腫瘍関連抗原をコードする核酸の増幅を可能とする配置において相補的な鎖にハイブリダイズする。
「アンチセンス」分子または「アンチセンス」核酸を用いて核酸の発現を制御、特に減少させることが出来る。「アンチセンス分子」または「アンチセンス核酸」の語は、本発明によると、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチドまたは修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドであって、生理条件下で特定の遺伝子を含むＤＮＡあるいは該遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズするものをいい、それによって、該遺伝子の転写および／または該ｍＲＮＡの翻訳が阻害される。本発明によると、「アンチセンス分子」はその通常のプロモーターに関して逆方向に核酸またはその部分を含むコンストラクトも含む。核酸またはその部分のアンチセンス転写産物は酵素を規定する天然のｍＲＮＡと二本鎖を形成することが出来、したがってｍＲＮＡの蓄積または活性な酵素への翻訳を阻害することが出来る。もう一つの可能性は核酸の不活化のためのリボザイムの使用である。本発明による好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは標的核酸の６−５０、特に１０−３０、１５−３０および２０−３０の連続するヌクレオチドの配列を有し、好ましくは標的核酸またはその部分に完全に相補的である。
好適な態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＮ−末端または５’上流部位、例えば、翻訳開始部位、転写開始部位またはプロモーター部位にハイブリダイズする。さらなる態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは３’非翻訳領域またはｍＲＮＡスプライシング部位にハイブリダイズする。
一つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその組み合わせからなり、一つのヌクレオチドの５’末端ともう一つのヌクレオチドの３’末端が互いにホスホジエステル結合で連結している。これらオリゴヌクレオチドは常套方法によって合成してもよいし、組換え産生してもよい。
好適な態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは「修飾」オリゴヌクレオチドである。ここで、オリゴヌクレオチドはその標的への結合能力を阻害しないで、様々に修飾して、例えば、その安定性または治療効力を上昇させてもよい。本発明によると、「修飾オリゴヌクレオチド」の語は以下のオリゴヌクレオチドを意味する：
（ｉ）少なくともそのヌクレオチドの２つが互いに合成インターヌクレオシド結合（即ち、ホスホジエステル結合ではないインターヌクレオシド結合）により連結されている、および／または
（ｉｉ）核酸において通常みられない化学基がオリゴヌクレオチドに共有結合している。
好ましい合成インターヌクレオシド結合は、ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホラミダイト、カーバメート、カーボネート、ホスフェートトリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステルおよびペプチドである。
「修飾オリゴヌクレオチド」の語はまた、共有結合により修飾された塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチドを含む。「修飾オリゴヌクレオチド」は、例えば、３’位のヒドロキシル基および５’位のホスフェート基以外の低分子量有機基に共有結合した糖残基を有するオリゴヌクレオチドである。修飾オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−アルキル化リボース残基またはリボース以外のその他の糖、例えばアラビノースを含むものでもよい。
好ましくは、本発明にしたがって記載されるタンパク質およびポリペプチドは単離されたものである。「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」の語は、タンパク質またはポリペプチドが自然環境から分離されていることを意味する。単離タンパク質またはポリペプチドは実質的に純粋な状態であり得る。「実質的に純粋な状態」という語は、タンパク質またはポリペプチドが、自然あるいはインビボでそれらが結合しているその他の物質を実質的に含まないということを意味する。
かかるタンパク質およびポリペプチドは、例えば、抗体の産生および治療薬として免疫学的または診断アッセイにおいて利用できる。本発明にしたがって記載されるタンパク質およびポリペプチドは生物学的サンプル、例えば組織または細胞ホモジネートから単離したものでもよいし、様々な原核または真核発現系において組換え発現させたものでもよい。
本発明の目的のために、タンパク質またはポリペプチドあるいはアミノ酸配列の「誘導体」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。
アミノ酸挿入バリアントはアミノ−および／またはカルボキシ−末端融合を含み、また、１または２以上のアミノ酸の特定のアミノ酸配列への挿入も含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１または複数のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されているが、結果的に得られる産物の適当なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。アミノ酸欠失バリアントは配列からの１または複数のアミノ酸の欠如によって特徴づけられる。アミノ酸置換バリアントは配列における少なくとも１残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることによって特徴づけられる。好ましくは修飾は相同的タンパク質またはポリペプチド間で保存されていないアミノ酸配列における位置のものである。好ましくは、アミノ酸を類似の特性、例えば、疎水性、親水性、電気陰性度、側鎖の大きさなどを有する別のアミノ酸で置換する（保存的置換）。保存的置換は、例えば、１つのアミノ酸の、置換すべきアミノ酸と同じ群に属する以下に挙げる別のアミノ酸による交換に関する：
１．小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）
２．負に荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）
５．大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ。
タンパク質構造のその特定の部分により、３つの残基を括弧内に示す。Ｇｌｙは側鎖を有さない唯一の残基でありしたがって鎖に柔軟性を与える。Ｐｒｏは鎖を大幅に制限する珍しい構造を有する。Ｃｙｓはジスルフィド結合を形成することが出来る。
上記のアミノ酸バリアントは公知のペプチド合成技術、例えば、固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６４）および類似の方法または組換えＤＮＡ操作によって容易に調製できる。あらかじめ決定した位置における置換突然変異の、配列既知のまたは部分的に既知のＤＮＡへの導入技術は周知であり、例えばＭ１３突然変異誘発が含まれる。置換、挿入または欠失を有するタンパク質の調製のためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９）に詳細に記載されている。
本発明によると、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「誘導体」は１または複数の酵素に関連する分子の置換、欠失および／または付加が含まれ、かかる分子としては、炭水化物、脂質および／またはタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが挙げられる。「誘導体」の語は、該タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのすべての機能的化学的同等体も含む。
本発明によると、腫瘍関連抗原の部分または断片はそれが由来するポリペプチドの機能的特性を有する。かかる機能的特性には、抗体との相互作用、その他のポリペプチドまたはタンパク質との相互作用、核酸の選択的結合および酵素活性が挙げられる。特定の特性はＨＬＡと複合体を形成する能力であり、適当な場合、免疫応答が導かれる。この免疫応答は細胞障害性またはヘルパーＴ細胞の刺激に基づきうる。本発明の腫瘍関連抗原の部分または断片は好ましくは腫瘍関連抗原の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０の連続するアミノ酸の配列を含む。
腫瘍関連抗原をコードする核酸の部分または断片は本発明によると上記のように少なくとも腫瘍関連抗原および／または該腫瘍関連抗原の部分または断片をコードする核酸の部分に関する。
腫瘍関連抗原をコードする遺伝子の単離と同定はまた、１または複数の腫瘍関連抗原の発現によって特徴づけられる疾患の診断を可能とする。これら方法は、腫瘍関連抗原をコードする１または複数の核酸を判定すること、および／またはコードされる腫瘍関連抗原および／またはそれに由来するペプチドを判定することを含む。核酸は常套方法によって判定でき、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応または標識化プローブによるハイブリダイゼーションを含む。腫瘍関連抗原またはそれに由来するペプチドは、抗原および／またはペプチドの認識について患者の抗血清をスクリーニングすることによって判定できる。それはまた、対応する腫瘍関連抗原に対する特異性について患者のＴ細胞をスクリーニングすることによっても判定できる。
本発明はまた本明細書に記載する腫瘍関連抗原に結合するタンパク質の単離も可能にし、これには抗体および該腫瘍関連抗原の細胞結合パートナーが含まれる。
本発明によると、特定の態様は腫瘍関連抗原由来の「ドミナントネガティブ」ポリペプチドを提供する。ドミナントネガティブポリペプチドは不活性タンパク質バリアントであり、細胞機構と相互作用することにより、その細胞機構との相互作用から活性のタンパク質ととってかわるか、あるいは活性のタンパク質と競合するものであり、それによって該活性のタンパク質の効果を低減させる。例えば、リガンドに結合するが、リガンドへの結合に応答してシグナルを生じないドミナントネガティブ受容体は該リガンドの生理効果を低減させうる。同様に、通常標的タンパク質と相互作用するが該標的タンパク質をリン酸化しないドミナントネガティブな触媒的に不活性なキナーゼは、細胞シグナルの応答としての該標的タンパク質のリン酸化を低減しうる。同様に、遺伝子の制御領域におけるプロモーター部位に結合するが該遺伝子の転写を上昇させないドミナントネガティブな転写因子は、転写を上昇させることなくプロモーター結合部位を占有することによって通常の転写因子の効果を低減しうる。
細胞におけるドミナントネガティブなポリペプチドの発現の結果、活性なタンパク質の機能が低下する。当業者であればタンパク質のドミナントネガティブバリアントを、例えば、常套の突然変異誘発方法そしてバリアントポリペプチドのドミナントネガティブ効果の評価によって調製することができるであろう。
本発明はまた、腫瘍関連抗原に結合するポリペプチド等の物質も含む。かかる結合性物質は、例えば、腫瘍関連抗原および腫瘍関連抗原とその結合パートナーの複合体の検出のためのスクリーニングアッセイにおいて、および該腫瘍関連抗原ならびにその結合パートナーとの複合体の精製において利用することが出来る。かかる物質は例えばかかる抗原への結合によって、腫瘍関連抗原の活性の阻害にも用いることが出来る。
本発明はそれゆえ腫瘍関連抗原に選択的に結合することが出来る結合性物質、例えば、抗体または抗体断片を含む。抗体はポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、これらは常套方法より産生される。
かかる抗体はネイティブなおよび／または変性状態におけるタンパク質を認識することが出来る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３： １８９９−１９０４、１９８９； Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３４： １０７−１１６、２０００； Ｋａｙｙｅｍ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０８： １−８、１９９２； Ｓｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２４ ： ５１−６０、１９９９）。
標的タンパク質に特異的に結合する特異的抗体を含む抗血清は様々な標準的方法で調製することが出来る；例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄｅａｎ ＩＳＢＮ０−１９−９６３７２２−９； “Ａｎｔｉｂｏｆｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” ， Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、ＩＳＢＮ： ０８７９６９３１４２および“Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ” ， Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ＩＳＢＮ ０８７９６９５４４７を参照されたい。したがってネイティブな形態において複雑な膜タンパク質を認識するアフィン（ａｆｆｉｎｅ）および特異的抗体を作成することも可能である（Ａｚｏｒｓａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２２９： ３５−４８、１９９９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３： １８９９−１９０４、１９８９； Ｇａｒｄｓｖｏｌｌ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３４： １０７−１１６、２０００）。これは特に治療的に用いられるだけでなく多くの診断用途を有する抗体の調製に関する。これに関して、全タンパク質、細胞外部分配列、また生理的に折りたたまれた形態にて標的分子を発現する細胞によって免疫することが可能である。
モノクローナル抗体は古典的にはハイブリドーマ技術を用いて調製される（技術的詳細については以下を参照されたい： “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄｅａｎ ＩＳＢＮ０−１９−９６３７２２−９； “Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ ＩＳＢＮ： ０８７９６９３１４２； “Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ”， Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ＩＳＢＮ： ０８７９６９５４４７）。
抗体分子の小さい部分、即ち、抗原結合部位だけが、抗体のそのエピトープへの結合に関与していることが知られている（以下を参考：Ｃｌａｒｋ、Ｗ．Ｒ．（１９８６）、Ｔｈｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｒｏｉｔｔ、Ｉ．（１９９１）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、７ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。ｐＦｃ’およびＦｃ領域は、例えば、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与していない。Ｆ（ａｂ’）２断片と称されるｐＦｃ’領域が酵素的に除かれた抗体またはｐＦｃ’領域を含まないように産生された抗体は、完全な抗体の両方の抗原結合部位を担持する。同様に、Ｆａｂ断片と称されるＦｃ領域が酵素的に除かれた抗体またはＦｃ領域を含まないように産生された抗体は、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を担持する。さらに、Ｆａｂ断片は共有結合した抗体の軽鎖と該抗体のＦｄと称される重鎖の部分からなる。Ｆｄ断片は主な抗体特異性の決定部分であり（一つのＦｄ断片は、抗体の特異性を変化させることなく１０までの異なる軽鎖と結合できる）、Ｆｄ断片は単離されても、エピトープへの結合能を保持する。
抗体の抗原結合部分のなかに抗原エピトープと直接相互作用する相補性決定領域（ＣＤＲ）と抗原結合部位の三次構造を維持するフレームワーク領域（ＦＲ）が位置する。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖のＦｄ断片と軽鎖の両方は４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）を含み、これは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）によって分断されている。ＣＤＲおよび、特に、ＣＤＲ３領域そして、さらに重鎖のＣＤＲ３領域が抗体特異性に非常に重要である。
哺乳類抗体の非−ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープに対する特異性を維持したまま同じまたは異なる特異性の抗体の同様の領域によって置換され得ることが知られている。これによって「ヒト化」抗体の開発が可能となり、ここで非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合して機能性の抗体が作られる。
これはいわゆる「ＳＬＡＭ」技術に用いることが出来、ここで全血からＢ細胞が単離され、細胞が単クローン化される。次いで、単一のＢ細胞の上清がその抗体特異性に関して分析される。ハイブリドーマ技術と異なり、抗体遺伝子の可変領域が単細胞ＰＣＲを用いて増幅され、好適なベクターにクローニングされる。このようにして、モノクローナル抗体の供給が加速されている（ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０７： ６１−６７、１９９７）。
別の例として、ＷＯ９２／０４３８１はヒト化マウスＲＳＶ抗体の産生と使用を記載しており、ここで少なくともマウスＦＲ領域の一部がヒト起源のＦＲ領域と置換された。この種の抗体、例えば、抗原結合能を有するインタクトな抗体の断片は「キメラ」抗体と称される。
本発明はまた、抗体のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦｄ断片ならびにキメラ抗体、ここで、Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖−ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列に置換されている、キメラＦ（ａｂ’）２−断片抗体、ここでＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖−ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列で置換されている、キメラＦａｂ−断片抗体、ここでＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖−ＣＤＲ３領域が相同のヒトまたは非ヒト配列で置換されている、そしてキメラＦｄ−断片抗体、ここでＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同のヒトまたは非ヒト配列で置換されている、を提供する。本発明はまた「一本鎖」抗体も含む。
本発明はまた、腫瘍関連抗原に特異的に結合するポリペプチドも含む。この種のポリペプチド結合性物質は、例えば、単に溶液中に固定化形態で調製されているかあるいはファージディスプレーライブラリーとして調製されるディジェネレートペプチドライブラリーにより提供され得る。１または複数のアミノ酸を有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーを調製することも同様に可能である。ペプトイドおよび非ペプチド合成残基のライブラリーも調製可能である。
