WO2014025198A2

WO2014025198A2 - Lfa3 변이체 및 상기 변이체 또는 lfa3 cd2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도

Info

Publication number: WO2014025198A2
Application number: PCT/KR2013/007111
Authority: WO
Inventors: 장우익; 배진건; 조영규; 원재선; 양인영; 윤창현; 부경현; 이운영; 이진각; 이민경
Original assignee: 주식회사 한독
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2013-08-07
Publication date: 2014-02-13
Also published as: WO2014025198A3

Abstract

본원은 변형된 LFA3, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하는 벡터 및 숙주세포가 개시된다. 본원은 또한 본원에 따른 변형된 LFA3 또는 야생형 LFA3 및 이와 융합된 표적 특이적 폴리펩타이드의 융합단백질 및 이의 질환 치료제로서의 용도가 개시된다. 본원에 개시된 LFA3 변이체 및 이를 포함하는 융합단백질은 특정 세포를 특이적으로 인식할 수 있도록 제조되어 면역계 활성화를 통해 암과 같은 특정 세포의 사멸을 유도하여 질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

LFA3 변이체 및 상기 변이체 또는 LFA3 CD2 결합영역과 이에 표적 특이적 폴리펩타이드가 연결된 융합단백질 및 그 용도

LFA3 및 그 변이체를 이용한 치료제 기술분야이다.

자가면역 질환 및 암을 포함하는 다양한 질환에서 면역계를 이용한 표적 치료가 효과적인 치료 방법으로 대두되고 있다. 기존에 면역계를 이용한 치료는 특정 항원을 발현하는 세포를 살해하는 효과기 기능을 이용하는 것이다. 예를 들면 T 세포나 NK세포, 대식세포 등을 타겟으로 하여 특정 면역 효능 세포를 이용하는 것으로 이 중 특히 T 세포를 사용하는 방법이 널리 사용되고 있는데 그 중 대표적인 것이 CD3를 타겟으로 하는 것이다. CD3은 신호 전달에 관여하며 T 세포 수용체와 복합체를 형성하고 있다. CD3은 흔히 세포독성 T 세포를 특정 항원을 발현하는 세포로 유도하여 직접적으로 사멸하는 것을 목적으로 하여 사용된다. 그러나 T 세포가 활성화되기 위해서는 다양한 공자극인자가 필요하다. 이러한 한계를 극복하는 CD3 표적 분자로는 BiTE(Bispecific T cell engager)가 있는데 기존의 다른 CD3 항체에 비해 co-stimulation 없이 T-세포 매개 세포독성을 보이는 것으로 관찰되었다(Curr Opin Mol Ther. 11, 22-30 (2009). 그러나 BiTE는 다클론적으로 T 세포 활성에 관여하나, 작은 분자 사이즈로 인하여 혈액 내 반감기가 짧아 매일 투여를 해야 하는 단점을 가지고 있다.

다른 예로는 T 세포 활성화 분자를 이용하는 것으로 LFA3 (Lymphocyte Function associated Antigen-3)를 들 수 있다. 이는 항원제시세포 등에 존재하는 단백질로 T 세포의 CD2 수용체에 결합하여 메모리 T 세포의 증식을 유도하여 사이토카인의 방출을 유도한다. 따라서 CD2에의 결합을 방해하는 LFA3와 항체의 Fc 영역등과의 융합단백질을 이용한 Alefacept (Biogen Inc.)와 같은 건선치료용 약품이 개발되었다.

미국 공개특허공보 제2006-0233796호는 메모리 효과기 T 세포 조절방법 및 조성물에 관한 것으로, LFA3의 CD2 결합 영역을 이용하여 장질환, 류마티스성 관절염, 다발성경화증에의 치료용도를 개시하고 있다.

미국 등록특허 제 5,547,853호는 LFA3의 CD2 결합영역 서열을 개시하고 있다.

하지만 T 세포 활성화 분자를 이용한 특정 세포를 표적으로 할 수 있는 다양한 질환의 치료제의 생산 및 부작용에 있어서, 개선된 물질의 개발이 필요하다.

본원은 상기 문제점을 해결하기 위해서 안출된 것으로, 면역계를 이용하여 질환과 관련된 특정 인자를 특이적으로 발현하는 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

한 양태에서 본원은 변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 따른 CD2 결합 폴리펩타이드 변이체는 서열번호 1의 서열을 기준으로 29 내지 123 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 변형은 하기 모든 위치에서, 하기 각 위치에 기재된 아미노산 중 어느 하나로 치환된 것인, 변형된 LFA3 CD2 결합 폴리펩타이드: 36번째 아미노산이 Val에서 Thr, Lys, Pro 또는 Val; 37번째 아미노산이 Val에서 Trp, Lys 또는 Val; 38번째 아미노산이 Tyr에서 Lys 또는 Gly; 40번째 아미노산이 Asn에서 Asp 또는 Thr; 76번째 아미노산이 Ser에서 Asp, 또는 Arg; 79번째 아미노산이 Asn에서 Gly; 93 번째 아미노산이 Tyr에서 Asn; 94 번째 아미노산이 Asn에서 Ser; 96 번째 아미노산이 Thr에서 Gln, Lys, 또는 Arg; 97 번째 아미노산이 Ile, Arg, Ala 또는 Pro으로 치환된 것이다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 변이체에 포함되는 치환은 하기 하나 이상의 변형을 부가적으로 포함한다: 39번째 아미노산이 Gly에서 Asp; 44번째 아미노산이 His에서 Thr; 45번째 아미노산이 Val에서 Cys; 46번째 아미노산이 Pro에서 Thr; 47번째 아미노산이 Ser에서 Ala; 48번째 아미노산이 Asn에서 Ser; 50번째 아미노산이 Pro에서 Lys; 51번째 아미노산이 Leu에서 Ser; 52번째 아미노산이 Lys에서 Ile; 81번째 아미노산이 Val에서 Ala; 82번째 아미노산이 Tyr에서 Asp; 83번째 아미노산이 Leu 에서 Trp; 85 번째 아미노산이 Thr에서 Gln; 86 번째 아미노산이 Val에서 Gly; 87 번째 아미노산이 Ser에서 Asn; 88 번째 아미노산이 Gly에서 Phe; 89 번째 아미노산이 Ser에서 Pro; 98 번째 아미노산이 Ser에서 Glu; 또는 101 번째 아미노산이 Asp에서 Gly으로 치환; 또는 48번째 부위에 Gln의 삽입 또는 82번째 부위에 Ser-Arg-Arg-Ser-Leu으로 서열의 폴리펩타이드의 삽입.

본원에 따른 다른 구현예에서 본원의 변형된 CD2 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나로 표시된다. 본원에 따른 다른 구현예에서, 상기 폴리펩타이드는 그 C-말단에 Leu-Pro-Ser-Pro-Thr을 추가로 포함한다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8 내지 12 중 어느 하나로 표시된다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8 내지 12 로 표시되는 서열의 3’말단에 상기 C-말단에 추가된 Leu-Pro-Ser-Pro-Thr를 코딩하는 핵산서열 ctgccgtctccgacc를 추가로 포함한다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 이에 작동가능하게 연결된 조절서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 균주 예를 들면 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드 또는 이의 야생형 폴리펩타이드 및 표적 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질을 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서, CD2 결합 폴리펩타이드는 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단 부위에 위치할 수 있다.

본원에 따른 융합단백질은 링커, 예를 들면 폴리펩타이드 링커, 예를 들면 유연성있는 폴리펩타이드 링커, 예를 들면 서열번호 13의 서열로 표시되는 링커에 의해 연결될 수 있다.

본원에 따른 융합단백질에 연결되는 표적 특이적 폴리펩타이드는 항원 또는 에피토프를 특이적으로 인식하는 것으로 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체로, 공지된 다양한 표적 특이적 폴리펩타이드가 사용될 수 있으며, 예를 들면 scFv, BITE, TandAb, Immunobody, Flexibody, Nanobody, Triomab, Troybody, Pepbody, Vaccibody, SMIP, Fab(fragment antigen binding), mAb², UniBody, Fv (fragment variable), dAB, scFV-Fc, Diabody, Tetrabody, Minibody, scFab(single chain Fab), 또는 Fcab를 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 항체 모방체는 DARPin, Tetranectin, Affibody, Transbody, Anticalin, AdNectin, Affilin, Microbody, Peptide aptamer, Phylomer, Stradobody, Avimer, Maxibodiy, Evibody, 또는 Fynomer를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 융합단백질은 특정 표적을 특이적으로 인식하는 것으로, 이러한 표적은 특히 세포 표면에 위치한다. 세포 표면에 위치하는 표적을 인식한 후 면역계의 활성을 통해 세포 사멸을 유도할 수 있다. .본원에 따른 일 구현예에서 본원의 표적 특이적 폴리펩타이드가 인식하는 세포 표면에 위치하는 인자는 예를 들면 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 본원에 따른 일 구현예에서는 HER2 또는 CD20이다. 본원에 따른 일 구현예에서 표적이 위치하는 세포는 암세포, 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암, 및 간암을 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서, 본원의 융합단백질에 포함되는 HER2 또는 CD20를 특이적으로 인식하는 폴리펩타이드는 ScFv 또는 Fab이며, 이러한 융합단백질의 서열은 예를 들면 HER2를 표적으로 하는 scFv 융합단백질은 서열번호 14, 15, 또는 16로 표시되고, 상기 CD20를 표적으로 하는 scFv 융합단백질은 서열번호 18 내지 24 중 어느 하나로 표시되고, 상기 CD20를 표적으로 하는 Fab 융합단백질은 서열번호 25 및 26으로 표시된다.

다른 양태에서 본원은 본원의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이를 포함하며, 이에 작동가능하게 연결된 조절서열을 포함하는 벡터, 및 상기 벡터를 포함하는 균주를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 상기 폴리뉴클레오타이드는 HER2를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 17으로 표시되며, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 CD20를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 27 내지 32 중 어느 하나로 표시된다.

다른 양태에서 본원은 또한 인비트로에서 T-세포 매개된, 표적 세포의 붕해(lysis) 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 표적 세포를 본원의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 단백질은 상기 표적 세포의 표면에 존재하는 인자를 특이적으로 인식한다.

본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 표적세포는 질환 유래의 세포로, 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 칸디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis)을 포함하는 미생물감염과 관련되거나 또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 다른 측면에서 표적세포는 암 유래로, 이러한 암은 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암, 또는 간암을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 T-세포 매개된 표적 세포의 붕해용 약학 조성물을 제공한다. 본원에 따른 약학조성물이 표적으로 하는 세포 및 세포 표면에 위치하는 인자는 앞서 설명한 바와 같다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 암을 특이적으로 인식하는, 약학적으로 유효한 양의 융합단백질을 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.

본원에 따른 변이체 또는 야생형 LFA3와 세포에서 발현되는 특정 인자를 특이적으로 인식하는 표적 특이적 폴리펩타이드와 융합되어 사용될 경우 T 세포의 활성화로 인하여 정상세포에 대한 독성없이 특정 인자를 발현하는 세포만을 파괴할 수 있어 암과 같은 질환 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있으며, 다양한 표적인자에 대한 폴리펩타이드를 채용하면 다양한 질환에 적용될 수 있다.

본원의 융합단백질은 또한 포유류 세포를 이용한 생산이 가능하여 자연 상태의 당쇄화를 재현할 수 있기 때문에 E.coli에서 발현한 단백질보다 높은 활성을 가지는 치료제 개발이 가능하다.

도 1은 pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3 플라스미드 개열지도이다.

도 2는 6X HIS tag, LFA3, linker, VH, VL domain을 포함한 anti-HER2 scFv-LFA3의 구조의 모식도이다.

도 3은 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 발현을 SDS-PAGE 로 분석한 결과로 적색 화살표가 발현된 단백질을 나타낸다.

도 4는 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 HER2에 대한 특이적 결합여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 5는 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 무작위로 선정된 두 가지 비특이적 항원에 대한 결합 여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 6은 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의, CD2를 발현하는 Jurkat T 세포에 대한 특이적 결합여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 7은 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의, HER2를 발현하는 SKBR3 세포에 대한 특이적 결합여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 8은 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의, HER2를 발현하는 CT26-Her2/neu 세포에 대한 특이적 결합여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 9는 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의, HER2를 가지는 A431 세포에 대한 특이적 결합여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 10은 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 CD4-양성 T 림프구 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 11은 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 암세포인 SKBR3에 대한 독성을 분석한 결과이다.