ファージディスプレーは本発明の結合性ペプチドの同定に特に有効である。これについえ、例えば、４から約８０アミノ酸残基長のインサートを表す（例えば、Ｍ１３、ｆｄまたはラムダファージを使用して）ファージライブラリーを調製する。ファージを次いで腫瘍関連抗原に結合するインサートを担持するかについて選抜する。この工程は２サイクル以上繰り返してもよく、腫瘍関連抗原へ結合するファージを再選択する。繰り返すことによって、特定の配列を有するファージが濃縮される。ＤＮＡ配列の分析を行って発現するポリペプチドの配列を同定してもよい。腫瘍関連抗原に結合する配列の最も小さい直線状の部分を決定するとよい。酵母の「ツーハイブリッドシステム」を用いて腫瘍関連抗原に結合するポリペプチドを同定してもよい。本発明による腫瘍関連抗原またはその断片はファージディスプレーライブラリーを含むペプチドライブラリーのスクリーニングに用いて、腫瘍関連抗原のペプチド結合性パートナーの同定および選択をすることができる。かかる分子は、腫瘍関連抗原の機能の妨害およびその他の当業者に知られた目的のために、例えば、スクリーニングアッセイ、精製プロトコールに用いることが出来る。
上記の抗体およびその他の結合性分子を、例えば、腫瘍関連抗原を発現する組織の同定に用いることが出来る。抗体は腫瘍関連抗原を発現する細胞および組織を示すために特定の診断物質と結合させてもよい。これらは治療上有用な物質と結合させてもよい。診断物質としては、これらに限定されないが以下が含まれる：硫酸バリウム、イオセタミン酸（ｉｏｃｅｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、イオパノ酸、イポダートカルシウム、ナトリウムジアトリゾエート、メグルミンジアトリゾエート、メトリザミド、チロパノエートナトリウムおよび放射性診断薬、例えば、陽電子放射体、例えば、フッ素−１８および炭素−１１、ガンマ放出体、例えば、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１、核磁気共鳴のための核種、例えば、フッ素およびガドリニウム。本発明によると、「治療上有用な物質」との語は所望により１または複数の腫瘍関連抗原を発現する細胞に選択的に導かれるあらゆる治療用分子をいい、例えば、抗癌薬、放射性ヨウ素標識化合物、毒素、細胞増殖抑制剤または細胞溶解剤などが挙げられる。抗癌薬としては、例えば、以下が含まれる：アミノグルテチミド、アザチオプリン、硫酸ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロン−α、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、プロカルバジンＨＣｌ、チオグアニン、硫酸ビンブラスチンおよび硫酸ビンクリスチン。その他の抗癌剤は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ、“Ｔｈｅ ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９０、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ．、特に Ｃｈａｐｔｅｒ ５２ （Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｒｕｇｓ （Ｐａｕｌ Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ Ａ． Ｃｈａｂｎｅｒ））に記載されている。毒素はタンパク質、例えば、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素またはシュードモナス外毒素であってもよい。毒素残基は、高エネルギー放射性核種、例えば、コバルト−６０であってもよい。
本発明によると「患者」の語は、ヒト、非ヒト霊長類またはその他の動物、特に哺乳類、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類、例えば、マウスおよびラットをいう。特に好ましい態様において、患者はヒトである。
本発明によると、「疾患」の語は、腫瘍関連抗原が発現しているか異常に発現しているあらゆる病的状態をいう。「異常な発現」とは本発明によると、発現が健康な個体における状態と比べて変化、好ましくは上昇していることをいう。発現の上昇は、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％または少なくとも１００％の上昇をいう。一つの態様において、腫瘍関連抗原は疾患個体の組織にのみ発現しており、健康な個体における発現は抑制されている。かかる疾患の一例は癌であり、ここで「癌」の語は本発明によると、白血病、精上皮腫、メラノーマ、奇形腫、神経膠腫、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、腸癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、胃腸癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻喉（ＥＮＴ）癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移を含む。
本発明によると、生物学的サンプルは組織サンプルおよび／または細胞サンプルであってよく、本明細書に記載する様々な方法における使用のため、以下のような常套手段によって得られるものであってよい：組織診、例えば、パンチ生検、および血液、気管支吸引液、痰、尿、便またはその他の体液の採取。
本発明によると、「免疫反応性細胞」の語は、好適な刺激によって免疫細胞（例えば、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞）へと成熟しうる細胞を意味する。免疫反応性細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未熟および成熟Ｔ細胞ならびに未熟および成熟Ｂ細胞を含む。腫瘍関連抗原を認識する細胞溶解性またはヘルパーＴ細胞の産生が望ましい場合は、免疫反応性細胞を細胞溶解性Ｔ細胞およびヘルパーＴ細胞の産生、分化および／または選択に好ましい条件下で腫瘍関連抗原を発現する細胞と接触させる。抗原に曝された際のＴ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞の分化は、免疫系のクローン選択と類似である。
いくつかの治療方法は患者の免疫系の反応に基づき、その結果、抗原提示細胞、例えば１または複数の腫瘍関連抗原を提示する癌細胞の溶解が導かれる。これに関して、例えば、腫瘍関連抗原とＭＨＣ分子との複合体に特異的な自己細胞障害性Ｔリンパ球が細胞異常を有する患者に投与される。かかる細胞障害性Ｔリンパ球のインビトロでの産生は知られている。Ｔ細胞の分化方法の例は、ＷＯ−Ａ−９６３３２６５に記載されている。一般に、細胞、例えば血液細胞を含むサンプルを患者から採取し、細胞を、複合体を提示し、細胞障害性Ｔリンパ球（例えば、樹状細胞）の増殖を引き起こしうる細胞と接触させる。標的細胞はトランスフェクトされた細胞、例えばＣＯＳ細胞とすればよい。かかるトランスフェクトされた細胞はその表面に所望の複合体を提示し、細胞障害性Ｔリンパ球と接触すると、細胞障害性Ｔリンパ球の増殖を刺激する。クローン拡張された自己細胞障害性Ｔリンパ球は次いで患者に投与される。
抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球の選択の別の方法において、ＭＨＣクラスＩ分子／ペプチド複合体の蛍光発生テトラマーが、細胞障害性Ｔリンパ球の特異的クローンの検出に用いられる（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：９４−９６、１９９６； Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．８：４１３−４１６、１９９８）。可溶性ＭＨＣクラスＩ分子はβ２ミクログロブリンおよび該クラスＩ分子に結合するペプチド抗原の存在下でインビトロで折りたたまれる。ＭＨＣ／ペプチド複合体は精製され、次いでビオチン標識される。テトラマーがビオチン化ペプチド−ＭＨＣ複合体と標識化アビジン（例えば、フィコエリトリン）の混合によりモル比４：１にて形成される。テトラマーは次いで細胞障害性Ｔリンパ球、例えば末梢血またはリンパ節と接触される。テトラマーはペプチド抗原／ＭＨＣクラスＩ複合体を認識する細胞障害性Ｔリンパ球に結合する。テトラマーに結合した細胞は蛍光制御細胞ソーティングによってソートされ、反応性細胞障害性Ｔリンパ球が単離される。単離された細胞障害性Ｔリンパ球はインビトロで増殖させればよい。
養子免疫伝達と称される治療方法において（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６（５）：１９１７、１９８６； Ｒｉｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：２３８、１９９２； Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１：１４０３−１４１０、１９９１； Ｋａｓｔ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ５９：６０３−６１４、１９８９）、所望の複合体を提示する細胞（例えば、樹状細胞）は治療すべき患者の細胞障害性Ｔリンパ球と混合され、その結果、特異的細胞障害性Ｔリンパ球が増殖する。増殖した細胞障害性Ｔリンパ球は特異的複合体を提示する特定の異常細胞によって特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与される。細胞障害性Ｔリンパ球は次いで異常細胞を溶解し、それによって所望の治療効果が達成される。
しばしば患者のＴ細胞レパートリーのなかで、この種の特異的複合体に低親和性を有するＴ細胞のみが増殖できる。というのは、高親和性のものは寛容の発生のために失われてしまうためである。ここで取って代わるのはＴ細胞受容体自体の移入であろう。このためにも、所望の複合体を提示する細胞（例えば、樹状細胞）が健康な個体またはその他の種（例えば、マウス）の細胞障害性Ｔリンパ球と混合される。この結果、Ｔリンパ球が特異的複合体と以前に接触していないドナー生物由来の場合、高親和性の特異的細胞障害性Ｔリンパ球の増殖が起こる。これら増殖した特異的Ｔリンパ球の高親和性Ｔ細胞受容体がクローニングされる。高親和性Ｔ細胞受容体が他の種からクローニングされている場合、それらは様々な程度でヒト化すればよい。かかるＴ細胞受容体は次いで遺伝子移入、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって所望により患者のＴ細胞に導入される。次いで養子移入をこれら遺伝的に変化したＴリンパ球を用いて行う（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：９６２−７０、２００１； Ｋｅｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：９５７−６１、２００１）。
上記治療態様は、少なくともいくつかの患者の異常細胞が腫瘍関連抗原とＨＬＡ分子との複合体を提示するという事実から出発する。かかる細胞はそれ自体公知の方法によって同定できる。複合体を提示する細胞が同定されたら出来るだけ早く、それらを細胞障害性Ｔリンパ球を含む患者からのサンプルと混合する。細胞障害性Ｔリンパ球が複合体を提示する細胞を溶解すると、腫瘍関連抗原の存在が推定できる。
養子免疫伝達は本発明によって適用できる唯一の治療形態ではない。細胞障害性Ｔリンパ球はそれ自体公知の方法でインビボでも作ることが出来る。一つの方法では複合体を発現する非増殖性細胞を用いる。ここで用いられる細胞は通常複合体を発現する細胞、例えば、照射された腫瘍細胞または複合体の提示に必要な一方または両方の遺伝子（即ち、抗原ペプチドとそれを提示するＨＬＡ分子）をトランスフェクトされた細胞であろう。様々な細胞型を利用できる。さらに、目的の遺伝子の一方または両方を担持するベクターを使用することも可能である。特に好ましくはウイルスまたは細菌ベクターである。例えば、腫瘍関連抗原またはその部分をコードする核酸を、特定の組織または細胞型において該腫瘍関連抗原またはその断片の発現を制御するプロモーターおよびエンハンサー配列と機能的に連結させるとよい。核酸は発現ベクターに組み込んでもよい。発現ベクターは非修飾染色体外核酸、プラスミドまたはウイルスゲノムであり得、それに外来核酸を挿入すればよい。腫瘍関連抗原をコードする核酸はレトロウイルスゲノムに導入してもよく、それによって、核酸の標的組織または標的細胞のゲノムへの組込みが可能となる。かかる系において、微生物、例えば、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスが目的の遺伝子を担持し、事実上、宿主細胞に「感染」する。別の好適な形態は組換えＲＮＡの形態における腫瘍関連抗原の導入であり、これは例えば、リポソーム移入またはエレクトロポーレーションによって細胞に導入するとよい。その結果得られた細胞は目的の複合体を提示し、自己細胞障害性Ｔリンパ球に認識され、自己細胞障害性Ｔリンパ球が増殖する。
抗原提示細胞へのインビボでの取り込みを可能とするための同様の効果は腫瘍関連抗原またはその断片とアジュバントとを混合することにより達成できる。腫瘍関連抗原またはその断片は、タンパク質、（例えば、ベクター内で）ＤＮＡまたはＲＮＡとして表されうる。腫瘍関連抗原はプロセシングされてＨＬＡ分子に対するペプチドパートナーが生ずるが、その断片はさらなるプロセシングの必要なく提示されうる。後者は特に、それらがＨＬＡ分子に結合しうる場合である。完全な抗原がインビボで樹状細胞によってプロセシングされる投与形態が好ましい。というのはこれによって有効な免疫応答に必要とされるヘルパーＴ細胞応答も産生されうるからである（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ７４：７５−９、２０００；Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１８７：６９３−７０２、１９９８）。一般に、例えば皮内注射によって患者に有効量の腫瘍関連抗原を投与することが可能である。しかし、注射はリンパ節内に行うことも可能である（Ｍａｌｏｙ ｅｔ ａｌ．、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：３２９９−３０３、２００１）。それは樹状細胞への取り込みを促進する試薬と組み合わせて行うことも出来る。好ましい腫瘍関連抗原は、多くの癌患者の同種癌抗血清またはＴ細胞と反応するものを含む。しかし特に興味深いのは、自発的免疫応答が前から存在しないものに対するものである。明らかに、腫瘍を溶解しうるこれら免疫応答を誘導することが可能である（Ｋｅｏｇｈ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：７８７−９６、２００１； Ａｐｐｅｌｌａ ｅｔａｌ．、Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ １：１７７−８４、１９９５； Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２：６０３−１２、１９９５）。
本発明による医薬組成物はまた免疫化のためのワクチンとして使用することもできる。本発明によると、「免疫化」または「ワクチン接種」の語は、抗原に対する免疫応答の上昇または活性化を意味する。腫瘍関連抗原またはそれをコードする核酸の使用により癌に対する免疫効果を試験するために動物モデルを使用することができる。例えば、ヒト癌細胞をマウスに導入して腫瘍を導き、腫瘍関連抗原をコードする１または複数の核酸を投与すればよい。癌細胞に対する効果（例えば、腫瘍サイズの減少）は、核酸による免疫化の有効性のための尺度として測定すればよい。
免疫化用組成物の一部として、１または複数の腫瘍関連抗原またはその刺激性の断片を１または複数のアジュバントとともに投与して免疫応答を誘導し、あるいは免疫応答を上昇させる。アジュバントは抗原に組み込まれるか、抗原と共に投与される物質であって、免疫応答を増強させるものである。アジュバントは、抗原蓄積（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の提供（細胞外またはマクロファージ中）、マクロファージの活性化および／または特定のリンパ球の刺激によって免疫応答を増強しうる。アジュバントは公知であり、これらに限定されないが以下を含む：一リン酸化脂質Ａ（ＭＰＬ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、サポニン、例えば、ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＤＱＳ２１ （ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ； ＷＯ ９６／３３７３９）、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−Ｌ１ （Ｓｏ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ ７：１７８−１８６、１９９７）、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、ビタミンＥ、モンタニド、ミョウバン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３７４：５４６−９、１９９５参照）および生分解性油、例えば、スクアレンおよび／またはトコフェロールから調製される様々な油中水乳剤。好ましくは、ペプチドはＤＱＳ２１／ＭＰＬとの混合物として投与する。ＤＱＳ２１とＭＰＬの比は典型的には約１：１０〜１０：１であり、好ましくは約１：５〜５：１、特に約１：１である。ヒトへの投与用のワクチン製剤は典型的にはＤＱＳ２１とＭＰＬを約１μｇ〜約１００μｇの範囲で含む。
患者の免疫応答を刺激するその他の物質を投与してもよい。例えば、リンパ球に対するその調節特性からサイトカインをワクチン接種に使用するのが可能である。かかるサイトカインには、例えばインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）が含まれ、これは、ワクチンの保護作用を増強することが示されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：１４３２−１４３４、１９９５参照）、またＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８も含まれる。
免疫応答を増強し、それゆえワクチン接種に使用できる化合物が多数存在する。該化合物にはタンパク質または核酸の形態で提供される共刺激性分子が含まれる。かかる共刺激性分子の例はＢ７−１およびＢ７−２であり（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）、樹状細胞（ＤＣ）上に発現されてＴ細胞上に発現するＣＤ２８分子と相互作用する。この相互作用は抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ−刺激（シグナル１）Ｔ細胞に対して共刺激（シグナル２）を提供し、それによって該Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能が増強される。Ｂ７はまたＴ細胞上のＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）とも相互作用し、ＣＴＬＡ４およびＢ７リガンドについての研究により、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用は抗腫瘍免疫およびＣＴＬ増殖を増強しうることが示された（Ｚｈｅｎｇ、Ｐ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９５（１１）：６２８４−６２８９ （１９９８））。
Ｂ７は典型的には腫瘍細胞では発現せず、したがってＴ細胞に対する有効な抗原提示細胞（ＡＰＣ）はない。Ｂ７発現の誘導は、腫瘍細胞がより有効に細胞障害性Ｔリンパ球の増殖とエフェクター機能を刺激するのを可能にする。Ｂ７／ＩＬ−６／ＩＬ−１２の組み合わせによる共刺激により、Ｔ細胞集団におけるＩＦＮ−ガンマおよびＴｈ１−サイトカインプロフィールの誘導が明らかとなり、その結果さらにＴ細胞活性が増強される（Ｇａｊｅｗｓｋｉｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５６３７−５６４８ （１９９５））。
細胞障害性Ｔリンパ球の完全な活性化および完全なエフェクター機能には、該ヘルパーＴ細胞上のＣＤ４０リガンドと樹状細胞によって発現されるＣＤ４０分子との相互作用を介するヘルパーＴ細胞の関与が必要である（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４（１９９８）、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７８ （１９９８）、Ｓｃｈｏｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４８０ （１９９８））。この共刺激シグナルのメカニズムはおそらくＢ７産生の上昇と関係があり、該樹状細胞（抗原提示細胞）によるＩＬ−６／ＩＬ−１２産生を伴う。したがってＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用はシグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）とシグナル２（Ｂ７−ＣＤ２８）の相互作用を補充する。
樹状細胞の刺激のための抗−ＣＤ４０抗体の使用は、腫瘍抗原に対する応答を直接増強すると考えられ、これは通常炎症応答の範囲外であるか、あるいは非専門抗原提示細胞（腫瘍細胞）によって提示されるものである。かかる状況において、ヘルパーＴおよびＢ７共刺激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原でパルスされた樹状細胞に基づく治療に関係して利用されうる。
本発明はまた、核酸、ポリペプチドまたはペプチドの投与を提供する。ポリペプチドおよびペプチドはそれ自体公知の方法で投与すればよい。一つの態様において、核酸はエキソビボ方法で投与され、即ち、患者から細胞を取り出して、該細胞の遺伝子操作により腫瘍関連抗原を取り込ませ、変化した細胞を患者に再導入する。これは一般に患者の細胞への遺伝子の機能的コピーのインビトロでの導入および遺伝的に変化した細胞の患者への再導入を含む。遺伝子の機能的コピーは調節要素の機能的制御下にあり、それによって遺伝子が遺伝的に改変された細胞で発現する。トランスフェクションおよび形質導入方法は当業者に知られている。本発明はまた、ベクター、例えば、ウイルスおよび標的制御リポソームを用いることによるインビボでの核酸の投与も提供する。
好適な態様において、腫瘍関連抗原をコードする核酸の投与用のウイルスベクターは以下からなる群から選択される：アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスおよび弱毒ポックスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子。特に好ましいのはアデノウイルスおよびレトロウイルスである。レトロウイルスは典型的には複製欠損のものである（即ち、それらは感染性粒子を産生できない）。
本発明によるとインビトロまたはインビボで細胞に核酸を導入するための様々な方法を利用できる。この種の方法には以下が含まれる：核酸ＣａＰＯ４沈殿のトランスフェクション、ＤＥＡＥによる核酸トランスフェクション、目的の核酸を担持する上記ウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなど。特定の態様において、特定の細胞に核酸を送達するのが好ましい。かかる態様において、細胞への核酸の投与に用いられる担体（例えば、レトロウイルスまたはリポソーム）は結合標的制御分子を有していてもよい。例えば、分子、例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質または標的細胞上の受容体のリガンドに特異的な抗体を核酸担体に組み込むか結合すればよい。好ましい抗体は腫瘍関連抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームを介した核酸の投与が望ましい場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込んで、標的制御および／または取り込みを可能とすればよい。かかるタンパク質には、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、取り込まれるタンパク質に対する抗体、細胞内部位に案内するタンパク質等が含まれる。
本発明の治療用組成物は医薬上許容される調製物中で投与すればよい。かかる調製物は通常、医薬上許容される濃度の塩、バッファー物質、保存料、担体、補助免疫増強物質、例えば、アジュバント、ＣｐＧおよびサイトカインならびに適切な場合、治療的に活性なその他の化合物を含む。
本発明の治療的に活性な化合物はいずれの常套経路で投与してもよく、かかる経路には注射または注入によるものが含まれる。投与は例えば以下のように行えばよい：経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経皮。好ましくは、抗体は肺噴霧剤により治療的に投与する。アンチセンス核酸は好ましくは、ゆっくりと静脈内から投与する。
本発明の組成物は有効量にて投与される。「有効量」とは、単独でまたはさらなる用量とともに、所望の反応または所望の効果を達成する量をいう。１または複数の腫瘍関連抗原の発現によって特徴づけられる特定の疾患または特定の症状を治療する場合、所望の反応は疾患の経過の阻害である。これには疾患の進行の遅延が含まれ、特に、疾患の進行の妨害である。疾患または症状の治療における所望の反応は該疾患または症状の発症の遅延または発症の予防であってよい。
本発明の組成物の有効量は治療すべき症状、疾患の重症度、患者の個々のパラメーター、例えば、年齢、生理状態、身長および体重、治療期間、併用療法の種類（存在する場合）、投与の特定の経路およびそういった因子に依存する。
本発明の医薬組成物は好ましくは無菌であり、所望の反応または所望の効果を達成するために有効量の治療的に活性な物質を含む。
本発明の組成物の投与用量は様々なパラメーター、例えば、投与タイプ、患者の症状、望ましい投与期間等に依存する。患者における反応が最初の用量で不十分な場合、より高い用量（あるいは別のより局所的な投与経路により達成される有効に高い用量）を用いればよい。
一般に、１ｎｇ〜１ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ〜１００μｇの用量の腫瘍関連抗原を製剤し、治療用または免疫応答の誘導または上昇のために投与する。腫瘍関連抗原をコードする核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の投与が望ましい場合、１ｎｇ〜０．１ｍｇの用量を製剤し、投与する。
本発明の医薬組成物は、一般に医薬上許容される組成物中で医薬上許容される量を投与する。「医薬上許容される」の語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない非毒性物質をいう。この種の調製物は通常、塩、バッファー物質、保存料、担体および適当な場合はその他の治療的に活性な化合物を含む。医薬中に使用する場合、塩は医薬上許容されるものでなければならない。しかし、医薬上許容されない塩を用いて医薬上許容される塩を調製してもよく、これも本発明に含まれる。この種の薬理上および医薬上許容される塩としてはこれらに限定されないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。医薬上許容される塩はアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として調製してもよい。
本発明の医薬組成物は医薬上許容される担体を含んでいてもよい。本発明によると、「医薬上許容される担体」の語は、１または複数のヒトへの投与に好適な適合性の固体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質をいう。「担体」の語は、適用を促進するためにその中に活性成分が混合される天然または合成の有機または無機成分をいう。本発明の医薬組成物の成分は、通常、所望の医薬効果を実質的に阻害する相互作用が起こらないようなものである。
本発明の医薬組成物は好適なバッファー物質、例えば塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸および塩中のリン酸を含んでいてもよい。
医薬組成物は適当である場合、好適な保存料、例えば、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールを含んでいてもよい。
医薬組成物は通常均一な剤形において提供され、それ自体公知の方法で調製できるものである。本発明の医薬組成物はカプセル、錠剤、トローチ剤、懸濁液、シロップ、エリキシルの形態または例えば乳濁液の形態であってよい。
非経口投与に好適な組成物は通常、活性化合物の無菌の水性または非水性調製物を含み、それは好ましくはレシピエントの血液と等張である。許容される担体および溶媒の例は、リンゲル液および等張食塩水である。さらに、通常、無菌の不揮発性油が溶液または懸濁液の媒体として用いられる。
本発明を以下の図面と実施例によりさらに詳細に説明するが、これらは単に例示の目的であり、限定を意図するものではない。詳細な説明および実施例の記載により、本発明に含まれうるさらなる態様は当業者に明らかである。
図１は、結腸癌組織診におけるＧＰＲ３５ ｍＲＮＡ発現である。 図２は、正常および腫瘍組織におけるＧＵＣＹ２Ｃ ｍＲＮＡ発現の定量的ＰＣＲ分析である。 図３は、腫瘍特異的ＧＵＣＹ２Ｃスプライスバリアントの同定である。 図４は、正常肺および肺癌における選択的ＳＣＧＢ３Ａ発現である。 図５は、胃、食道、胃癌および膵臓癌におけるクローディン１８Ａ２．１発現である。 図６は、腎臓および腎臓細胞癌におけるＳＬＣ１３Ａ１発現である。 図７は、結腸、結腸癌および胃癌におけるＣＬＣＡ１発現である。 図８は、結腸および結腸癌におけるＦＬＪ２１４７７発現である。 図９は、結腸および結腸癌におけるＦＬＪ２０６９４発現である。 図１０は、胃、肺および肺癌におけるｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ発現である。 図１１は、胸腺、肺および肺癌におけるＰｌｕｎｃ発現である。 図１２は、肺、肺癌および甲状腺におけるＳＬＣ２６Ａ９発現である。 図１３は、胃、卵巣、肺および肺癌におけるＴＨＣ１００５１６３発現である。 図１４は、腎臓および腎臓細胞癌におけるＬＯＣ１３４２８８発現である。 図１５は、腎臓および腎臓細胞癌におけるＴＨＣ９４３８６６発現である。 図１６は、結腸および結腸癌におけるＦＬＪ２１４５８発現である。 図１７は、ＧＰＲ３５の細胞内局在である。 図１８は、ＧＰＲ３５の定量的発現である。 図１９は、ＧＵＣＹ２Ｃの定量的発現である。 図２０は、ＳＣＧＢ３Ａ２の定量的発現である。 図２１は、ＳＣＧＢ３Ａ２−特異的抗体による免疫蛍光である。 図２２は、クローディン１８スプライスバリアントの模式図である。 図２３は、クローディン−１８、バリアントＡ１の定量的発現である。 図２４は、クローディン１８、バリアントＡ２の定量的発現である。 図２５は、クローディン１８Ａ２−特異的抗体（細胞外ドメイン）の使用である。 図２６は、クローディン１８Ａ２−特異的抗体（細胞外ドメイン）の使用である。 図２７は、クローディン１８のＣ−末端細胞外ドメインに対する抗体の使用である。 図２８は、クローディン１８Ａ１−特異的抗体の使用である。 図２９は、ウェスタンブロットにおけるクローディン１８Ａ２の検出である。 図３０は、胃および胃腫瘍からのサンプルでのクローディン１８Ａ２ウェスタンブロッティングである。 図３１は、肺腫瘍におけるクローディン１８の発現である。 図３２は、胃腫瘍組織におけるクローディン１８Ａ２−特異的抗体を用いるクローディン１８の免疫組織化学分析である。 図３３は、クローディン１８−特異的ポリクローナル抗血清による胃−特異的Ｓｎｕ１６細胞の間接的免疫蛍光である。 図３４は、ＳＬＣ１３Ａ１の定量的発現である。 図３５は、ＳＬＣ１３Ａ１の細胞内局在である。 図３６は、ＣＬＣＡ１の定量的発現である。 図３７は、ＦＬＪ２１４７７の定量的発現である。 図３８は、ＦＬＪ２０６９４の定量的発現である。 図３９は、ＦＬＪ２１４５８の定量的発現である。 図４０は、ＦＬＪ２１４５８−特異的抗体による免疫蛍光である。 図４１は、配列である。
図面の簡単な説明
図１は、結腸癌組織診におけるＧＰＲ３５ ｍＲＮＡ発現である。
ＤＮＡ−無含有ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ研究は、ほとんどの結腸癌組織診でのＧＰＲ３５発現を示す。一方、正常組織においては検出可能な発現はない（１乳房、２−肺、３−リンパ節、４胸腺、５結腸、６−１５結腸癌、１６−ネガティブコントロール）。
図２は、正常および腫瘍組織におけるＧＵＣＹ２Ｃ ｍＲＮＡ発現の定量的ＰＣＲ分析である。
ＧＵＣＹ２Ｃ−特異的プライマー（配列番号２２−２３）を用いたリアルタイムＰＣＲ研究は、正常回腸、結腸、およびすべての結腸癌組織診における選択的ｍＲＮＡ発現を示す。顕著な量のＧＵＣＹ２Ｃ転写産物が肝臓における結腸癌転移にも検出された。
図３は、腫瘍特異的ＧＵＣＹ２Ｃスプライスバリアントの同定である。
正常結腸組織および結腸癌からのＰＣＲ産物をクローニングし、両群からのクローンを制限分析（ＥｃｏＲ Ｉ）によって確認し、配列決定した。
図４は、正常肺および肺癌における選択的ＳＣＧＢ３Ａ発現である。
遺伝子特異的ＳＣＧＢ３Ａ２プライマー（配列番号３７、３８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析は、正常肺（レーン８、１４−１５）および肺癌組織診（レーン１６−２４）においてもっぱらのｃＤＮＡ増幅を示す（１−肝臓−Ｎ、２ＰＢＭＣ−Ｎ、３リンパ節−Ｎ、４胃−Ｎ、５精巣−Ｎ、６乳房−Ｎ、７腎臓−Ｎ、８−肺−Ｎ、９−胸腺−Ｎ、１０−卵巣−Ｎ、１１副腎−Ｎ、１２脾臓−Ｎ、１４−１５−肺−Ｎ、１６−２４−肺癌、２５ネガティブコントロール）。
図５は、胃、食道、胃癌および膵臓癌におけるクローディン１８Ａ２．１発現である。 クローディン１８Ａ２．１−特異的プライマー（配列番号３９、４０）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析により、本発明によると８／１０の胃癌組織診および３／６の膵臓癌組織診における顕著なクローディン１８Ａ２．１発現が示された。顕著な発現は胃および正常食道組織においても検出された。これに対して、卵巣および卵巣癌においては発現は検出されなかった。
図６は、腎臓および腎臓細胞癌におけるＳＬＣ１３Ａ１発現である。
ＳＬＣ１３Ａ１−特異的プライマー（配列番号４９、５０）を用いたＲＴ−ＰＣＲ分析により、７／８の腎臓細胞癌サンプルにおける発現が示された。しかし、正常組織における転写産物はもっぱら腎臓において検出された（１−２−腎臓、３−１０−腎臓細胞癌、１１乳房、１２肺、１３肝臓、１４結腸、１５リンパ節、１６脾臓、１７食道、１８胸腺、１９甲状腺、２０ＰＢＭＣ、２１卵巣、２２精巣）。
図７は、結腸、結腸癌および胃癌におけるＣＬＣＡ１発現である。
ＣＬＣＡ１−特異的プライマー（配列番号６７、６８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により結腸における選択的発現が確認され、調べた結腸癌（３／７）および胃癌サンプル（１／３）における高い発現が示された。その他の正常組織（ＮＴ）では発現が無いか、非常に弱いことが示された。
図８は、結腸および結腸癌におけるＦＬＪ２１４７７発現である。
ＦＬＪ２１４７７−特異的プライマー（配列番号６９、７０）によるＲＴ−ＰＣＲ研究により結腸における選択的発現、そしてさらに様々なレベルの調べた結腸癌サンプル（７／１２）における発現が示された。その他の正常組織（ＮＴ）は発現を示さなかった。
図９は、結腸および結腸癌におけるＦＬＪ２０６９４発現である。
ＦＬＪ２０６９４−特異的プライマー（配列番号７１、７２）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、結腸における選択的発現および様々なレベルの調べた結腸癌サンプル（５／９）における発現が示された。その他の正常組織（ＮＴ）は発現を示さなかった。
図１０は、胃、肺および肺癌におけるｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ発現である。
ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ−特異的プライマー（配列番号７３、７４）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、胃、肺および（５／１０）の調べた肺癌サンプルにおける選択的発現が示された。その他の正常組織（ＮＴ）は発現を示さなかった。
図１１は、胸腺、肺および肺癌におけるＰｌｕｎｃ発現である。
Ｐｌｕｎｃ−特異的プライマー（配列番号７５、７６）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、胸腺、肺および（６／１０）の調べた肺癌サンプルにおける選択的発現が示された。その他の正常組織は発現を示さなかった。
図１２は、肺、肺癌および甲状腺におけるＳＬＣ２６Ａ９発現である。
ＳＬＣ２６Ａ９−特異的プライマー（配列番号７７、７８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、肺およびすべての（１３／１３）調べた肺癌サンプルにおける選択的発現が示された。その他の正常組織（ＮＴ）は甲状腺を除き、発現を示さなかった。
図１３は、胃、卵巣、肺および肺癌におけるＴＨＣ１００５１６３発現である。
ＴＨＣ１００５１６３−特異的プライマー（配列番号７９）および非特異的オリゴｄＴタグプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、胃、卵巣、肺および（５／９）の肺癌組織診における発現が示された。その他の正常組織（ＮＴ）は発現を示さなかった。
図１４は、腎臓および腎臓細胞癌におけるＬＯＣ１３４２８８発現である。
ＬＯＣ１３４２８８−特異的プライマー（配列番号８０、８１）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、腎臓および（５／８）の調べた腎臓細胞癌組織診における選択的発現が示された。
図１５は、腎臓および腎臓細胞癌におけるＴＨＣ９４３８６６発現である。
ＴＨＣ９４３８６６−特異的プライマー（配列番号８２、８３）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により腎臓および（４／８）の調べた腎臓細胞癌組織診における選択的発現が示された。
図１６は、結腸および結腸癌におけるＦＬＪ２１４５８発現である。
ＦＬＪ２１４５８−特異的プライマー（配列番号８６、８７）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により結腸および（７／１０）の調べた結腸癌組織診における選択的発現が示された。（１−２−結腸、３−肝臓、４−ＰＢＭＣ、５−脾臓、６前立腺、７腎臓、８卵巣、９皮膚、１０回腸、１１肺、１２精巣、１３−２２結腸癌、２３−ネガティブコントロール）。
図１７は、ＧＰＲ３５の細胞内局在である。
ＧＰＲ３５−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するプラスミドのトランスフェクション後のＧＰＲ３５の細胞内局在の検出のための免疫蛍光である。矢印は蛍光性ＧＦＰの膜結合蛍光を示す。
図１８は、ＧＰＲ３５の定量的発現である。
Ａ． ＧＰＲ３５−特異的プライマー（配列番号８８、８９）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲは、腸、結腸腫瘍サンプルおよび腸腫瘍からの転移における選択的発現を示す。以下の正常組織を分析した：肝臓、肺、リンパ節、胃、脾臓、副腎、腎臓、食道、卵巣、精巣、胸腺、皮膚、乳房、膵臓、リンパ球、活性化リンパ球、前立腺、甲状腺、輸卵管、子宮内膜、小脳、脳。
Ｂ．結腸腫瘍およびその転移におけるＧＰＲ３５の罹患率。ＧＰＲ３５はケースの９０％以上で腫瘍および転移の両方に発現する。
図１９は、ＧＵＣＹ２Ｃの定量的発現である。
ＧＵＣＹ２Ｃ−特異的プライマー（配列番号９８、９９）による定量的ＲＴ−ＰＣＲは、正常結腸および胃組織における高い選択的発現（Ａ）および結腸および胃腫瘍サンプルにおけるＧＵＣＹ２Ｃ−特異的発現（Ｂ）を示す。ＧＵＣＹ２Ｃは１１／１２の結腸癌および７／１０の胃癌において検出可能である。
図２０は、ＳＣＧＢ３Ａ２の定量的発現である。