도 12는 E.coli pLysS 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 인간 PBMC에 대한 IL-2(pg/ml) 유도 정도를 분석한 결과이다.

도 13은 합성된 포유류 세포에서 발현이 최적화된 anti-HER2 scFv-LFA3를 제한 효소 처리 후 그 크기를 아가로스젤 분석으로 확인한 결과이다.

도 14는 포유류 세포에서 발현이 최적화된 LFA3, linker, VH, VL domain, 6X HIS tag을 포함하는 anti-HER2 scFv-LFA3 구조의 모식도이다.

도 15는 pCIneo-anti-HER2 scFv-LFA3 플라스미드의 개열지도이다.

도 16은 pCIneo-anti-HER2 scFv-LFA3 플라스미드의 클로닝에 사용된pCIneo 벡터 및 anti-HER2 scFv-LFA3의 아가로스 젤 분석 결과이다.

도 17은 포유류 세포에서 발현이 최적화된 anti-HER2 scFv-LFA3와 E.coli 에서 발현이 최적화된 anti-HER2 scFv-LFA3의 유전자 크기 차이 확인한 아가로스젤 분석 결과이다.

도 18은 포유류 세포에서 발현이 최적화된 anti-HER2 scFv-LFA3의 COS-7세포에서의 발현을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과로 적색 화살표가 발현된 단백질을 나타낸다.

도 19는 포유류 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3의 HER2에 대한 특이적 결합을 ELISA로 분석한 결과이다.

도 20은 포유류 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3의 무작위로 선정된 두 가지 비특이적 항원에 대한 결합 여부를 ELISA로 분석한 결과이다.

도 21은 포유류 발현 시스템을 이용하여 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3의 두 가지 항원에 동시에 결합하는 능력을 ELISA로 분석한 결과이다.

도 22는 E.coli pLysS 발현시스템을 이용하여 발현된 pRSET-A-anti CD20 scFv-LFA3 플라스미드의 개열지도 이다.

도 23은 E.coli pLysS 발현시스템을 이용하여 발현된 anti-CD20 scFv-LFA3-1의, CD20를 발현하는 Raji 세포에 대한 특이적 결합을 ELISA로 분석한 결과이다.

도 24는 E.coli pLysS 발현시스템을 이용하여 발현된 anti-CD20 scFv-LFA3-1의, CD20을 발현하는 Jurkat T 세포에 대한 특이적 결합을 ELISA로 분석한 결과이다.

도 25는 E.coli pLysS 발현시스템을 이용하여 발현된 anti-CD20 scFv-LFA3-1의 CD4-양성 T 림프구 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다.

도 26은 E.coli pLysS 발현시스템을 이용하여 발현된 anti-CD20 scFv-LFA3의 인간 PBMC에 대해 IL-2(pg/ml) 유도 정도를 분석한 결과이다.

도 27은 LFA3을 포함하는 bi-specific, tri-specific, tetra-specific, multi-specific 형태의 융합 단백질 구조의 모식이다.

도 28은 포유류 세포 발현 시스템을 이용하여 생산된 anti-CD20 scFv-LFA3 구조의 모식도이다.

도 29는 포유류 세포 발현 시스템을 이용하여 생산된 anti-CD20 Fab-LFA3 구조의 모식도이다.

도 30a는 누드 마우스 모델에서 SKOV3로 암을 유도한 후 항암제를 처리한 후 (delayed treatement model) 암세포 성장에 미치는 항-HER2scFv-LFA3의 효능을 나타낸 것이다.

도 30b는 누드 마우스 모델에서 SKOV3 암세포 이식과 동시에 항암제를 처리하여 (early treatment model) 암세포 성장에 미치는 항-HER2scFv-LFA3의 효능을 나타낸 것이다.

도 31은 NOD.CB17/scid 마우스에 Raji 세포를 이식한, 인체유래 혈액암(Raji) 이식 모델에서 항-CD20 scFv-LFA3의 항암 효과를 평가한 결과이다.

본원은 면역계를 이용하여 특정 항원을 발현하는 세포의 살해를 유도하는 효과기(effector)로서 작용하는 LFA3의 변이체를 제작하고, 이를 세포의 특정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드와 융합한 융합단백질을 이용하여 인간 면역계를 활성화시킴으로써 질환을 치료할 수 있음을 규명한 것에 기반한 것이다.

한 양태에서 본원은 변형된 LFA3 (Lymphocyte Functioning Associated Antigen-3)의 CD2 결합영역에 관한 것이다. 본원의 변형된 LFA3는 원핵세포에서 글라이칸이 없는 상태로 발현되는 변이체가 안정적으로 T 림프구 수용체에 결합할 수 있도록 한다.

LFA3 (CD58)는 대체적 스플라이싱 및 당사슬 부가의 차이에 따라 55,000~75,000 da 크기의 다수의 동형이 존재한 면역글로블린 상과(immunoglobulin superfamily)에 속하는 접합분자(adhesion molecule)로 다수의 동형이 존재하며, 예를 들면 막관통형 및 GPI 부착형이 존재한다. LFA3는 두 개의 세포외영역(ectodomain)과 하나의 막관통 영역 (transmembrane domain)으로 이루어지며, 거의 모든 세포에서 발현되며, 특히 항원 제시 세포 특히, 대식세포의 표면에 존재한다. LFA3는 사이토카인의 자극에 의해 발현이 증가된다. 또한 CD2와 결합하여 세포상해활성발현 또는 항원제시 반응 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 두 개의 세포외 영역 중 첫 번째 도메인만이 T 림프구 표면의 CD2와 결합하여 T 림프구와 항원 제시 세포를 가까이에 위치시켜 T 림프구로 하여금 면역 반응을 일으킬 수 있도록 하는 기능을 한다 (Biogen Inc. J. Exp. Med. 1993; 178(1):211-222). 하지만 이를 이용하여 면역계를 활성화시킴으로서 암을 치료하고자 하는 것은 기존에 시도된 바가 없으며 본원이 최초이다.

본원에 따른 변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 기준으로 LFA3의 CD2 결합영역에서 다음과 같은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하도록 변형된다: 36번째 아미노산이 Val에서 Thr, Lys, Pro 또는 Val; 37번째 아미노산이 Val에서 Trp, Lys 또는 Val; 38번째 아미노산이 Tyr에서 Lys 또는 Gly; 39번째 아미노산이 Gly에서 Asp; 40번째 아미노산이 Asn에서 Asp 또는 Thr; 44번째 아미노산이 His에서 Thr; 45번째 아미노산이 Val에서 Cys; 46번째 아미노산이 Pro에서 Thr; 47번째 아미노산이 Ser에서 Ala; 48번째 아미노산이 Asn에서 Ser (또는 Gln 삽입); 50번째 아미노산이 Pro에서 Lys; 51번째 아미노산이 Leu에서 Ser; 52번째 아미노산이 Lys에서 Ile; 76번째 아미노산이 Ser에서 Asp, 또는 Arg; 79번째 아미노산이 Asn에서 Gly; 81번째 아미노산이 Val에서 Ala; 82번째 아미노산이 Tyr에서 Asp (또는 삽입 SRRSL); 83번째 아미노산이 Leu 에서 Trp; 85 번째 아미노산이 Thr에서 Gln; 86 번째 아미노산이 Val에서 Gly; 87 번째 아미노산이 Ser에서 Asn; 88 번째 아미노산이 Gly에서 Phe; 89 번째 아미노산이 Ser에서 Pro; 93 번째 아미노산이 Tyr에서 Asn; 94 번째 아미노산이 Asn에서 Ser; 96 번째 아미노산이 Thr에서 Gln, Lys, 또는 Arg; 97 번째 아미노산이 Ile, Arg, Ala 또는 Pro; 98 번째 아미노산이 Ser에서 Glu; 또는 101 번째 아미노산이 Asp에서 Gly으로 치환을 포함한다.

본원에서 CD2 결합영역은 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 신호서열을 제외한 잔기 29 내지 잔기 123이며, 상기 CD2 결합영역은 필요에 따라 예를 들면 추가로 5개 아미노산 잔기 (서열번호 1의 서열을 기준으로 124-128 잔기에 해당하는 Leu-Pro-Ser-Pro-Thr)를 포함할 수 있으며, 상기 잔기를 포함하는 경우 후술하는 핵산 서열도 이에 상응하는 하는 서열 예를 들면 ctgccgtctccgacc을 추가로 카복시말단 (Carboxy 또는 C-terminal)에 포함할 수 있다.

본원에 따른 효과를 가지는 한, 상술한 바와 같은 치환 범위내에서 다양한 조합 (아미노산의 위치 및 각 위치에서의 아미노산의 종류)의 변이체가 본원에 포함될 수 있다.

예를 들면 본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 변이체는 하기 모든 위치에서의 치환을 포함한다: 36번째 아미노산이 Val에서 Thr, Lys, Pro 또는 Val; 37번째 아미노산이 Val에서 Trp, Lys 또는 Val; 38번째 아미노산이 Tyr에서 Lys 또는 Gly; 40번째 아미노산이 Asn에서 Asp 또는 Thr; 76번째 아미노산이 Ser에서 Asp, 또는 Arg; 79번째 아미노산이 Asn에서 Gly; 93 번째 아미노산이 Tyr에서 Asn; 94 번째 아미노산이 Asn에서 Ser; 96 번째 아미노산이 Thr에서 Gln, Lys, 또는 Arg; 97 번째 아미노산이 Ile, Arg, Ala 또는 Pro으로 치환.

본원에 따른 다른 구현예에서는 상기 치환은 하기 하나 이상의 치환을 부가적으로 포함한다: 39번째 아미노산이 Gly에서 Asp; 44번째 아미노산이 His에서 Thr; 45번째 아미노산이 Val에서 Cys; 46번째 아미노산이 Pro에서 Thr; 47번째 아미노산이 Ser에서 Ala; 48번째 아미노산이 Asn에서 Ser; 50번째 아미노산이 Pro에서 Lys; 51번째 아미노산이 Leu에서 Ser; 52번째 아미노산이 Lys에서 Ile; 81번째 아미노산이 Val에서 Ala; 82번째 아미노산이 Tyr에서 Asp; 83번째 아미노산이 Leu 에서 Trp; 85 번째 아미노산이 Thr에서 Gln; 86 번째 아미노산이 Val에서 Gly; 87 번째 아미노산이 Ser에서 Asn; 88 번째 아미노산이 Gly에서 Phe; 89 번째 아미노산이 Ser에서 Pro; 98 번째 아미노산이 Ser에서 Glu; 또는 101 번째 아미노산이 Asp에서 Gly으로 치환; 또는 48번째 부위에 Gln의 삽입 또는 82번째 부위에 Ser-Arg-Arg-Ser-Leu 서열을 갖는 폴리펩타이드의 삽입.

본원에 따른 다른 구현예에서, 본원에 따른 LFA3 변이체는 서열번호 2 내지 6 중 어느 하나로 표시될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 상술한 바와 같은 본원에 따른 LFA3 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로, 예를 들면 서열번호 8 내지 12 중 어느 하나로 표시될 수 있다.

또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드의 mRNA로의 발현 또는 mRNA의 단백질로의 발현을 조절하는 서열, 예를 들면 프로모터 및/또는 인핸서 등과 같은 조절서열을 포함하는 벡터 또는 플라스미드에 관한 것이다. 본원에 따른 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포에서의 증폭 및/또는 발현을 위해 공지된 적절한 조절 서열 및 벡터에 연결될 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 벡터 및 조절서열이 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서, 이러한 벡터는 본원 실시예 및 도면에 기재된 것, 예를 들면 도 1, 도 15 또는 도 22의 벡터를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포에 관한 것으로, 숙주세포는 본원에 따른 벡터의 증폭 및/또는 벡터가 발현하도록 되어 있는 단백질의 생산을 위한, 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함하는 것이다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 세포가 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 예를 들면 대장균(E.coli), 포유동물 세포(Mammalian cell), 효모(Yeast), 식물 세포(Plant cell), 곤충 세포(Insect cell)를 포함한다.

숙주세포를 본원에 따른 벡터로 형질전환하는 방법은 공지된 것으로, 예를 들면, 칼슘포스페이트 침전법, 샷건 방법, 리포좀을 이용한 방법, 나노니들 또는 전기천공법등 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

본원에 따른 LFA3 는 T 림프구에 결합하여 면역계를 활성화하여 세포의 살해를 유도할 수 있는 효과기로서 작용할 수 있다. 이러한 측면에서 본원은 하나 이상의, 본원에 따른 변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드(또는 영역이라고도 칭함) 또는 이의 야생형 폴리펩타이드, 즉 서열번호 1의 29 내지 123 잔기 또는 29 내지 128 잔기로 구성되는 폴리펩타이드 및 이에 연결된 표적 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질에 관한 것이다.