ＳＣＧＢ３Ａ２−特異的プライマー（配列番号１０３、１０４）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲは、肺サンプルおよび肺腫瘍サンプルにおける選択的発現を示す。１９／２０の肺腫瘍サンプルはＳＣＧＢ３Ａ２−陽性であり、ＳＣＧＢ３Ａ２はサンプルの５０％以上で少なくとも１０倍過剰発現している。以下の正常組織を分析した：肝臓、肺、リンパ節、胃、脾臓、副腎、腎臓、食道、卵巣、精巣、胸腺、皮膚、乳房、膵臓、リンパ球、活性化リンパ球、前立腺、甲状腺、輸卵管、子宮内膜、小脳、脳。
図２１は、ＳＣＧＢ３Ａ２−特異的抗体による免疫蛍光である。
ＣＯＳ７細胞をＳＣＧＢ３Ａ２−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。
Ａ．トランスフェクトした融合タンパク質のＳＣＧＢ３Ａ２−特異的ウサギ抗血清（配列番号１０５により免疫化）による検出。
Ｂ．ＧＦＰ蛍光によるトランスフェクトした融合タンパク質の検出。
Ｃ．ＡおよびＢからの２つの蛍光の重ね合わせ。黄色が２つの蛍光が重なり合った点でみられ、したがってＳＣＧＢ３Ａ２抗血清の特異性が示される。
図２２は、クローディン１８スプライスバリアントの模式図である。
２つのクローディン１８スプライスバリアントＡ１およびＡ２はＮ末端において異なり、異なる可能性のあるグリコシル化部位を示す。
図２３は、クローディン１８、バリアントＡ１の定量的発現である。
クローディン−Ａ１は多数の腫瘍組織において高度に活性化されている。特に強い発現が胃腫瘍、肺腫瘍、膵臓癌および食道癌においてみられる。
図２４は、クローディン１８、バリアントＡ２の定量的発現である。
バリアントＡ２は、バリアントＡ１と同様に、多くの腫瘍において活性化されている。
図２５は、クローディン１８Ａ２−特異的抗体（細胞外ドメイン）の使用である。
（上）クローディン１８Ａ２−陽性胃癌細胞（ＳＮＵ−１６）のペプチド（配列番号１７）による免疫化によって産生された抗体での染色。膜染色は特に細胞／細胞相互作用領域において強く表れる。Ａ免疫前、ＭｅＯＨ；Ｂ−免疫血清ＭｅＯＨ、５μｇ／ｍｌ；
（下）クローディン１８Ａ２−ＧＦＰ−トランスフェクト２９３Ｔ細胞における共存分析による抗体の特異性を示す。Ａクローディン１８Ａ２ＧＦＰ；Ｂ抗−クローディン−Ａ２；Ｃ重ね合わせ。
図２６は、クローディン１８Ａ２−特異的抗体（細胞外ドメイン）の使用である。
ペプチド（配列番号１１３、Ｎ末端に位置する細胞外ドメイン）による免疫化によって産生された抗体によるクローディン１８Ａ２−陽性胃癌細胞（ＳＮＵ １６）の膜染色。 Ｅ−カドヘリンに対するモノクローナル抗体を対比染色法に用いた。
Ａ抗体；Ｂ対比染色法；Ｃ重ね合わせ。
図２７は、クローディン１８のＣ−末端細胞外ドメインに対する抗体の使用である。
（左、上および下）ペプチド（配列番号１１６、Ｃ末端に位置する細胞外ドメイン）による免疫化によって産生された抗体によるクローディン１８Ａ２−陽性胃癌細胞（ＳＮＵ １６）の膜染色。Ｅ−カドヘリンに対するモノクローナル抗体を対比染色法に用いた（右、上、下）。
図２８は、クローディン１８Ａ１−特異的抗体の使用である。
（上）クローディン１８Ａ１−特異的ペプチド（配列番号１１５）による免疫化によって産生された抗体による胃癌細胞（ＳＮＵ １６；クローディン１８Ａ２陽性）の弱い〜無い染色。
Ａ−抗−Ｅ−カドヘリン；Ｂ抗−クローディン１８Ａ１；Ｃ重ね合わせ。
（下）クローディン１８Ａ１−ＧＦＰ−トランスフェクト２９３Ｔ細胞における共存分析による抗体の特異性を示す。
Ａ−ＧＦＰ−クローディン１８Ａ１；Ｂ−抗−クローディン１８Ａ１；Ｃ−重ね合わせ。
図２９は、ウェスタンブロットにおけるクローディン１８Ａ２の検出である。
配列番号１７のエピトープに対するクローディン１８Ａ２−特異的抗体を用いた様々な健康組織からの可溶化液を用いたウェスタンブロッティング。１胃；２精巣；３皮膚；４乳房；５肝臓；６結腸；７肺；８腎臓；９リンパ節。
図３０は、胃および胃腫瘍からのサンプルでのクローディン１８Ａ２ウェスタンブロッティングである。
胃および胃腫瘍からの可溶化液をブロットし、配列番号１７を有するエピトープに対するクローディン１８Ａ２−特異的抗体を用いて試験した。胃腫瘍ではクローディン−１８Ａ２のグリコシル化形態が少なかった。胃可溶化液のＰＮＧａｓｅＦ処理により低−グリコシル化形態の形成が導かれる。
左：１−胃Ｎｏ＃Ａ；２−胃Ｔｕ＃Ａ；３胃Ｎｏ＃Ｂ；４胃Ｔｕ＃Ｂ
右：１−胃Ｎｏ＃Ａ；２−胃Ｎｏ＃Ｂ；３−胃Ｎｏ＃Ｂ＋ＰＮＧａｓｅＦ；４−胃Ｔｕ＃Ｃ；５胃Ｔｕ＃Ｄ；６胃Ｔｕ＃Ｄ＋ＰＮＧａｓｅＦ
図３１は、肺腫瘍におけるクローディン１８の発現である。
低−グリコシル化クローディン−１８Ａ２バリアントを図３０にしたがって肺腫瘍において検出した。１胃Ｎｏ；２胃Ｔｕ；３ ９−肺Ｔｕ
図３２は、胃腫瘍組織におけるクローディン１８Ａ２−特異的抗体を用いるクローディン１８の免疫組織化学分析である。
図３３は、クローディン１８−特異的ポリクローナル抗血清による胃−特異的Ｓｎｕ１６細胞の間接的免疫蛍光である。
Ａ．免疫化の前に作成された免疫前血清による染色；Ｂ．クローディン１８−特異的血清による染色。
図３４は、ＳＬＣ１３Ａ１の定量的発現である。
ＳＬＣ１３Ａ１−特異的プライマー（配列番号１２１、１２２）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、正常腎臓組織における高い選択的発現（Ａ）および腎臓細胞癌におけるＳＬＣ１３Ａ１−特異的発現が示される（Ｂ）。ＳＬＣ１３Ａ１転写は５／８の腎臓細胞癌において検出可能である。
図３５は、ＳＬＣ１３Ａ１の細胞内局在である。
ＳＬＣ１３Ａ１−ＧＦＰ融合タンパク質を提供するプラスミドでのトランスフェクション後のＳＬＣ１３Ａ１の細胞内局在を示す免疫蛍光。ＳＬＣ１３Ａ１融合タンパク質の膜結合蛍光が明らかにみられる（トランスフェクト細胞のまわりの環として）。
図３６は、ＣＬＣＡ１の定量的発現である。
ＣＬＣＡ１−特異的プライマー（配列番号１２５、１２６）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、正常結腸組織および胃組織における高い選択的発現（Ａ）および結腸および胃腫瘍サンプルにおけるＣＬＣＡ１−特異的発現（Ｂ）が示される。ＣＬＣＡ１は６／１２の結腸癌および７／１０の胃癌において検出可能である。
図３７は、ＦＬＪ２１４７７の定量的発現である。
ＦＬＪ２１４７７−特異的プライマー（配列番号１２７、１２８）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、正常結腸および胃組織における高い選択的発現ならびに胸腺、食道および脳における弱い発現（Ａ）そして結腸腫瘍サンプルにおけるＦＬＪ２１４７７−特異的発現（Ｂ）が示される。ＦＬＪ２１４７７は１１／１２の結腸癌において検出可能である。
図３８は、ＦＬＪ２０６９４の定量的発現である。
ＦＬＪ２０６９４−特異的プライマー（配列番号１２９、１３０）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、正常結腸および胃組織における高い選択的発現（Ａ）および結腸および胃腫瘍サンプルにおけるＦＬＪ２０６９４−特異的過剰発現（Ｂ）が示される。ＦＬＪ２０６９４は、１１／１２の結腸癌および７／１０の胃癌において検出可能である。
図３９は、ＦＬＪ２１４５８の定量的発現である。
ＦＬＪ２１４５８−特異的プライマー（配列番号１３３、１３４）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、精巣、胃および腸組織における選択的発現が示される。さらに、ＦＬＪ２１４５８−特異的転写産物が２０／２０の結腸腫瘍および７／１１の結腸転移において検出可能であった。以下の正常組織を分析した：肝臓、肺、リンパ節、脾臓、副腎、腎臓、食道、卵巣、精巣、胸腺、皮膚、乳房、膵臓、リンパ球、活性化リンパ球、前立腺、甲状腺、輸卵管、子宮内膜、小脳、脳。
図４０は、ＦＬＪ２１４５８−特異的抗体による免疫蛍光である。
（上）２９３細胞をＦＬＪ２１４５８−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。
Ａ：トランスフェクトした融合タンパク質のＦＬＪ２１４５８−特異的ウサギ抗血清（配列番号１３６での免疫化）による検出。
Ｂ：トランスフェクトした融合タンパク質のＧＦＰ蛍光による検出。
Ｃ：ＡとＢからの２つの蛍光の重ね合わせ。
黄色が２つの蛍光が重なる点において生じ、したがってＦＬＪ２１４５８抗血清の特異性が示される。
（下）内因的にＦＬＪ２１４５８を合成するＳｎｕ１６細胞の分析。
Ａ：ＦＬＪ２１４５８−特異的ウサギ抗血清（配列番号１３６による免疫化）を用いたタンパク質検出。
Ｂ：膜タンパク質Ｅ−カドヘリンの検出。
Ｃ：ＡとＢからの２つの蛍光の重ね合わせ。
黄色が２つの蛍光が重なる点において生じ、ＦＬＪ２１４５８の膜局在を示す。
図４１は、配列である。
参照される配列がここで作られ、示される。
材料および方法「インシリコ」、「電子工学」および「ネットワーク上クローニング」の語は、データベースに基づく方法の使用を意味し、これはまた研究室での実験方法をシュミレーションするのにも用いられる。
特に断りのない限り、その他のすべての用語および表現は当業者に理解されるように用いられる。言及する技術および方法はそれ自体公知の方法で行い、例えば、以下に記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、製造業者の指示にしたがって行われる。
新規な腫瘍関連遺伝子の決定のためのデータマイニングに基づく戦略２つのインシリコ戦略、即ち、ＧｅｎＢａｎｋキーワード検索およびｃＤＮＡｘＰｒｏｆｉｌｅｒを組み合わせた。ＮＣＢＩ ＥＮＴＲＥＺ Ｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｙｓｔｅｍ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ検索を行い、特異的組織において特異的に発現するものとして解釈される候補遺伝子を検索した（Ｗｈｅｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ ２８：１０−１４、２０００）。
キーワード、例えば「結腸−特異的遺伝子」、「胃−特異的遺伝子」または「腎臓−特異的遺伝子」、について検索を行い、候補遺伝子（ＧＯＩ、目的の遺伝子）をデータベースから抽出した。生物について「ヒト」、分子タイプについて「ｍＲＮＡ」と制限することによってこれらデータベースのすべての情報の一部に制限して検索した。見いだされたＧＯＩのリストを同じ配列についての違う名前を決定して検証および修正し、かかる重複を排除した。
キーワード検索によって得られたすべての候補遺伝子を次にその組織分布に関して「電子工学ノザン（ｅＮｏｒｔｈｅｎ）」方法によって調べた。ｅＮｏｒｔｈｅｒｎは、ＧＯＩ配列とＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ）データベース（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１、１９９１）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）とのアラインメントに基づく。挿入されたＧＯＩに相同的であることが見いだされた各ＥＳＴの組織起源を決定することが出来、そのようにしてすべてのＥＳＴの和から、ＧＯＩの組織分布の予備的評価が得られる。非器官特異的正常組織からのＥＳＴと相同性の無いＧＯＩについてのみさらなる研究を行った。この評価では、共有財産が間違って解釈されたｃＤＮＡライブラリーを含むということも考慮した（Ｓｃｈｅｕｒｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：４０３７−４０４３、２０００）（ｗｗｗ．ｆａｕ．ｅｄｕ／ｃｍｂｂ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｅｓ６．ｈｔｍ）。
使用した第二のデータマイニング方法はＮＣＢＩ Ｃａｎｃｅｒ ＧｅｎｏｍｅＡｎａｔｏｍｙ ＰｒｏｊｅｃｔのｃＤＮＡ ｘＰｒｏｆｉｌｅｒであった（ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｉｓｓｕｅｓ／ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ）（Ｈｉｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：８０７−８２８、１９９６； Ｐｅｎｎｉｓｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：１０２３−１０２４、１９９７）。これによってデータベースに寄託されたトランスクリプトームのプールを論理演算子によって互いに関連づけることが可能となる。本発明者らは混合ライブラリーを除き、例えば結腸から調製されたすべての発現ライブラリーが割り当てられたプールＡを規定した。結腸以外の正常組織から調製されたすべてのｃＤＮＡライブラリーをプールＢに割り当てた。一般に、すべてのｃＤＮＡライブラリーを基礎となる調製方法とは独立に使用し、ただしサイズ＞１０００のものだけを許容した。プールＢをデジタル処理でＢＵＴ ＮＯＴ演算子によってプールＡから差し引いた。このようにして見いだされたＧＯＩのセットをまたｅＮｏｒｔｈｅｒｎ研究に供し、文献調査によって確認した。
この組み合わせデータマイニングは全部で公共財産における約１３０００の全長遺伝子を含み、器官−特異的発現を示す可能性のある遺伝子を予測した。
すべてのその他の遺伝子はまず特異的ＲＴ−ＰＣＲによって正常組織において評価した。非器官特異的正常組織において発現していることが判明したすべてのＧＯＩは偽陽性と見なす必要があり、さらなる研究から除外した。残りのＧＯＩを様々な腫瘍組織の大きなパネルにおいて研究した。以下に示す抗原は、腫瘍細胞において活性化されていることが判明した。
ＲＮＡ抽出、ポリ−ｄ（Ｔ）プライムドｃＤＮＡの調製および常套のＲＴ−ＰＣＲ分析トータルＲＮＡをカオトロピック剤としてグアニジウムイソチオシアナートを用いることによりネイティブな組織材料から抽出した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＆ Ｓａｃｃｈｉ、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−９、１９８７）。酸性フェノールによる抽出およびイソプロパノール沈降の後、該ＲＮＡをＤＥＰＣ−処理水に溶解した。
２−４μｇのトータルＲＮＡからの第一鎖ｃＤＮＡ合成をＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって製造業者の指示に従って２０μｌの反応混合物中において行った。用いたプライマーはｄＴ（１８）オリゴヌクレオチドであった。ｃＤＮＡの完全性と質を３０サイクルのＰＣＲにおいてｐ５３の増幅によって確認した（センスＣＧＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＧＡＧＡＴＧＴＴＣＣＧ、アンチセンスＣＣＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧ、ハイブリダイゼーション温度６７℃）。
第一鎖ｃＤＮＡの記録を多数の正常組織および腫瘍集団から調製した。発現研究のために、０．５μｌのこれらｃＤＮＡを３０μｌの反応混合物において増幅した。これにはＧＯＩ−特異的プライマー（以下参照）および１ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた。各反応混合物は、０．３ｍＭｄＮＴＰ、０．３μＭ各プライマーおよび３μｌ１０×反応バッファーを含むものであった。
プライマーは２つの異なるエキソン中に位置するように選択し、偽陽性結果を導く汚染ゲノムＤＮＡによる妨害の排除を、非逆転写ＤＮＡをテンプレートとして試験することによって確認した。ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性化のための９５℃、１５分の後、３５サイクルのＰＣＲを行った（１分９４℃、１分、特定のハイブリダイゼーション温度、２分７２℃および最終伸長７２℃６分）。
２０μｌのこの反応を分画し、臭化エチジウム染色アガロースゲルで分析した。
示すハイブリダイゼーション温度における対応する抗原の発現分析に以下のプライマーを用いた。
ＧＰＲ３５（６５℃）
センス：５’−ＡＧＧＴＡＣＡＴＧＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧ−３’
アンチセンス：５’−ＧＣＡＧＣＡＧＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧ−３’
ＧＵＣＹ２Ｃ（６２℃）
センス：５’−ＧＣＡＡＴＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＧ−３’
アンチセンス：５’−ＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＡＧ−３’
ＳＣＧＢ３Ａ２（６６℃）
センス：５’−ＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＡＧＴＴＡＣＴＣＴＧＣ−３’
アンチセンス：５’−ＴＧＴＣＡＣＡＣＣＡＡＧＴＧＴＧＡＴＡＧＣ−３’
クローディン１８Ａ２（６８℃）
センス１：５’−ＧＧＴＴＣＧＴＧＧＴＴＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＣ−３’
アンチセンス１：５’−ＣＧＧＣＴＴＴＧＴＡＧＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＣＴＧＧＴＧ−３’
センス２：５’−ＴＧＴＴＴＴＣＡＡＣＴＡＣＣＡＧＧＧＧＣ−３’
アンチセンス２：５’−ＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＣ−３’
クローディン１８Ａ１（６４℃）
センス：５’−ＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡ−３’
アンチセンス：５’−ＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＡＧＴＣＣ−３’
ＳＬＣ１３Ａ１（６４℃）
センス：５’−ＣＡＧＡＴＧＧＴＴＧＴＧＡＧＧＡＧＴＣＴＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＣＡＧＣＴＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＡＡＴＧ−３’
ＣＬＣＡ１（６２℃）
センス：５’−ＡＣＡＣＧＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＡＣＡＧＴＧ−３’
アンチセンス：５’−ＡＴＡＣＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＡＴＧ−３’
ＦＬＪ２１４７７（６８℃）
センス：５’−ＡＣＴＧＴＴＡＣＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧ−３’
ＦＬＪ２０６９４（６４℃）
センス：５’−ＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＣＴＡ−３’
アンチセンス：５’−ＡＧＡＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＴＣ
Ｅｂｎｅｒ（７０℃）
センス：５’−ＡＴＣＧＧＣＴＧＡＡＧＴＣＡＡＧＣＡＴＣＧ−３’
アンチセンス：５’−ＴＧＧＴＣＡＧＴＧＡＧＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧ−３’
Ｐｌｕｎｃ（５５℃）
センス：５’−ＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧ−３’
アンチセンス：５’−ＧＴＧＡＧＣＡＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣ−３’
ＳＬＣ２６Ａ９（６７℃）
センス：５’−ＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＡＧＡＧＡＣＧＴＧＡ−３’
アンチセンス５’−ＡＧＧＴＧＴＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＧ−３’
ＴＨＣ１００５１６３（６０℃）
センス：５’−ＧＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧ−３’
ＬＯＣ１３４２８８（６４℃）
センス：５’−ＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＡＧ−３’
アンチセンス：５’−ＣＴＣＴＴＣＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＡＣＡＴＣ−３’
ＴＨＣ９４３８６６（５９℃）
センス：５’−ＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＴＴＡＣＧＴＧＧＴＣ−３’
アンチセンス：５’−ＣＣＴＴＴＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＣＴＣ−３’
ＦＬＪ２１４５８（６２℃）
センス：５’−ＡＴＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣ−３’
アンチセンス：５’−ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＣＧＴＡＣＴＣ−３’。
ランダムヘキサマー−プライム化ｃＤＮＡの調製および定量的リアルタイムＰＣＲいくつかの遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって定量した。ＰＣＲ産物をインターカレートレポーター色素としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを用いて検出した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎのレポーター蛍光は溶液中で抑制されており、色素は二本鎖ＤＮＡ断片と結合した後にのみ活性になる。各ＰＣＲサイクルの後のＧＯＩ−特異的プライマーを用いた特異的増幅の結果としてのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ蛍光の上昇を定量に用いる。標的遺伝子の発現を絶対的にあるいは調べる組織において一定に発現しているコントロール遺伝子の発現と比べて相対的に定量する。発現はΔΔ−Ｃｔ法（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いていわゆるハウスキーピング遺伝子としての１８ｓ ＲＮＡに対するサンプルの標準化の後に測定した。反応は二連で行い、三連で測定した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）を製造業者の指示に従って用いた。ｃＤＮＡを高容量ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って使用して、ヘキサマープライマーを用いて合成した。希釈したｃＤＮＡの各５μｌ部分を総容量２５μｌのＰＣＲに用いた：センスプライマー３００ｎＭ、アンチセンスプライマー３００ｎＭ；最初の変性９５℃、１５分；９５℃、３０秒；３０秒のアニーリング；７２℃、３０秒；４０サイクル。使用したプライマーの配列はそれぞれの実施例に示す。
クローニングおよび配列分析
全長および遺伝子断片のクローニングは常套方法によって行った。配列を確かめるため、対応する抗原をプルーフリーディングポリメラーゼｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて増幅した。ＰＣＲの完了後、アデノシンを、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってアンプリコンの末端に連結し、製造業者の指示に従って断片をＴＯＰＯ−ＴＡベクターにクローニングした。配列決定は業者サービスによって行った。配列を常套の予測プログラムとアルゴリズムを用いて分析した。
ウェスタンブロッティング
標的タンパク質を含む可能性のある細胞培養物（標的遺伝子の内因性発現または標的タンパク質をコードする発現ベクターのトランスフェクション後の標的タンパク質の合成）または組織サンプルからの細胞を１％ＳＤＳ溶液で溶解する。ＳＤＳは可溶化液に存在するタンパク質を変性させる。実験混合物の可溶化液を８−１５％変性ポリアクリルアミドゲル（１％ＳＤＳ含有）での電気泳動によって予想タンパク質サイズに応じてサイズによって分画した（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。タンパク質を半乾燥電気ブロッティング法（Ｂｉｏｒａｄ）によってニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ）にトランスファーし、メンブレン上で所望のタンパク質が検出される。この目的のため、メンブレンをまず（例えば、粉乳により）ブロッキングし、次いで１：２０−１：２００（抗体の特異性による）の希釈度の特異的抗体とともに６０分インキュベートする。洗浄工程の後、メンブレンをマーカー（例えば、酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）と結合させた一次抗体を認識する二次抗体とインキュベートする。さらなる洗浄工程の後、標的タンパク質を酵素反応（例えば、ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によるメンブレン上の発色または化学発光反応によって可視化する。結果を適当なカメラで撮影することにより記録する。
タンパク質修飾の分析は通常ウェスタンブロッティングによって行う。通常数ｋＤａのサイズを有するグリコシル化により、標的タンパク質の総分子量が大きくなり、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画できる。特異的Ｏ−およびＮ−グリコシド結合を検出するために、組織または細胞からのタンパク質可溶化液をインキュベートした後、ＯまたはＮ−グリコシダーゼ（製造業者の指示に従って、例えば、ＰＮｇａｓｅ、エンドグリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＨ、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてＳＤＳによって変性させる。この後ウェスタンブロッティングを上記のように行う。したがって、グリコシダーゼとのインキュベーションの後、標的タンパク質のサイズが減少していれば、特異的グリコシル化を検出することが出来、そしてこのようにして、修飾の腫瘍特異性を分析できる。グリコシル化アミノ酸の正確な位置はアルゴリズムおよび予測プログラムを用いて予測できる。
免疫蛍光
標的タンパク質を内因的に合成するか（ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＮＡの検出またはウェスタンブロッティングによるタンパク質の検出）、プラスミドＤＮＡをＩＦの前にトランスフェクトされた樹立細胞株の細胞を用いる。様々な方法（例えば、エレクトロポーレーション、リポソームに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降）がＤＮＡによる細胞株のトランスフェクトのために十分に確立されている（例えば、Ｌｅｍｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９７； ７５： ４４１−７）。トランスフェクトされるプラスミドは免疫蛍光において非修飾タンパク質をコードするものでもよいし、様々なアミノ酸マーカーを標的タンパク質に結合させるものでもよい。もっとも重要なマーカーは、例えば、様々な蛍光性形態における蛍光性の「緑色蛍光性タンパク質」（ＧＦＰ）および、それに対する高親和性および特異的抗体が入手可能な６−１２アミノ酸の短いペプチド配列である。標的タンパク質を合成する細胞をパラホルムアルデヒド、サポニンまたはメタノールで固定する。所望の場合細胞を界面活性剤（例えば、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００）とのインキュベーションにより透過性にしてもよい。固定／透過性化の後、細胞を標的タンパク質に対する一次抗体または結合マーカーに対する一次抗体とともにインキュベートする。洗浄工程の後、混合物を蛍光性マーカー（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｄａｋｏ）と結合させた一次抗体と結合する二次抗体とインキュベートする。このようにして標識した細胞をグリセロールの層で被覆し、製造業者の指示に従って蛍光顕微鏡によって分析する。この場合特異的蛍光発光が用いる物質に応じた特異的励起によって達成される。分析は通常、標的タンパク質の信頼できる局在化を可能とし、抗体の質および標的タンパク質は標的タンパク質に加えてその局在が以前に文献に記載されている結合アミノ酸マーカーまたはその他のマーカータンパク質を染色する二重染色において確認される。ＧＦＰおよびその誘導体は直接励起でき、それ自体蛍光を発生する特別の場合を表し、したがって検出のための抗体は必要ではない。
免疫組織化学
ＩＨＣは特に以下に役立つ：
（１）腫瘍および正常組織における標的タンパク質の量の評価を可能とする、
（２）腫瘍および健康組織におけるどれほど多くの細胞が標的遺伝子を合成しているかを分析する、および／または、
（３）標的タンパク質が検出可能である組織における細胞のタイプ（腫瘍、健康細胞）を規定する。
異なるプロトコールを個々の抗体に応じて用いる必要がある（例えば、“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、Ｄａｖｉｄ Ｊ．、ＭＤ ＤａｂｂｓＩＳＢＮ： ０４４３０６５６６７”または“Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ａｎｄ Ａｎｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ｆｏｒ Ｌｉｇｈｔａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＩＳＢＮ： ０３０６４６７７０４”）。
特異的組織サンプルにおける免疫組織化学（ＩＨＣ）は、対応する組織におけるタンパク質の検出に役立つ。この方法の目的は、機能的にインタクトな組織集合体におけるタンパク質の局在を同定することである。ＩＨＣは特に以下に役立つ：
（１）腫瘍および正常組織における標的タンパク質の量の評価を可能とする、
（２）どれほど多くの腫瘍および健康組織における細胞が標的遺伝子を合成するかを分析する、そして、
（３）標的タンパク質が検出可能である組織における細胞タイプ（腫瘍、健康細胞）を規定する。
あるいは、標的遺伝子のタンパク質の量はデジタルカメラおよび適当なソフトウェア（例えば、Ｔｉｌｌｖｉｓｉｏｎ、Ｔｉｌｌ−ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた組織免疫蛍光により定量できる。この技術は多く公表されており、染色と顕微鏡法についての詳細は例えば以下にみることができる：“Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｕｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、Ｄａｖｉｄ Ｊ．、ＭＤ ＤａｂｂｓＩＳＢＮ： ０４４３０６５６６７ または“Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｕｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ｆｏｒ Ｌｉｇｈｔ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ” ＩＳＢＮ：０３０６４６７７０４。抗体の性質によって、有効な結果を得るためには異なるプロトコールを用いなければならないことに注意されたい（一例を以下に示す）。
通常、組織学的に規定された腫瘍組織および、参照として、対応する健康組織をＩＨＣに用いる。標的遺伝子の存在がＲＴ−ＰＣＲ分析によって知られているポジティブおよびネガティブコントロール細胞株を用いることも可能である。バックグラウンドコントロールは常に含めなければならない。
固定された組織（例えば、アルデヒド−含有物質、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドまたはアルコール溶液による固定）または１−１０μｍの厚さのショック冷凍組織片をガラス台に乗せる。パラフィン包埋サンプルから例えばキシレンによってパラフィンを除く。サンプルをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、血清中でブロッキングする。この後、一次抗体（希釈：１：２〜１：２０００）との１８時間のインキュベーションを行い、ここでアフィニティー精製抗体を通常用いる。洗浄工程の次にアルカリホスファターゼ（あるいは例えばペルオキシダーゼ）と結合した、一次抗体に対する二次抗体とのインキュベーションを約３０−６０分行う。この後、結合した酵素によって変換される色素基質を用いた着色反応を行う（例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３９： ７４１−７４８、１９９１；Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ６４： ６９３−７０２、１９９１を参照）。抗体特異性を示すために、反応を免疫原を先に添加することによってブロッキングしてもよい。
免疫化
（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、 Ｐｈｉｌｉｐ Ｓｈｅｐｈｅｒｄ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｄｅａｎ ｉｓｂｎ ０ １９ ９６３７２２ ９； Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ ＩＳＢＮ： ０８７９６９３１４２；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ： Ｐｏｒｔａｂｌｅ ＰｒｏｃｏｔｏｌＮＯ．、Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ＩＳＢＮ：０８７９６９５４４７も参照されたい）。
抗体の調製方法は以下に簡単に説明し、その詳細は引用文献にみられる。まず、動物（例えば、ウサギ）を所望の標的タンパク質の最初の注射により免疫する。免疫原に対する動物の免疫応答は所定の時間内での（先の免疫化の約２−４週間後）二回目または三回目の免疫化によって増強できる。様々な所定の時間後に（最初の採血は４週間後、次いで約２週間毎に計５回までの採血）、血液を動物から採取し、それから免疫血清を得る。
動物は通常４つの確立された方法の１つで免疫するがその他の方法も利用できる。標的タンパク質に特異的なペプチドによって免疫することが出来、ここで全長タンパク質またはタンパク質の細胞外部分配列は実験的にまたは予測プログラムによって同定できる。
（１）第一の場合において、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合したペプチド（長さ：８−１２アミノ酸）を標準的インビトロ方法によって合成し、これらペプチドを免疫化に用いる。通常、３回の免疫化を行い、その濃度は５−１０００μｇ／免疫化とする。免疫化はまた、サービス業者からのサービスとして行うことも出来る。
（２）あるいは、免疫化は組換えタンパク質を用いて行うことも出来る。この目的のため、標的遺伝子のクローニングされたＤＮＡを発現ベクターにクローニングし、標的タンパク質を特定の製造業者の条件と同様に、例えば細胞−フリーインビトロにて、細菌（例えば大腸菌）中、酵母（例えば、Ｓ． ｐｏｍｂｅ）中、昆虫細胞中または哺乳類細胞中にて合成する（例えば、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｑｉａｇｅｎ）。系のいずれかでの合成の後、標的タンパク質を精製し、この場合精製は通常標準的クロマトグラフィー方法により行う。これに関しては、精製の助けとして分子アンカーを有する免疫化のためのタンパク質を用いてもよい（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｑｉａｇｅｎ； ＦＬＡＧタグ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ； Ｇｓｔ融合タンパク質）。多数のプロトコールが例えば以下においてみられる：“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ。
（３）所望のタンパク質を内因的に合成する細胞株が入手可能な場合、この細胞株を用いて特異的抗血清を産生することが出来る。この場合、免疫化は各回約１−５×１０７細胞にて１−３回の注射にて行う。
（４）免疫化はＤＮＡの注射によって行うことも出来る（ＤＮＡ免疫化）。この目的のため、標的遺伝子を最初に、標的配列が強力な真核プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下になるように発現ベクターにクローニングする。次いで、５−１００μｇのＤＮＡを「遺伝子銃」を用いて生物（例えば、マウス、ウサギ）における強い血流のある毛細血管領域に免疫原として移入する。移入されたＤＮＡは動物細胞に取り込まれ、標的遺伝子が発現し、動物は最終的に標的遺伝子に対する免疫応答を発達させる（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １２：４１−４９、２００１； Ｋａｓｉｎｒｅｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｈｙｂｒｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ ２１：２８７−２９３、２００２）。
ポリクローナル血清または抗体の質の管理
細胞培養に基づくアッセイ、次いでウェスタンブロッティングは特異性を示すのにもっとも好適である（様々な改変が、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．、Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅに記載されている）。それを示すために、細胞に、強力な真核プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター）の制御下の標的タンパク質に対するＤＮＡをトランスフェクトする。様々な方法（例えば、エレクトロポーレーション、リポソームに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降）がＤＮＡによる細胞株のトランスフェクトについて確立されている（例えば、Ｌｅｍｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７５：４４１−７、１９９７）。標的遺伝子を内因的に発現する細胞株を用いることも可能である（標的遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲによって示される）。コントロールとして理想的な場合においては相同的遺伝子を実験においてトランスフェクトし、以下のウェスタンブロットにおいて分析する抗体の特異性を確認することができる。
次いでウェスタンブロットにおいて、標的タンパク質を含む可能性がある細胞培養物または組織サンプルからの細胞を１％ＳＤＳ溶液で溶解し、タンパク質をそれによって変性させる。可溶化液を、８−１５％変性ポリアクリルアミドゲル（１％ＳＤＳ含有）（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において電気泳動によってサイズに応じて分画する。タンパク質を次いで複数のブロッティング方法の１つによって特定のメンブレン（例えば、ニトロセルロース、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｌｌ）にトランスファーする（例えば、半乾燥電気ブロット； Ｂｉｏｒａｄ）。所望のタンパク質をこのメンブレン上で可視化できる。この目的のため、メンブレンをまず、標的タンパク質を認識する抗体（抗体の特異性に応じて希釈度約１：２０−１：２００）と６０分間インキュベートする。洗浄工程後、メンブレンをマーカー（例えば、酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）と結合し、一次抗体を認識する二次抗体とインキュベートする。次いで着色または化学発光反応において（例えば、ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、メンブレン上で標的タンパク質を可視化することができる。標的タンパク質に対する高い特異性を有する抗体は理想的な場合において所望のタンパク質自体のみを認識するはずである。