본원에 따른 표적 특이적 폴리펩타이드는 표적세포에서 발현되는 특정 인자에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드로서, 예를 들면 세포 표면에 존재하는 단백질 마커 또는 기타 항원으로서 작용할 수 있는 인자를 특이적으로 인식하여 이에 결합할 수 있는 것이다. 예를 들면 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 일 구현에서, 항체는 폴리클로날, 모노클로날 항체, 또는 키메라 또는 인간화 항체, 전장 항체 또는 그 단편을 포함하는 것이다. 본원에 따른 다른 구현예에서, 항원결합단편은 전장 항체 중에서 항원결합 부위의 전부 또는 일부를 포함하는 것으로, 예를 들면 scFv (후술하는 내용 참조), BITE (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), TandAb(예를 들면 미국 공개특허 제2005-089519호 참조), Immunobody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-146505호 참조), Flexibody (예를 들면 미국 특허 제6838254호 참조), Nanobody (예를 들면 미국 공개특허 제2003-088074호 참조), Triomab (예를 들면 미국 특허 제6551592호 참조), Troybody (예를 들면 미국 특허 제6294654호 참조), Pepbody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-101905호 참조), Vaccibody (예를 들면 미국 공개특허 제2004-253238호 참조), SMIP (예를 들면 미국 공개특허 제2008-227958호 참조), Fab (fragment antigen binding fragment, 실시예의 내용 참조), mAb² (예를 들면 미국 공개특허 제2009-298195호 참조), UniBody(예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Fv (Fragment variable), dAB (예를 들면 미국 공개특허 제2006-280734호 참조), scFV-Fc, Diabody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Tetrabody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), Minibody (예를 들면 미국 특허 제7235641호 참조), scFab(single chain Fab), Fcab (예를 들면 미국 공개특허 제2009-298195호 참조)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 다른 구현예에서 항체 모방체는 DARPin (예를 들면 미국 특허 제7417130호 참조), Tetranectin(예를 들면 미국 공개특허 제2004-132094호 참조), Affibody (예를 들면 미국 특허 제5831012호 참조), Transbody (예를 들면 미국 공개특허 제2004=023334호 참조), Anticalin (예를 들면 미국 특허 제7250297호 참조), AdNectin (예를 들면 미국 특허 제6818418호 참조), Affilin (예를 들면 미국 특허 제7838629호 참조), Microbody (예를 들면 미국 특허 제7186524호 참조), Peptide aptamer (예를 들면 미국 특허 제6004746호 참조), Phylomer (예를 들면 미국 특허 제6994982호 참조), Stradobody (예를 들면 미국 공개특허 제2010-239633호 참조), Avimer (예를 들면 미국 특허 제7803907호 참조), Evibody (예를 들면 미국 특허 제7166697호 참조), 또는 Fynomer (예를 들면 미국 공개특허 제2010-119446호 참조)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 융합단백질에 포함되는 각 구성 즉, LFA3 CD2 결합영역 및 상술한 바와 같은 표적 특이적 폴리펩타이드는 각각 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있으며, 방향은 예를 들면 융합되는 특이적 폴리펩타이드의 종류에 따라 결정될 수 있다.

본원에 따른 링커는 융합단백질에 포함되는 각 단백질을 서로 연결하는 분자로서, 본원에 따른 융합단백질의 효과를 달성하는 한, 공지된 다양한 종류 및 길이의 링커가 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 폴리펩타이드 링커가 사용될 수 있으며, 당업자라면 본원에 기술된 내용 및 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여, 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서 링커는 유연성(flexible)이 있어야 하며, 단백질분해효소에 의해 분해되지 않는 것이어야 한다. 본원에 따른 일구현예에서는 LFA3가 효과적으로 기능할 수 있도록 하기 위해, 서열번호 13으로 표시되는 폴리펩타이드 링커가 사용된다 다른 구현예에서는 GGGGS, GGGGSGGGGS, 또는 GGGGSGGGGSGGGGS 또는 GSTSGSGKPGSGEGSTKG와 같은 링커 (상기 서열에서 G는 글라이신, S는 세린, T는 트레오인, K는 라이신, P는 프롤린, E는 글루탐산을 나타냄)가 사용될 수 있다.

본원에 따른 융합단백질은 상술한 바와 같은 표적 특이적 폴리펩타이드를통해 특정 인자를 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 융합단백질은 이에 포함되는 표적 특이적 폴리펩타이드의 종류에 따라 다양한 인자에 결합 할 수 있다. 이러한 인자는 주로 세포 표면에 존재하여, 본원에 따른 융합단백질의 효과를 고려하여, 일정 세포에 특이적으로 발현되는 인자를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 세포는 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포이며, 인자는 이러한 세포에서 특이적으로 발현되는 비수식 또는 수식된 (modified) 단백질일 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 암과 관련된 세포로, 암에서 특이적으로 발현되는 마커 또는 인자에 결합 수 있다. 이러한 세포 표면에서 발현되는 인자는 공지되어 있으며, 본원에 따른 융합단백질을 사용하고자 하는 구체적 표적에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서는 유방암, 또는 난소암 마커인 HER2, 림프종 마커인 CD20가 사용된다.

상술한 바와 같은 인자를 표적으로 하는 폴리펩타이드는 상술한 바와 같은 다양한 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체의 맥락에서 제조될 수 있으며, 본원에 따른 일 구현예에서는 scFV 또는 Fab가 사용되나, 이로 제한하는 것은 아니다. scFV (Single chain Fv)는 항체분자의 결합 부위 중 최소 단위인 VH와 VL을 아미노산 폴리펩타이드 링커로 연결한 형태이고(Anal Biochem 205, 263-270 (1992)), Fab는 항체 분자의 항원 결합 부분만을 사용한 것으로 scFv 보다 안정된 구조를 가진다(Int J Cancer 57, 856-864 (1994)).

본원에 따른 표적 폴리펩타이드가 결합할 수 있는 인자에 대한 결합영역을 포함하는 다양한 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체의 맥락에서 제조되어, 본원에 따른 다양한 하나 이상의 LFA3와 융합될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 HER2를 표적으로 하는 scFv 및 Fab가 본원에 따른 LFA3 야생형 CD2 결합영역 또는 이의 변이체와 융합된 단백질이 제공되며,예를 들면 상기 HER2를 표적으로 하는 융합단백질은 서열번호 14, 15, 또는 16로 표시되고, 상기 CD20를 표적으로 하는 scFv 융합단백질은 서열번호 18 내지 24 중 어느 하나로 표시되고, 상기 CD20를 표적으로 하는 Fab 융합단백질은 서열번호 25 및 26으로 표시되나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 효과를 나타내는 한 본원의 융합단백질에 포함되는 LFA3 및 표적 특이적 폴리펩타이드는 각각 하나 이상 포함될 수 있으며, N- 또는 C-말단에 다양하게 위치할 수 있다. 또한, 하나 이상을 포함하는 경우, 각각의 구성 단백질은 중복적, 반복적 또는 무작위로 조합될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 상술한 바와 같은 본원에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 HER2를 표적으로 하는 융합단백질이 제공되며 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 17으로 표시된다. 다른 구현예에서는 CD20를 표적으로 하는 융합단백질이 제공되며 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 27 내지 32 중 어느 하나로 표시되나 이로 제한하는 것은 아니다.

또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드의 mRNA로의 발현 또는 mRNA의 단백질로의 발현을 조절하는 서열, 예를 들면 프로모터 및/또는 인핸서를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본원에 따른 벡터는 원핵 및/또는 진핵세포에서의 증폭 및/또는 발현을 위해 공지된 적절한 벡터 및 조절 서열과 연결될 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 벡터 및 조절서열이 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 이러한 벡터는 예를 들면 벡터는 도 1, 도 15 또는 도 22에 개시된 것을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 벡터를 포함하는 숙주세포, 즉 재조합 세포주에 관한 것으로, 숙주세포는 본원에 따른 벡터의 증폭 및/또는 벡터가 발현하도록 되어 있는 단백질의 생산을 위한, 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함하는 것이다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 다양한 세포가 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 구체적 목적 및 효과를 고려하여 적절한 것으로 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 본원의 실시예 및 도면에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 숙주세포를 본원에 따른 벡터로 형질전환하는 방법은 공지된 것으로, 예를 들면, 칼슘포스페이트 침전법, 샷건 방법, 리포좀을 이용한 방법, 나노니들 또는 전기천공법등 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 또한, 상기 제작된 재조합 세포주를 배양하는 단계; 및 세포주로부터 표적 특이적 융합단백질을 분리하는 단계를 포함하는 융합단백질의 제조방법에 관한 것이다.

본원에 따른 융합단백질은 특정 인자에 결합한 후 T 세포 매개된 면역시스템을 활성화하여 세포를 사멸시키는 효과를 갖는 것으로, 이러한 측면에서 본원은 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 T-세포 매개된, 표적 세포 붕해용 약학 조성물에 관한 것이다. 본원에 따른 약학 조성물은 상기 붕해되는 세포의 종류의 따라 구체적 질환 치료제로 제공될 수 있다. 예를 들면 상기 표적 세포는 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포일 경우, 각각 암치료제, 자가면역질환치료제, 미생물감염 치료제 등으로 칭할 수 있다.

본원의 조성물이 사용될 수 있는 질환은 특히 제한되는 것은 아니며, 표적 세포의 종류의 따라 다양한 질환이 포함될 수 있으며, 예를 들면 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증,항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 칸디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis)을 포함하는 미생물감염과 관련된 질환 등의 치료에 사용될 수 있다.

표적 세포는 다양한 질환 유래 예를 들면 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암 및/또는 간암일 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.

상술한 바와 같이 표적 세포는 각 세포에서 특이적으로 발현되는 인자를 특히 그 표면에 발현하는 것으로, 본원에 따른 일구현예에서 상기 표적 세포는 암, 자가면역질환, 또는 미생물감염과 관련된 세포이며, 특히 암세포 이며, 이 경우 상기 인자는 암세포 특이적 인자이다. 본원에 따른 상기 암세포 특이적 인자는 예를 들면 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)를 포함하나, 이로 제한 되는 것은 아니다.

또한 본원의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 담체란 사용되는 투여량 및 농도에 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제를 의미하는 것이다. 이러한 담체의 예로는 식염수, 링거액, 완충 식염수, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액, 아스코르브산을 비롯한 산화방지제, 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드, 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어폴리비닐피롤리돈, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물, 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA, 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 염 형성 카운터 이온, 예를 들어 나트륨, 및(또는) 비이온계 계면활성제, 예를 들어 트윈, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)를 들 수 있다.

필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명으로 표시되는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본원의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.01μg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01μg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본원에 따른 융합단백질은 T 세포 매개된 면역계를 활성화시켜 특정 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. 이러한 측면에서 본원은 또한 인비보 또는 인비트로에서 T-세포 매개된, 표적 세포의 붕해(lysis) 방법이다. 일 구현예서 상기 방법은 표적 세포를 본원에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 단백질은 상기 표적 세포의 표면에 존재하는 인자를 특이적으로 인식한다. 본원의 방법이 효과가 있는 표적 세포는 그 세포에 특이적인 인자를 발현하는 것으로, 예를 들면 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증,항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis)을 포함하는 미생물감염과 관련된 세포이나 이로 제한하는 것은 아니다. 다른 측면에서 본원의 방법이 효과를 발휘할 수 있는 표적세포는 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암, 또는 간암 유래이나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원의 조성물은 상기 언급한 억제제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.

또한 본원의 치료제는 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

언급한 바와 같이 본원에 따른 융합단백질을 포함하는 조성물은 LFA3의 T 림프구 활성화 능력을 이용하여 암과 같은 질환의 치료에 사용될 수 있다.

이러한 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 표적 특이적 융합단백질, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 약학조성물의 치료적 유효량을 암과 같은 질환의 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 따른 융합단백질은 면역계의 활성을 통해 융합단백질이 결합되는 세포의 사멸을 유도하여 암을 치료하는 것으로 본원의 융합단백질에 포함된 표적 특이적 폴리펩타이드가 인식하는 인자에 따라 다양한 암의 치료에 사용될 수 있으며, 그 예는 앞서 언급한 것을 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 본원의 방법이 사용될 수 있는 암은 HER2 또는 CD2가 과발현되는 암, 예를 들면 유방암, 난소암, 자궁암 및 위암 중 어느 하나이거나, CD20가 과발현되는 암인 비호지킨 림프종, 만성림프성 백혈병, 류마티스 관절염 및 모발상세포 백혈병 중 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본원의 방법에 사용되는 융합단백질, 폴리뉴클레오타이드 및 조성물과, 투여량, 투여방법 및 치료 가능한 암의 종류는 앞서 설명한 것을 참조하면 된다.