インシリコアプローチで同定された標的タンパク質の膜局在の確認には様々な方法が用いられる。上記抗体を用いる重要かつよく確立された方法は免疫蛍光（ＩＦ）である。標的タンパク質（ＲＴ−ＰＣＲにおけるＲＮＡの検出またはウェスタンブロットにおけるタンパク質の検出）を合成するかあるいはプラスミドＤＮＡをトランスフェクトされた樹立細胞株の細胞がこのために用いられる。様々な方法（例えば、エレクトロポーレーション、リポソームに基づくトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降）がＤＮＡによる細胞株のトランスフェクションのために確立されている（例えば、Ｌｅｍｏｉｎｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７５：４４１−７、１９９７）。細胞にトランスフェクトされたプラスミドは、免疫蛍光において、非修飾タンパク質をコードするかあるいは標的タンパク質に様々なアミノ酸マーカーを結合させうる。主要なマーカーは、例えば、蛍光性の様々な蛍光性形態における「緑色蛍光性タンパク質」（ＧＦＰ）、６−１２アミノ酸の短いペプチド配列であってそれに対する高親和性かつ特異的抗体が入手可能なもの、あるいはそのシステイン特異的蛍光物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を介して結合しうる短いアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓである。標的タンパク質を合成する細胞は、例えば、パラホルムアルデヒドやメタノールで固定される。次いで細胞は所望により界面活性剤（例えば、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００）とのインキュベーションによって透過性にされうる。細胞は次いで標的タンパク質または結合マーカーの１つに対する一次抗体とともにインキュベートされる。洗浄工程後、混合物を蛍光性マーカー（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｄａｋｏ）と結合し、一次抗体と結合する二次抗体とインキュベートする。このように標識した細胞は次いでグリセロール層で被覆し、製造業者の指示に従って蛍光顕微鏡によって分析される。特異的蛍光発光はこの場合、用いる物質に応じた特異的励起によって達成される。分析は通常標的タンパク質の信頼できる局在化を可能にし、抗体の質と標的タンパク質が標的タンパク質に加えて、その局在が既に文献に記載されている結合したアミノ酸マーカーまたはその他のマーカータンパク質の染色をする二重染色によって確認される。ＧＦＰおよびその誘導体は特別な場合を表し、直接励起可能でありそれ自体蛍光を発する。界面活性剤の使用により制御されうる膜透過性は、免疫原性エピトープが細胞の内側と外側のいずれに位置しているかを免疫蛍光において示すことを可能にする。選択されたタンパク質の予測はこのようにして実験的に支持される。別の可能性はフローサイトメトリーによる細胞外ドメインの検出である。この目的のために、細胞は非透過性条件下で固定され（例えば、ＰＢＳ／Ｎａアジド／２％ＦＣＳ／５ｍＭ ＥＤＴＡ）、製造業者の指示に従ってフローサイトメーターにて分析される。細胞外エピトープのみがこの方法で分析される抗体によって認識されうる。免疫蛍光との違いは例えば、ヨウ化プロピジウムまたはトリパンブルーの使用によって死細胞と生細胞を区別することが可能であること、そして偽陽性結果を避けられることである。
アフィニティー精製
ポリクローナル血清の精製は、ペプチド抗体の場合すべて、あるいは組換えタンパク質に対する抗体の場合、部分的に契約会社のサービスとして行った。この目的のために、両方の場合において、適当なペプチドまたは組換えタンパク質をマトリックスに共有結合させ、後者を結合後、ネイティブバッファー（ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水）で平衡化し、次いで粗血清とインキュベートした。さらなるＰＢＳ洗浄工程の後、抗体を１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．７で溶出し、溶出液をすぐに２Ｍ ＴＲＩＳ、ｐＨ８で中和した。このように精製した抗体を次いで、ウェスタンブロッティングおよび免疫蛍光による標的タンパク質の特異的検出に供し得た。
ＥＧＦＰトランスフェクタントの調製
異種発現した腫瘍関連抗原の免疫蛍光顕微鏡法のために、抗原の完全なＯＲＦをｐＥＧＦＰ Ｃ１およびｐＥＧＦＰ Ｎ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。スライド上で培養したＣＨＯおよびＮＩＨ３Ｔ３細胞にＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて適当なプラスミドコンストラクトを製造業者の指示に従ってトランスフェクトし、１２−２４時間後、免疫蛍光顕微鏡法によって分析した。
実施例１
診断上および治療上癌標的としてのＧＰＲ３５の同定
ＧＰＲ３５（配列番号１）およびその翻訳産物（配列番号９）は、推定Ｇタンパク質共役受容体として記載されている。配列はＧｅｎｂａｎｋにおいて登録番号ＡＦ０８９０８７として公表されている。この転写産物は３０９アミノ酸、分子量３４ｋＤａのタンパク質をコードしている。ＧＰＲ３５は、７つの膜貫通ドメインを有するＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリーに属すると予測された（Ｏ’Ｄｏｗｄ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４７：３１０−１３、１９９８）。細胞における予測されたＧＰＲ３５の局在を確認するために、タンパク質をレポーター分子としてのｅＧＦＰと融合させ、適当なプラスミドでのトランスフェクションの後、異種的に２９３細胞において発現させた。局在を次いで蛍光顕微鏡で分析した。本発明によると、ＧＰＲ３５は完全な膜貫通分子（図１７）であることが確認された。ヒトＧＰＲ３５に対する今日までの研究（とりわけ、Ｈｏｒｉｋａｗａ Ｙ、Ｏｄａ Ｎ、Ｃｏｘ ＮＪ、Ｌｉ Ｘ、Ｏｒｈｏ−Ｍｅｌａｎｄｅｒ Ｍ、Ｈａｒａ Ｍ、Ｈｉｎｏｋｉｏ Ｙ、Ｌｉｎｄｎｅｒ ＴＨ、Ｍａｓｈｉｍａ Ｈ、ＳｃｈｗａｒｚＰＥ、ｄｅｌ Ｂｏｓｑｕｅ−Ｐｌａｔａ Ｌ、Ｈｏｒｉｋａｗａ Ｙ、Ｏｄａ Ｙ、Ｙｏｓｈｉｕｃｈｉ Ｉ、Ｃｏｌｉｌｌａ Ｓ、Ｐｏｌｏｎｓｋｙ ＫＳ、Ｗｅｉ Ｓ、Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｐ、Ｉｗａｓａｋｉ Ｎ、ＳｃｈｕｌｚｅＪ、Ｂａｉｅｒ ＬＪ、Ｂｏｇａｒｄｕｓ Ｃ、Ｇｒｏｏｐ Ｌ、Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ Ｅ、Ｈａｎｉｓ ＣＬ、Ｂｅｌｌ ＧＩ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ２０００ Ｏｃｔ；２６（２）：１６３−７５を参照されたい）は、ＧＰＲ３５は多くの健康組織で活性化されていることを示唆している。この遺伝子のリーディングフレームは１つのエキソンを含む。本発明によると、ＧＰＲ３５に対する遺伝子特異的プライマー対（配列番号２０、２１）をＲＴ−ＰＣＲ分析に用いて結腸および結腸癌（１３／２６）におけるｃＤＮＡを増幅した。一方、その他の正常組織においては有意な発現は検出不可能であった。ＧＰＲ３５は単一のエキソンからなるという事実により、イントロンにまたがるプライマーによってゲノムＤＮＡ不純物を検出することが出来ない。それゆえ、ＲＮＡサンプルのゲノムによる汚染を排除するために、すべてのＲＮＡをＤＮＡｓｅで処理した。ＧＰＲ３５転写産物はＤＮＡ−無含有ＲＮＡを用いると本発明によると、結腸、直腸、精巣および結腸癌においてのみ検出された。
表１：正常組織におけるＧＰＲ３５発現
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正常結腸組織および結腸癌組織診におけるＧＰＲ３５転写産物の選択的かつ高い発現（図１）は以前には知られておらず、本発明による分子診断法に用いることが出来る。例えば、血清および骨髄における転移性腫瘍細胞の検出およびその他の組織における転移の検出のためのＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。特異的プライマー（配列番号８８および８９）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＧＰＲ３５が高度に選択的な腸−特異的分化抗原であることが確認され、これは腸腫瘍および腸腫瘍転移にも含まれる。いくつかの腸腫瘍において、それは実際正常腸に比較して１ログ過剰発する（図１８）。ＧＰＲ３５タンパク質検出用の抗体をウサギの免疫化によって産生した。以下のペプチドをかかる抗体の増殖に用いた：
配列番号９０ ＧＳＳＤＬＴＷＰＰＡＩＫＬＧＣ（ＡＡ９−２３）
配列番号９１： ＤＲＹＶＡＶＲＨＰＬＲＡＲＧＬＲ（ＡＡ１１２−１２７）
配列番号９２： ＶＡＰＲＡＫＡＨＫＳＱＤＳＬＣ（Ｃ末端）
配列番号９３ ＣＦＲＳＴＲＨＮＦＮＳＭＲ（細胞外ドメイン２）
かかる抗体を用いた例えばウェスタンブロットによる染色により、腫瘍における発現が確認される。ＧＰＲ３５の４つのすべての細胞外ドメイン（配列番号９の配列における予測細胞外ドメインの位置、ＡＡ１−２２（配列番号９４）；ＡＡ８１−９４（配列番号９５）；ＡＡ１５６−１７６（配列番号９６）；ＡＡ２８０−３０９（配列番号９７））を本発明によるとモノクローナル抗体の標的構造として利用できる。かかる抗体は腫瘍細胞の細胞表面に特異的に結合し、そして、診断および治療方法の両方に利用できる。腫瘍におけるＧＰＲ３５の過剰発現は、かかる使用に対するさらなる支持を提供する。さらに、タンパク質をコードする配列は本発明によると腫瘍特異的免疫応答（Ｔ細胞およびＢ細胞−媒介免疫応答）を誘導するワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質）として利用できる。さらに、驚くべきことにさらなる開始コドンが一般に知られている開始コドンの前の５’側に存在し、Ｎ末端が伸長したタンパク質を発現することが見いだされた。
したがって本発明によると以前に遍在性に発現すると記載されていたタンパク質であるＧＰＲ３５が、胃腸腫瘍、特に結腸腫瘍に選択的に過剰発現する腫瘍関連抗原であることが見いだされた。ＧＰＲ３５はそれゆえ特にかかる腫瘍の診断及び治療のための分子標的構造として好適である。ヒトＧＰＲ３５の今日までの研究、例えば、Ｈｏｒｉｋａｗａ Ｙ、Ｏｄａ Ｎ、Ｃｏｘ ＮＪ、Ｌｉ Ｘ、Ｏｒｈｏ−Ｍｅｌａｎｄｅｒ Ｍ、Ｈａｒａ Ｍ、Ｈｉｎｏｋｉｏ Ｙ、Ｌｉｎｄｎｅｒ ＴＨ、Ｍａｓｈｉｍａ Ｈ、ＳｃｈｗａｒｚＰＥ、ｄｅｌ Ｂｏｓｑｕｅ−Ｐｌａｔａ Ｌ、Ｈｏｒｉｋａｗａ Ｙ、Ｏｄａ Ｙ、Ｙｏｓｈｉｕｃｈｉ Ｉ、Ｃｏｌｉｌｌａ Ｓ、Ｐｏｌｏｎｓｋｙ ＫＳ、Ｗｅｉ Ｓ、Ｃｏｎｃａｎｎｏｎ Ｐ、Ｉｗａｓａｋｉ Ｎ、ＳｃｈｕｌｚｅＪ、Ｂａｉｅｒ ＬＪ、Ｂｏｇａｒｄｕｓ Ｃ、Ｇｒｏｏｐ Ｌ、Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ Ｅ、Ｈａｎｉｓ ＣＬ、Ｂｅｌｌ ＧＩ Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． ２０００ Ｏｃｔ；２６（２）：１６３−７５は、ＧＰＲ３５が多くの健康組織において活性化されていることを示唆している。一方、本発明の研究によると、ＧＰＲ３５は驚くべきことにほとんどの正常組織で有意に検出されず、それに対して、原発性および転移性結腸腫瘍において高度に活性化されていることが示された。さらに以前に記載されているＧＰＲ３５配列の他に、本発明によると別の開始コドンを利用する新規な翻訳バリアントが見いだされた（配列番号１０）。
ＧＰＲ３５はＧ共役受容体（ＧＰＣＲ）の群のメンバーであり、Ｇ共役受容体（ＧＰＣＲ）の群は、その構造と機能が非常によく研究されている非常に大きなタンパク質ファミリーである。ＧＰＣＲは医薬上活性な物質の開発のための標的構造として非常に好適である。というのはそれに必要な方法（例えば、受容体発現、精製、リガンドスクリーニング、突然変異誘発、機能阻害、アゴニスト性およびアンタゴニスト性リガンドの選択、リガンドの放射標識）が非常によく開発されており、例えば、以下に詳細に記載されているからである。“Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ−ＣｏｕｐｌｅｄＲｅｃｅｐｔｏｒｓ” 、 Ｔａｔｓｕｙａ Ｈａｇａ、Ｇａｂｒｉｅｌ Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｇａｂｒｉｅｌ ＢｅｒｎｓｔｅｉｎＩＳＢＮ： ０８４９３３３８４９および、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆＧ− Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ”、Ｋｅｖｉｎ Ｒ． Ｌｙｎｃｈ ＡＳＩＮ： ０４７１１８３１０５。本発明によると、ＧＰＲ３５はほとんどの健康組織で検出できず、細胞表面にて腫瘍関連発現をするという認識により、例えば、薬理活性リガンド、特に例えば、医薬物質としての放射性分子と組み合わせての使用など、その腫瘍関連標的構造としての利用が可能となる。特定の態様においてＧＰＲ３５に結合する放射標識リガンドをインビボでの腫瘍細胞の検出または結腸腫瘍の治療に利用することが可能である。
実施例２
診断上および治療上癌標的としての肝臓および卵巣腫瘍におけるＧＵＣＹ２Ｃならびに新規ＧＵＣＹ２Ｃスプライスバリアントの同定
グアニル酸シクラーゼ２Ｃ（配列番号２；翻訳産物：配列番号１１）−Ｉ型膜貫通タンパク質−はナトリウム利尿ペプチド受容体のファミリーに属する。その配列はＧｅｎｂａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿００４９６３として公表されている。ペプチド、グアニリン（ｇｕａｎｙｌｉｎ）およびウログアニリン（ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ）あるいは耐熱性エンテロトキシン（ＳＴａ）の結合は、細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させ、したがって細胞内のシグナル伝達プロセスを誘導する。
最近の研究はＧＵＣＹ２Ｃの発現が腸外領域、例えば、胃および食道の原発性および転移性腺癌にも及ぶことを示している（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ ＥｐｉｄｅｍｉｏｌＢｉｏｍａｒｋｅｒｓ Ｐｒｅｖ． １１： ７３９−４４、２００２）。腸の正常および形質転換組織の両方にみられるＧＵＣＹＣのスプライスバリアントはエキソン１における１４２ ｂｐ欠失を含み、したがってＧＵＣＹ２Ｃ−様産物の翻訳が妨げられる（Ｐｅａｒｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｇ． Ｄｉｓ． Ｓｃｉ． ４５：２９８−０５、２０００）。現在までに記載されている唯一のスプライスバリアントは翻訳産物を導かない。
本発明の目的は診断および治療の両方に利用できるＧＵＣＹ２Ｃの腫瘍関連スプライスバリアントを同定することであった。
ＧＵＣＹ２Ｃ−特異的プライマー対（配列番号２２、２３、９８、９９）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究は、正常結腸および胃における強いＧＵＣＹ２Ｃ転写産物の発現、そして肝臓、精巣、卵巣、胸腺、脾臓、脳および肺における弱い発現を示した（表２、図１９）。結腸および胃における発現はその他のすべての正常組織と比べて少なくとも５０倍高かった。顕著なＧＵＣＹ２Ｃ転写産物レベルが結腸癌および胃癌において検出された（表２）。これらの結果は定量的ＰＣＲ分析により特定され、正常結腸、回腸、およびほぼすべての調べた結腸癌サンプルにおける顕著なＧＵＣＹ２Ｃ発現を示した（図２、１９Ｂ）。多大な過剰発現がいくつかの結腸癌サンプルにおいて検出可能であった。さらに、発現は７／１０の胃腫瘍でみられた。本発明者らはまた驚くべきことに、該遺伝子が多くの以前に記載されていなかった腫瘍、とりわけ、卵巣、乳房、肝臓および前立腺腫瘍において活性化されていることを見いだした（図１９Ｂ、表２）。
表２：正常および腫瘍組織におけるＧＵＣ２Ｃ発現
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以下のプライマー対を用いて結腸組織および結腸癌組織におけるスプライスバリアントを検出した：
ＧＵＣＹ２Ｃ−１１８ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−４９８ａｓ（配列番号２４、２９）；
ＧＵＣＹ２Ｃ−６２１ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−１１４０ａｓ（配列番号２５、３０）；
ＧＵＣＹ２Ｃ １４５０ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−１７９０ａｓ（配列番号２６、３１）；
ＧＵＣＹ２Ｃ １９９３ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−２３６６ａｓ（配列番号２７、３２）；
ＧＵＣＹ２Ｃ ２７１７ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−３２００ａｓ（配列番号２８、３３）；
ＧＵＣＹ２Ｃ １１８ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−１１４０ａｓ（配列番号２４、３０）；
ＧＵＣＹ２Ｃ ６２１ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−１７９０ａｓ（配列番号２５、３１）；
ＧＵＣＹ２Ｃ １４５０ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−２３６６ａｓ（配列番号２６、３２）；
ＧＵＣＹ２Ｃ １９９３ｓ／ＧＵＣＹ２Ｃ−３２００ａｓ（配列番号２７、３３）。
結腸癌組織におけるスプライスバリアントの研究において３つの以前に知られていない形態が本発明によって同定された。
ａ）１１１アミノ酸長で位置１１１のアスパラギンがプロリンに置換されているＧＵＣＹ２Ｃのバリアントを導くエキソン３の欠失（配列番号３）。
ｂ）２５８アミノ酸長の発現産物をもたらすエキソン６の欠失（配列番号４）。これは１３アミノ酸からなるＣ末端新エピトープを作る。
ｃ）ヌクレオチド位置１６０６−１６１４、そして対応するアミノ酸Ｌ（５３６）、Ｌ（５３７）およびＱ（５３８）が欠失しているバリアント（配列番号５）。
エキソン３およびエキソン６がそれぞれ欠失している本発明によるスプライスバリアント（配列番号３、４）は、特に膜貫通ドメインを有さない翻訳産物（配列番号１２、１３）によって認識される。エキソン６の欠失の場合の結果は、１３アミノ酸のＣ末端新エピトープであり、これは既知のいかなるタンパク質とも相同性を示さない。この新エピトープはしたがって免疫療法の標的構造に予定される。本発明の位置１６０６−１６１４において塩基が欠失したスプライスバリアント（配列番号５）およびその翻訳産物（配列番号１４）は同様に新エピトープを含む。ＧＵＣＹ２Ｃタンパク質検出用の抗体をウサギの免疫化により産生した。以下のペプチドをこれら抗体の増殖に用いた：
配列番号１００：ＨＮＧＳＹＥＩＳＶＬＭＭＧＮＳ（ＡＡ３１−４５）
配列番号１０１：ＮＬＰＴＰＰＴＶＥＮＱＱＲＬＡ（ＡＡ１００９−１０２３）
かかる抗体は原理的には診断および治療目的で利用しうる。
特に、ＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメイン（配列番号１１の配列からの推定細胞外ドメインの位置：ＡＡ４５４−１０７３（配列番号１０２））は本発明によると、モノクローナル抗体の標的構造として利用できる。しかし、構造予測はいくらか不明瞭であり、実験的に確認されておらず、したがって別の膜位置もあり得る。この場合、アミノ酸１−４３１は細胞外にあり、モノクローナル抗体の出発点として好適である。これら抗体は腫瘍細胞の細胞表面に特異的に結合し、診断および治療方法の両方に利用できる。特に結腸腫瘍におけるＧＵＣＹ２Ｃの過剰発現は、かかる使用のさらなる支持を提供する。タンパク質をコードする配列はさらに本発明によると腫瘍特異的免疫応答（Ｔ細胞−およびＢ細胞−媒介免疫応答）を誘導するワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ペプチド、タンパク質）として使用できる。