본원에서 사용된 용어 "치료"란 본원에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 질환의 정확한 기준을 파악하고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. E.coli 발현 시스템을 이용한, HER2 항원에 특이적으로 결합하는 scFv 및 LFA3를 포함하는 융합단백질의 제작

1-1. E.coli 발현 시스템을 위한 최적화된 LFA3 유전자의 합성

야생형 LFA3 (LFA3 WT 서열번호 1)의 잔기 29 내지에 해당하는 CD2 결합영역 (서열번호 7의 서열) 및 항-HER2 single chain variable fragment(anti-HER2 scFv, 서열번호 33)의 유전자는 (주)COSMOgenetech에 합성을 의뢰하였다. 이때 N-말단 부분에 BamHⅠ제한효소 site를, C-말단 부분에 EcoRⅠ제한효소 부위를 각각 넣어 합성하였다. 또한, 항-HER2 scFv의 경우 N-말단 부분과 C-말단 부분에 모두 HindⅢ 제한효소 부위를 넣어 합성하였으며, LFA3 영역과 anti-HER2 scFv 영역 사이에 링커 삽입을 위해 항-HER2 scFv 서열의 N-말단 부분에는 13개의 유연성 링커 (서열번호 13: GGGGSGGSGSGGG)를 포함시키도록 합성하였다.

1-2. HER2 항원에 특이적으로 결합하는 scFv 및 LFA3를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 구축

상기 실시예 1-1과 같이 합성된 유전자는 pUC57 벡터에 삽입된 형태로 제작되었으며, 유전자가 삽입된 pUC57-LFA3WT 및 pUC57-anti-HER2 scFv 플라스미드를 RBC 사의 HITTM-DH5αValue 108(catalog no. RH617)에 제조자의 방법대로 형질전환하였다.

이어 상기와 같이 제조된 pUC57-LFA3WT, pUC57-anti-HER2 scFv, pRSET-A 벡터를 이용하여, anti-HER2 scFv 및 LFA3를 포함하는 융합 단백질을 발현하기 위한 재조합 벡터인 pRSET-A-anti HER2-scFv-LFA3WT, pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3-5 벡터를 제조하였다. 구체적인 방법은 하기와 같다.

우선적으로, 합성된 anti-HER2 scFv는 N-말단에 HindⅢ를 EcoRΙ부위로 대체하기 위하여 하기 [표 1]에 기재된 프라이머를 사용하여 Anti-HER2 scFv 단백질을 코딩하는 플라스미드를 주형으로 PCR을 수행하였으며, 얻어진 PCR 산물은 EcoRΙ과 HindⅢ로 처리하였다.

표 1

서열번호	서열이름	서열
34	EcoRIcFv-F	CGGGAATTCGGCGGTGGAGGCT5
35	scFvHindIII NotI-R	GGCCCGCGGCCGCAAGCTTTTATTTGA

pUC57-LFA3WT에 하기 [표 2]의 프라이머를 이용하여 sewing PCR을 수행하여 서열번호 12의 서열의 C 말단에 Leu-Pro-Ser-Pro-Thr에 해당하는 ctg ccg tct ccg acc 서열이 포함된 LFA3-5 (LFA3 변이체)를 제작하였다. 구체적으로, Sewing PCR은 pUC57-LFA3WT을 주형으로 하여 세 부분으로 나누어 정방향 및 역방향 프라이머를 합성하여 총 6개의 프라이머를 합성하였다. 프라이머 1, 4와 프라이머 5, 17 과 프라이머 18, 8을 쌍으로 각각 PCR을 수행하여 3개의 PCR 산물 1, 2, 3를 얻었으며, PCR 산물 1 및 2를 프라이머 1, 17을 이용하여 PCR하고, PCR 산물 2 및 3을 프라이머 5, 8을 이용하여 다시 PCR을 수행하여 PCR 산물 4, 5를 얻었다. 새로 얻은 PCR 산물 4, 5를 프라이머 1, 8을 이용하여 PCR을 수행하여, 최종 PCR 산물을 얻었다. 최종적으로 얻은 PCR 산물인 LFA3-5와 주형으로 사용한 LFA3WT 각각을 BamHΙ과 EcoRΙ으로 처리하였다. 동일한 방법의 sewing PCR을 수행하여 서열번호 8, 9, 10 및 11 및 상기 각 서열의 C 말단에 Leu-Pro-Ser-Pro-Thr에 해당하는 ctg ccg tct ccg acc 서열이 추가된 LFA3 변이체 1, 2, 3, 및 4 를 수득하였다.

표 2

서열번호	서열이름	서열
36	Primer 1	cccgcgaaattaatacgactcactataggg
37	Primer 4	acgacctttgaagtcagagaaagcacggaactcaga
38	Primer 5	tctgacttcaaaggtcgtgtttacctggacaccgtt
39	Primer 8	ccattcctcctcttccttcaatgaattcggc
40	Primer 17	gaagtcttccggctgcagagagttgatggtcagagaaccagaaac
41	Primer 18	ctgcagccggaagacttcggtgaatacgaaatggaatctccg

상기 제한 효소로 처리된 각각의 절편을 1% 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, pRSET-A 벡터를 EcoRI/BamHI으로 절단하였다.

상기 절단한 anti-HER2 scFv 유전자, pRSET-A 벡터와 절단된 LFA3WT 또는 LFA3-5를 각각 1:1:1로 혼합하고, T4 DNA 라이게이즈(New England BioLabs)를 제조자의 방법대로 이용하여 라이게이션을 수행하였다. 구축된 플라스미드는 도 1에 개시된 바와 같고, 이를 pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3WT 및 pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3-5라 명명하였으며, 삽입된 유전자의 구조는 도 2의 모식도와 같다.

1-3. 재조합 융합단백질의 발현 최적화

상기 실시예 1-2에서 구축된 pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3WT 및 pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3-5를 대장균 발현 세포주인 pLysS(invitrogen)에 형질전환시켜 단백질 발현 시험을 수행하였으며, 이때 발현된 단백질의 아미노산 서열은 각각 서열번호 14 및 16으로 표시된다.

그 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 재조합 플라스미드가 형질전환된 세포 내 단백질의 SDS-PAGE를 통해 pLysS competent cell에서 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5 재조합 플라스미드에 의해 재조합 융합 단백질의 발현이 효율적으로 일어나는 것을 확인하였다.

1-4. 봉입체 세척 및 단백질 가용화

LFA3 재조합 융합단백질은 각각 플라스미드 pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3WT, pRSET-A-anti-HER2 scFv-LFA3-5 에 의해 만들어지며, 숙주 세포인 invitrogen의 pLysS에서 발현하였다. 발현된 단백질은 박테리아 세포 내부에 봉입체 (inclusion body) 형태로 생산되기 때문에 이것을 세척하고 가용화(solublization)시킨 후 다시 재접힘을 거쳐 활성이 있는 재조합 단백질을 얻었으며, 봉입체의 세척 및 단백질 가용화의 구체적인 방법은 하기와 같다.

박테리아는 Novagen의 LB broth miller medium(yeast extract 5g, peptone from casein 10g, sodium chloride 10g)에 50μg/ml 앰피실린(ampicillin)을 첨가한 배양액에서 37℃로 키웠다. OD₆₀₀ 1.4에서 최종농도 0.5mM IPTG를 넣어 재조합 단백질의 발현을 유도한 후, 3시간 더 배양하였다. 박테리아 세포는 10,000rpm, 4℃, 10분 동안(BECKMAN COULTER, Avanti J-E) 원심분리하여 침전 형태로 모은 다음, 세포 배양액의 부피 1L 당 50ml의 융해 완충액 (50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 5mM DTT, 1mM EDTA)으로 완전히 현탁시켜 15분의 초음파 분쇄기(SONICS, Vibra-cell)로 세포를 파쇄한 후 최종농도 1mM이 되도록 PMSF(Phenyl Methane Sulfonyl Fluoride)를 첨가하여 10,000rpm, 4℃, 15분 동안 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 얻었다.

이어 세포를 파쇄한 후 1mM PMSF를 넣고 10,000rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 상등액과 침전된 펠렛(ppt)을 분리하였다. 분리한 펠렛은 세척 완충액 I 20ml(1L 세포 배양액 기준, 50mM Tris(pH 8.0), 100mM NaCl, 2M Urea(F.W = 60.1), 1mM EDTA, 1mM DTT)로 펠렛이 완전히 현탁될 때까지 30분간 실온에서 회전시켰다. 다시 10,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상등액과 펠렛을 분리한 후, 분리한 펠렛은 세척 완충액 II 20ml (1L 세포 배양액 기준, 50mM Tris(pH 8.0), 2% Triton X-100, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT)로 다시 현탁 시킨 후 30분간 실온에서 회전시킨 후 10,000rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 하여 상등액과 펠렛을 분리하였다. 얻은 펠렛을 세척 완충액 Ⅲ(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT)을 배양액 부피 1L당 20ml로 세척하고 10,000rpm, 4℃, 15분 동안 원심 분리하여 다시 펠렛을 얻었다. 얻은 펠렛을 가용화 완충액(8M Urea, 50mM Tris-HCl, 5mM DTT, 1mM EDTA)으로 배양액 부피 1L 당 20ml을 사용하여 4℃에서 하룻밤 동안 교반하여 단백질을 가용화하였다. 14,000rpm, 4℃, 30분 동안 원심 분리하여 상등액만을 취하여 protein assay dye reagent concentrate(Biorad, catalog no. 500-0006)를 사용하여 정량하여 적당량씩 분주하여 재접힘을 수행하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.

1-5. 단백질의 재접힘 최적화

가용화시킨 각 단백질(anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5)을 QuickFold protein refolding kit(Athena ES)를 제조자의 방법대로 사용하여 1ml 에서 15가지의 완충액으로 재접힘 시험을 실시하였다.

요약하면 각 15가지 완충액을 마이크로튜브에 950μl씩 분주하였다. 상기 실시예 1-4에서 가용화하여 얼려두었던 단백질 용액을 녹여서 총 부피가 모두 50μl로 하여, 50μg/ml부터 1000μg/ml의 농도로 천천히 넣고 상온에서 천천히 흔들어주면서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 용액의 100μl은 96 웰 플레이트의 웰에 넣고 350nm에서 ELISA reader(Thermo Scientific, VarioSkan Flash)로 탁도를 측정하고 나머지 용액은 원심분리(eppendorf, 5415) 하여 응집 정도를 육안으로 확인하고 상등액을 취하여 SDS-PAGE로 분석하였다. 분석 후 젤은 Coomassie blue(Coomasie blue 2g, EtOH 250ml, acetic acid 50ml, DDW 200ml)로 염색하고 탈색 용액(acetic acid 1L, EtOH 4L, DW 5L)으로 탈색하여 확인하였다.

그 결과, 탁도는 1000μg/ml 농도에서도 크게 증가하지는 않았고, 따라서 SDS-PAGE의 결과 단백질 농도가 증가함에 따라 변성된 단백질 대조군(8M Urea solublized protein)에 비해 밴드의 크기가 감소하는 바가 없었다. 또한, anti-HER2 scFv-LFA3WT이나 anti-HER2 scFv-LFA3-5은 각각 수십 ml의 대용량 시험에서도 1ml 용량의 재접힘 시험과 유사한 결과를 얻었으며, 이를 통해 단백질 재접힘의 적정 농도를 400μg/ml 로 결정하였다.

또한, 재접힘 완충액은 상기 재접힘 시험 결과 중요한 재접힘 요소들을 포함하고 있는 50mM Tris-HCl, 9.6mM NaCl, 0.4mM KCl, 15mM β-mercaptoethanol, 1mM GSH, 0.1mM GSSH, protease inhibitor cocktail(protease inhibitor cocktail EDTA-free, Roche)로 결정하였다. 제조한 재접힘 완충액을 400rpm 이상으로 교반하면서 8M Urea에 녹여둔 단백질 용액을 미리 녹여 두었다가 400μg/ml로 재접힘 완충액에 적가방식으로 천천히 희석하면서 4℃에서 하룻밤 동안 재접힘을 진행하였다. 재접힘의 효율은 다음날 원심분리 후 상등액을 채취하여 bradford assay로 정량하여 재접힘 시의 단백질의 양인 400μg/ml와 비교하여 측정하였다. 그 결과 anti-HER2 scFv-LFA3WT의 경우 재접힘 수율이 평균 71~75% 정도 되었고, anti-HER2 scFv-LFA3-5의 경우 평균 90%이상 수율을 보였다.

1-6. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 정제

재접힘 후, 재접힘 완충액에서 1mM GSH, 0.1mM GSSH를 제거한 완충액에 10,000kDa MWCO 투석 멤브레인을 이용하여 투석하였다. 투석하면서 생긴 침전물을 제거하기 위하여 12,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다. 상등액만을 모아 0.45μm의 기공 크기의 셀룰로오스 여과 막에 여과하여 미리 평형 완충액으로 평형화시킨 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩했다. 150mM 이미다졸(Imidazole) 근처에서 용출되어 나온 바인딩 분획을 모아 12% SDS-PAGE로 밴드를 확인한 후 한외 여과 방식으로 농축한 후 1X PBS로 완충액을 교환하였다. 얻어진 단백질은 엔도톡신을 제거하기 위해 단백질 부피의 1% 가량의 Triton X-114를 넣고 잘 혼합하여 제거한 후 최종 단백질을 얻은 후 protein assay dye reagent concentrate(Biorad, catalog no. 500-0006) 를 사용하여 얻은 최종 단백질 양을 정량하였다.

1-7. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 특이적인 항원에 대한 결합 분석

본원의 융합 단백질에 포함된 LFA3 영역은 T 림프구 표면의 CD2와 결합하는 영역이며, anti-HER2 scFv 영역은 ERBB2 유전자에 의해 암호화되며 HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor2)로도 알려져 있는 ERBB2와 결합을 하도록 제작하였다. 이때, HER2 항원(에이엔알쎄라퓨틱스에서 구입)에 대한 본 발명에서 제작된 융합 단백질의 친화도를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였으며, 구체적인 방법은 하기와 같다.

HER2 항원을 50mM Bicarbonate/Carbonate 코팅완충액에 희석하여 1μg/웰이 되게 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰 세척기(Thermo Scientifics, Wellwash Plus)를 이용하여 PBST 버퍼(PBS, 0.05% Tween-20)로 5회 세척하고 ELISA blocking buffer로 1시간 동안 비특이적인 결합을 블로킹하였다. 이어 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5를 샘플 희석 완충액에 10μg/ml, 1 μg/ml, 0.1 μg/ml 이 되도록 희석하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 상온에서 2시간 동안 배양하였다.

이어 웰 세척기를 이용하여 PBST로 5번 세척 후 anti-human kappa chain HRP(Sigma)를 샘플 희석 완충액으로 3000:1로 희석하여 웰 당 100 μl를 넣어 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 PBST 버퍼로 5회 세척 후 TMB(Tetramethylbenzidine substrate solution, sigma, K-T0440-1)를 처리한 후 15분 동안 반응시켰다. 1.8N 황산으로 반응을 중단시키고 ELISA 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본원의 정제된 융합 단백질이 농도 의존적으로 HER2 항원과 결합함을 확인하였고, LFA3 야생형 또는 변이체의 형태에 따른 차이는 크지 않았다. CD2 항원에 대한 융합 단백질의 결합 분석은 하기의 CD2-positive cell-based ELISA를 통해 확인하였다.

1-8. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 비특이적인 항원에 대한 결합 분석

상기 수행된 단백질 재접힘이 제대로 이루어졌는지를 간접적으로 확인하기 위하여, 융합 단백질이 결합하는 HER2 항원이나 CD2 항원이 아닌 다른 단백질에 대해 결합 여부로 확인하였다. 무작위로 선정된 단백질은 본 발명자들이 보유하고 있던 단백질 A와 B로 명명하였으며 ELISA에 대한 구체적인 실험 방법은 하기와 같다.

단백질 A와 B 각각을 50mM Bicarbonate/Carbonate 코팅 완충액에 1μg/웰이 되게 희석하여 상온에서 1시간 동안 배양 후 실시예 1-7과 같이 ELISA를 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 정제된 anti-HER2 scFv-LFA3WT과 anti-HER2 scFv-LFA3-5는 무작위로 선정된 A, B 단백질 모두에 대해 특이적인 결합을 보이지 않음을 확인하였다.

1-9. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 특이적인 세포에 대한 결합 분석

특정 항원을 가지는 세포에 대해 본 발명의 정제된 융합 단백질의 친화도를 확인하기 위하여 cell-based ELISA를 수행하였다. 실험에 사용한 세포는 정제된 융합 단백질의 LFA3 영역과 결합하는 CD2 항원을 표면에 가지는 Jurkat T 세포와 정제된 융합 단백질의 anti-HER2 scFv 영역과 결합하는 HER2 항원을 표면에 가지고 있는 SKBR3 세포, CT26-Her2/neu 세포, A431 세포를 사용하였다.

우선적으로, 50μg/ml의 poly-D-lysine을 50μl씩 96 웰 마이크로플레이트의 각 웰에 넣고 50℃ 드라이 오븐에서 두 시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 상온에서 실온으로 식히고 부유시켜 놓은 Jurkat T 세포(1.5X10⁵cells/ml), SKBR3 세포, CT26-Her2/neu 세포, A431 세포(1X10⁵cells/ml)를 웰에 각각 200μl씩 넣고 하루 동안 37℃ 배양기에서 배양하였다. 다음날, 세포가 잘 붙어 있는지 확인하고 플레이트에서 배지를 제거한 다음 PBST(PBS, 0.05% Tween-20)로 3회 세척하였다. 이어 메탄올/아세톤(1:1) 혼합액을 100μl씩 넣어 세포를 고정시켜 주고, PBST 버퍼로 5회 세척하였다. 비특이적인 결합을 방지하기 위해 3% skim milk 용액으로 상온에서 1시간 동안 블락킹시키고, PBST로 4회 세척하였다. 10μg/ml, 1μg/ml, 0.1μg/ml, 0.01μg/ml, 0.001μg/ml 농도의 정제된 융합 단백질을 각각 웰에 100μl씩 넣어주고 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, PBST로 3회 세척하였다. Anti-human kappa chain-HRP를 3000:1로 100μl씩 넣어주고 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. 100μl의 Tetramethylbenzidine substrate solution (sigma, K-T0440-1)을 각 웰에 넣어주고 10~15분간 반응시킨 다음 1.8N 황산을 각 웰에 100μl씩 넣어 반응을 중단시킨 다음 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 anti-HER2 scFv-LFA3WT과 anti-HER2 scFv-LFA3-5 각각은 CD2를 발현하는 Jurkat T 세포와 농도 의존적으로 결합하는 것을 확인하였고, LFA3 야생형 또는 변이체에 따른 차이는 크지 않았다. 아울러, 도 7, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, HER2를 발현하고 있는 SKBR3 세포, CT26-Her2/neu 세포, A431 세포에서도 정제된 융합 단백질이 농도의존적으로 결합함을 확인하였으며, 이때에도 LFA3 야생형 또는 변이체에 따른 차이는 크지 않았다.

1-10. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 CD4(+) T 림프구 증식 실험(Mixed Lymphocyte Reaction;MLR)

본 발명의 정제된 융합 단백질이 T 림프구 표면에 있는 CD2와 결합하여 T 림프구를 활성화시키는지 여부를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.

본 분석은 말초 혈액의 항원 제시 세포가 T 림프구에의 항원 제시시 발생하는 T 림프구의 활성화에 기반한다. 이러한 활성화는 세포 대 세포의 부착에 의해 발생하며 T 림프구 표면의 CD2 항원과 항원 제시 세포 표면의 LFA3 분자에 의해 매개된다. 융합 단백질이 가지는 LFA3 영역이 항원 제시 세포 표면의 LFA3가 가지는 T 림프구 활성화 효과를 가지는지 확인하기 위한 분석이다.

T 림프구를 수득하기 위한 PBMC는 건강한 기증자의 혈액 30ml 로부터 Ficoll-Paque(GE Healthcare) 농도 구배 방법으로 분리하였다. 혈액은 1:1 비율로 PBS 완충액에 희석하여 사용하였고, 3:1 비율로 Ficoll 농도구배 (30ml 혈액 PBS 혼합액:10ml Ficoll)를 만들었다. 세포는 2,000rpm, 20℃, 30분 동안 원심분리 하였다. 세포를 포함하는 중간층을 각 25~30ml 정도씩 수집하여 PBS 완충액을 혼합한 후 1,500rpm, 4℃, 5분 동안 원심분리하여 세척하였다. 상등액을 버리고 세포는 RPMI 배지(GIBCO RPMI, 10% FBS)에 현탁하여 사용하였다. 특히 본 MLR의 경우 얻은 세포를 CD4 microbead (Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD4-양성 T 림프구 만을 분리하여 실시하였다.

PBMC 분리 전 날 단백질을 농도별로 코팅하여 4℃ 보관해둔 96F immuneplate(Nunc, catalog no. NUN-439454)의 단백질 용액을 제거한 후, 멸균된 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 상기 분리한 CD4-양성 T 림프구를 2X10⁶ cells/ml로 RPMI에 현탁하여 준비한 다음 각 웰에 100μl씩 분주하고 플레이트를 습윤한 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 3일 동안 배양한다. 18시간 동안 1μCi 티미딘(Thymidine)으로 펄스(pulse)를 준 다음 방사능(radioactivity)을 측정하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 anti-HER2 scFv-LFA3WT, anti-HER2 scFv-LFA3-5 융합 단백질 모두 1μg/ml, 10μg/ml에서 농도 의존적으로 T 림프구를 증식시키는 효과가 있으며, 10μg/ml 처리 시 anti-HER2 scFv-LFA3-5 가 anti-HER2 scFv-LFA3WT 보다 더 효과적임을 확인하였다.

1-11. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 암세포에 대한 독성실험

본 발명에서 제조된 융합 단백질에 의해 활성화된 인간 PBMC가 타겟 암세포를 억제하는 지의 여부를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험에서 anti-HER2 scFv-LFA3에 대한 표적 암세포로, HER2가 표면에 과발현되어있는 SKBR3(ATCC No. HTB-30) 세포를 사용하였으며, 이 암세포를 면역활성화 반응을 통해 제거하기 위한 효과기 세포로 인간 혈액으로부터 분리된 말초혈액단핵세포 (huPBMC)를 사용하였다. 인간 혈액 100ml을 1x PBS (바이오세상, P2007P)와 1:1로 희석한 뒤, 혼합액 40ml을 10ml 피콜(ficoll)(BD, 17-1440-03)이 담겨있는 50ml 튜브에 층이 이루어지도록 로딩(loading)한 뒤, 2,000rpm, 30분 동안 -20℃하에 원심분리기로 원심분리(Vision, VS-550)하였다. 이 후 얻어진 백혈구 층(buffy coat)을 분리하여 1x PBS로 1회 세척한 후, 1500 rpm 4℃ 5분 동안 원심분리하여 PBMC를 분리하였다. 이 후 얻어진 PBMC는 10% FBS(Gibco)를 포함하는 RPMI(Gibc) 배지에 1 x 10⁶cells/ml로 배양하였다. 암세포로 사용할 SKBR3는 실험 하루 전 96 웰-플레이트에 10,000 세포/웰로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 10% FBS가 함유된 RPMI로 배양하였다.

암세포의 독성 실험을 위해 상기 배양한 SKBR3에 huPBMC를 1:40(Target cell:Effector cell)으로 넣고, anti-HER2 scFv-LFA3WT과 anti-HER2 scFv-LFA3-5 융합 단백질 각각을 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml 조건으로 처리한 후 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양 후 암세포의 생존능을 측정하기 위해, CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit (Promega, G1780)을 제조자의 방법대로 사용하였으며, anti-HER2 scFv-LFA3WT 또는 anti-HER2 scFv-LFA3-5로 활성화된 huPBMC에 의해 암세포가 파괴될 경우, 사멸 세포로부터 분출된 LDH(Lactate Dehydrogenase)를 규정된 프로토콜에 따라 측정하였다.

이를 위해, 250g로 4℃에서 4분동안 원심분리한 후 배지 50μl를 기질 완충용액 50μl와 혼합한 뒤, 상온에서 30분 동안 반응시켰으며, 정지 용액 50μl로 반응을 종료시킨 뒤 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 세포 독성은 하기 식으로 계산하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.