さらにＧＵＣＹ２Ｃ分子の細胞機能によると本発明によると、腫瘍細胞に対する酵素の機能を調節する物質、特に低分子を開発することが出来る。酵素反応の生成物であるｃＧＭＰは、多数の機能を有する公知の細胞内シグナル分子である（Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２３０、３１）。
実施例３
診断上および治療上の癌標的としてのＳＣＧＢ３Ａ２の同定
ＳＣＧＢ３Ａ２（配列番号６）（翻訳産物：配列番号１５）は分泌グロブリン（ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｉｎ）遺伝子ファミリーに属する。配列はＧｅｎＢａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿０５４０２３として公表されている。ＳＣＧＢ３Ａ２（ＵＧＲＰ１）はサイズ１７ｋＤａのホモ二量体分泌タンパク質であり、肺および気門にもっぱら発現している（Ｎｉｉｍｉ ｅｔ ａｌ．、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７０：７１８−２５、２００２）。プライマー対（配列番号３７、３８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により正常肺組織における選択的発現が確認された。肺−および気管−特異的遺伝子、例えばサーファクタントタンパク質に対する遺伝子は、脱分化の際に悪性腫瘍において高度に下方制御され、通常肺腫瘍においては検出不可能である。驚くべきことに、ＳＣＧＢ３Ａ２が原発性および転移性肺腫瘍において活性であることが見いだされた。本発明による研究は、ＳＣＧＢ３Ａ２が強くそして高頻度に気管支癌において発現していることが示された（図４）。その他の試験した２３の正常組織は、肺および気管を除いて、発現を示さなかった（図２０）。
これをさらに特異的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（配列番号１０３、１０４）（図２０）において確認し、これはさらに５０％以上の気管支癌における少なくとも１ログの過剰発現を示した。
正常肺組織および肺癌組織診におけるＳＣＧＢ３Ａ２の選択的な高い発現は本発明によると血液および骨髄、痰、気管支吸引液または洗浄液における転移性腫瘍細胞の検出のため、そしてその他の組織、例えば局所リンパ節における転移の検出のための分子診断法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲに利用することが出来る。健康肺において、ＳＣＧＢ３Ａ２は特定の細胞によってもっぱら気管支へと分泌される。したがって、ＳＣＧＢ３Ａ２タンパク質は健康な個体における気道の外の体液において検出されることは予測されない。一方、特に転移性腫瘍細胞はそれらタンパク質産物を直接血流に分泌する。本発明の一態様はそれゆえ肺腫瘍の診断発見としての特異的抗体アッセイを介して患者の血清または血漿におけるＳＣＧＢ３Ａ２産物の検出に関する。
ＳＣＧＢ３Ａ２タンパク質を検出するための抗体をウサギの免疫化によって産生した。以下のペプチドをこれら抗体の産生に用いた：
配列番号１０５：ＬＩＮＫＶＰＬＰＶＤＫＬＡＰＬ
配列番号１０６：ＳＥＡＶＫＫＬＬＥＡＬＳＨＬＶ。
ＳＣＧＢ３Ａ２−特異的反応は免疫蛍光において検出可能であった（図２１）。分泌タンパク質について予測されるように、細胞におけるＳＣＧＢ３Ａ２の分泌は小胞体および分泌顆粒が行い得た（図２１Ａ）。特異性を確認するために、細胞をＳＣＧＢ３Ａ２−ＧＦＰ融合タンパク質を合成するプラスミドで並行してトランスフェクトした。タンパク質検出はこの場合自己蛍光性ＧＦＰ（緑色蛍光性タンパク質）（図２１Ｂ）を介して行った。２つの蛍光の図の重ね合わせにより明らかに、免疫血清が特異的にＳＣＧＢ３Ａ２タンパク質を認識すること（図２１Ｃ）が示された。
本発明によるとかかる抗体は例えば診断および治療用途でイムノアッセイの形態で利用できる。
実施例４
診断上および治療上癌標的としてのクローディン１８Ａ１およびクローディン１８Ａ２スプライスバリアントの同定
クローディン１８遺伝子は４つの膜貫通ドメインおよび細胞内Ｎ末端およびＣ末端を有する表面膜分子をコードする。Ｎｉｉｍｉら（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２１：７３８０−９０、２００１）は肺組織（クローディン１８Ａ１）および胃組織（クローディン１８Ａ２）においてそれぞれ選択的に発現すると記載されているマウスおよびヒトのクローディン１８の２つのスプライスバリアントを記載している。これらバリアントはＮ末端において相違している（図２２）。
本発明によると、スプライスバリアントであるクローディン１８Ａ２（配列番号７）とクローディン１８Ａ１（配列番号１１７）、ならびにそれらの翻訳産物（配列番号１６および１１８）が、腫瘍のためのマーカーまたは治療標的構造としてどの程度利用できるかを調べた。２つのバリアントを識別できる定量的ＰＣＲはをＡ１−特異的（配列番号１０９＆１１０）およびＡ２特異的（配列番号１０７＆１０８）プライマー対を選択することによって確立した。Ａ２スプライスバリアントはさらに常套のＰＣＲによって第二のプライマー対（配列番号３９＆４０）を用いて試験した。Ａ１バリアントは正常肺においてのみ活性であると記載されている。しかし、驚くべきことに本発明によると、Ａ１バリアントが胃粘膜においても活性であることが見いだされた。胃および肺のみが有意な活性化を示す正常組織である。その他のすべての正常組織はクローディンＡ１について陰性である。腫瘍を調べると、驚くべきことにクローディンＡ１が多数の腫瘍組織において高度に活性化されていることが見いだされた。特に強い発現は胃腫瘍、肺腫瘍、膵臓癌、食道癌（図２３）、ＥＮＴ腫瘍および前立腺癌においてみられた。ＥＮＴ、前立腺、膵臓および食道腫瘍におけるクローディンＡ１発現レベルは１００−１００００倍対応する正常組織のレベルより高かった。クローディンＡ２スプライスバリアントの研究に用いたオリゴヌクレオチドはこの転写産物の増幅を特異的に可能とするものであった（配列番号３９＆４０および１０７＆１０８）。研究により、Ａ２スプライスバリアントは胃粘膜と程度は低いが精巣組織以外の２０を超える調べた正常組織のいずれにおいても発現していないことが明らかとなった。本発明者らは、Ａ２バリアントも、Ａ１バリアントと同様に、多くの腫瘍において活性化されていることを見いだした（例えば図２４に示す）。これらには胃腫瘍（８／１０）、膵臓腫瘍（６／６）、食道癌（５／１０）および肝臓癌が含まれる。健康肺においてはクローディン１８Ａ２の活性化は検出されなかったが、驚くべきことにいくらかの肺腫瘍がＡ２．１スプライスバリアントを発現することが見いだされた。
図３Ａ：正常および腫瘍組織におけるクローディン１８Ａ２の発現
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表３Ｂ：正常および腫瘍組織におけるクローディン１８Ａ１の発現
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独立のコントロール研究としての常套のＰＣＲもまた、定量的ＰＣＲの結果を確認するものであった。これに用いたオリゴヌクレオチド（配列番号３９、４０）はＡ２スプライスバリアントの特異的増幅を可能とする。本発明によると、８／１０の胃癌および試験した膵臓癌の半分がこのスプライスバリアントの強い発現を示した（図５）。一方、常套のＰＣＲによってはその他の組織における発現は検出されなかった。特に、肺、肝臓、血液、リンパ節、乳房組織および腎臓組織では発現は無かった（表３）。
したがって該スプライスバリアントは、本発明によると、上部胃腸管ならびに肺腫瘍、ＥＮＴ腫瘍、前立腺癌およびその転移の腫瘍に対する高度に特異的な分子マーカーを表す。これら分子マーカーを本発明によると腫瘍細胞の検出に利用できる。腫瘍の検出は本発明によると上記オリゴヌクレオチドを利用して行うことが出来る（配列番号３９、４０、１０７−１１０）。特に好適なオリゴヌクレオチドは、少なくともその一方が、１８０塩基対長であって一方（配列番号８）または他方のスプライスバリアント（配列番号１１９）に特異的な転写産物のセグメントとストリンジェントな条件下で結合するプライマー対である。
タンパク質レベルでこれらのデータを確認するために、クローディン−特異的抗体および免疫血清を動物の免疫化により測定した。クローディン１８の細胞膜局在およびタンパク質トポロジーを、バイオインフォマティクスツール（ＴＭＨＭＭ、ＴＭＰＲＥＤ）による膜貫通ドメインの分析および増強ＧＦＰをタグ付加されたクローディン１８融合タンパク質を発現する細胞の免疫蛍光研究によって確認した。クローディン１８は２つの細胞外ドメインを有する。Ｎ末端細胞外ドメインは２つのスプライスバリアントにおいて配列において異なる（Ａ１は配列番号１１１およびＡ２は配列番号１１２）。Ｃ末端細胞外ドメインは両方のバリアントについて同一である（配列番号１３７）。今日まで、クローディン１８の細胞外ドメインに結合する抗体は記載されていない。本発明によると、細胞外に位置し、バリアントＡ１またはＡ２に特異的な、または両バリアントに存在するペプチドエピトープを免疫化に選択した。クローディン１８の両方のバリアントは古典的なグリコシル化モチーフを有さず、タンパク質のグリコシル化はそれゆえ予測されなかった。にもかかわらず、アスパラギン、セリン、スレオニンを含むエピトープが古典的グリコシル化部位が無くてもまれにグリコシル化される可能性があることを考慮して、エピトープの選択に注意を払った。エピトープのグリコシル化はこのエピトープに対して特異的な抗体の結合を妨害しうる。とりわけ、エピトープは本発明によると、それによって作られる抗体が、抗原のグリコシル化状態の識別を可能とするように選択した。以下のペプチドをとりわけ、免疫化のために抗体の産生に選択した：
配列番号１７：ＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮ（Ｎ−末端細胞外ドメイン、Ａ２−特異的、グリコシル化と関係なく結合）
配列番号１８：ＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱ（Ｎ−末端細胞外ドメイン、Ａ２−特異的、非グリコシル化形態に主に結合、Ｎ３７）
配列番号１１３：ＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦ（Ｎ−末端細胞外ドメイン、Ａ２−特異的、非グリコシル化形態のみに結合、Ｎ３７）
配列番号１１４：ＤＭＷＳＴＱＤＬＹＤＮＰ（Ｎ−末端細胞外ドメイン、Ａ１−特異的）
配列番号１１５：ＣＲＰＹＦＴＩＬＧＬＰＡ（Ｎ−末端細胞外ドメイン、主にＡ１に特異的）
配列番号１１６：ＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧ（Ｃ−末端細胞外ドメイン、Ａ１とＡ２との両方を認識）。
配列番号１７による免疫化により産生されたＡ２−特異的抗体についてのデータを例示により示す。特異的抗体は免疫蛍光研究のための様々な固定条件下で利用できる。ＲＴ−ＰＣＲ−陽性および陰性細胞株の比較染色により、容易に検出可能な量において、対応するタンパク質は陽性とされる胃癌細胞株において特異的に検出できる（図２５）。内因性タンパク質は膜に位置し、膜上に比較的大きな限局的な集合体を形成する。この抗体をさらにウェスタンブロッティングにおけるタンパク質検出に用いた。予測されたように、タンパク質は胃にのみ検出され、その他の正常組織においては、肺においてさえ検出されなかった（図２９）。患者からの胃腫瘍と隣接する正常胃組織の対比染色により、驚くべきことに、クローディン１８Ａ２が、このタンパク質が検出されるすべての胃腫瘍において小さい分子量を有していることが明らかとなった（図３０、左）。本発明によると一連の実験において、正常胃組織の可溶化液を脱グリコシル化剤ＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した場合にもこのレベルのバンドが現れることが判明した（図３０、右）。一方Ａ２バリアントのグリコシル化形態はもっぱらすべての正常胃組織において検出可能であり、Ａ２は６０％以上の調べた胃癌において検出可能であり、特にもっぱら脱グリコシル化形態におけるものであった。クローディン１８のＡ２バリアントはタンパク質レベルにおいてさえ正常肺では検出されないが、それは気管支癌においてはみられ、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べたとおりであった。この場合も、脱グリコシル化バリアントのみが存在した（図３１）。本発明によるとクローディン１８Ａ２スプライスバリアントの細胞外ドメインを認識する抗体を産生した。さらに、クローディン１８Ａ１スプライスバリアントのＮ末端ドメインを選択的に認識する抗体（図２８）およびＣ末端細胞外ドメインの領域において両方のバリアントに結合する抗体（図２７）を産生した。本発明によると診断目的でのかかる抗体の使用、例えば、免疫組織学（図３２）、だけでなく上述のように治療目的での使用が可能である。さらに重要な態様はクローディン１８の示差的にグリコシル化されたドメインに関する。本発明によると非グリコシル化エピトープにのみ結合する抗体を産生した。クローディン１８自体は胃組織（Ａ２）ならびに肺および胃（Ａ１）に対する高度に選択的な分化抗原である。腫瘍においてはそれはグリコシル化機構における変化によって明らかに影響を受けるため、特定の脱グリコシル化されたＡ２のバリアントが腫瘍において産生される。これは診断および治療に利用できる。免疫血清、例えばここで記載する免疫血清（配列番号１７のペプチドに対するもの）を診断に、例えば、ウェスタンブロッティングにおいて利用できる。例えば配列番号１１３のペプチドでの免疫化によって生じる、グリコシル化されたエピトープにまったく結合することが出来ない抗体（図２６）は、結合において腫瘍組織を正常組織と区別できる。特にかかる抗体の治療での使用が可能である。というのはそれらは高度に選択的であるからである。産生された抗体は、キメラまたはヒト化組換え抗体の産生に直接用いることも出来る。これはまたウサギから得た抗体を用いて直接行いうる（これについては、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｍａｙ５；２７５（１８）：１３６６８−７６ ｂｙ Ｒａｄｅｒ Ｃ、Ｒｉｔｔｅｒ Ｇ、Ｎａｔｈａｎ Ｓ、Ｅｌｉａ Ｍ、ＧｏｕｔＩ、Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ ＡＡ、Ｃｏｈｅｎ ＬＳ、Ｗｅｌｔ Ｓ、Ｏｌｄ ＬＪ、ＢａｒｂａｓＣＦ ３ｒｄ． “Ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ”を参照）。この目的のために、免疫した動物からのリンパ球を保存した。アミノ酸１−４７（配列番号１９および１２０）もまた免疫療法、例えば、ワクチンおよび抗原−特異的Ｔリンパ球の養子移入、の特に良好なエピトープである。
実施例５
診断上および治療上癌標的としてのＳＬＣ１３Ａ１の同定
ＳＬＣ１３Ａ１は硫酸ナトリウム共輸送体のファミリーに属する。ヒト遺伝子は、この遺伝子のマウスホモログと異なり、腎臓において選択的に発現する（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ７０：３５４−６３）。ＳＬＣ１３Ａ１は５９５ アミノ酸のタンパク質をコードし、１３の推定膜貫通ドメインを含む。選択的スプライシングにより、４種類の転写産物（配列番号４１−４４）およびその対応する翻訳産物（配列番号４５−４８）が生じる。ＳＬＣ１３Ａ１が腎臓腫瘍のマーカーとして利用できるかを調べた。ＳＬＣ１３Ａ１の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号４９、５０）をこの目的のために用いた。
表４：正常および腫瘍組織におけるＳＬＣ１３Ａ１の発現
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ＳＬＣ１３Ａ１−特異的プライマー対（配列番号４９、５０）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、実質的に腎臓における選択的発現が確認され、本発明により示されるように調べた腎臓細胞癌組織診の実質的にすべて（７／８）において高発現していた（表４、図６）。特異的プライマー（配列番号１２１、１２２）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲもまたこれらのデータを確認した（図３４）。弱いシグナルが以下の正常組織において検出可能であった：結腸、胃、精巣、乳房、肝臓および脳。腎臓癌における発現はしかし、その他のすべての正常組織よりも、少なくとも１００倍高かった。
細胞におけるＳＬＣ１３Ａ１の細胞内局在を分析するために、タンパク質をレポーター分子としてのｅＧＦＰと融合させ、適当なプラスミドでのトランスフェクションの後、２９３細胞において異種発現させた。局在を次いで蛍光顕微鏡下で分析した。本発明者らのデータは驚くべきことにＳＬＣ１３Ａ１が膜内在性分子であることを確認した（図３５）。
ＳＬＣ１３Ａ１タンパク質の検出用の抗体をウサギの免疫化により産生した。配列番号１２３および１２４のペプチドをこれら抗体の産生に用いた。かかる抗体は原理的に診断および治療目的で利用できる。
ＳＬＣ１３Ａ１タンパク質は１３の膜貫通ドメインおよび７つの細胞外領域を有する。ＳＬＣ１３Ａ１のこれら細胞外ドメインは特に本発明によるとモノクローナル抗体の標的構造として利用できる。ＳＬＣ１３Ａ１はイオンの輸送にチャンネルタンパク質として関与している。健康腎臓におけるＳＬＣ１３Ａ１の細胞外ドメインは極性によって尿路（管腔内）の方向を向いている。しかし治療に用いられる高分子量モノクローナル抗体は尿路に入らないため、健康腎臓においてはＳＬＣ１３Ａ１への結合は起こらない。一方、ＳＬＣ１３Ａ１の極性は腫瘍細胞においては無くなり、タンパク質は血流を介して直接抗体標的化に用いられる。腎臓細胞癌におけるＳＬＣ１３Ａ１の顕著な発現および高頻度により、このタンパク質は本発明によると非常に興味深い診断上および治療上のマーカーとなる。これは本発明によるとＲＴ−ＰＣＲによる、血清、骨髄、尿における転移性の腫瘍細胞の検出およびその他の組織における転移の検出を含む。さらに本発明によると、ＳＬＣ１３Ａ１の細胞外ドメインは、モノクローナル抗体を用いる免疫診断および治療のための標的構造としての使用が可能である。ＳＬＣ１３Ａ１はさらに本発明によると腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞−媒介免疫応答）を誘導するためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として利用できる。これは、本発明によると、ＳＬＣ１３Ａ１の生理活性を調節するいわゆる低分子化合物の開発も含み、腎臓腫瘍の治療用に利用することが出来る。
実施例６
診断上および治療上癌標的としてのＣＬＣＡ１の同定
ＣＬＣＡ１（配列番号５１；翻訳産物：配列番号６０）は、Ｃａ＋＋−活性化Ｃｌ−チャンネルのファミリーに属する。配列はＧｅｎｂａｎｋにおいて登録番号ＮＭ＿００１２８５として公表されている。ＣＬＣＡ１はもっぱら腸陰窩上皮および杯細胞に発現している（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５４：２００−１４、１９９８）。ＣＬＣＡ１が結腸癌および胃癌のマーカーとして利用できるかを調べた。ＣＬＣＡ１の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号６７、６８）をこの目的のために用いた。このプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により結腸における選択的発現が確認され、本発明によると（３／７）の調べた結腸癌および（１／３）の調べた胃癌サンプルにおける高い発現が示された（図７）。その他の正常組織は、発現を示さないか非常に弱い発現を示した。これはさらに特異的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（配列番号１２５、１２６）によって確認され、ここで、発現は分析した正常組織においては検出されなかった（図３６）。この実験で調べた腫瘍サンプルの中で、６／１２の結腸癌サンプルと５／１０の胃癌サンプルはＣＬＣＡ１について陽性であった。総じて、この遺伝子の腫瘍における発現は無調節であるようであった。非常に強い発現を示すサンプルに加えて、ＣＬＣＡ１はその他のサンプルにおいて顕著に下方制御されていた。