Cytotoxicity (%) = Experimental - Effector Spontaneous - Target Spontaneous/Target Maximum - Target Spontaneous X 100

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 양성 대조군으로 사용한 anti-CD3 항체(ab86883)는 10μg/ml에서 71%, 1μg/ml 에서 39%, 0.1μg/ml에서 23%의 SKBR3 세포 사멸 효과를 보였으며, 음성 대조군으로 huPBMC와 SKBR3 세포만 넣어준 경우, 세포 독성이 없는 것으로 측정되었다.

융합 단백질 anti-HER2 scFv-LFA3WT은 10μg/ml, 1μg/ml, 0.1μg/ml에서 각각 15%, 13%, 5% 정도의 특이적 암세포 파괴 능력을 보였고, anti-HER2 scFv-LFA3-5은 10μg/ml, 1μg/ml, 0.1μg/ml에서 각각 43%, 17%, 0%의 특이적 암세포 파괴 능력을 보였다. 세 번의 반복실험에서 세포 독성(%) 값은 실험에 사용하는 혈액 공여자에 따라 차이가 있었지만 그 패턴은 유사하였다. 정제단백질 중 anti-HER2 scFv-LFA3-5는 10μg/ml에서 양성 대조군으로 사용한 anti-CD3 antibody 1μg/ml 의 세포 독성 효과와 비슷한 효과를 보였으며, 그 효과는 anti-HER2 scFv-LFA3WT에 비해 우수하였다.

1-12. E.coli 발현 시스템에서 생산한 단백질의 IL-2 사이토카인 ELISA 분석

상기 제조된 융합 단백질인 Anti-HER2 scFv-LFA3WT 및 anti-HER2 scFv-LFA3-5에 의해 인간 PBMC가 활성화되는 지의 여부를 확인하기 위해 PBMC 활성화를 시험하는 가장 대표적인 방법으로, 인간 사이토카인(human cytokine) 중 하나인 IL-2(Interleukin-2)에 대한 ELISA를 수행하였다.

IL-2는 대표적인 면역 사이토카인(immune cytokine)의 하나로서, 특히, T 림프구의 성장과 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서, PBMC에서의 IL-2의 발현양을 측정하여 T 림프구의 활성화를 간접적으로 확인할 수 있다. 하기 실험에서는 인간 혈액으로부터 분리된 말초혈액단핵세포(huPBMC)를 상기 발현, 정제한 본 발명의 융합 단백질 anti-HER2 scFv-LFA3WT 및 anti-HER2 scFv-LFA3-5를 사용하여 활성화시킨 후, human IL-2 cytokine ELISA kit (R&D Systems, DY202)을 제조자의 방법대로 사용하여 발현된 IL-2의 양을 측정하였으며, 구체적인 방법은 하기와 같다.

요약하면 상기 <실시예 1-11>과 같은 방법으로 분리한 PBMC 을 48 웰 플레이트에 웰당 2 x 10⁶개의 세포를 넣고 융합 단백질은 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml의 농도로 각각 넣었다. 그 후 21시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. IL-2 ELISA를 위해서 96 웰-플레이트에 캡쳐 항체(R&D Systems, Part 840104)를 4μg/ml의 농도로 100μl, 4℃에서 하룻밤 동안 코팅한 후, 블락킹 용액(1% BSA in PBS with 0.05% NaN3) 300μl로 상온에서 1시간 동안 배양시켰다. 이 후 10μg/ml, 1μg/ml, 0.1μg/ml의 단백질이 처리된 PBMC 배지를 각각 96 웰-플레이트에 넣고 상온에서 두 시간 동안 배양 한 뒤, 검출 항체(R&D Systems, Part 840105)를 27μg/ml로 100μl, 상온에서 두 시간 동안 배양하였다. 이 후, Streptavidin-HRP(R&D Systems, Part 890803)를 1:200으로 희석하여 100μl, 상온에서 20분 동안 처리한 뒤, Tetramethylbenzidine substrate solution(sigma, K-T0440-1)을 100μl 처리하여 검출 신호를 확인하였다. 흡광도는 각기 450nm, 540nm로 측정하였으며 보정을 위해 키트의 매뉴얼에서 제시하는 방법에 따라 450nm 측정값에서 540nm 측정값을 빼고 계산하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 양성 대조군으로 사용한 5μg/ml의 PWM(pokeweed mitogen, sigma)에서 IL-2의 분비가 8000pg/ml 이상으로 측정되었고, 인간 PBMC 만 넣어주고 융합 단백질을 넣어주지 않은 음성 대조군 1 과 배양 배지만을 측정한 음성 대조군 2에서는 IL-2가 전혀 측정되지 않았다. Anti-HER2 scFv-LFA3WT은 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml 농도에서 각각 838pg/ml, 1500pg/ml, 3005pg/ml의 IL-2를 생산 유도한 것으로 측정되었다. 또한, Anti-HER2 scFv-LFA3-5은 0.1μg/ml, 1μg/ml, 10μg/ml 농도에서 각각 1300pg/ml, 2203pg/ml, 2224pg/ml의 IL-2를 생산 유도한 것으로 측정되었다.

이는 본 발명에서 제조된 융합 단백질 Anti-HER2 scFv-LFA3WT 및 Anti-HER2 scFv-LFA3-5는 T 림프구를 활성화시켜서 IL-2를 분비하게 하고, 분비된 IL-2는 T 림프구의 성장 및 분화에 영향을 미쳐 T 림프구를 도 10과 같이 증식시킬 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2. 포유류 발현 시스템을 이용한, HER2 항원에 특이적으로 결합하는 scFv 및 LFA3를 포함하는 융합단백질의 구축

2-1. 포유류 세포에서의 발현에 최적화된 유전자 합성

LFA3는 원래 그 기원이 인간이기 때문에 포유동물 세포(mammalian cell), 특히 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 생산하기 위해 포유동물에서의 코돈 최적화(codon optimization) COSMOgentech에 의뢰하여 수행하였고, 서열번호 15의 1~123 아미노산잔기에 해당하는 LFA3 CD2 결합영역을 코딩하는 서열번호 17의 1~369 해당하는 염기서열을 합성하였으며, 제대로 합성되었는지의 여부를 도 13과 같이 확인하였다. 상기 합성된 서열은 포유동물 세포의 발현에 최적화하였고, XhoⅠ과 Not Ⅰ제한 효소부위, kozak 서열, 신호서열 (서열번호 17의 nt 1 내지 84), LFA3 CD2 결합영역인 ectodomain 1 (서열번호 17의 nt 29 내지 369), 링커, anti-HER2 scFv 서열, TEV 절단부위, 6X HIS 부위를 포함하도록 제작하였다.

상기 포유류 세포에서 발현을 최적화시킨 본 발명의 유전자에 의해 생산되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 15와 같으며, 생산되는 단백질의 간단한 구조도는 도 14에서 나타내었다.

표 3

서열번호	서열
17	Mammalian expression system에 optimization하여 합성한 anti-HER2 scFv-LFA3 유전자의 염기 서열
15	Mammalian expression system에 optimization하여 합성한 anti-HER2 scFv-LFA3의 아미노산 서열
17의 nt 1 내지 369	Mammalian expression system에 optimization하여 합성한 LFA3의 유전자 염기서열
서열번호 15의 잔기 1 내지 123	Mammalian expression system에 optimization하여 합성한 LFA3의 아미노산 서열 (잔기 29 내지 123)

2-2. 포유류 세포에서의 발현에 최적화된 단백질 생산을 위한 플라스미드 구축

상기 <실시예 2-1>에서 합성된 유전자를 COS-7세포에서 일시적으로 발현하기 위해 포유류 세포 발현 벡터인 pCIneo 벡터를 이용하였고, 합성된 유전자는 XhoⅠ과 NotⅠ을 사용하여 pCIneo 벡터에 클로닝하였으며, 제작된 벡터는 [도 15]에 나타내었다. 또한, 클로닝한 플라스미드는 상기의 제한효소를 처리하여 도 16과 같이 확인하였고, 상기 실시예 1에서 합성한 E.coli에서 발현하기 위한 anti-HER2 scFv-LFA3 유전자와는 100bp정도 크기가 차이가 있음을 [도 17]에서 확인하였다.

상기 제작한 포유류에서 발현하기 위한 재조합 플라스미드에 대해 하기 [표 4]의 universal T3 primer, pCIneo-F primer, pCIneo-R primer를 이용하여 서열분석을 실시하였으며, 그 결과 돌연변이가 발생하지 않았음을 확인하였다.

표 4

서열번호	Primer	염기서열
42	T3	ATTAACCCTCACTAAAG
43	pCIneo-R	TACAAATAAAGCAATAGCAT
44	pCIneo-F	CACTTTGCCTTTCTCTCCAC

2-3. COS7 세포에서 mammalian cell에서의 발현에 최적화된 단백질의 생산

상기 2-2에서 제작한 anti-HER2 scFv-LFA3 플라스미드는 COS7 세포에 일시적으로 형질도입하여,포유류 시스템에서 융합 단백질을 생산하였다.

구체적으로, COS7 세포는 T175 플라스크에서 70-80% 정도를 채울 정도로 키웠다. DNA는 70μg을 Opti-MEM I media(BD Bioscience)에 전체 부피가 4.3ml이 되게 희석하였고, 형질도입 시약은 lipofectamine 2000(invitrogen)을 사용하였으며, 175μl의 lipofectamine 2000을 Opti-MEM I 배지로 전체 부피가 4.3ml이 되게 희석하여 상온에서 5분간 반응시켰다. DNA/lipofectamine 2000 혼합물을 20분 동안 상온에서 반응시킨 후, COS7 세포가 있는 플라스크에 넣어주었다. 37℃에서 5~7시간 배양 후 배지를 무혈청 배지로 갈아준 다음, 3일 경과 후 배지를 수집하여 원액과 1/20 농축액에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 웨스턴 블랏이 검출 항체로는 polyclonal anti-CD58 항체(sc-20925), anti-human kappa chain antibody(Sigma), anti-C term HIS HRP antibody(INV-R931-25)를 사용하였다. 세가지 항체 모두로 발현을 확인하였으며, 이중 anti-human kappa chain antibody(Sigma)로 발현을 확인한 결과는 도 18과 같다. 이때, 당쇄화(Glycosylation)로 인해 E.coli 발현시스템을 이용하여 발현된 단백질에 비해 크기가 더 큼을 확인하였다.

2-4. CHO 세포에서 포유류세포에서의 발현에 최적화된 단백질을 생산하는 초기 세포주 구축

상기와 같이, anti-HER2 scFv-LFA3의 일시적인 발현을 COS-7 세포에서 확인한 후, 안정적 발현을 위해 pAD15 벡터에 클로닝한 후 CHO 세포에 실시예 2-3과 동일한 방법으로 형질 전환시켜 HT 선별 및 제한 희석을 하여 선별된 콜로니에 대하여 MTX 증폭을 통해 초기 세포주를 만들었다.

2-5. 포유류 세포에서 발현된 단백질의 정제

COS-7세포에 일시적 전달이입 3일 후 배지를 모아 2000rpm, 4℃, 3분 동안 원심분리한 후 얻은 세포는 0.45 μm의 기공 크기의 셀룰로오스 여과 막에 여과하여 미리 평형 완충액으로 평형화시킨 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩했다. 용출되어 나온 바인딩 분획을 모아 12% SDS-PAGE로 밴드를 확인한 후 한외 여과 방식으로 농축한 후 1X PBS로 완충액 교환을 수행하였다. 얻어진 단백질은 엔도톡신을 제거하기 위해 단백질 부피의 1% 가량의 Triton X-114를 넣고 잘 혼합하여 제거한 후 최종 단백질을 얻은 후 protein assay dye reagent concentrate(Biorad, catalog no. 500-0006) 를 사용하여 얻은 최종 단백질 양을 정량하였다.

2-6. 특이적 및 비특이적 항원에 대한 결합 분석

상기 실시예 1-7의 실험 방법으로 특이적 암 항원인 HER2 에 결합 여부를 측정하였다. 실험은 정제하기 이전의 배양 배지를 10kDa cut off 컬럼(millipore)으로 10배 농축한 배지 샘플, 원액 배지 샘플, 1/10 희석한 샘플, 1/100 희석한 샘플로 수행하였으며, 대조군으로는 E.coli에서 생산 및 정제한 anti-HER2 scfv-LFA3WT를 사용하였다.

그 결과, 도 19에서 보는 바와 같이 포유류 세포에서 발현된 anti-HER2 scFv-LFA3 역시 HER2 항원에 농도 의존적으로 결합함을 확인하였다. 그 효과가 E.coli에서 발현한 융합 단백질에 비해 우수해 보이지만, 포유류 세포에서 생산한 단백질은 정확히 정량을 하지 않고 사용한 것이기 때문에 농도에 따른 효과는 직접적으로 비교할 수 없다. 하지만 정제되기 이전의 단백질의 효과가 도 19와 같으므로 정제 과정을 거치게 된다면, 그 활성이 더욱 증가할 것으로 예측된다.

COS-7에서 일시적으로 발현된 단백질이 비특이적 항원에 결합하는지 상기 실시예 1-8의 실험 방법으로 결합 여부를 측정하였다. 실험은 정제하기 이전의 배양 배지를 10kDa cut off 컬럼(millipore)으로 10배 농축한 배지 샘플, 원액 배지 샘플, 1/10 희석한 샘플, 1/100 희석한 샘플로 수행하였다. 융합 단백질이 결합하는 HER2 항원이나 CD2 항원이 아닌 다른 단백질에 대해 결합을 하지 않는지 무작위로 선정된 보유하고 있던 단백질 A와 단백질 B에 대한 결합 분석 여부를 ELISA를 통해 확인하였다.

그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이 포유류세포에서 생산한 anti-HER2 scFv-LFA3 역시 무작위로 선정된 A, B 단백질 모두에 대해 비특이적인 결합을 나타내지 않았다.

2-7. COS-7 세포에서 생산한 다특이적 단백질의 이중 (dual) 결합 분석

COS-7 세포에서 일시적으로 발현한 anti-HER2 scFv-LFA3가 포함된 배양 배지를 정제하기 이전에 HER2 항원과 CD2 항원에 동시에 결합을 할 수 있는지의 여부를 다음 방법과 같이 ELISA를 수행하여 확인하였다.

구체적으로, HER2 항원을 50mM Bicarbonate/Carbonate 코팅 완충액에 희석하여 1μg/웰이 되게 96 웰 플레이트에 분주하고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 웰 세척기(Thermo Scientifics, Wellwash Plus)를 이용하여 PBST 버퍼(PBS, 0.05% Tween-20)로 5회 세척하고 ELISA 블락킹 완충액으로 1시간 동안 비특이적인 결합을 블로킹하였다. 웰 세척기를 이용하여 PBST로 5번 세척 후 anti-HER2 scFv-LFA3 배양 배지를 10kDa cut off 컬럼(millipore) 으로 10배 농축한 배지 샘플, 원액 배지 샘플, 1/10 희석한 샘플, 1/100 희석한 샘플, 1/1000 희석한 샘플을 96 웰 플레이트에 각각 분주하고 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 웰 세척기를 이용하여 PBST로 5번 세척 후 웰 당 50000개의 Jurkat T 세포를 넣어주고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBST로 3회 세척 후 남아있는 Jurkat T 세포를 calcein AM으로 30분간 표지하였다. ELISA 판독기로 490nm/ 520nm에서 형광도를 측정하였다.

그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, anti-HER2 scFv-LFA3의 농도 의존적으로 HER2 항원과 동시에 CD2 항원을 가지는 Jurkat T 세포와 결합함을 확인하였고, 그 효과는 E. coli에서 발현 정제된 단백질에 비해 우수해 보이나, COS-7에서 발현된 단백질은 정제 및 정량하여 사용한 것이 아니므로, 정확한 비교는 어렵다. 하지만 정제되기 이전의 단백질의 효과가 [도 21]과 같으므로 정제 과정을 거치게 된다면, 그 활성이 더욱 증가할 것으로 예측된다.

실시예 3. anti-CD20 Fab-LFA3 및 anti-CD20 scFv-LFA3 융합단백질 제작

3-1. anti-CD20 scFv-LFA3 융합단백질 구축 및 E.coli에서 발현한 단백질의 활성

본 실시예에서는 HER2(+) 암 치료제로 개발한 Anti-HER2 scFv-LFA3 의 암 항원을 인식하는 영역을 anti-CD20 scFv로 전환하여, Anti-CD20 scFv-LFA3 융합 단백질을 제작하여 B 세포 림포마(lymphoma)에 대한 치료제로서 적용하였다.

본 실시예에서 사용된 Anti-CD20 scFv는 하기와 같이 ㈜Cosmogenetech에 의뢰하여 합성되었다.

기존의 합성된 LFA3 야생형과 변이체들의 서열은 상술한 바와 같다. anti-CD20 scFv은 N-말단 부분에는 EcoR Ⅰ 부위를 넣었고, C-말단 부분에는 Hind Ⅲ 제한효소 부위를 넣었으며, 최종적으로 pRSET-A 벡터에 anti-CD20 scFv-LFA3 야생형과 변이체들을 클로닝하여 [도 22]과 같은 벡터를 구성하였다. 각각의 발현된 단백질의 염기 서열은 서열번호 25, 26, 27, 28, 29 및 30과 같고, 그 아미노산 서열은 서열번호 31, 32, 33, 34, 35 및 36과 같으며, 이는 하기 [표 5]에서 보는 바와 같다. 이때, E.coli에서 발현한 단백질은 상기 실시예 1-6의 anti-HER2 scFv-LFA3s 정제 과정과 동일한 방법으로 생산하여 얻었다.

표 5

서열번호	서열
27	Anti-CD20 scFv-LFA3 WT 염기서열
28	Anti-CD20 scFv-LFA3-1 염기서열
29	Anti-CD20 scFv-LFA3-2 염기서열
30	Anti-CD20 scFv-LFA3-3 염기서열
31	Anti-CD20 scFv-LFA3-4 염기서열
32	Anti-CD20 scFv-LFA3-5 염기서열
18	Anti-CD20 scFv-LFA3 WT 아미노산 서열
19	Anti-CD20 scFv-LFA3-1 아미노산 서열
20	Anti-CD20 scFv-LFA3-2 아미노산 서열
21	Anti-CD20 scFv-LFA3-3 아미노산 서열
22	Anti-CD20 scFv-LFA3-4 아미노산 서열
23	Anti-CD20 scFv-LFA3-5 아미노산 서열

상기 방법을 통해 정제된 본 발명의 anti-CD20 scFv-LFA3-1 단백질은 CD20-positive Raji 세포와 CD2-positive Jurkat T 세포에 도 23, 24와 같이 각각 결합을 하였다. 각 세포는 96 웰 플레이트의 웰 당 2 X 10⁶ 세포를 poly-D-lysine으로 붙여 사용하였고, 융합 단백질을 결합시키기 이전에 FcR blocker(Miltenyibiotec, catalog no. 130-059-901)를 1:500으로 희석하여 플레이트에 처리하고 실험하였다. 검출 항체로는 anti-6X HIS tag-HRP 항체(ab1187)를 1:3000으로 희석하여 사용하였다.

또한, 정제한 단백질 anti-CD20 scFv-LFA3-1로 T 림프구 증식분석(MLR)을 수행한 결과, 도 25와 같이 양성 대조군으로 사용한 anti-CD3 항체 0.1μg/ml에 준하는 정도의 T 림프구 급증을 확인하였다.

아울러, E.coli에서 생산한 anti-CD20 scFv-LFA3WT에 의해 인간 PBMC가 활성화되는 지를 확인하기 위해 PBMC 활성화를 시험하는 가장 대표적인 방법으로 인간 사이토카인 중 하나인 IL-2(Interleukin-2)에 대한 사이토카인 ELISA를 human IL-2 cytokine ELISA kit(R&D Systems, DY202)를 사용하여 실시예 1-12에 기재된 방법과 동일하게 진행하였다.

그 결과, 도 26에 나타난 바와 같이, 인간 PBMC 만 넣어주고 융합 단백질을 넣어주지 않은 음성 대조군은 IL-2가 전혀 측정되지 않았고, Anti-CD20 scFv-LFA3WT 은 1μg/ml 농도에서 3000pg/ml이상의 IL-2를 생산 유도한 것으로 측정되었다.

이러한 결과는 Anti-CD20 scFv-LFA3WT 은 T 림프구를 활성화시켜서 IL-2를 분비하게 하고, 분비된 IL-2는 T 림프구의 성장 및 분화에 영향을 미쳐, 도 25와 같이 T 림프구를 증식시킴을 나타내는 것이다.

3-2. 포유류 발현 시스템에서 발현 최적화한 anti-CD20 Fab-LFA3 및 anti-CD20 scFv-LFA3 융합 단백질 제작 및 포유류 세포에서 단백질의 발현

Anti-CD20 Fab 서열 및 anti-CD20 scFv 서열은 DrugBank Rituximab (Accession number DB00073)을 참조하였고, 사용된 LFA3 서열은 포유류 세포에서 발현시키기 위하여 anti-HER2 scFv-LFA3 제작에 사용한 서열과 같다.

Anti-CD20 Fab과 LFA3를 융합한 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 25(anti-CD20 VH-CH-LFA3), 서열번호 26(anti-CD20 VL-CL)와 같으며, Anti-CD20 scFv와 LFA3를 융합한 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 24와 같다. 상기 세 개의 서열은 Genescript사에 의뢰하여 합성하였다. 합성한 유전자의 DNA 정량과 형질전환, DNA 정제 및 클로닝 과정은 실시예 2와 동일하다. 최종 플라스미드에 삽입된 anti-CD20 scFv-LFA3 및 anti-CD20 Fab-LFA3의 모식도는 각각 도 28 및 도 29와 같다.

실시예4. 인체유래 난소암(SKOV3) 이식 모델에서 anti-HER2 scFv-LFA3의 항암 약효 평가

HER2 항원을 가지는 SKOV3 세포를 누드 마우스에 이종 이식한 동물 모델에 anti-HER2 scFv-LFA3을 정맥 주사로 투여하여 항암 활성을 검증하였다.

첫 번째 동물 실험은 암을 유도한 다음 약물을 처리하는 지연치료 모델 (delayed treatment model)을 진행하였다. 실험에 사용한 마우스는 BALB/C계통의 특정병원체 부재(SPF) 누드 마우스(Nara Biotech Co.)였으며, SKOV3 암세포를 1×10⁷ cells/ml로 현탁하여 마우스당 0.3 ml(즉, 3×10⁶ cells/mouse)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와 부위 피하에 주입 하였다. SKOV3 암세포와 PBMC혼합 이식군은 각각 두 배 농도로 만들어 1:1로 섞은 후 같은 양을 같은 방법으로 주입하였다. 암 덩어리의 크기가 60mm³ 이 도달하였을 때, anti-HER2 scFv-LFA3을 마우스당 0.2ml씩 매일 1회, 5일 동안 미정맥 주사하였다(day0~4). 모든 동물은 anti-HER2 scFv-LFA3의 독성 여부를 판단하기 위해 체중 및 투여에 따른 일반 증상을 관찰하였는데, 시험기간 동안 특이한 일반증상은 관찰되지 않았으며, 유의한 체중 감소 역시 없었다. 그 결과 도 30a에 나타난 바와 같이 실험 최종일에 용매 대조군 및 용매 + PBMC 대조군에 비해 anti-HER2 scFv-LFA3 투여군의 경우 38.3%의 종양 성장 억제 효과가 있는 것을 확인하였다.

다음으로 암 세포와 동시에 약물을 처리하는 조기치료 모델 (early treatment model)을 진행하였다. 실험에 사용한 마우스와 실험 방법은 첫 번째 동물 실험과 동일하나, 실험 조건에 따라 암세포, PBMC, anti-HER2 scFv-LFA3을 동시에 처리했다는 점이 다르다. anti-HER2 scFv-LFA3투여는 10μg, 50μg, 100μg의 세가지 농도로 진행하였다. 모든 동물은 anti-HER2 scFv-LFA3의 독성 여부를 판단하기 위해 체중 및 투여에 따른 일반 증상을 관찰하였는데, 시험기간 동안 특이한 일반증상은 관찰되지 않았으며, 유의한 체중 감소 역시 없었다. 그 결과 도 30b에 나타난 바와 같이, 실험 최종일에 용매 대조군에 비해 anti-HER2 scFv-LFA3 최고농도 투여군의 경우 37.4%의 종양 성장 억제 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다. 또한 10μg 투여군, 50μg 투여군, 및 100μg 투여군에서 용매 대조군에 비해 최종일 종양 무게가 각각 8.2%, 17.0%(p<0.01), 35.2%(p<0.001) 감소하였다.