タンパク質は４つの膜貫通ドメイン、全部で２つの細胞外領域を有すると予測される。ＣＬＣＡ１のこれら細胞外ドメインは、特に本発明によるとモノクローナル抗体のための標的構造として利用できる。
ＣＬＣＡ１が胃癌および結腸癌において強力に発現していることそして高頻度であることにより、このタンパク質は本発明によると興味深い診断上および治療上のマーカーとなる。これには本発明によると、ＲＴ−ＰＣＲによる血清、骨髄、尿の転移性腫瘍細胞の検出ならびにその他の器官における転移の検出が含まれる。さらに本発明によるとＣＬＣＡ１の細胞外ドメインをモノクローナル抗体による免疫診断および治療の標的構造として利用できる。ＣＬＣＡ１は本発明によるとさらに腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞−媒介免疫応答）を誘発するためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として利用できる。これには本発明によるとＣＬＣＡ１の輸送タンパク質としての生理活性を調節し、胃腸腫瘍の治療に利用できるいわゆる低分子化合物の開発が含まれる。
実施例７
診断上および治療上癌標的としてのＦＬＪ２１４７７の同定
ＦＬＪ２１４７７（配列番号５２）およびその推定翻訳産物（配列番号６１）は仮定上のタンパク質としてＧｅｎｂａｎｋにおいて登録番号．ＮＭ＿０２５１５３として公表されている。それはＡＴＰａｓｅ活性および４つの膜貫通ドメインを有する膜内在性タンパク質であり、したがって特異的抗体による治療に好適である。ＦＬＪ２１４７７−特異的プライマー（配列番号６９、７０）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により結腸における選択的発現、さらに（７／１２）の調べた結腸癌サンプルにおいて様々なレベルの発現が示された（図８）。その他の正常組織は発現を示さなかった。これをさらに特異的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（配列番号１２７、１２８）により確認した。ＦＬＪ２１４７７−特異的発現は結腸（図３７Ａ）および１１／１２の結腸癌において検出可能であった。結腸組織における発現の他に、発現はさらに胃組織でも検出可能であった。さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲの条件下で、脳、胸腺および食道において検出可能な発現は、結腸および胃と比較して顕著に弱かった（図３７Ａ）。さらに以下の腫瘍サンプルにおけるＦＬＪ２１４７７−特異的発現を検出することが出来た：胃、膵臓、食道および肝臓。
タンパク質は４つの膜貫通ドメインと全部で２つの細胞外領域を有すると予測される。これらＦＬＪ２１４７７の細胞外ドメインは、本発明によると特にモノクローナル抗体のための標的構造として利用できる。
胃および結腸癌におけるＦＬＪ２１４７７の発現とその高い頻度により、該タンパク質は本発明によると、有用な診断上および治療上マーカーとなる。これには本発明によるとＲＴ−ＰＣＲによる血清、骨髄、尿における転移性腫瘍細胞の検出ならびにその他の器官における転移の検出が含まれる。さらに、ＦＬＪ２１４７７の細胞外ドメインは本発明によるとモノクローナル抗体による免疫診断および治療の標的構造として利用できる。さらに本発明によると、ＦＬＪ２１４７７は腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞−媒介免疫応答）の誘発のためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として利用できる。
実施例８
ＦＬＪ２０６９４の診断上および治療上癌標的としての同定
ＦＬＪ２０６９４（配列番号５３）およびその翻訳産物（配列番号６２）は仮定上のタンパク質としてＧｅｎｂａｎｋに登録番号．ＮＭ＿０１７９２８として公表されている。このタンパク質は膜内在性分子（膜貫通ドメインＡＡ３３−５４）であり、チオレドキシン機能を有するようである。ＦＬＪ２０６９４−特異的プライマー（配列番号７１、７２）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、結腸における選択的発現、さらに（５／９）の結腸癌サンプルにおける様々なレベルの発現が示された（図９）。その他の正常組織は発現を示さなかった。これはさらに特異的定量的ＲＴ−ＰＣＲ（配列番号１２９、１３０）により確認された（図３８）。ＦＬＪ２９６９４発現は結腸および胃（最初の実験では分析していない）以外のその他の正常組織では検出されなかった。
タンパク質は１つの膜貫通ドメインと１つの細胞外領域を有すると予測される。ＦＬＪ２０６９４のこれら細胞外ドメインは特に本発明によると、モノクローナル抗体のための標的構造として利用できる。
さらに、ＦＬＪ２０６９４は本発明によると腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞−媒介免疫応答）を誘発するためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として利用できる。これには本発明によるとＦＬＪ２０６９４の生理活性を調節するいわゆる低分子化合物の開発も含まれ、胃腸腫瘍の治療に利用できる。
実施例９
ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓタンパク質（ｃ２０ｏｒｆ１１４）の診断上および治療上癌標的としての同定
ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓタンパク質（配列番号５４）およびその翻訳産物（配列番号６３）は上気道および鼻咽頭上皮のＰｌｕｎｃ−関連タンパク質としてＧｅｎｂａｎｋにおいて登録番号．ＡＦ３６４０７８として公表されている。本発明によると、ｖｏｎ Ｅｂｎｅｒ’ｓタンパク質が肺癌のマーカーとして利用できるかを調べた。Ｅｂｎｅｒ’ｓタンパク質の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号７３、７４）をこの目的のために用いた。このプライマーセットによるＲＴ−ＰＣＲ研究は、肺および（５／１０）の調べた肺癌サンプルにおける選択的発現を示した（図１０）。正常組織の群において胃での発現も示された。その他の正常組織は発現を示さなかった。
実施例１０
Ｐｌｕｎｃの診断上および治療上癌標的としての同定
Ｐｌｕｎｃ（配列番号５５）およびその翻訳産物（配列番号６４）はＧｅｎｂａｎｋに登録番号．ＮＭ＿０１６５８３として公表されている。ヒトＰｌｕｎｃは２５６アミノ酸であってマウスＰｌｕｎｃタンパク質と７２％の相同性を示すタンパク質をコードする（Ｂｉｎｇｌｅ ａｎｄ Ｂｉｎｇｌｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４９３：３６３−７、２０００）。Ｐｌｕｎｃの発現は気管、上気道、鼻咽頭上皮および唾液腺に限定されている。
本発明により、Ｐｌｕｎｃが肺癌のマーカーとして利用できるかを調べた。Ｐｌｕｎｃの特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号７５、７６）をこの目的のために使用した。
このプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、胸腺、肺および（６／１０）の調べた肺癌サンプルにおける選択的発現が示された（図１１）。その他の正常組織は発現を示さなかった。
実施例１１
ＳＬＣ２６Ａ９の診断上および治療上癌標的としての同定
ＳＬＣ２６Ａ９（配列番号５６）およびその翻訳産物（配列番号６５）はＧｅｎｂａｎｋに登録番号．ＮＭ＿１３４３２５として公表されている。ＳＬＣ２６Ａ９は陰イオン交換体のファミリーに属する。ＳＬＣ２６Ａ９の発現は細気管支および肺の肺胞上皮に限定されている（Ｌｏｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：１４２４６−５４、２００２）。
ＳＬＣ２６Ａ９が肺癌のマーカーとして利用できるかを調べた。この目的のためにＳＬＣ２６Ａ９の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号７７、７８）を用いた。ＳＬＣ２６Ａ９−特異的プライマー（配列番号７７、７８）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、肺およびすべて（１３／１３）の調べた肺癌サンプルにおける選択的発現が示された（図１２）。甲状腺を除くその他の正常組織は発現を示さなかった。まず、配列番号１３１および１３２のプライマーを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験においてこれらの結果を確認することが出来、さらなる情報が得られた。４−５の腫瘍組織のプールされたサンプルにおいて、肺、結腸、膵臓および胃腫瘍におけるＳＬＣ２６Ａ９−特異的ＲＮＡの高い発現レベルを検出することが出来た。ＳＬＣ２６Ａ９は膜貫通陰イオン輸送体のファミリーのメンバーである。健康な肺において、タンパク質は気道の方向において管腔内に向いており、したがって血液からのＩｇＧ抗体を直接用いることは出来ない。一方、タンパク質の極性は腫瘍では失われている。したがって本発明によると、特定の腫瘍、とりわけ、肺腫瘍、胃癌、膵臓癌においてモノクローナル抗体を用いた治療標的としてＳＬＣ２６Ａ９を用いることが出来る。肺、胃、膵臓および食道癌におけるＳＬＣ２６Ａ９の顕著な高発現および高頻度により、このタンパク質は本発明によると、良好な診断上および治療上マーカーとなる。これには本発明によるとＲＴ−ＰＣＲによる血清、骨髄および尿における転移性腫瘍細胞の検出ならびにその他の器官における転移の検出が含まれる。さらに、ＳＬＣ２６Ａ９の細胞外ドメインは本発明によると、モノクローナル抗体による免疫診断および治療のための標的構造として利用することが出来る。さらに本発明によると腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞−媒介免疫応答）の誘発のためのワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）としてＳＬＣ２６Ａ９を用いることが出来る。これには本発明によると、ＳＬＣ２６Ａ９の生理活性を調節するいわゆる低分子化合物の開発も含まれ、肺腫瘍および胃腸腫瘍の治療に利用できる。
実施例１２
ＴＨＣ１００５１６３の診断上および治療上癌標的としての同定
ＴＨＣ１００５１６３（配列番号５７）はＴＩＧＲ遺伝子インデックスからの遺伝子断片である。該遺伝子は３’領域のみ明らかになっており、ＯＲＦは欠失している。ＲＴ−ＰＣＲ研究をＴＨＣ１００５１６３−特異的プライマー（配列番号７９）および５’末端に２１特異的塩基の特異的タグを有するオリゴｄＴ１８プライマーを用いて行った。このタグは公知の配列との相同性についてのデータベースサーチプログラムを用いて調べた。この特異的プライマーをまずゲノムＤＮＡの汚染を除くためにｃＤＮＡ合成に用いた。このプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、胃、卵巣、肺および（５／９）の肺癌組織診における発現が示された（図１３）。その他の正常組織は発現を示さなかった。
実施例１３
ＬＯＣ１３４２８８の診断上および治療上癌標的としての同定
ＬＯＣ１３４２８８（配列番号５８）およびその推定翻訳産物（配列番号６６）はＧｅｎｂａｎｋに登録番号．ＸＭ＿０５９７０３として公表されている。
本発明によると、ＬＯＣ１３４２８８が腎臓細胞癌のマーカーとして利用できるかを調べた。ＬＯＣ１３４２８８の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号８０、８１）をこの目的のために用いた。ＲＴ−ＰＣＲ研究により腎臓および（５／８）の調べた腎臓細胞癌組織診における選択的発現が示された（図１４）。
実施例１４
ＴＨＣ９４３８６６の診断上および治療上癌標的としての同定
ＴＨＣ９４３８６６（配列番号５９）はＴＩＧＲ遺伝子インデックスからの遺伝子断片である。ＴＨＣ９４３８６６が腎臓細胞癌のマーカーとして利用できるかを調べた。ＴＨＣ９４３８６６の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号８２、８３）をこの目的のために用いた。
ＴＨＣ９４３８６６−特異的プライマー（配列番号８２、８３）を用いたＲＴ−ＰＣＲ研究により、腎臓および（４／８）の調べた腎臓細胞癌組織診における選択的発現が示された（図１５）。
実施例１５
ＦＬＪ２１４５８の診断上および治療上癌標的としての同定
ＦＬＪ２１４５８（配列番号８４）およびその推定翻訳産物（配列番号８５）はＧｅｎｂａｎｋに登録番号．ＮＭ＿０３４８５０として公表されている。配列分析により、該タンパク質が新規なブチロフィリンファミリーのメンバーを表すことが明らかとなった。構造分析によりそれは１つの細胞外免疫グロブリンドメインを有する１型膜貫通タンパク質であることが明らかとなった。ＦＬＪ２１４５８の特異的増幅を可能とするオリゴヌクレオチド（配列番号８６、８７）を発現の調査に用いた。ＦＬＪ２１４５８−特異的プライマー（配列番号８６、８７）によるＲＴ−ＰＣＲ研究は、結腸および（７／１０）の調べた結腸癌組織診における選択的発現を示した（図１６、表５）。特異的プライマー（配列番号１３３、１３４）を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、選択的発現プロフィールが確認された（図３９）。さらにこの実験において結腸、胃、直腸および盲腸におけるＦＬＪ２１４５８の胃腸−特異的検出および精巣における検出を行うことが可能であった。７／１１の結腸転移サンプルも定量的ＰＣＲにおいて陽性であった。ＦＬＪ２１４５８−特異的発現はその他の腫瘍にも拡張され、タンパク質−特異的発現は胃、膵臓および肝臓腫瘍において検出可能であった（表５）。ＦＬＪ２１４５８タンパク質の検出用の抗体はウサギの免疫化によって産生した。以下のペプチドをこれら抗体の産生に用いた：
配列番号１３５：ＱＷＱＶＦＧＰＤＫＰＶＱＡＬ
配列番号１３６：ＡＫＷＫＧＰＱＧＱＤＬＳＴＤＳ。
ＦＬＪ２１４５８−特異的反応は免疫蛍光において検出可能であった（図４０）。抗体の特異性を確認するために、２９３細胞をＦＬＪ２１４５８−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドでトランスフェクトした。特異性は一方でＦＬＪ２１４５８−特異的抗体を用いた共存研究により確認され、他方で自己蛍光性ＧＦＰにより確認された。２つの蛍光図の重ね合わせは、免疫血清が特異的にＦＬＪ２１４５８タンパク質を認識することを明白に示した（図４０ａ）。タンパク質の過剰発現により結果として得られた細胞染色は散在性であり、明白なタンパク質の局在化は出来なかった。このため、さらなる免疫蛍光実験をＦＬＪ２１４５８を内因的に発現する胃腫瘍特異的細胞株Ｓｎｕ１６を用いて行った（図４１Ｂ）。細胞をＦＬＪ２１４５８−特異的抗血清および膜タンパク質Ｅ−カドヘリンを認識するもう１つの抗体で染色した。ＦＬＪ２１４５８−特異的抗体は少なくとも弱く細胞膜を染色し、したがってＦＬＦ２１４５８が細胞膜に局在することが証明された。
バイオインフォマティクス研究により、ＦＬＪ２１４５８によってコードされるタンパク質が細胞表面分子であり、免疫グロブリン超分子ドメインを有することが示された。この表面分子の選択的発現により、それは、腫瘍細胞の検出の診断方法および腫瘍細胞を排除する治療方法の開発のための良好な標的となる。
胃癌および結腸癌におけるＦＬＪ２１４５８の高発現および高頻度によりこのタンパク質は本発明によると、非常に興味深い診断上および治療上のマーカーとなる。これには本発明によると、ＲＴ−ＰＣＲによる、血清、骨髄および尿における転移性腫瘍細胞の検出およびその他の器官における転移の検出が含まれる。さらに本発明によるとＦＬＪ２１４５８の細胞外ドメインを、モノクローナル抗体による免疫診断および治療のための標的構造として利用することが出来る。さらに本発明によるとＦＬＪ２１４５８を腫瘍特異的免疫応答（ＴおよびＢ細胞−媒介免疫応答）を誘導するワクチン（ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド）として用いることが出来る。これには、本発明によるとＦＬＪ２１４５８の生理活性を調節するいわゆる低分子化合物の開発が含まれ、胃腸腫瘍の治療に利用することが出来る。
表５：正常および腫瘍組織におけるＦＬＪ２１４５８発現
Figure 0006182127

Claims (13)

  1. 以下を含む腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる癌疾患に関連する癌細胞の検出を補助する方法であって、前記癌疾患が膵臓癌、肝臓癌、または結腸癌転移である検出補助方法：
    （ｉ）腫瘍関連抗原をコードする核酸の検出、および／または、
    （ｉｉ）腫瘍関連抗原の検出、
    ここで該腫瘍関連抗原は以下からなる群から選択される核酸によってコードされる配列を有する：
    （ａ）配列番号８４の核酸配列を含む核酸、および
    （ｂ）（ａ）の核酸と少なくとも９５％同一である核酸。
  2. 検出が以下の工程を含む請求項１の方法：
    （ｉ）生物学的サンプルと、腫瘍関連抗原をコードする核酸にまたは腫瘍関連抗原に特異的に結合する剤とを、接触させる工程、および、
    （ｉｉ）剤と、核酸または腫瘍関連抗原との複合体の形成を検出する工程。
  3. 前記核酸を、該核酸に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いるか、あるいは該核酸を選択的に増幅することによって検出する、請求項１または２のいずれかの方法。
  4. 前記腫瘍関連抗原が該腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体を用いて検出される請求項１または２のいずれかの方法。
  5. 腫瘍関連抗原の発現または異常発現によって特徴づけられる癌疾患の退行、経過または発症の判定を補助する方法であって、前記癌疾患が膵臓癌、肝臓癌、または結腸癌転移であり、該疾患を患う患者または該疾患に罹患すると予測される患者からのサンプルを、以下からなる群から選択される１または複数のパラメーターについてモニタリングすることを含む判定補助方法：
    （ｉ）腫瘍関連抗原をコードする核酸の量、および
    （ｉｉ）腫瘍関連抗原の量、
    ここで該腫瘍関連抗原は以下からなる群から選択される核酸によってコードされる配列を有する：
    （ａ）配列番号８４の核酸配列を含む核酸、
    （ｂ）（ａ）の核酸と少なくとも９５％同一である核酸。
  6. 核酸の量を、該核酸に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブを用いるか、あるいは該核酸を選択的に増幅することによってモニタリングする、請求項５の方法。
  7. 腫瘍関連抗原の量を該腫瘍関連抗原に特異的に結合する抗体を用いてモニタリングする、請求項５の方法。
  8. ポリヌクレオチドプローブまたは抗体が検出可能な様式で標識される、請求項３または４および６または７のいずれかの方法。
  9. 抗体がモノクローナル抗体、キメラまたはヒト化抗体、または抗体の抗原結合断片である請求項４または７のいずれかの方法。
  10. 腫瘍関連抗原が配列番号８５、１３５および１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１−９のいずれかの方法。
  11. タンパク質またはポリペプチドに結合する抗体を含む診断用組成物であって、ここで該タンパク質またはポリペプチドが以下：
    （ａ）配列番号８４の核酸配列を含む核酸、および
    （ｂ）（ａ）の核酸と少なくとも９５％同一である核酸、
    からなる群から選択される核酸によってコードされ、前記組成物が膵臓癌、肝臓癌、または結腸癌転移の診断に使用するためのものであり、前記タンパク質またはポリペプチドが配列番号８５、１３５および１３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、組成物。
  12. 抗体が、モノクローナル、キメラまたはヒト化抗体あるいは抗体の抗原結合断片である、請求項１１の組成物。
  13. 抗体が診断薬と結合している、請求項１１または１２の組成物。
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