실시예 5. 인체유래 혈액암(Raji) 이식 모델에서 anti-CD20 scFv-LFA3의 항암 약효 평가

CD20 항원을 가지는 Raji 혈액암 세포를 NOD.CB17/scid 마우스에 이종 이식한 동물 모델에 anti-CD20 scFv-LFA3을 정맥 주사로 투여하여 항암 활성을 검증하였다.

암 세포와 동시에 약물을 처리하는 조기치료 모델을 진행하였다. 실험에 사용한 마우스는 ARC(Perth, WA, Australia)에서 생산한 NOD.CB17/scid mice(5W, female)(㈜중앙실험동물) 였으며, Raji 암세포를 1.65×10⁷ cells/ml로 조절하여 마우스당 0.3 ml(즉, 5×10⁶ cells/mouse)씩 우측의 견갑부와 흉벽 사이의 액와 부위 피하에 주입 하였다. Raji 암세포와 PBMC혼합 이식군은 각각 두배 농도로 만들어 1:1로 섞은 후 같은 양을 같은 방법으로 주입하였다. anti-CD20 scFv-LFA3을 마우스당 0.2ml씩 매일 1회, 5일동안 미정맥 주사하였다(day0~4). anti-CD20 scFv-LFA3투여는 2μg, 20μg, 200μg의 세가지 농도로 진행하였다. 모든 동물은 anti-CD20 scFv-LFA3의 독성 여부를 판단하기 위해 체중 및 투여에 따른 일반 증상을 관찰하였는데, 그 결과, 최종일에 용매 대조군에서는 하반신 마비 증세를 나타내는 동물들이 발생한 반면 anti-CD20 scFv-LFA3투여군에서는 어떠한 이상 증상도 관찰되지 않았고 유의미한 체중 감소 역시 관찰되지 않았다. 그 결과 도 31에 나타난 바와 같이, 실험 최종일에 용매 대조군에 비해 anti-CD20 scFv-LFA3 최고 농도 투여군의 경우 75.6%(p<0.001)의 종양 성장 억제 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한 용매대조군과 비교하여 aCD20 scFv-LFA3 200μg/mouse 처리군에서는 68.2(p<0.01)%의 종양 무게 감소가 있었다.

서열번호 1 내지 44를 포함하는 서열목록은 본 명세서에 첨부되었으며, 본 명세서를 구성한다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드로, 상기 CD2 결합 폴리펩타이드는 서열번호 1의 서열을 기준으로 29 내지 123 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 변형은 하기 모든 위치에서, 하기 각 위치에 기재된 아미노산 중 어느 하나로 치환된 것인, 변형된 LFA3 CD2 결합 폴리펩타이드:

36번째 아미노산이 Val에서 Thr, Lys, Pro 또는 Val;

37번째 아미노산이 Val에서 Trp, Lys 또는 Val;

38번째 아미노산이 Tyr에서 Lys 또는 Gly;

40번째 아미노산이 Asn에서 Asp 또는 Thr;

76번째 아미노산이 Ser에서 Asp, 또는 Arg;

79번째 아미노산이 Asn에서 Gly;

93 번째 아미노산이 Tyr에서 Asn;

94 번째 아미노산이 Asn에서 Ser;

96 번째 아미노산이 Thr에서 Gln, Lys, 또는 Arg; 또는

97 번째 아미노산이 Ile, Arg, Ala 또는 Pro으로 치환
제 1 항에 있어서, 상기 치환은 하기 하나 이상의 변형을 부가적으로 포함하는 것인, 변형된 LFA3 CD2 결합 폴리펩타이드:

39번째 아미노산이 Gly에서 Asp;

44번째 아미노산이 His에서 Thr;

45번째 아미노산이 Val에서 Cys;

46번째 아미노산이 Pro에서 Thr;

47번째 아미노산이 Ser에서 Ala;

48번째 아미노산이 Asn에서 Ser;

50번째 아미노산이 Pro에서 Lys;

51번째 아미노산이 Leu에서 Ser;

52번째 아미노산이 Lys에서 Ile;

81번째 아미노산이 Val에서 Ala;

82번째 아미노산이 Tyr에서 Asp;

83번째 아미노산이 Leu 에서 Trp;

85 번째 아미노산이 Thr에서 Gln;

86 번째 아미노산이 Val에서 Gly;

87 번째 아미노산이 Ser에서 Asn;

88 번째 아미노산이 Gly에서 Phe;

89 번째 아미노산이 Ser에서 Pro;

98 번째 아미노산이 Ser에서 Glu;

101 번째 아미노산이 Asp에서 Gly으로 치환; 또는

48번째 부위에 Gln의 삽입 또는

82번째 부위에 Ser-Arg-Arg-Ser-Leu 서열의 폴리펩타이드 삽입.
제 3 항에 있어서, 상기 변형된 CD2 결합 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 6중 어느 하나로 표시되는 것인, 변형된 LFA3 CD2 결합 폴리펩타이드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제 4 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8 내지 12 중 어느 하나인, 폴리뉴클레오타이드.
하나 이상의 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 변형된 LFA3의 CD2 결합 폴리펩타이드 또는 이의 야생형 폴리펩타이드 및 표적 특이적 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질.
제 6 항에 있어서, 상기 융합단백질은 링커를 추가로 포함하는 것인, 융합단백질.
제 7 항에 있어서, 상기 링커는 폴리펩타이드인, 융합단백질.
제 8 항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 13로 표시되는 것인, 융합단백질.
제 6 항에 있어서, 상기 CD2 결합 폴리펩타이드는 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 위치하는 것인, 융합단백질.
제 6 항에 있어서, 상기 표적 특이적 폴리펩타이드는 항체, 항체의 항원결합 단편, 항체 모방체, 앱타머, 또는 수용체인 것인, 융합단백질.
제 11 항에 있어서, 상기 항체는 항체의 키메라 항체, 인간화 항체를 포함하고, 상기 항원결합 단편은 scFv, BITE, TandAb, Immunobody, Flexibody, Nanobody, Triomab, Troybody, Pepbody, Vaccibody, SMIP, Fab(fragment antigen binding), mAb², UniBody, Fv (fragment variable), dAB, scFv-Fc, Diabody, Tetrabody, Minibody, scFab(single chain Fab), 또는 Fcab을 포함하는 것인, 융합단백질.
제 11 항에 있어서, 상기 항체 모방체는 DARPin, Tetranectin, Affibody, Transbody, Anticalin, AdNectin, Affilin, Microbody, Peptide aptamer, Phylomer, Stradobody, Avimer, Maxibodiy, Evibody, 또는 Fynomer를 포함하는 것인, 융합단백질.
제 6 항에 있어서, 상기 표적은 세포 표면에 존재하는 인자인, 융합단백질.
제 14 항에 있어서, 상기 세포는 암 세포인, 융합단백질.
제 14 항에 있어서, 상기 인자는 HER2(Human Epidermal Growth factor 2)또는 CD20인 것인, 융합단백질.
제 16 항에 있어서, 상기 HER2 또는 CD20를 표적으로 하는 폴리펩타이드는 상기 HER2 또는 CD20에 특이적으로 결합하는 scFv 또는 Fab인, 융합단백질.
제 17 항에 있어서, 상기 HER2를 표적으로 하는 scFv 융합단백질은 서열번호 14, 15, 또는 16로 표시되고, 상기 CD20를 표적으로 하는 scFv 융합단백질은 서열번호 18 내지 24 중 어느 하나로 표시되고, 상기 CD20를 표적으로 하는 Fab 융합단백질은 서열번호 25 및 26으로 표시되는, 융합단백질.
제 6 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제 20 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 HER2를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 17으로 표시되며, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드는 CD20를 표적으로 하는 것으로, 서열번호 27 내지 32 중 어느 하나로 표시되는 것인, 폴리뉴클레오타이드.
T-세포 매개된, 표적 세포의 붕해(lysis) 방법으로, 상기 표적 세포를 제 6 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 융합단백질 또는 상기 폴리뉴클레오타이드에 의해 발현되는 단백질은 상기 표적 세포의 표면에 존재하는 인자를 특이적으로 인식하는 것인, 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 표적 세포는 암, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 다발성 경화증, 항조중구세포질항체-연관성 혈관염으르 포함하는 자가면역질환, 또는 결핵(Tuberculosis), 리스테리아증(Listeriosis), 레기오넬라증 (Legionnaires’disease), 칸디다증 (candidiasis), 또는 전염단핵구증(infectious mononucleosis)을 포함하는 미생물감염과 관련된 세포인, 방법.
제 22 항에 있어서, 상기 표적 세포는 난소암, 유방암, 대장암, 전립선암, 흑색종, 호지킨스 림프종, 비호지킨스 림프종을 포함하는 림프종, 백혈병 (급성골수성 백혈병, 만성 골수성백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병을 포함하는 백혈병, 위암, 신장세포암종, 대장암, 결장암, 폐암, 뇌암, 자궁 경부암, 식도암, 또는 간암인 방법.
제 21 항에 있어서, 상기 인자는 암과 연관된 것인, 방법.
제 24 항에 있어서, 상기 인자는CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a, GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS (phosphatidyl serine) lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, Type I membrane protein, IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR (secreted chain of the polymorphic immunoglobulin receptor), 14-3-3 protein eta. 5T4 oncofetal protein, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 방법.
제 6 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 T-세포 매개된 표적 세포의 붕해용 약학 조성물.
제 26 항에 있어서, 상기 표적 세포는 그 표면에 암세포 특이적 인자를 발현하는 암세포인, 약학조성물.
제 27 항에 있어서, 상기 암세포 특이적 인자는 CD2, CD4, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD37, CD40, CD44v6, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD98, CD138, EGFR(Epidermal growth factor receptor), VEGF(Vascular endothelial growth factor), VEGFRI(Vascular endothelial growth factor receptor I), PDGFR(Platelet-derived growth factor receptor), RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand), GPNMB(Transmembrane glycoprotein Neuromedin B), EphA2(Ephrin type-A receptor 2), MN(a novel tumor-associated protein), PSMA(Prostate-specific membrane antigen), Cripto(Cryptic family protein 1B), EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule), CTLA4(Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), IGF-IR(Type 1 insulin-like growth factor receptor), GP3(M13 bacteriophage), GP9(Glycoprotein IX (platelet), CD42a), GP40(Glycoprotein 40kDa) TRAILRI(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor I), TRAILRII(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor II), FAS(Type II transmembrane protein), PS lipid, Gal GlNac Gal N-linked, Muc1(Mucin 1, cell surface associated, PEM), Muc18 CD146, A5B1 integrin(α5β1), α4β1 integrin, αv integrin(Vitronectin Receptor), Chondrolectin, CAIX(Carbonic anhydrase IX, gene G250/MN-encoded transmembrane protein), GD2 gangloside, GD3 gangloside, GM1 gangloside, Lewis Y, Mesothelin, HER2(Human Epidermal Growth factor 2), HER3, FN14(Fibroblast Growth Factor Inducible 14), CS1(Cell surface glycoprotein, CD2 subset 1, CRACC, SLAMF7, CD319), 41BB CD137, SIP(Siah-1 Interacting Protein), CTGF(Connective tissue growth factor), HLADR(MHC class II cell surface receptor), PD-1(Programmed Death 1, a Type I membrane protein), IL-2(Interleukin-2), IL-8(Interleukin-8), IL-13(Interleukin-13), PIGF(Phosphatidylinositol-glycan biosynthesis class F protein), NRP1(Neuropilin-1), ICAM1 CD54, GC182(Claudin 18.2), Claudin, HGF(Hepatocyte growth factor), CEA(Carcinoembryonic antigen), LTβR(lymphotoxin β receptor), Kappa Myeloma, Folare Receptor alpha, GRP78(BIP, 78 kDa Glucose-regulated protein), A33 antigen, PSA(Prostate-specific antigen (PSA), CA125(Cancer antigen 125 or carbohydrate antigen 125), CA19.9, CA15.3, CA242, Leptin, Prolactin, Osteopontin, IGF-II(Insulin-like growth factor 2), Fascin, sPIgR, 14-3-3 eta. 5T4, ETA(epithelial tumor antigen), MAGE(Melanoma-associated antigen), MAPG(Melanoma-associated proteoglycan, NG2), Vimentin, EPCA-1(Early prostate cancer antigen-2), TAG-72(Tumor-associated glycoprotein 72), Factor VIII, Neprilysin(Membrane metallo-endopeptidase) 및 17-1A(Epithelial cell surface antigen 17-1A)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 약학 조성물.
유효한 양의 제 6 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 융합단백질 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 암의 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.